Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp tPMT-C780 của Pasteurella multocida

✻✷

❚r÷í♥❣ ✣↕✐ ❤å❝ ◆æ♥❣ ▲➙♠ ❚P✳ ❍ç ❈❤➼ ▼✐♥❤

❈❧♦♥✐♥❣✱ ❡①♣r❡ss✐♥❣ ❛♥❞ ♣✉r✐❢✐❝❛t✐♦♥ ♦❢ r❡❝♦♠❜✐♥❛♥t ❈✲t❡r♠✐♥❛❧ P▼❚ ♦❢

P❛st❡✉r❡❧❧❛

♠✉❧t♦❝✐❞❛

❍✉♥❣ ❑✳ ❱✉1∗ ✱ ❚❤✐♥❤ ❚✳ ◆❣✉②❡♥1 ✱ ❍❛♥❣ ❚✳ ❚✳ ❚r✐♥❤1 ✱ ❚❤✉② ❚✳❚✳ ◆❣✉②❡♥1 ✱
●✐❛♥❣ ❚✳ ❚✳ ◆❣✉②❡♥1 ✱ ❆♥❤ ❚✳ ❚✳ ❉♦2 ✱ ✫ ❚r✉♦♥❣ ❳✳ ◆❣✉②❡♥1
1

■♥st✐t✉t❡ ♦❢ ❱❡t❡r✐♥❛r② ❘❡s❡❛r❝❤ ❛♥❞ ❉❡✈❡❧♦♣♠❡♥t ♦❢ ❈❡♥tr❛❧ ❱✐❡t♥❛♠✱ ❑❤❛♥❤ ❍♦❛✱ ❱✐❡t♥❛♠
2
❇✐♦t❡❝❤♥♦❧♦❣② ❛♥❞ ❊♥✈✐r♦♥♠❡♥t ■♥st✐t✉t❡✱ ◆❤❛ ❚r❛♥❣ ❯♥✐✈❡rs✐t②✱ ❑❤❛♥❤ ❍♦❛✱ ❱✐❡t♥❛♠

❆❘❚■❈▲❊ ■◆❋❖
❘❡s❡❛r❝❤ P❛♣❡r
❘❡❝❡✐✈❡❞✿ ▼❛r❝❤ ✶✾✱ ✷✵✶✾
❘❡✈✐s❡❞✿ ❙❡♣t❡♠❜❡r ✶✵✱ ✷✵✶✾
❆❝❝❡♣t❡❞✿ ❖❝t♦❜❡r ✶✺✱ ✷✵✶✾

❑❡②✇♦r❞s

❊s❝❤❡r✐❝❤✐❛ ❝♦❧✐ ❇▲✷✶
P❛st❡✉r❡❧❧❛ ♠✉❧t♦❝✐❞❛
P▼❚
tP▼❚✲❈✼✽✵
∗

❈♦rr❡s♣♦♥❞✐♥❣ ❛✉t❤♦r

❱ô ❑❤➢❝ ❍ò♥❣
❊♠❛✐❧✿ ✈✉❦❤❛❝✻✽❅❤♦t♠❛✐❧✳❝♦♠

❆❇❙❚❘❆❈❚
P❛st❡✉r❡❧❧❛ ♠✉❧t♦❝✐❞❛ str❛✐♥s ♣r♦❞✉❝❡ ❤❡❛t✲st❛❜❧❡ t♦①✐♥ P❛st❡✉r❡❧❧❛
▼✉❧t♦❝✐❞❛ ❚♦①✐♥ ✭P▼❚✮ ✇❤✐❝❤ ✐s t❤❡ ♠❛✐♥ ✈✐r✉❧❡♥❝❡ ❢❛❝t♦r ❝❛✉s✐♥❣
♣❛st❡✉r❡❧❧♦s✐s ✐♥ ♣✐❣s✳ ❚❤❡r❡❢♦r❡✱ P▼❚ ♣r♦t❡✐♥ ✐s ❝♦♥s✐❞❡r❡❞ ❛s ❛
♣r♦♠✐s✐♥❣ ❝❛♥❞✐❞❛t❡ t♦ st✉❞② r❡❝♦♠❜✐♥❛♥t ✈❛❝❝✐♥❡ ❛❣❛✐♥st ♣❛st❡✉r❡❧❧♦s✐s
✐♥ ♣✐❣s✳ ■♥ t❤✐s st✉❞②✱ ✇❡ ❝❧♦♥❡❞ t❤❡ ♥✉❝❧❡♦t✐❞❡ s❡q✉❡♥❝❡ ❝♦❞✐♥❣
❈✲t❡r♠✐♥❛❧ ❢r❛❣♠❡♥t ♦❢ P▼❚ ✭tP▼❚✲✼✽✵✮✱ ❢r♦♠ ❛❝✐❞ ❛♠✐♥❡ ✺✵✻ t♦
❛❝✐❞ ❛♠✐♥❡ ✶✷✽✺✱ ✐♥t♦ ♣❘❙❊❚✲❆ ✈❡❝t♦r ❛♥❞ ❡①♣r❡ss❡❞ ✐t ♦♥ ❊s❝❤❡r✐❝❤✐❛
❝♦❧✐ ❇▲✷✶ ❜❛❝t❡r✐❛✳ ❚❤❡ ❙❉❙✲P❆●❊ r❡s✉❧t s❤♦✇❡❞ t❤❛t tP▼❚✲❈✼✽✵
✇❛s ✇❡❧❧✲❡①♣r❡ss❡❞ ❜② ■P❚● ✶♠▼ ✐♥❞✉❝t✐♦♥ ❛♥❞ ❞❡t❡r♠✐♥❡❞ t♦ ❜❡
✐♥s♦❧✉❜❧❡ ♣r♦t❡✐♥✱ t❤❡r❡❢♦r❡ ✐t ✇❛s ♣✉r✐❢✐❡❞ ❜② ❞❡♥❛t✉r❛t✐♦♥ ♠❡t❤♦❞
✉s✐♥❣ ◆✐✲◆❚❆ ❜❡❛❞s✳ ❚❤❡ ♣r♦t❡✐♥ ❡❧✉t✐♦♥ s❛♠♣❧❡s ❝♦♥t❛✐♥❡❞ ♦♥❧② ♦♥❡
♣r♦t❡✐♥ ❜❛♥❞ s✐♠✐❧❛r ✇✐t❤ t❤❡ s✐③❡ ♦❢ tP▼❚✲❈✼✽✵ ❛♥❞ ♣♦s✐t✐✈❡❧② r❡❛❝t❡❞
✇✐t❤ P▼❚✲s♣❡❝✐❢✐❝ ❛♥t✐❜♦❞②✳ ❚❤❡s❡ r❡s✉❧ts s✉❣❣❡st❡❞ t❤❛t ✇❡ ✇❡r❡
s✉❝❝❡ss❢✉❧ ✐♥ ❡①♣r❡ss✐♥❣ ❛♥❞ ♣✉r✐❢②✐♥❣ ❈✲t❡r♠✐♥❛❧ ♣r♦t❡✐♥ ♦❢ P▼❚ t♦①✐♥✱
tP▼❚✲❈✼✽✵✳ ❚❤✐s ✐s t❤❡ ♣r✐♠❛r② ♠❛t❡r✐❛❧ ❢♦r ❢✉rt❤❡r st✉❞✐❡s t♦ ♣r♦❞✉❝❡
r❡❝♦♠❜✐♥❛♥t ✈❛❝❝✐♥❡ ❛❣❛✐♥st ♣❛st❡✉r❡❧❧♦s✐s ✐♥ ♣✐❣s✳

❈✐t❡❞ ❛s✿ ❱✉✱ ❍✳ ❑✳✱ ◆❣✉②❡♥✱ ❚✳ ❚✳✱ ❚r✐♥❤✱ ❍✳ ❚✳ ❚✳✱ ◆❣✉②❡♥✱ ❚✳ ❚✳ ❚✳✱ ◆❣✉②❡♥✱ ●✳ ❚✳ ❚✳✱ ❉♦✱

❆✳ ❚✳ ❚✳✱ ✫ ◆❣✉②❡♥✱ ❚✳ ❳✳ ✭✷✵✶✾✮✳ ❈❧♦♥✐♥❣✱ ❡①♣r❡ss✐♥❣ ❛♥❞ ♣✉r✐❢✐❝❛t✐♦♥ ♦❢ r❡❝♦♠❜✐♥❛♥t ❈✲t❡r♠✐♥❛❧
P▼❚ ♦❢ P❛st❡✉r❡❧❧❛ ♠✉❧t♦❝✐❞❛✳ ❚❤❡ ❏♦✉r♥❛❧ ♦❢ ❆❣r✐❝✉❧t✉r❡ ❛♥❞ ❉❡✈❡❧♦♣♠❡♥t ✶✽✭✺✮✱ ✻✷✲✻✾✳

❚↕♣ ❝❤➼ ◆æ♥❣ ♥❣❤✐➺♣ ✈➔ P❤→t tr✐➸♥ ✶✽✭✺✮

✇✇✇✳❥❛❞✳❤❝♠✉❛❢✳❡❞✉✳✈♥




rữớ ồ ổ P ỗ

ỏ t s rt t tờ ủ tP ừ

Pstr

t

ụ ũ1 1 r 1 ừ1
1 ộ r 2 rữớ1
P ú r ỏ
ổ ồ ổ rữớ rữớ ồ r ỏ
1

2





ồ

ừ ở ỹ Pstr t tt r ở ở tố t
Pstr t P tố ở ỹ ừ

tử t trũ tr ủ ở tố P ởt tố
t ự t t tờ ủ ỏ
tử t trũ ủ r ự ú tổ t
t ỏ rt ừ P tP
tứ t ừ P tr sr
tr s t q
P t rt t tờ ủ tP
ự ợ P ữủ rt ổ t
ữủ t s t ữỡ t q ởt
rt t ữủ s t s ự ởt rt
õ t tữỡ ữỡ ợ tP ự ữỡ
t ợ t P ự tọ ú tổ
t s t ổ rt ừ ở tố P ỗ
ự t t t
t tờ ủ ỏ tử t trũ ủ Pstr
t r


sỷ


ứ õ

sr
Pstr t
P
tP

ụ ũ
t

t

t r t
t r ỳ õ số ờ
tử t trũ tr ủ ởt số tt sú tử t
t t ồ Pstr trũ tở t r ỳ
t r tữớ ú t tr tốt õ t tổ õ tử t
tr t õ tr ừ ụ trũ ữ t ữỡ r tứ
ự ổ số tr ổ ừ tr ữợ r ờ tử
ụ ởt rt ố ợ ủ t trũ ủ ợ
t ỳ ỡ s ổ t tr ổ ỳ ớ
sỹ tt t ợ t ử tốt ổ t ỏ ụ ữ sỷ ử
r tử t trũ ỏ ỏ q ũ ổ ũ
ởt tr ỳ tự t ừ ở ự t t ợ s ờ tử
rố ổ s s t t trũ r q ổ
trồ ọ ữớ ổ
t t é t
tử t trũ ởt tr ỳ
tr t trữớ sỷ ử
t ủ t ờ t ỏ tử t trũ õ
P t tr ủ tữớ ổ t t số ữủ ở
tở õ P
số ỳ
rữợ tử t trũ ủ r õ ởt số t ữ ổ t

ổ Pt tr




rữớ ồ ổ P ỗ

õ ở số ữủ ở
õ t ờ tr t ữớ ở rs
sỷ ử ổ t tờ
ủ t tr õ t sợ
õ t t
tờ ủ õ t ữủ tờ ủ tứ tố
s ữủ
ự sỷ ử rt t
tờ ủ t
t t t ỹ ss
t õ ổ t tờ ủ tr
ự õ t ữủ sỷ ử t tr
q ú ố
t ừ P t t ỗ
t t
tờ ủ ỏ tử t trũ
P t r tr ủ ú tổ t
t ỏ t s rt t
tờ ủ tP tr

tP

tr tr Pr
tr õ t ữủ
sỷ ử t ỏ s
ự P tr
r sr t tr
õ tr tỹ r
tr ự s tờ ủ rt s
r ttrs P
õ tr tỹ õ ổ ủ
st s ổ ủ s ú
t ừ rt ử t ú t
rt t

t t tr
t ợ ợ
sỷ ử trữợ õ

rtr

ỏ s tP

tờ số ừ P t
õ ở tố P ữủ t t ở
t r Prt
ổ ự P
õ rt tP P ự P sỷ ử
ỗ tP tP ợ tr
t 0 út ý ừ 0
0 0 s õ ỷ ỵ 0
út ỳ 0 P s õ ữủ

ố ợ
tr tr tỹ tP ữủ
t ọ tr
s #
s # tr
t Pữỡ P ự ụ ữủ t ợ
tP s t s ữủ ố ợ tr
t
Ps t t ữủ
ỳ t t s õ
ừ s t ừ Pt ữủ s ồ ự P
ữủ tứ ừ ủ ỗ rtr tP ợ tr
tử t trũ õ ở t 0 út ý ừ 0
tố P ữủ sỷ ử ỗ 0 0 s õ ỷ ỵ 0
tr tỹ t õ rt tP út ỳ 0
ừ ũ
s ồ ỳ s
tr t ỏ ữ ỳ s t tờ ủ tP ữủ ổ t
ũ tr rt
t s ở t r r

rt tP tr


Ps tP ữủ
ỏ rt
ữủ s ồ tr ổ trữớ
õ ờ s à
ữủ tr ự P
ỗ rtr tP ợ

ỗ ự P ỗ ự
tr t 0 út ý ừ 0
P sỷ ử tr ự ữủ tờ
0 0 s õ ỷ ỵ
ủ ổ t rst s r
0 út ỳ 0
ỗ ữủ t tr tỹ t ừ
s tP
r tỹ
ữủ ổ ỏút tr ổ
ỗ ữ s
trữớ õ ờ s à
tP
ự P t t 600

ổ Pt tr




rữớ ồ ổ P ỗ



tớ ự ớ t ở ổ
0

tr t t t s rt
tr t t ừ rt ữủ
ú tổ t t tr

st r s P
s ự ổ ự r
õ t ữủ ỷ ỵ sõ s
t số tr út r
s õ ữủ t
ỏút út ữủ t
tr tr P
Prt s õ ữủ t s ữỡ
s ỵ ỹ sỷ ử t
Pr Prt tr t s õ
ữủ rỷ t


P ự str t
rt t ữủ s t s ữủ
t tr r s
õ ữủ s trs
tố sr ttrs
rs t t tr ớ
ự rt s ữủ ừ tr
sỳ s tr ớ t t ở
ỏ s ữủ ừ ợ ự
t sỡ ừ P ợ t
tPstr t
t rt
t 0 q rỷ ợ
rỷ P P
ữủ ừ ợ ự t tự
rsrs rs sr rt t
rs ợ t

t t ở ỏ ớ ữủ rỷ
ợ rỷ tố
ở trt
ồ t q

t
t q t ỏ tP

t q P tP tứ

tờ số ừ P t
t ố ự P s
P tP

P t ữủ
õ ở tố P t q t
ú tổ ữủ tr tỹ õ
tữợ tữỡ ữỡ tữợ ừ tP
ữ õ t ú tổ
t ổ tP
P t ữủ s õ ữủ t
ỏ ợ tr t q tr s
tP ỗ tP
P t ú tổ
t ữủ t q ữỡ t
ợ tP ữủ t
t t s ỷ tr tỹ t q
t ú tổ t ữủ tr tỹ tữỡ
ỗ ợ tr tỹ ố õ tP
ữ ú tổ t ỏ t ổ

tP tứ P t

tP s õ ữủ t tứ
tr tr
ữủ rt ừ P
trữợ t ú tổ õ ữủ tr tỹ ồ tr ổ trữớ ự
õ tr tỹ rt tP ữủ à ữủ s ồ ự P
tt õ tr tỹ t tứ ợ ỗ rtr tP t q
ừ P rt ữủ t t ú tổ t
ự P tứ tờ số ừ ữủ ỳ ữỡ t ợ


ổ Pt tr




rữớ ồ ổ P ỗ

ró t tữỡ ữỡ tữợ ừ
tP ữ ú tổ t ỏ ữủ
tP tr tr
Ps tứ ỳ ữỡ t ữủ
tr sỹ
tỗ t q ớ
t tr ổ trữớ t ự
à 0 t q tr
P t s
tP ờ tỗ t q
t q P tr tP ữ ú tổ t ỏ t

tr s t ổ tP tr s
ố ự s ờ tỗ t
tP
q t tr

t q rt tP

tP
ữủ ổ 0 t t ở
t ữủ ự ợ P
t ỗ ở t 0 tr ớ
t q tr rt tP
ữủ t ữ

P tr tP tr

s tr
t ố ự ữỡ ợ ổ
s tP ố ự


rt tP tr



rt ổ
ự ự P ự P
t ự P
t

t q P tr sỹ õ t ừ

s tP s
t ố ự
ữỡ ợ ổ s tP
ố ự
tP t

ổ Pt tr

t q t tP ữủ
tốt ự ợ P
ổ õ sỹ t t ủ ự P
ợ t Prt õ
tữợ tữỡ ữỡ ợ
tữợ rt tP ú tổ tt
ữ tP ữủ t ỏ



rữớ ồ ổ P ỗ



t ổ õ t sỷ ử t
t t s t t

ữủ ừ ợ t 0 tr ớ
stP rt t õ
t ữủ t t rỷ ợ

t q tr t t t s P ự r
rt
ọ rt ổ ố
t s õ ữủ ừ ợ P
t s rt ữủ ỏ ự r tr
t tr t út t s tP tứ t
ự trữợ t r t q P t rt
t t tờ ủ s ữủ r t ữủ s t s ự rt õ
t ổ t ợ tr t tữợ tữỡ ữỡ ợ rt tP
rt ữủ ỏ t t t q t rt tP
tr r trữợ t ữủ t s t ổ t
ữợ t s r ự ở s
ú tổ t ừ s ố t
tP ớ t 0 tr
st r s P
s ự ổ ự r
õ t ữủ ù sõ s
t t t t
t tr P t q t
t rt ừ
tr t t tr
ổ ự r ữ tP
rt ổ ỏ t ú tổ sỷ
ử r ỏ t t rt
t ữợ t s
t t ữỡ s ỵ ỹ sỷ ử
t

t q t s rt tP

t rt rt tờ số ổ
ự rt tờ số ự P r
t s t s

tr rt t s ự
str t

P ố rt tP tr

t t rt rt
tP ổ ự
P rt tP
ự P trữợ t

t ữủ s t
P s ự r


tr rt ữủ t
s õ tr tỹ ừ ở tố
P ổ ú tổ t rt
t s tr r s õ tỹ
ự ợ t ừ ở
tố P tPstr s
t rt ữỡ
t ỳ t rt ữủ
ự ỳ rs ỡ t
t q t t r
t t s t tr ỡ õ ự
ữỡ t ợ t P

ữ rt t s ú
tổ t ữủ rt ừ P
tP ú tổ ố
ổ Pt tr




rữớ ồ ổ P ỗ

q ự ừ tr tỹ
ừ P õ ự
õ ở tốt tr ở
t t tr
ự ú tổ t ỏ
t s tr tỹ tứ t
ừ rt P t q
t ú tổ tờ ủ t s ữủ
rt tP ỡ s ú tổ
t ự t t t
t tờ ủ ỏ tử t trũ tr
ủ

t

t q str t ừ rt t

s ợ t P tPstr
s t rt
t rt r

t tP rt t s ụ t
tr ừ tP

ú tổ t ỏ t s
t ổ rt t tờ ủ tP
tr tỹ rt tứ t
ừ ở tố P t P
t q t ổ ữợ ú
tổ t t t tờ ủ ỏ
tử t trũ tr ủ


ú tổ tt t ỗ
ỵ ợ ở ừ

ớ


ự ữủ ữỡ tr
ổ
ồ ở ổ Pt
P ở tố ừ P t rt
tr
ổ
tổ
t ỹ tr tr tỹ ừ P
ự ở ỹ ừ P t ụ ữ
t ữợ s t t tờ ủ tứ ở tố rs
t Prt P ỗ rtrsts strss
t r t ởt

t rt rs trr s
qs
ở tố tỷ rt
t ỗ P tr tứ t
strss
ũ t tử t
s s ss s r
ở tố t t ừ P õ
t trtt srs s tr
ssrtt t t rst r
trỏ tữỡ t sỷ ờ rt tr t
tr t
ở t t ừ s t
t
r r P r
t tờ ủ ỹ tr ở tố P õ
ự tốt t ỡ s ợ
t r t ss
t t q ự ừ ởt số t
trữợ t rt t tờ ủ t r
tứ P t r t
tr t t
t t

ổ Pt tr

s st
tr sss s trr r

r rr
ssts
t r r tr s Pstr
t sts r s trr
r




❚r÷í♥❣ ✣↕✐ ❤å❝ ◆æ♥❣ ▲➙♠ ❚P✳ ❍ç ❈❤➼ ▼✐♥❤

✻✾

❍♦❛♥❣✱ ❍✳ ❉✳ ✭✷✵✵✹✮✳ ❙t✉❞② ❡♣✐❞❡♠✐♦❧♦❣✐❝❛❧ ❝❤❛r❛❝t❡r✲
✐st✐❝s ❛♥❞ ❢❛❝t♦rs ✐♥❢❧✉❡♥❝✐♥❣ ♣❛st❡✉r❡❧❧♦s✐s ✐♥ ❜✉❢✲
❢❛❧♦❡s✱ ❛♥❞ ❝♦✇s ✐♥ ❇❛❝ ●✐❛♥❣ ✭✶✾✾✺✲✷✵✵✶✮✱ ❛♥❞ s✉❣✲
❣❡st ♣r❡✈❡♥t✐✈❡ ❛♥❞ tr❡❛t♠❡♥t ♠❡❛s✉r❡s✳ ✭❯♥♣✉❜❧✐s❤❡❞
❞♦❝t♦r❛❧ ❞✐ss❡rt❛t✐♦♥✮✳ ❍❛♥♦✐ ❆❣r✐❝✉❧t✉r❡ ❛♥❞ ❋♦r❡str②
❯♥✐✈❡rs✐t②✱ ❍❛ ◆♦✐✱ ❱✐❡t♥❛♠✳

▲❡❡✱ ❑✳ ❊✳✱ ❏❡♦✉♥❣✱ ❍✳ ❨✳✱ ▲❡❡✱ ❏✳ ❨✳✱ ▲❡❡✱ ▼✳ ❍✳✱ ❈❤♦✐✱ ❍✳
❲✳✱ ❈❤❛♥❣✱ ❑✳ ❙✳✱ ❖❤✱ ❨✳ ❍✳✱ ✫ ❆♥✱ ❉✳ ❏✳ ✭✷✵✶✷✮✳ P❤❡✲
♥♦t②♣✐❝ ❝❤❛r❛❝t❡r✐③❛t✐♦♥ ❛♥❞ r❛♥❞♦♠ ❛♠♣❧✐❢✐❡❞ ♣♦❧②✲
♠♦r♣❤✐❝ ❉◆❆ ✭❘❆P❉✮ ❛♥❛❧②s✐s ♦❢ P❛st❡✉r❡❧❧❛ ♠✉❧✲
t♦❝✐❞❛ ✐s♦❧❛t❡❞ ❢r♦♠ ❑♦r❡❛♥ P✐❣s✳ ❇❛❝t❡r✐♦❧♦❣② ✼✹✭✺✮✱
✺✻✼✲✺✼✸✳

❍✉ss❛✐♥✐✱ ❏✳✱ ❆❜❞✉❧❧❛❤✐✱ ▼✳ ❆✳✱ ✫ ■s♠❛✐❧✱ ❙✳ ✭✷✵✶✷✮✳
❊①♣r❡ss✐♦♥ ❛♥❞ ✐♠♠✉♥♦❣❡♥✐❝✐t② ❞❡t❡r♠✐♥❛t✐♦♥ ♦❢r❡✲
❝♦♠❜✐♥❛♥t ❝❧♦♥❡ ♦❢ P❛st❡✉r❡❧❧❛ ♠✉❧t♦❝✐❞❛ s❡r♦t②♣❡ ❇

❛❣❛✐♥st ❍❛❡♠♦rr❤❛❣✐❝ s❡♣t✐❝❛❡♠✐❛ ✿ ❚♦✇❛r❞s ❛ ✈❛❝❝✐♥❡
❞❡✈❡❧♦♣♠❡♥t✳ ❏♦✉r♥❛❧ ♦❢ ❆♥✐♠❛❧ ❛♥❞ ❱❡t❡r✐♥❛r② ❆❞✲
✈❛♥❝❡s ✶✶ ✭✸✮✱ ✸✺✶✲✸✺✻✳

▲✐❛♦✱ ❈✳ ▼✳✱ ❍✉❛♥❣✱ ❈✳✱ ❍s✉❛♥✱ ❙✳ ▲✳✱ ❈❤❡♥✱ ❩✳ ❲✳✱ ▲❡❡✱
❲✳ ❈✳✱ ▲✐✉✱ ❈✳ ■✳✱ ❲✐♥t♦♥✱ ❏✳ ❘✳✱ ✫ ❈❤✐❡♥✱ ▼✳ ❙✳ ✭✷✵✵✻✮✳
■♠♠✉♥♦❣❡♥✐❝✐t② ❛♥❞ ❡❢❢✐❝❛❝② ♦❢ t❤r❡❡ r❡❝♦♠❜✐♥❛♥t s✉❜✲
✉♥✐t P❛st❡✉r❡❧❧❛ ♠✉❧t♦❝✐❞❛ t♦①✐♥ ✈❛❝❝✐♥❡s ❛❣❛✐♥st ♣r♦✲
❣r❡ss✐✈❡ ❛tr♦♣❤✐❝ r❤✐♥✐t✐s ✐♥ ♣✐❣s✳ ❱❛❝❝✐♥❡ ✷✹✭✶✮✱ ✷✼✲✸✺✳

❍✉ss❛✐♥✐✱ ❏✳✱ ◆❛③♠✉❧✱ ▼✳ ❍✳ ▼✳✱ ❆❜❞✉❧❧❛❤✱ ▼✳ ❆✳✱ ✫
■s♠❛✐❧ ❙✳ ✭✷✵✶✶✮✳ ❘❡❝♦♠❜✐♥❛♥t ❝❧♦♥❡ ❆❇❆✸✾✷ ♣r♦✲
t❡❝ts ❧❛❜♦r❛t♦r② ❛♥✐♠❛❧s ❢r♦♠ P❛st❡✉r❡❧❧❛ ♠✉❧t♦❝✐❞❛
s❡r♦t②♣❡ ❇✳ ❆❢r✐❝❛♥ ❏♦✉r♥❛❧ ▼✐❝r♦❜✐♦❧♦❣② ❘❡s❡❛r❝❤ ✺✱
✷✺✾✻✲✷✺✾✾✳

◆❣✉②❡♥✱ ❉✳ ❚✳ ❑✳ ✭✷✵✶✵✮✳ ❉❡t❡r♠✐♥❛t✐♦♥ ♦❢ P❛st❡✉r❡❧❧❛
♠✉❧t♦❝✐❞❛ ❝❛✉s✐♥❣ ♣❛st❡✉r❡❧❧♦s✐s ✐♥ ❜✉❢❢❛❧♦❡s✱ ❝♦✇s ✐♥
❍❛ ●✐❛♥❣✱ ❈❛♦ ❇❛♥❣✱ ❛♥❞ ✐♥✐t✐❛❧ t❡sts ♦❢ ❛✉t♦✈❛❝❝✐♥❡✳
✭❯♥♣✉❜❧✐s❤❡❞ ♠❛st❡r✬s t❤❡s✐s✮✳ ❚❤❛✐ ◆❣✉②❡♥ ❯♥✐✈❡r✲
s✐t②✱ ❚❤❛✐ ◆❣✉②❡♥✱ ❱✐❡t♥❛♠✳

❑✐♠✱ ❚✳ ❏✳✱ ▲❡❡✱ ❏✳ ■✳✱ ✫ ▲❡❡✱ ❇✳ ❏✳ ✭✷✵✵✻✮✳ ❉❡✈❡❧♦♣♠❡♥t
♦❢ ❛ P▼❚ ●❡♥❡ ❑♥♦❝❦✲♦✉t ▼✉t❛♥t ♦❢ P❛st❡✉r❡❧❧❛ ♠✉❧✲
t♦❝✐❞❛ ❛♥❞ ❡✈❛❧✉❛t✐♦♥ ♦❢ ✐ts ♣r♦t❡❝t✐✈❡ ❡❢❢❡❝ts✳ ❏♦✉r♥❛❧
♦❢ ▼✐❝r♦❜✐♦❧♦❣② ✹✹✭✸✮✱ ✸✷✵✲✸✷✻✳

☎
☎
❖❦❛②✱ ❙✳✱ ❖③❝❡♥❣✐③✱

❊✳✱ ●✉rs❡❧✱ ■✳✱ ✫ ❖③❝❡♥❣✐③✱
●✳ ✭✷✵✶✷✮✳
■♠♠✉♥♦❣❡♥✐❝✐t② ❛♥❞ ♣r♦t❡❝t✐✈❡ ❡❢❢✐❝❛❝② ♦❢ t❤❡ r❡❝♦♠✲
❜✐♥❛♥t P❛st❡✉r❡❧❧❛ ❧✐♣♦♣r♦t❡✐♥ ❊ ❛♥❞ ♦✉t❡r ♠❡♠❜r❛♥❡
♣r♦t❡✐♥ ❍ ❢r♦♠ P❛st❡✉r❡❧❧❛ ♠✉❧t♦❝✐❞❛ ❆✿ ✸ ✐♥ ♠✐❝❡✳
❘❡s❡❛r❝❤ ■♥ ❱❡t❡r✐♥❛r② ❙❝✐❡♥❝❡ ✾✸✱ ✶✷✻✶✲✶✷✻✺✳

▲❡✱ ◆✳ ❱✳ ✭✷✵✶✺✮✳ ❉✐s❡❛s❡s ✐♥ ❱✐❡t♥❛♠ s✇✐♥❡s✿ ❊❢❢❡❝t✐✈❡
tr❡❛t♠❡♥t ♠❡❛s✉r❡s✳ ❍♦ ❈❤✐ ▼✐♥❤ ❈✐t②✱ ❱✐❡t♥❛♠✿ ❆❣r✐✲
❝✉❧t✉r❛❧ P✉❜❧✐s❤✐♥❣ ❍♦✉s❡✳

P❤❛♥✱ P✳ ❚✳ ✭✷✵✵✵✮✳ P❛st❡✉r❡❧❧♦s✐s ♦❢ ❛♥✐♠❛❧ ❛♥❞ ♣♦✉❧✲
tr② ❛♥❞ ✐ts ❝♦♥tr♦❧ ♠❡❛s✉r❡s✳ ❱❡t❡r✐♥❛r② ❙❝✐❡♥❝❡s ❛♥❞
❚❡❝❤♥✐q✉❡s ✼✭✷✮✱ ✼✽✲✽✻✳

▲❡❡✱ ❏✳✱ ✫ ❲♦♦ ❍✳ ❏✳ ✭✷✵✶✵✮✳ ❆♥t✐❣❡♥✐❝✐t② ♦❢ P❛rt✐❛❧
❋r❛❣♠❡♥ts ♦❢ ❘❡❝♦♠❜✐♥❛♥t P❛st❡✉r❡❧❧❛ ♠✉❧t♦❝✐❞❛
❚♦①✐♥✳ ❏♦✉r♥❛❧ ♦❢ ▼✐❝r♦❜✐♦❧♦❣② ❛♥❞ ❇✐♦t❡❝❤♥♦❧♦❣②
✷✵✭✶✷✮✱ ✶✼✺✻✲✶✼✻✸✳

◗✉r❡s❤✐✱ ❙✳✱ ✫ ❙❛①❡♥❛✱ ❍✳ ▼✳ ✭✷✵✶✹✮✳ ❊st✐♠❛t✐♦♥ ♦❢ t✐t❡rs
♦❢ ❛♥t✐❜♦❞② ❛❣❛✐♥st P❛st❡✉r❡❧❧❛ ♠✉❧t♦❝✐❞❛ ✐♥ ❝❛tt❧❡
✈❛❝❝✐♥❛t❡❞ ✇✐t❤ ❤❛❡♠♦rr❤❛❣✐❝ s❡♣t✐❝❡♠✐❛ ❛❧✉♠ ♣r❡❝✐♣✲
✐t❛t❡❞ ✈❛❝❝✐♥❡✳ ❱❡t❡r✐♥❛r② ❲♦r❧❞ ✼✭✹✮✱ ✷✷✹✲✷✷✽✳

✇✇✇✳❥❛❞✳❤❝♠✉❛❢✳❡❞✉✳✈♥

❚↕♣ ❝❤➼ ◆æ♥❣ ♥❣❤✐➺♣ ✈➔ P❤→t tr✐➸♥ ✶✽✭✺✮