Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

PHẠM VĂN SƠN

NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM
SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ
CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
Mã số : 9.64.01.02

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI, 2018


Công trình được hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Người hướng dẫn khoa học:

Phản biện 1:

1. PGS. TS. Nguyễn Bá Hiên
2. TS. Nguyễn Văn Cảm

GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên
Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên

Phản biện 2:

GS.TS. Lê Thanh Hòa
Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 3:

PGS. TS. Phạm Công Hoạt
Bộ Khoa học và Công nghệ

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp
Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi 08h0 ngày 28 tháng 12 năm 2018

Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome – PRRS) hay bệnh tai xanh được đặc trưng bởi những rối loạn
sinh sản của lợn nái và những vấn đề về đường hô hấp ở lợn con và lợn trưởng thành
(Meulenberg et al., 1993). Bệnh gây ra bởi virus PRRS, thuộc bộ Nidovirales, họ
Arteriviridae, chi Arterivirus (Cavanagh, 1997). Virus PRRS được nhóm thành hai kiểu
gen, châu Âu (type 1) và Bắc Mỹ (type 2), các dấu hiệu lâm sàng của nhiễm trùng đều
giống nhau, nhưng các chủng phân lập lại khác nhau về độc lực ở động vật nhiễm bệnh
(Halbur et al., 1995b) và khác nhau về đặc tính kháng nguyên, di truyền (Meng, 2000;
Nelsen et al., 1999; Nelson et al., 1993). Dịch PRRS xuất hiện ở hầu hết các khu vực
chăn nuôi lợn quy mô lớn trên khắp thế giới. Tổn thất hàng năm cho ngành chăn nuôi

lợn ở Hoa Kỳ do PRRSV gây ra ước tính khoảng 664 triệu USD (Holtkamp et al.,
2013). Đối với lợn nái, bệnh gây hậu quả nghiêm trọng như: lợn con sơ sinh yếu ớt,
giảm số con sơ sinh sống sót/ổ, tình trạng bệnh âm ỉ, rối loạn sinh sản, động dục kéo
dài, chậm động dục trở lại. Đối với đực giống, số lượng tinh dịch giảm, chất lượng tinh
dịch kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con (Pejsak et al., 1997).
Kháng thể kháng PRRSV lần đầu tiên được phát hiện ở Việt Nam năm 1997 trên một
đàn lợn nhập từ Mỹ. Từ năm 2007 đến nay, PRRS liên tục xảy ra và bùng phát ở rộng
khắp các tỉnh thành trong cả nước gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi. Tình hình
PRRS ngày càng phức tạp đòi hỏi sự chủ động trong phòng chống dịch, trong đó
phương pháp phòng PRRS hiệu quả nhất là sử dụng vacxin. Tuy nhiên, sự đa dạng di
truyền và thay đổi kháng nguyên của các chủng PRRSV là một trở ngại lớn trong việc
phát triển một loại vacxin có hiệu quả để kiểm soát PRRS. Các vacxin sống đã được sử
dụng phổ biến để kiểm soát PRRS vì chúng có khả năng bảo vệ tốt hơn so với vacxin
đã vô hoạt hoặc các vacxin tái tổ hợp (Charerntantanakul, 2012; Hu and Zhang, 2014;
Kim et al., 2011; Zuckermann et al., 2007). Nhưng ngày càng có nhiều quan ngại về sự
an toàn của việc sử dụng vacxin sống vì sự hồi phục nhanh chóng độc lực của PRRSV
trong quá trình sao chép ở lợn (Hu and Zhang, 2014; Mengeling et al., 2003; Pejsak et
al., 1997). Hiện nay, trước tình hình nước ta đang phải tốn rất nhiều chi phí cho các loại
vacxin ngoại nhập mà hiệu quả phòng bệnh chưa được như mong muốn. Nhằm chủ
động trong nguồn cung cấp vacxin hiệu quả cao, an toàn và giảm chi phí nhập khẩu
vacxin, thì việc sản xuất được vacxin vô hoạt từ chủng virus PRRS phân lập tại Việt
Nam là việc làm cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao. Để sản xuất được vacxin hiệu
quả cần phải có chủng giống gốc đại diện cho các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt
Nam, do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này. Với mục tiêu lựa chọn được giống
gốc, sản xuất được vacxin vô hoạt PRRS đạt tiêu chí an toàn, có hiệu lực cao để phòng
bệnh cho lợn.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
1.2.1. Mục tiêu chung
Sản xuất được vacxin vô hoạt PRRS có hiệu quả từ chủng virus phân lập tại Việt Nam.
1

1.2.2. Mục tiêu cụ thể
Tuyển chọn được chủng virus PRRS phân lập từ lợn mắc PRRS ở Việt Nam, sử
dụng làm giống gốc phục vụ sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS.
Sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc PRRS được
tuyển chọn. Vacxin vô hoạt PRRS nghiên cứu sản xuất ra đạt các tiêu chí về vô trùng,
thuần khiết, an toàn và hiệu lực.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng virus PRRS cường độc phân lập từ lợn mắc PRRSở Việt Nam.
1.3.2. Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi về không gian nghiên cứu: Các chủng virus PRRS được phân lập từ lợn
mắc PRRS thu thập tại các tỉnh: Hà Nội, Thái Bình, Nam Định, Hưng Yên, Ninh Bình,
Thanh Hóa, Nghệ An, TP Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Cần Thơ.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y và
phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông
nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện từ 2014-2017
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài lần đầu tiên tuyển chọn được chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam để
làm giống gốc sử dụng cho sản xuất vacxin vô hoạt phòng PRRS cho lợn. Giống gốc
PRRS được thẩm định tại cơ quan thú y có thẩm quyền và đạt các tiêu chí vô trùng,
thuần khiết, có hiệu giá cao, có khả năng kích thích miễn dịch tốt, kháng thể do vacxin
tạo ra có thể trung hòa được các chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam.
Đề tài của luận án đã đưa ra được một quy trình phân lập, sàng lọc và tuyển chọn
giống gốc. Trên cơ sở này, có thể áp dụng để tạo ra một chủng Master seed mới thay thế
những chủng cũ không còn đáp ứng tính tương đồng kháng nguyên.
Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ chủng
virus thực địa, đây là vacxin vô hoạt đầu tiên về PRRS của Việt Nam được nghiên

cứu sản xuất. Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt PRRS có thể chuyển giao để sản xuất
vacxin phòng PRRS cho đàn lợn, giúp người chăn nuôi giảm thiệt hại kinh tế do
PRRS gây ra.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Những kỹ thuật, quy trình được áp dụng trong đề tài góp phần nâng cao năng lực
nghiên cứu cho người làm trong lĩnh vực thú y. Các kết quả nghiên cứu phản ảnh đầy
đủ về đặc điểm sinh học, sinh học phân tử, đặc tính kháng nguyên và tính sinh miễn
dịch của các chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam. Cung cấp các thông tin
tham khảo, tham chiếu cho các nhà khoa học nghiên cứu về virus PRRS ở Việt Nam
cũng như trên thế giới.

2


1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Giống gốc được tuyển chọn là chủng virus PRRS đại diện cho các chủng virus
đang lưu hành ở Việt Nam có thể sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng, đa dòng,
phục vụ sản xuất kháng thể trị bệnh cũng như kháng thể trong chẩn đoán bệnh. Giống
gốc có thể sử dụng để sản xuất kháng nguyên trong chế tạo Kít ELISA chẩn đoán bệnh,
Kít phát hiện nhanh bệnh, góp phần vào công cuộc phòng và chống PRRS cho toàn
ngành chăn nuôi.
Đề tài đã nghiên cứu sản xuất thành công vacxin vô hoạt PRRS đạt các chỉ tiêu về
vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực, đây là cơ sở quan trọng để ứng dụng nghiên
cứu sản xuất các loại vacxin virus khác giúp nâng cao năng lực sản xuất vacxin vật nuôi
của ngành Thú y nước nhà, hạn chế nhập khẩu vacxin.
Vacxin vô hoạt PRRS có thể chuyển giao sản xuất trên quy mô công nghiệp, tạo
ra một vacxin có hiệu quả và rẻ so với các vacxin nhập ngoại trên thị trường, góp
phần khống chế dịch bệnh, giảm thiệt hại cho ngành chăn nuôi.
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. LỊCH SỬ VÀ TÌNH HÌNH DỊCH PRRS Ở LỢN
2.1.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ vào
năm 1987 với tên là "bệnh bí hiểm" (Mystery swine disease) bởi tính tự nhiên khó hiểu
của bệnh nguyên. Hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St. Paul, Minnesota đã
nhất trí dùng tên PRRS và đã được Tổ chức Thú y thế giới công nhận chính thức gọi là
"Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn" (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome-PRRS), căn nguyên bệnh được gọi là virus gây hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus PRRSV).
2.1.2. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam
Lần đầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, kháng thể kháng PRRSV được phát hiện
trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam. Kết quả kiểm tra thấy, 10/51 lợn
giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS. Toàn bộ số lợn này đã được xử
lý vào thời gian đó. Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh trên
những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính
với bệnh rất khác nhau từ 1,3% cho tới 68,29% (Cục Thú y, 2008).
2.2. CĂN BỆNH
2.2.1. Cấu trúc virus PRRS
Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) thuộc chi Arterivirus,
họ Arteriviridae, bộ Nidovirales. Hạt virus thường có hình oval với đường kính xấp xỉ
60nm và bề mặt có gai được cấu tạo từ phức hợp protein màng. Virus PRRS là virus sợi
đơn dương với kích thước phân tử 15,1- 15,5 kb (Dokland, 2010). Genome của virus
PRRS có kích thước khoảng 15kb, gồm ít nhất 10 khung đọc mở ORF (open reading
frames): ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF5a, ORF6, ORF7
mã hóa cho các protein cấu trúc và phi cấu trúc.

3


2.2.2. Phân loại virus PRRS

Hiện nay, PRRSV đã được xác lập với 2 kiểu gen chính là kiểu gen có nguồn gốc
từ châu Âu (EU) và kiểu gen có nguồn gốc từ Bắc Mỹ (NA). Việc so sánh chuỗi gen đã
cho thấy sự khác biệt di truyền quan trọng giữa 2 nhóm này.
2.2.3. Khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus PRRS
Về mặt độc lực, người ta thấy PRRSV tồn tại dưới 2 dạng:
▪ Dạng cổ điển: có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì tỷ lệ chết thấp,
chỉ từ 1% - 5% trong tổng đàn.
▪ Dạng biến thể độc lực cao: gây nhiễm và chết nhiều lợn.
2.3. TRUYỀN NHIỄM HỌC
2.3.1. Loài vật mắc bệnh
Lợn ở mọi lứa tuổi, người và các động vật khác không mắc bệnh, tuy nhiên trong
các loài thuỷ cầm chân màng, vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm với virus.
2.3.2. Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây
Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn ốm, hoặc mang trùng
và phát tán ra môi trường. Tinh dịch của lợn đực giống cũng được xác định là nguồn
phát tán mầm bệnh.
2.3.3. Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây và đáp ứng miễn dịch
2.3.3.1. Cơ chế sinh bệnh
Virus có ái lực cao với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào phế nang. Vì vậy,
virus nhân lên trong đại thực bào, sau đó giết chết đại thực bào. Có tới 40% đại thực
bào bị phá hủy. PRRSV loại bỏ phần lớn cơ chế bảo vệ của cơ thể, cho phép vi khuẩn,
virus khác tăng sinh và gây hại.
2.3.3.2. Phương thức truyền lây
Bệnh có thể lây lan trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn ốm, lợn mang trùng
với lợn khoẻ và có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian bị nhiễm virus như:
dụng cụ, thiết bị chăn nuôi; các phương tiện vận chuyển; các loài côn trùng; các loài có
vú khác và gia cầm (Tô Long Thành, 2007).
2.3.3.3. Đáp ứng miễn dịch
Về khả năng bảo hộ chéo của các type PRRSV vacxin với các type PRRSV khác
cũng còn nhiều ý kiến chưa thống nhất. Kovacs and Schagemann (2003) báo cáo rằng

vacxin sống Ingelvac- PRRS MLV (chủng Bắc Mỹ) có khả năng bảo hộ chéo khi công
cường độc bằng virus PRRS chủng châu Âu. Tài liệu hướng dẫn sử dụng vacxin JXA1R (Ngô Thanh Long, 2011) cũng cho biết, vacxin này (chứa virus Bắc Mỹ biến đổi) có
khả năng bảo hộ lợn phòng PRRS do chủng Bắc Mỹ cổ điển gây ra.
2.4. TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH
2.4.1. Triệu chứng lâm sàng
Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS rất thay đổi và phụ thuộc vào chủng
virus, trạng thái miễn dịch của đàn, điều kiện quản lý chăm sóc. Thời gian nung bệnh từ
3-5 ngày. Các dấu hiệu đầu tiên là bỏ ăn, sốt, xanh da. Các triệu chứng tiếp theo tùy
thuộc vào tuổi lợn và giai đoạn mang thai (Tô Long Thành, 2007).
4


2.4.2. Bệnh tích
Bệnh tích biến đổi chủ yếu ở phổi. Thuỳ phổi bị bệnh màu đỏ xám, có mủ và đặc
chắc (nhục hoá). Bề mặt cắt ngang của thuỳ phổi lồi ra, khô và xuất hiện những nốt loét
trên các cơ quan nội tạng (Lê Văn Năm, 2007).
2.5. CHẨN ĐOÁN VÀ PHÒNG TRỊ BỆNH
2.5.1. Chẩn đoán
2.5.1.1. Chẩn đoán lâm sàng
Chẩn đoán lâm sàng dựa vào hai nhóm triệu chứng:
+ Triệu chứng đường sinh sản: Trong giai đoạn đầu của ổ dịch có thể thấy hiện
tượng sảy thai ở cuối thời kỳ mang thai, lợn nái đẻ non, thai yếu, thai chết lưu hoặc thai
gỗ, lợn con đẻ ra yếu, lợn chết trước khi cai sữa.
+ Triệu chứng đường hô hấp: Lợn có triệu chứng viêm phổi và lây lan rất nhanh
trong đàn.
2.5.1.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
+ Phân lập virus trên một số tế bào: Tế bào phế nang của lợn, tế bào MA- 104,
CL 2621, CRL-17171, MARC-145 ...
+ Phương pháp bệnh lý miễn dịch.
+ Phương pháp huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng nguyên.

+ Phương pháp nhân gen (PCR).
+ Phương pháp lai phân tử tại chỗ (institu hybridization).
- Giải trình tự gen NSP2 và ORF5 của PRRSV.
- Gây bệnh thực nghiệm: Sử dụng lợn con 21 ngày tuổi trong cùng một đàn;
không mang PRRSV (PRRSV-Ag) và không có kháng thể PRRSV (PRRSV-Ab); tiêm
cơ 0,5 ml/con; nhỏ mũi 1 ml/con.
2.5.2. Các biện pháp phòng trị bệnh
2.5.2.1. Điều trị PRRS
Hiện nay chưa có thuốc đặc trị với PRRS, để làm giảm thiệt hại của bệnh, chủ
yếu theo hướng nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi, chữa các triệu chứng lâm sàng,
giảm nhẹ và tập trung vào điều trị các bệnh kế phát.
2.5.2.2. Một số chế phẩm vacxin PRRS được dùng để phòng bệnh hiện nay
Hiện nay, tại Việt Nam có 8 loại vacxin PRRS đã và đang được phép lưu hành.
2.6. GIỐNG GỐC TRONG SẢN XUẤT VACXIN
2.6.1. Định nghĩa
Giống gốc (Master seed - MS) là một lượng virrus cụ thể đủ lớn mà sự thuần
khiết, an toàn và tính kháng nguyên của chính cũng như của các thế hệ sau đã được thử
nghiệm, chứng minh và được dùng làm giống để chế tạo vacxin.

5


2.6.2. Cách chế tạo giống gốc
Việc chế tạo giống gốc tùy thuộc vào từng loại virus, cách quản lý của mỗi quốc
gia, phương pháp chế tạo vacxin và sự sáng tạo của các nhà khoa học. Về lý thuyết, bất
kỳ virus nào cũng có thể dùng để chế tạo giống gốc.
2.6.3. Cách quản lý giống gốc
Các nước phương Tây đi đầu trong việc đưa ra khái niệm giống gốc và quản lý
giống gốc. Việc này bắt nguồn từ phương pháp quản lý trên căn bản của sở hữu tư nhân
và kéo theo nó là việc đăng ký bản quyền. Nói cách khác, việc sản xuất vacxin là của

các hãng tư nhân và chính họ đòi hỏi nhà nước sự bảo hộ bản quyền cho họ.
2.6.4. Các phương pháp bảo quản giống gốc PRRSV trong phòng thí nghiệm
2.6.4.1. Phương pháp cấy chuyển virus PRRS liên tục trên tế bào MARC-145
Virus PRRS rất thích hợp phát triển trên tế bào MARC-145, sau khi cấy chuyển
có thể bảo quản ở nhiệt độ thích hợp. Phương pháp này chỉ được lặp lại trong thời hạn
nhất định, thường được áp dụng trong các trường hợp dùng liên tục virus PRRS để
nghiên cứu và làm thí nghiệm (thường chỉ cấy chuyển 4 đời sau đó sẽ chuyển thành
giống sản xuất - working seed).
2.6.4.2. Phương pháp đông khô virus
Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh
vật khác nhau trong đó có virus PRRS.
2.6.4.3. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp
Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng mẫu lớn.
Thông thường theo phương pháp này, virus có thể được bảo quản từ 10-20 năm.
2.6.4.4. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì virus được bảo quản trong môi
trường dịch thể ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80°C).
2.7. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACXIN PHÒNG PRRS
2.7.1. Sản xuất vacxin bằng phương pháp vô hoạt virus
Vacxin vô hoạt thường được sử dụng nhằm phòng chống bệnh tai xanh ở các đàn
lợn nái, hoặc ở các trại lợn chưa từng xuất hiện bệnh tai xanh. Việc sản xuất vacxin vô
hoạt được thực hiện bằng cách phân lập và nuôi cấy các chủng PRRSV thực địa trong
môi trường tế bào và tiến hành vô hoạt chúng bằng một số chất vô hoạt như BEI,
formaline hoặc β propiolactone .
2.7.2. Sản xuất vacxin bằng phương pháp nhược độc virus trên môi trường tế bào
Về nguyên lý chung, để tạo được chủng virus PRRS nhược độc dùng làm
vacxin, các chủng virus PRRS cường độc được cấy truyền nhiều đời trên môi trường
tế bào. Cụ thể, để làm chủng virus PRRS cường độc thành chủng virus PRRS nhược
độc, công ty Boehringer–Ingelheim Corp đã cấy truyền 37 đời, công ty Hippra Corp
đã cấy truyền 20 đời.

6


2.7.3. Phương pháp sản xuất vacxin thế hệ mới
Vacxin DNA, sử dụng các khung đọc mở, từ ORF1 cho đến ORF7 để chế tạo
vacxin. Vacxin dưới đơn vị (subunit): dùng protein của virus để chế vacxin, ví dụ như
dùng GP5. Vacxin peptide tổng hợp: GP5.Vacxin vector: dùng nhiều loại virus, vi khuẩn
làm vector tái tổ hợp. Tất cả các vacxin thử nghiệm này đều không cho kết quả vượt trội
nào, đều chưa đạt được mục tiêu phòng bệnh của một vacxin.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, phòng thí nghiệm bộ môn
Vi sinh vật truyền nhiễm, Khu nuôi động vật thí nghiệm - Khoa Thú y - Học viện Nông
nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu từ năm 2014 đến năm 2017.
3.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Lợn nghi mắc PRRS, các chủng virus PRRS cường độc phân lập từ các lợn mắc
PRRS ở Việt Nam.
3.2.2. Vật liệu nghiên cứu
Máy móc, thiết bị được sử dụng trong đề tài : Box an toàn sinh học Cấp II (Esco), tủ
ấm CO2 (Memmert), kính hiển vi soi ngược (Leica), máy PCR (Biorad), máy giải trình tự
gen (Backman Counter), máy điện di, máy votex (IKa), máy ly tâm (eppendorf), tủ -80oC
(Sanyo), máy đồng hóa tạo nhũ, hệ thống Bioreactor, máy lọc tiếp tuyến, máy đọc
ELISA (Bioteck), kính hiển vi thường (Zeiss).
Dụng cụ: Pipet (Eppendorf), đầu típ các loại (Corning), bình nuôi cấy tế bào T25,
T75, T225 (Corning), màng lọc (corning), khay 96 (Corning), ống eppendorf, ống ly tâm
15ml, 50ml (corning), bơm tiêm, găng tay, khẩu trang.
Hóa chất: môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (Gibco), tế bào dòng MARC-145, kít

tách chiết RNA, DNA (Qiagen), Kít PCR/RT-PCR (Invitrogen), kít Realtime - PCR
(Invitrogen), kít giải trình tự gen (Backman Counter), Kít ELISA (Idexx), hóa chất cho
nuôi cấy tế bào, hóa chất cho kỹ thuật IPMA, hóa chất vô hoạt virus (Merk), nhũ dầu
(Seppic).
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn ở những ổ dịch PRRS và thu thập mẫu
- Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV
- Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp mổ khám
Trong nghiên cứu này, quá trình mổ khám được thực hiện theo TCVN 8402:2010.
7


3.4.2. Phương pháp RT – PCR
Quy trình tách chiết RNA của virus dùng KIT của hãng Qiagen. Sản phẩm của
phản ứng RT - PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di. Kết thúc điện di,
bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide hoặc SYBR green trong khoảng 5 đến 7
phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả
điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc
nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.4.3. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể, lấy mẫu ngâm trong formol
trung tính 10% để làm tiêu bản vi thể. Cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích
vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng
parafin, nhuộm Haematoxilin - Eosin (HE) của Bộ môn Bệnh lý Thú y.
3.4.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào
Tế bào MARC-145 được nuôi cấy trong môi trường đầy đủ DMEM, 10% FBS.
3.4.5. Phương pháp nhân virus PRRS
Tiến hành nhân virus trên tế bào MARC-145 khi tế bào được nuôi cấy trong bình

nuôi T25 có độ che phủ đáy bình 60 - 70%. Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ và rửa tế
bào 2 lần bằng PBS1X. Bổ sung 0,5ml virus gốc/T25. Ủ virus và tế bào trong 1h ở
370C. Sau khi ủ loại bỏ dịch ủ và bổ sung 5 ml môi trường duy trì DMEM 2% FBS.
Nuôi virus trong tủ ấm 370C, 5% CO2, quan sát biến đổi bệnh tích tế bào MARC-145
dưới kính hiển vi soi ngược sau 24h, 48h, 60h, 72h. Thu virus khi bệnh tích tế bào đạt
80%.
3.4.6. Phương pháp xác định hiệu giá virus
TCID50 được xác định theo phương pháp của Spearman Kaber.
Lg TCID50 = (Xo + d/2) - d × (∑ri/n)
Trong đó: Xo là lg của bậc pha loãng virus cao nhất
d: là lg của bậc pha loãng
ri: là số giếng tế bào âm tính ở mỗi bậc pha loãng
n: là số giếng tế bào được gây nhiễm ở mỗi bậc pha loãng.
3.4.7. Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus
Tế bào MARC-145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5×104 tế bào/giếng)
và được nuôi như mô tả ở trên. Virus PRRS được gây nhiễm lên tế bào ở MOI 0,01.
Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus được hút bỏ và môi
trường nuôi dưỡng được rửa sạch một lần với 0,5ml PBS. Sau đó, dung dịch nuôi
dưỡng thiết yếu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 100µl/giếng. Virus được thu từ
dịch nổi và phần tế bào ở các thời điểm 24, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm virus.
Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng virus. Đường biểu
biễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log của TCID50 tại mỗi thời điểm
thu virus.

8


3.4.8. Phương pháp giải trình tự gen
Sử dụng máy giải trình tự gen tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí
nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y, Học viện Nông

nghiệp Việt Nam. Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động là dựa theo cơ
sở của phương pháp Sanger. Khi sợi DNA được tổng hợp sẽ sử dụng các nucleotide
có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang, các nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm
huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng, trong đó
Adenin cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine
cho màu đen.
3.4.9. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein
Hỗn hợp dịch kháng nguyên thu được để trong khay đá vảy để đảm bảo chất
lượng kháng nguyên, ly tâm ở tốc độ cao 35.000 vòng/4oC/2 giờ để thu cặn virus.
Lấy cặn thu được hoà tan trong PBS 1X được hỗn dịch kháng nguyên. Hỗn dịch
này sẽ được ly tâm tốc độ cao (35.000 vòng/4oC/2 giờ) qua gradient đường với các
nồng độ khác nhau (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%). Thu vạch band xuất hiện sau
khi ly tâm, đây chính là kháng nguyên virus.
3.4.10. Phương pháp gây tối miễn dịch trên chuột
Hỗn hợp kháng nguyên/nhũ dầu với tỷ lệ 1/1,5. Kháng nguyên gốc được pha
trong PBS 1x theo tỷ lệ tùy mẫu kháng nguyên.
Nhũ dầu (Adjuvant) loại complete hoặc incomplete, loại complete dùng cho lần
gây nhiễm virus đầu tiên với từng lô thí nghiệm, loại incomplete thì dùng cho những
lần gây nhiễm tiếp theo (lần 2, lần 3). Tiêm dưới da vùng lưng, hông (đối với chuột
lang) của từng chuột thí nghiệm, phân bố tiêm ở 2, 3 vị trí khác nhau với lượng kháng
nguyên đã chuẩn bị.
Sau khi tiêm thì tiến hành đánh dấu và ghi chép lại để theo dõi. Hai tuần sau, gây
nhiễm lần 2 để tăng cường đáp ứng miễn dịch trên chuột, hai tuần tiếp theo gây nhiễm
lần 3. Cuối cùng sau 2 tuần tiếp thì tiến hành gây mê, lấy máu, thu kháng thể và mổ
khám chuột thí nghiệm.
3.4.11. Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh
pha loãng)
Tiến hành pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 và sử dụng virus trung hòa ở
nồng độ 100TCID50/mL. Huyết thanh đã pha loãng trộn với virus và giữ ở nhiệt độ
phòng trong 30 phút, mỗi độ pha loãng gây nhiễm cho 5 giếng tế bào MARC-145.

Đọc kết quả: hiện tượng trung hòa được xác định theo bệnh tích trên tế bào một lớp
cảm thụ. Virus được trung hòa khi không có bệnh tích tế bào trên tế bào cảm thụ
MARC-145. Virus không được trung hòa khi xuất hiện bệnh tích tế bào trên giếng tế
bào MARC-145.
3.4.12. Phương pháp IPMA
Phát hiện kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh bằng phản ứng kháng nguyên
kháng thể trên môi trường tế bào MARC-145.

9


3.4.13. Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống PRRS (Master seed và Working seed)
Phương pháp kiểm tra
Mỗi mẫu giống gốc hoặc virus được cấy vào các loại môi trường thạch thường,
nước thịt, thạch máu, nước thịt gan yếm khí và thạch nấm. Mỗi loại môi trường cấy 4
ống/mẫu. Đến cuối quá trình theo dõi mà tất cả các ống thử đều trong suốt, mầu sắc
môi trường không đổi, kết quả là âm tính.
3.4.14. Phương pháp kiểm tra thuần khiết của giống (Master seed và Workingseed)
bằng kỹ thuật PCR/RT-PCR
Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện các loại virus Lở mồm long móng,
PCV2, dịch tả lợn, PED, TGE.
3.4.15. Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 trên hệ thống Bioreactor
Virus PRRS được nhân sinh khối lớn trên hệ thống túi nuôi có điều chỉnh nhiệt độ
và tốc độ lắc.
3.4.16. Phương pháp cô đặc virus PRRS bằng máy lọc tiếp tuyến
Virus sau khi được nhân lên với số lượng lớn được cô đặc bằng máy lọc tiếp
tuyến. Sau cô đặc tiến hành xác định lại hiệu giá virus. Mỗi một lần cô đặc có thể lọc
tiếp tuyến tối đa một lít virus, sau khi lọc thu được 500µl virus đã cô đặc và hiệu giá
virus thường tăng 101 so với trước lọc.
3.4.17. Phương pháp vô hoạt virus

Virus vacxin PRRS thu hoạch từ môi trường tế bào Marc 145 được lọc, cô đặc và vô
hoạt bằng formalin ở nồng độ thích hợp nhất. Dung dịch virus sau khi vô hoạt được đánh
giá kết quả vô hoạt theo quy trình kiểm tra sau vô hoạt nêu dưới đây.
3.4.18. Phương pháp kiểm tra sau vô hoạt
Sau khi trung hoà lấy 0,1 ml dung dịch virus đã vô hoạt cấy vào môi trường tế
bào MARC-145, để ở 370C và theo dõi bệnh tích tế bào trong 12h, 24h, 36h, 48h,
60h, 72h. Nếu mẫu dung dịch virus nào có gây bệnh tích tế bào thí có nghĩa là virus
chưa được vô hoạt hoàn toàn cần tiến hành vô hoạt lại. Mẫu nào không gây bệnh tích
tế bào có nghĩa là virus đã được vô hoạt cần lặp lại thí nghiệm lần 2 để có kết luận
chính thức.
3.4.19. Phương pháp nhũ hóa vacxin
Sau khi vô hoạt thành công tiến hành phối trộn hỗn dịch virus đã vô hoạt với chất
bổ trợ. Hỗn dịch virus vacxin được phối trộn với chất bổ trợ theo tỉ lệ 1:1. Đồng hóa
hỗn hợp này trong máy trộn tá dược (máy đồng hóa T18D của hãng IKA) ở 40C trong
thời gian tối thiểu 30 phút. Kiểm tra hỗn hợp vacxin vô hoạt bằng cách để ở 20C -80C
qua đêm. Hỗn hợp đồng nhất, không phân lớp, không lắng cặn không tách nước là đạt
yêu cầu. Nếu hỗn hợp vẫn tách nước và phân lớp thì tiếp tục chạy máy đồng hóa cho
đến khi đạt.
3.4.20. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vacxin
Theo TCVN8684:2011
3.4.21. Kiểm tra chỉ tiêu an toàn
Theo TCVN8684:2011

10


3.4.22. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin
Theo TCVN8684:2011
3.4.23. Phương pháp Realtime RT-PCR
Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR theo TCVN 8400-21:2014.

3.4.24. Phương pháp ELISA
- Các bước tiến hành theo hướng dẫn của bộ Kit
Đọc kết quả:
Kết quả: SP ≥ 0,4: Dương tính
SP < 0,4: Âm tính
3.4.25. Xử lý số liệu
Phân tích xác nhận chuỗi gen thu được thông qua chương trình Blast trên Ngân
hàng gen (GenBank) ( Xác định sự tương đồng về
nucleotide của phân đoạn gen thu được trong nghiên cứu bằng phần mềm Bioedit
Version 7.2.5. Xác định nguồn gốc phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gen của
chủng virus thu nhận được bằng phần mềm MEGA Version 6.0. Các số liệu được xử lý
trên phần mềm Excel 2010.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỂU HIỆN BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC PRRS
4.1.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm
Để phục vụ việc tuyển chọn virus PRRS làm giống sản xuất vacxin, chúng tôi
tiến hành thu thập mẫu lợn nghi mắc PRRS từ thực địa. Kết quả thu được 57 lợn nghi
mắc PRRS. Kết quả cho thấy các nhóm lợn được nghiên cứu đều biểu hiện các triệu
chứng như sốt cao, bỏ ăn, thân ửng đỏ, tiêu chảy, tai thâm tím, chảy nước mũi.
4.1.2. Kết quả chẩn đoán PRRS bằng phương pháp RT-PCR
Từ 57 lợn được thu thập, để khẳng định chính xác lợn mắc PRRS chúng tôi sử
dụng kỹ thuật RT- PCR. Kết quả chẩn đoán PRRS bằng kỹ thuật RT - PCR được trình
bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán PRRS
TT
1
2
3
4
5

Nhóm lợn
Lợn con theo mẹ
Lợn sau cai sữa
Lợn choai
Nái mang thai
Nái nuôi con
Tổng số

Số lượng
(con)

Dương tính
(con)

Tỉ lệ dương tính
(%)

13
10
11
8
15
57

07
06
06
05
09

33

53,8
60,0
54,5
62,5
60,0
57,9

11


Kết quả bảng 4.1 cho thấy, có 33 mẫu lợn thu thập tại địa phương dương tính với
virus PRRS, chiếm tỷ lệ 57,9 %; các mẫu dương tính phân bố ở cả 5 đối tượng lợn.
4.1.3. Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể
Bằng phương pháp mổ khám toàn diện đối với các mẫu lợn thu thập, mô tả và ghi
chép chi tiết từng trường hợp, so sánh với kết quả chẩn đoán RT-PCR, tất cả các trường
hợp dương tính với PRRS đều có các dấu hiệu bệnh tích điển hình giống nhau ở các khí
quan. Kết quả trình bày tại bảng 4.2.
Bảng 4.2. Bệnh tích đại thể ở phổi lợn mắc PRRS
Số con
Số con có
Tỉ lệ
theo dõi
biểu hiện
(%)
1
Viêm màng phổi
33
18

54,5
2
Phổi xuất huyết
33
33
100,0
3
Viêm phổi hóa mủ
33
16
48,5
4
Phổi hoại tử
33
2
6,1
5
Phổi nhục hóa
33
2
6,1
6
Mặt cắt phổi nhớt
33
26
78,8
7
Phổi tụ máu
33
21

63,6
8
Phù phổi
33
5
15,2
9
Phổi có các hạt khác thường
33
0
39,4
10
Hạch phổi có bệnh tích
33
33
0,0
Phổi xuất huyết tạo ra các đám, các mảng loang lổ, hình dạng phổi bẹp áp sát vào
khung sườn, rìa phổi có dịch nhầy đặc giống như đờm, mặt cắt phổi có mủ, nhiều lợn
bệnh có bệnh tích viêm phổi dính sườn.
STT

Bệnh tích

4.1.4. Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể
Nghiên cứu các biến đổi vi thể, nhuộm và đọc tiêu bản trên kính hiển vi, thu được
kết quả trình bày trên bảng 4.3.
Bảng 4.3. Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi và hạch amidan của lợn mắc PRRS
Phổi
Hạch phổi
Hạch amidan

Số
Số
Số
Số
Số
Số
mẫu
mẫu
mẫu
Bệnh tích
mẫu
Tỷ lệ mẫu
Tỷ lệ mẫu
Tỷ lệ
có
có
có
nghiên
(%) nghiên
(%) nghiên
(%)
biểu
biểu
biểu
cứu
cứu
cứu
hiện
hiện
hiện

Sung huyết
33
33 100,0 33
33 100,0 33
15 45,5
Xuất huyết
33
33 100,0 33
33 100,0 33
13 39,4
Thâm nhiễm tế bào viêm
33
32 97,0 33
12 36,4 33
2
6,1
Thoái hóa tế bào
33
13 39,4 33
10 30,3 33
15 45,5
Huyết khối trong lòng mạch 33
30 90,9 33
3
9,1
33
0
0,0
Qua bảng 4.3 cho thấy bệnh lý vi thể ở phổi, hạch phổi rất rõ ràng. 100% các tiêu
bản đọc thấy sung huyết và xuất huyết. Các phế nang chứa đầy dịch rỉ viêm. Sự thâm

nhiễm tế bào viêm ở phổi có tỷ lệ rất cao.
12


4.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG GIỐNG GỐC PRRS
4.2.1. Kết quả phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145
4.2.1.1. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS
phân lập được
Sử dụng dòng tế bào MARC-145 và môi trường nuôi cấy DMEM cho phân lập
virus PRRS, chúng tôi tiến hành phân lập toàn bộ mẫu phổi và hạch phổi của các mẫu
dương tính với virus PRRS được xác định bằng phương pháp RT-PCR. Kết quả phân
lập virus PRRS được trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145
Địa phương phân lập
Số lượng chủng virus phân lập được
Hà Nội
6
Hưng Yên
4
Thái Bình
2
Nam Định
4
Ninh Bình
2
Thanh Hoá
6
Nghệ An
3
TP Hồ Chí Minh

2
Tiền Giang
1
Cần Thơ
3
Tổng
33
Như vậy, từ các ca bệnh dương tính với PRRS, chúng tôi đã phân lập được các
virus PRRS gây bệnh tương ứng. Cùng với việc phân lập virus PRRS, chúng tôi cũng
theo dõi và ghi chép thời điểm xuất hiện bệnh tích tế bào và thời điểm tế bào bị virus
phá hủy hoàn toàn. Kết quả về khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus
PRRS phân lập được trình bày ở bảng 4.5.
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Bảng 4.5. Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được
TT

Thời gian
Xuất hiện Tế bào bị
bệnh tích

phá hủy
tế bào
hoàn toàn

Kí hiệu chủng virus phân lập

008HN, 012HY, 049HY 122NĐ, 010TB, 012NA,
052TH, 042TP, 072TG, 082CT
011HN, 032TB, 113HY 046NB, 42TH, 048CT,
2
48h
96h
092CT
3
48h
108h
023NĐ, 135TP
016HN, 041HN, 063HN, 092NĐ, 063NB, 031TH,
4
60h
96h
061TH, 101TH, 115HY
5
60h
108h
022HN, 055NĐ, 083TH162NA, 102NA
Qua bảng kết quả bảng 4.5 thấy rằng, virus gây bệnh tích tế bào sớm nhất ở 48h
sau gây nhiễm và bệnh tích tế bào có thể xuất hiện muộn hơn là 60h sau khi gây
1

48h

84h

13


nhiễm virus. Tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 84h đến 108h sau gây nhiễm tùy thuộc
vào từng chủng virus.
4.2.1.2. Kết quả xác định hiệu giá của các chủng virus PRRS phân lập được
Sau quá trình phân lập virus ban đầu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hồ sơ thu
mẫu (theo các vùng địa lý khác nhau và các thời điểm thu mẫu khác nhau), triệu chứng
ca bệnh, các biến đổi đại thể, biến đổi vi thể điển hình, khả năng nhân lên trên môi
trường tế bào, đã sơ bộ lựa chọn được 20 chủng virus PRRS phân lập đại diện khác
nhau để tiến hành xác định hiệu giá virus. Tiến hành xác định hiệu giá virus (TCID50)
của các chủng PRRS phân lập được theo phương pháp đã trình bày ở phần II. Kết quả
được thể hiện ở bảng 4.6.
Bảng 4.6. Kết quả xác định hiệu giá của các chủng PRRSV phân lập được
TT
Chủng virus
Hiệu giá virus TCID50/ml
1
041HN
6,67 ×103
2
011HN
1,44 ×104
3
008HN
3,16 × 105

4
022HN
6,67 ×102
5
049HY
1,26 × 106
6
012HY
6,67 × 105
7
010TB
3,16 × 106
8
032TB
3,16 ×104
9
092NĐ
3,16 ×104
10
122NĐ
1,44 × 105
11
052TH
6,67 × 105
12
031TH
6,67 ×104
13
061TH
3,16 ×103

14
042TH
1,44 ×102
15
012NA
1,96 × 106
16
162NA
6,67×104
17
102NA
1,44 ×102
18
042TP
1,44 × 105
19
072TG
6,67 × 105
20
082CT
3,16 × 104
Kết quả xác định hiệu giá của các chủng virus PRRS nghiên cứu cho thấy, các
chủng virus PRRS phân lập có hiệu giá TCID50 giao động từ 102 đến 106. Trong đó,
hiệu giá thấp nhất là chủng virus 102NA TCID50 đạt 1,44 × 102 và cao nhất là chủng
virus 010TB TCID50 đạt 3,16 × 106.
4.2.1.3. Kết quả xác định quy luật nhân lên trên môi trường nuôi cấy của các chủng
virus PRRS phân lập được
Chúng tôi đã chọn ra được 10 chủng virus PRRS có hiệu giá tương đối cao, có khả
năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào MARC-145 để tiếp tục nghiên
14

cứu quy luật nhân lên. Kết quả các chủng virus PRRS được lựa chọn và nghiên cứu quy
luật phát triển, nhân lên được trình bày ở bảng 4.7.
Nghiên cứu quy luật nhân lên của 10 chủng virus PRRS thấy rằng, sự nhân lên của
virus trong môi trường nuôi cấy là một quá trình liên tục. Trong đó có thời điểm virus
có hàm lượng thấp, có thời điểm virus đạt hàm lượng cao. Có thể chia quy luật nhân lên
của virus PRRS trong môi trường nuôi cấy thành 2 pha phát triển. Pha một, virus bắt
đầu xâm nhập và nhân lên trong tế bào cảm thụ và gây bệnh tích tế bào cho đến khi tế
bào bị phá hủy 80%, lúc này hiệu giá virus đạt cao nhất (đỉnh sinh trưởng của virus),
pha này thường bắt đầu từ 24h sau gây nhiễm và kéo dài đến 60h hoặc 72h sau gây
nhiễm. Pha hai, virus đã phá hủy gần như 100% tế bào cảm thụ và giải phóng ra môi
trường, lúc này hiệu giá virus bắt đầu giảm, pha này thường bắt đầu từ 84h đến 96h sau
gây nhiễm. Cụ thể 10 chủng virus nghiên cứu đều đạt hiệu giá cao nhất ở 72h sau gây
nhiễm, sau đó giảm dần.
Bảng 4.7. Các chủng virus PRRS được lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên
TT
Chủng virus
Hiệu giá virus TCID50/ml
1
008HN
3,16 × 105
2
049HY
1,26 × 106
3
012HY
6,67 × 105
4
010TB

3,16 × 106
5
122NĐ
1,44 × 105
6
052TH
6,67 × 105
7
012NA
1,96 × 106
8
042TP
1,44 × 105
9
072TG
6,67 × 105
10
082CT
3,16 × 105
4.2.2. Kết quả nghiên cứu sự ổn định một số đặc tính sinh học của các chủng virus
PRRS phân lập tại Việt Nam
4.2.2.1. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào theo thời gian của các
chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam qua các đời cấy chuyển
Từ lô virus gốc (P0 - Pasage 0), chúng tôi cấy chuyển qua 5 đời liên tiếp trên tế
bào MARC-145. So sánh khả năng nhân lên của đời P0 và P5 cho thấy, quá trình xâm
nhập, nhân lên và hủy hoại tế bào cảm thụ của các chủng virus PRRS nghiên cứu là
tương đối giống nhau và đồng đều. Virus bắt đầu hủy hoại tế bào ở thời điểm 48 giờ sau
khi gây nhiễm và đạt mức độ phá hủy cao ở 72 giờ sau gây nhiễm, sau 84 giờ gây nhiễm
thì tế bào cảm thụ bị phá hủy hoàn toàn. Tỉ lệ tế bào bị phá hủy tại các thời điểm 48h,
72h và 84h của 10 chủng virus nghiên cứu khác nhau không đáng kể (chệnh lệch 5%).

4.2.2.2. Kết quả xác định hiệu giá virus của các chủng virus PRRS phân lập tại Việt
Nam qua các đời cấy chuyển
Các chủng virus PRRS lựa chọn nghiên cứu được tiến hành xác định hiệu giá
qua 5 đời cấy chuyển. Kết quả xác định hiệu giá virus được trình bày ở bảng 4.8.
15


Qua bảng kết quả thấy rằng hiệu giá của các chủng virus nghiên cứu khá cao đạt từ
1,26 × 105TCID 50/ml đến 7,12 × 106TCID 50/ml và tương đối ổn định ở các đời cấy
chuyển. Cụ thể, hiệu giá cao nhất là chủng virus 010TB đạt 3,16 × 106 TCID 50/ml, hiệu
giá thấp nhất là chủng 112NĐ đạt 1,44 × 105 TCID 50/ml. Các chủng virus nghiên cứu
có hiệu giá virus không thay đổi nhiều (không giảm Lg) qua đời cấy chuyển P1 và P5,
đây là đặc tính rất quan trọng của một giống gốc để có thể đảm bảo trong quá trình nhân
giống sản xuất, hàm lượng virus vẫn được giữ nguyên qua các lô giống khác nhau. Trong
10 chủng virus nghiên cứu, chủng virus 010TB, 012NA, 049HY có hiệu giá lần lượt là
3,16 × 106; 1,96 × 106; 2,26 × 106 TCID 50/ml, đây là 3 chủng virus có hiệu giá cao
nhất so với các chủng còn lại và có tiềm năng làm giống gốc cho sản xuất vacxin.
Bảng 4.8. Hiệu giá của các chủng virus PRRS nghiên cứu qua 5 đời cấy chuyển
Hiệu giá (TCID50/ml)
P0
P1
P2
P3
P4
P5
5
5
5
5
5

052TH 6,67 × 10 7,11 × 10
5,40 × 10
6,67 × 10 1,26 × 10 6,67 × 105
010TB 3,16 × 106 5,03 × 106 3,33 × 106
3,03× 106 4,0 × 106 7,12 × 106
082CT 3,16 × 105 3,03 × 105 3,33 × 105 2,25 × 105 3,16 × 105 3,16 × 105
012NA 1,96 × 106 1,26 × 106 2,25 × 106 3,16 × 106 3,33 × 106 3,03 × 106
049HY 1,26 × 106 3,16 × 106 1,26 × 106
3,0 × 106 3,33× 106 3,16 × 106
012HY 6,67 × 105 7,11 × 105 5,40 × 105 9,60 × 105 5,40 × 105 6,67 × 105
008HN 3,16 × 105 3,03 × 105 2,25 × 105 5,40 × 105 3,03× 105 6,67 × 105
122NĐ 1,44 × 105 1,26 × 105 3,03 × 105 2,25 × 105 5,40 × 105 1,44 × 105
072TG 6,67 × 105 5,40 × 105 7,11 × 105 9,60 × 105 6,67 × 105 3,16 × 105
042TP 1,44 × 105 2,25 × 105 1,36 × 105 1,26 × 105 3,03 × 105 3,16 × 105
4.2.2.3. Kết quả xác định quy luật nhân lên trên môi trường nuôi cấy của các chủng
virus PRRS phân lập tại Việt Nam qua các đời cấy chuyển
Virus

Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu về đặc tính sinh học qua các đời cấy chuyển
của 10 chủng virus được tuyển chọn, kết quả đồ thị sinh trưởng của 5 chủng virus
052TH, 010TB, 012NA, 049HY, 008HN đại diện và kết quả xác định hiệu giá virus qua
các đời cấy chuyển, chúng tôi đã lựa chọn được 3 chủng virus đại diện nhất để tiếp tục
nghiên cứu sự ổn định tính di truyền và tính đại diện di truyền cho các chủng virus PRRS
cường độc phân lập tại Việt Nam. Đồng thời, chúng tôi cũng gửi thẩm định chủng giống
3 chủng virus này tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW. Kết quả lựa chọn các
chủng virus nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử được trình bày ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả lựa chọn chủng virus PRRS để nghiên cứu các đặc tính sinh học
phân tử
Kí hiệu chủng
virus phân lập

010 TB
012NA
049HY

Kí hiệu chủng
virus đăng kí
KTY-PRRS-01
KTY-PRRS-02
KTY-PRRS-03

Khả năng nhân lên trên
môi trường tế bào
Tốt, ổn định
Tốt, ổn định
Tốt, ổn định
16

Hiệu giá virus
(TCID50/ml)
3,16 × 106
1,96 × 106
1,26 × 106


4.2.3. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus PRRS
4.2.3.1. Kết quả giải trình tự gen ORF5 và so sánh trình tự nucleotide, axit amin của
các chủng virus PRRS nghiên cứu
Sau khi phân tích, chúng tôi thu được toàn bộ trình tự nucleotide của các đoạn
cần nghiên cứu, đoạn ORF5 có độ dài 603bp, đoạn ORF7 có độ dài 372bp. So sánh
trình tự nucleotide gen ORF5 của các chủng nghiên cứu và so sánh với các chủng

virus PRRS tham chiếu trên ngân hàng gen thấy rằng, ba chủng virus có mức độ
tương đồng về nucleotide gen ORF5 từ 98,1% đến 99,0%. So sánh với một số chủng
virus PRRS của Trung Quốc được công bố trên ngân hàng gen từ năm 2006 đến 2015
cho thấy tương đồng nucleotide đạt 97,8% đến 99,5%. Kết quả so sánh thành phần
axit amin của gen ORF5 giữa các chủng virus nghiên cứu (bảng 4.18) cho thấy tương
đồng về axit amin của 3 chủng virus nghiên cứu đạt từ 96,4% đến 97,5%. Trong đó
KTY-PRRS-02 và KTY-PRRS-03 tương đồng với nhau cao nhất 97,5% điều này cũng
phù hợp với tương đồng về nucleotide gen ORF5 của 2 chủng này. Hai chủng virus
KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-03 tương đồng thấp nhất với nhau đạt 96,4%. So sánh
thành phần axit amin gen ORF5 của các chủng nghiên cứu với một số chủng virus
PRRS của Việt Nam được công bố trên ngân hàng gen từ năm 2007 đến 2015 thấy
rằng tương đồng axit amin đạt được từ 94,2% đến 98,4%. So sánh với một số chủng
virus PRRS của Trung Quốc được công bố trên ngân hàng gen từ năm 2006 đến 2015
thấy rằng tương đồng axit amin đạt từ 95,8% đến 99,5%.
4.2.3.2. Kết quả giải trình tự gen ORF7 và so sánh trình tự nucleotide, axit amin của
các chủng virus PRRS nghiên cứu
Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen ORF7 giữa các chủng virus PRRS
nghiên cứu thấy tỉ lệ tương đồng dao động từ 99,1% đến 99,6%. Trong đó KTY-PRRS02 và KTY-PRRS-03 là tương đồng cao nhất (99,6%) và thấp nhất là KTY-PRRS-01
và KTY-PRRS-02, KTY-PRRS-03 (99,1%). So sánh với các chủng tham chiếu của
Việt Nam trên ngân hàng gen thế giới chúng tôi thấy rằng mức độ tương đồng về
nucleotide của gen ORF7 đạt 98,9% đến 99,7%. So sánh với các chủng tham chiếu của
Trung Quốc trên ngân hàng gen thế giới chúng tôi thấy rằng mức độ tương đồng về
nucleotide của gen ORF7 đạt 98,7% đến 100%. Kết quả so sánh sự tương đồng axit
amin cho thấy không có sự sai khác về thành phần axit amin của đoạn gen ORF7 của cả
3 chủng virus nghiên cứu, như vậy tương đồng axit amin của gen ORF7 của 3 chủng
virus nghiên cứu đạt 100%. So sánh sự tương đồng axit amin của gen ORF7 với một số
chủng tham chiếu của Việt Nam và Trung Quốc trên ngân hàng gen cũng không thấy sự
sai khác về thành phần axit amin của đoạn gen này.
4.2.3.3. Kết quả dựng cây phát sinh loài của các chủng virus PRRS nghiên cứu
Dựa trên trình tự gen ORF5 và ORF7, cây phát sinh loài tương ứng đã được xây

dựng một cách độc lập. Tất cả các chủng virus PRRS nghiên cứu được đặt phân tích
trong cùng một sơ đồ phả hệ (cây phân nhánh) với các chủng virus khác trên thế giới
17


để thấy được mối quan hệ di truyền giữa các chủng với nhau. Kết quả dựng cây phát
sinh loài được thể hiện ở hình 4.1 và 4.3.
93
45

JQ860367/Vietnam/2009/DN42
JQ860362/Vietnam/2008/DN444
KF735060 HPPRRS (Thailand 2010)

49

JQ860387/Vietnam/2012/DT7
10

KTY-PRRS-01

42
39

70

KF698647/Lao/2011/NA/LAO/L142
FJ895329/China/2009/SX2009
HQ832108/China/2008/AHXD

57

KM244763/Vietnam/2013/MN1

60
57

KC263035/China/2011/HD-11
FJ394029/Vietnam/2007/07QN

21
51

EF635006 HUN4 (China 2007)
EU864233/China/2006/TP
EF112445 JXA1 (China 2006)

53
20

KP998478/China/2015/FJZH
KTY-PRRS-03

54

42

0

KT208323/China/2015/2015-GDHY

KF699846/Vietnam/2013/HUA/HP1

40

KT208348/China/2014/gdsg-2014-gp5

75

JX144912/China/2012/YC1201

90

47

71

JQ955657/China/2013/GX1001
AB856283/Vietnam/2011/HUA-Viet.labPRRS1

97

86

LC105643/Vietnam/2015/BN10

62

HM214915/China/2010/GX09-32

KTY-PRRS-02

JQ860379/Vietnam/2010/HCM.CC3
DQ176019 MN184A (USA 2006)
U66394 PRRS (USA 1997)

43

PRRSV ATCC VR-2332 (U87392 NA)

81

AF159149 MLV RespPRRS/Repro (USA 2000)

98

PRRSV BCL-PS 100 (GU187014 Singapore)

84

AF066183 Ingelvac PRRS MLV (USA 2005)

7

DQ345725 VP-046 (Spain 2009)
M96262 Lelystad virus (Netherlands 1991)

100

(Ghi chú:

chủng virus nghiên cứu,

chủng virus vacxin Trung Quốc,
châu Âu)

chủng Bắc Mỹ,

Chủng

Hình 4.1. Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF5
54
57

KTY-PRRS-01
KP771770.China.2015
KM695199.Vietnam.2015

81

JQ663568.China.2012

42
57

KF735060.Thailand.2015
LC192549.Vietnam.2016

38

KTY-PRRS-02

KM659203.JXA1

58
70

KX815433.China.2017

45

GQ475526.China.2013

12
16

KU842720.Vietnam.2014

67

JN626287.China.2016

KTY-PRRS-03

DQ176021.VR2332
M96262.Lelystad

(Ghi chú:

chủng virus nghiên cứu,

chủng virus vacxin Trung Quốc, chủng Bắc Mỹ,

châu Âu)

Chủng

Hình 4.2. Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF7
Cây phát sinh loài hình 4.1 cho thấy, 3 chủng virus PRRS nghiên cứu nằm ở 2
nhóm phát sinh lớn khác nhau, trong đó KTY-PRRS-02 làm thành một nhóm và 2
chủng còn lại KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-03 làm thành một nhóm. Đồng thời chủng
độc lực cao Trung Quốc (JXA1) nằm cùng nhóm với chủng KTY-PRRS-01 và KTYPRRS-03. Các chủng virus nghiên cứu thuộc một nhánh của chủng Bắc Mỹ (VR-2332),
không có chủng virus nghiên cứu nào nằm cùng nhánh phát sinh với chủng Châu Âu
(Lelystad). Cây phát sinh loài hình 4.2 cho thấy các chủng virus nghiên cứu thuộc một
nhánh phát sinh của chủng Bắc Mỹ (VR-2332) và cùng nhánh phát sinh với các chủng
độc lực cao của Trung Quốc. Như vậy, qua việc so sánh mức độ tương đồng về
nucleotide và axit amin giữa các chủng virus PRRS phân lập, dựng cây phát sinh loài
phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu ta thấy các
18


chủng virus PRRS phân lập ở Việt Nam có mối quan hệ gen gần gũi với nhau và gần
với các chủng PRRSV đã phân lập ở Trung Quốc.
4.2.3.4. Kết quả xác định sự ổn định một số đặc tính sinh học phân tử của các chủng
chủng virus PRRS nghiên cứu qua các đời cấy chuyển
Ở mỗi đời cấy chuyển, hai đoạn gen ORF5 và ORF7 được giải trình tự. Kết quả
so sánh trình tự nucleotide ở các đời cấy chuyển cho thấy, ở 5 đời cấy chuyển liên tục, 3
chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02, KTY-PRRS-03 không có sự sai khác
hay biến đổi nào về trình tự nucleotide trên cả 2 đoạn ORF5 và ORF7.
4.2.4. Kết quả nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các
chủng virus PRRS nghiên cứu
4.2.4.1. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus PRRS
Từ 3 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02, KTY-PRRS-03 được lựa chọn

và được nhân lên trên môi trường tế bào MARC-145 với số lượng lớn, tiến hành tinh
chế kháng nguyên. Kết quả đã thu được kháng nguyên tinh khiết của 3 chủng virus.
Bảng 4.10. Kết quả tinh chế kháng nguyên các chủng virus PRRS nghiên cứu
Kháng nguyên virus
chế từ chủng virus
KTY - PRRS - 01
KTY - PRRS - 02
KTY - PRRS - 03

Nồng độ KN
lần 1 (mg/ml)
1
1
0,5

Nồng độ KN
lần 2 (mg/ml)
1
0,5
0,5

Nồng độ KN
lần 3 (mg/ml)
1
1,2
0,5

Các kháng nguyên tinh chế được có hàm lượng tương đối cao và ổn định qua
các lần tinh chế khác nhau. Kháng nguyên sau khi tinh chế được sử dụng cho nghiên
cứu đáp ứng miễn dịch trên chuột lang và kiểm tra sự miễn dịch chéo giữa các chủng

virus PRRS.
4.2.4.2. Kết quả gây tối miễn dịch cho chuột lang bằng kháng nguyên PRRSV tinh chế
Gây tối miễn dịch cho chuột lang bằng kháng nguyên PRRS đã tinh chế. Kết
quả cho thấy các chuột lang đều có kháng thể kháng virus PRRS, đạt tỷ lệ khá cao
như bảng 4.11.
Bảng 4.11. Kết quả của phản ứng IPMA kiểm tra kháng thể kháng PRRSV ở thời
điểm 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên PRRS cho chuột
Stt
1
2
3

Động vật TN

Lô thí nghiệm

Chuột lang

Lô CL1 (n=10)
Lô CL2 (n=10)
Lô CL3 (n=10)

Kết quả kháng thể
dương tính
10/10
10/10
10/10

Tỷ lệ
(%)

100
100
100

Kết luận
Đạt yêu cầu
Đạt yêu cầu
Đạt yêu cầu

Các mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng PRRSV của tất cả các lô thí nghiệm
được bảo quản ở -200C để dùng cho việc đánh giá sự tương đồng kháng nguyên.
19


4.2.4.3. Kết quả nghiên cứu sự tương đồng kháng nguyên của các chủng virus PRRS
phân lập tại Việt Nam
Sau khi kiểm tra hàm lượng kháng thể, sử dụng phản ứng trung hòa để đánh giá
sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu. Kết quả được
trình bày ở bảng 4.12.
Bảng 4.12. Phản ứng trung hòa xác định tương đồng kháng nguyên giữa các
chủng virus PRRS nghiên cứu
KN virus

KTY - PRRS - 01

KTY- PRRS - 02

KTY – PRRS - 03

KTY - PRRS - 01

+++

+++

++

KTY - PRRS - 02

++

+++

+

KTY - PRRS - 03

++

++

+++

Kháng thể

Nghiên cứu sự tương đồng kháng nguyên của các chủng virus PRRS chỉ ra rằng,
virus KTY-PRRS-01 là chủng có triển vọng nhất cho nghiên cứu sản xuất vacxin vô
hoạt PRRS vì kháng thể được tạo ra từ chủng virus này có khả năng trung hòa virus
rộng rãi nhất trong các chủng nghiên cứu.
4.2.5. Sản xuất giống gốc

4.2.5.1. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của giống gốc
Giống gốc PRRS ở các mẫu khi nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng thích
hợp, theo dõi 14 ngày không thấy bất cứ vi sinh vật nào phát triển. Cụ thể, trên môi
trường thạch thường, nước thịt gan yếm khí, thạch máu: sau 7 ngày theo dõi không có
khuẩn lạc mọc. Trong môi trường nước thịt, qua 7 ngày theo dõi không đục. Trên môi
trường thạch nấm, qua 14 ngày theo dõi không có nấm mọc. Như vậy, giống gốc PRRS
đảm bảo chỉ tiêu vô trùng và có thể sử dụng để nhân giống sản xuất phục vụ sản xuất
vacxin vô hoạt PRRS.
4.2.5.2. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của giống gốc
Kiểm tra bằng phương pháp PCR/RT-PCR cho thấy, chủng giống gốc chỉ có sự
hiện diện virus PRRS, không có mặt virus ngoại lai khác, chứng tỏ giống gốc không bị
tạp nhiễm. Như vậy, giống gốc PRRS đạt yêu cầu về độ vô trùng, thuần khiết, bước đầu
được phép sử dụng để nhân giống sản xuất phục vụ sản xuất vacxin vô hoạt PRRS.
4.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VACXIN VÔ HOẠT
NHŨ DẦU PHÒNG PRRS
4.3.1. Kết quả nhân giống sản xuất (Working seed) vacxin
4.3.1.1. Kết quả nhân giống sản xuất virus vacxin trên môi trường tế bào
Từ lô giống gốc, chúng tôi lấy ống giống gốc để nhân giống sản xuất. Kết quả
nhân giống sản xuất vacxin PRRS được 3 lô, mỗi lô 1 lít. Huyễn dịch virus được lấy
mẫu kiểm tra vô trùng và chuẩn độ hiệu giá virus. Khi các chỉ tiêu trên kiểm tra đạt yêu

20


cầu, các mẻ huyễn dịch virus được đồng nhất lên thành 1 lô huyễn dịch để phục vụ cho
mục đích sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS.
4.3.1.2. Kiểm tra sự vô trùng và thuần khiết của giống sản xuất
Tiến hành tương tự như kiểm tra chỉ tiêu vô trùng với giống gốc, cấy giống sản
xuất trên các môi trường kiểm tra, theo dõi trong 7 ngày (riêng môi trường nấm theo
dõi 14 ngày). Kết quả cho thấy, các lô giống sản xuất hoàn toàn không bị nhiễm các

loại vi khuẩn hiếu khí, yếm khí và nấm. Như vậy các lô giống sản xuất PRRS đạt chỉ
tiêu vô trùng và thuần khiết. Giống sản xuất sau khi được kiểm tra vô trùng, thuần khiết
một phần được sử dụng để sản xuất vacxin, một phần được bảo quản để sử dụng cho
nghiên cứu sự ổn định của giống sau thời gian bảo quản trong các điều kiện bảo quản
khác nhau.
4.3.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS
4.3.2.1. Nghiên cứu quá trình cô đặc virus kháng nguyên bằng máy lọc tiếp tuyến
Từ 3 lít giống sản xuất, chúng tôi tiến hành cô đặc virus bằng máy lọc tiếp tuyến.
Hỗn hợp virus đã cô đặc sau khi lọc, thu được 1,5 lít virus vacxin.
Bảng 4.13. Hiệu giá virus sau khi cô đặc bằng phương pháp lọc tiếp tuyến
Virus vacxin

Trước khi cô đặc

Sau khi cô đặc

Đánh giá

Hiệu giá virus
(TCID50/ml)

3,03 × 106

4,0 × 107

Đạt yêu cầu

Kết quả xác định hiệu giá virus vacxin sau cô đặc cho thấy, hàm lượng virus tăng
1 lg so với trước khi cô đặc và TCID50 đạt 4,0 × 107/ml, đạt yêu cầu cho sản xuất
vacxin vô hoạt PRRS.

4.3.2.2. Nghiên cứu quá trình vô hoạt virus vacxin
Tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ formalin sử dụng để vô hoạt vacxin ở,
các nồng độ thử nghiệm là 0,04%, 0,03%, 0,02% và thời gian ủ vô hoạt là 24 giờ. Kết
quả được trình bày ở bảng 4.14.
Bảng 4.14. Kết quả xác định nồng độ formalin sử dụng vô hoạt virus vacxinPRRS
Nồng độ formalin

0,04 %

0,03%

0,02%

Kết quả vô hoạt

Không đạt

Đạt

Không đạt

Qua bảng kết quả xác định nồng độ formalin thích hợp cho vô hoạt chúng tôi
thấy rằng nồng độ 0,03% là thích hợp nhất cho vô hoạt virus PRRS. Tiến hành vô hoạt
toàn bộ lô vacxin bằng nồng độ formalin trên, sau đó sản phẩm được gây nhiễm trên
môi trường tế bào MARC-145 để kiểm tra kết quả của quá trình vô hoạt virus. Kết quả
thu được hỗn hợp sau khi vô hoạt bằng formalin, virus bị vô hoạt hoàn toàn.
4.3.2.3. Kết quả nghiên cứu lựa chọn chất bổ trợ cho sản xuất vacxin vô hoạt PRRS
Lựa chọn 3 chất bổ trợ là dầu khoáng, keo phèn và alhydrogel. Kết quả kiểm tra
kháng thể kháng PRRSV sau tiêm vacxin với các chất bổ trợ khác nhau được trình bày
ở bảng 4.15.

21


Bảng 4.15. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của lợn sau khi
tiêm vacxin sử dụng chất bổ trợ khác nhau
Lô Thí
nghiệm
DK1
DK2
DK3
DK4
DK5
DKtb
KP1
KP2
KP3
KP4
KP5
KPtb
AG1
AG2
AG3
AG4
AG5
AGtb
ĐC1
ĐC2
ĐC3
ĐCtb

0 ngày
0,02
0,03
0,01
0,03
0,01
0,02
0,02
0,04
0,05
0,03
0,04
0,04
0,02
0,03
0,03
0,02
0,03
0,03
0,01
0,03
0,02
0,02

7 ngày
0,11
0,23
0,27
0,21
0,20

0,20
0,08
0,10
0,07
0,08
0,06
0,08
0,07
0,05
0,08
0,06
0,07
0,07
0,02
0,03
0,02
0,03

Giá trị S/P
14 ngày 21 ngày 28 ngày
0,72
0,96
1,14
0,84
1,37
1,41
1,16
1,51
1,62
0,93

1,27
1,38
0,92
1,29
1,38
0,91
1,28
1,39
0,47
0,74
0,79
0,48
0,82
0,84
0,45
0,85
0,87
0,47
0,81
0,85
0,46
0,80
0,81
0,47
0,80
0,83
0,38
0,43
0,44
0,35

0,40
0,42
0,33
0,45
0,46
0,36
0,45
0,45
0,32
0,41
0,43
0,35
0,43
0,44
0,02
0,03
0,03
0,02
0,04
0,03
0,01
0,02
0,03
0,02
0,03
0,03

Ghi chú : S/P ≥ 0,4 dương tính

35 ngày

1,38
1,52
1,68
1,47
1,61
1,53
0,84
0,92
0,93
0,92
0,87
0,90
0,46
0,43
0,47
0,46
0,45
0,45
0,02
0,04
0,02
0,03

42 ngày
1,51
1,62
1,71
1,54
1,68
1,61

0,92
0,94
0,95
0,96
0,94
0,94
0,45
0,45
0,47
0,47
0,46
0,46
0,04
0,04
0,03
0,04

S/P < 0,4 âm tính

DK: Dầu khoáng ; KP: Keo phèn; AG: Alhydrogel ;

tb: Trung bình

Kết quả nghiên cứu sử dụng các chất bổ trợ khác nhau cho thấy, các lô đối chứng
đều không có kháng thể kháng virus PRRS với các giá trị S/P < 0,4, điều này chứng tỏ
trong quá trình thử nghiệm, không có sự xâm nhập và lưu hành của virus PRRS tự
nhiên trong đàn lợn thí nghiệm. Trong đó, hàm lượng kháng thể ở lô sử dụng chất bổ
trợ là dầu khoáng và lô sử dụng chất bổ trợ là keo phèn đạt dương tính sau 14 ngày
tiêm. Riêng lô thí nghiệm sử dụng chất bổ trợ là Alhydrogel, đáp ứng miễn dịch chậm
hơn so với 2 lô thí nghiệm trên, cụ thể là đến ngày 21 sau khi tiêm vacxin mới có kháng

thể dương tính. Khi sử dụng dầu khoáng làm chất bổ trợ sẽ cho hàm lượng kháng thể cao
hơn so với lô sử dụng chất bổ trợ là keo phèn và alhydrogel. Chúng tôi nhận thấy, sử
dụng chất bổ trợ là dầu khoáng hay keo phèn đều có tính an toàn cao và giúp lợn sản sinh
kháng thể đặc hiệu với virus PRRS. Tuy vậy, chất bổ trợ dầu khoáng sẽ cho đáp ứng
miễn dịch cao nhất. Vì vậy, quyết định lựa chọn được chất bổ trợ là dầu khoáng để sản
xuất vacxin vô hoạt PRRS. Tiến hành nhũ hóa vacxin với dầu khoáng theo tỉ lệ 1: 1. Sau
đó các lô vacxin này được kiểm tra bằng cảm quan về các chỉ tiêu như: độ nhớt, tách
22


nước, phân lớp, chuyển màu bằng phương pháp ly tâm để kiểm tra tính ổn định và
dùng phương pháp đo tốc độ chảy của vacxin để kiểm tra độ nhớt. Đồng thời, theo dõi
tính ổn định của nhũ dầu trong thời gian bảo quản cho thấy, vacxin không có hiện
tượng chuyển màu, không tách pha nước, không phân lớp. Kết quả nhũ hóa vacxin và
kiểm tra sau nhũ hóa được trình bày ở bảng 4.16.
Bảng 4.16. Kết quả kiểm tra cảm quan các lô nhũ hoá
Lô vacxin

Tính ổn định

Chuyển màu

Tách pha nước

Phân lớp

L1

+++

-

-

-

L2

+++

-

-

-

L3

+++

-

-

-

Chú thích : +++ : Tốt ; ++ : Bình thường ; + Kém ; - Không quan sát thấy

Qua bảng 4.16, chúng tôi nhận thấy các chỉ tiêu về tính ổn định, sự chuyển màu,
tách pha nước, phân lớp đạt yêu cầu ở tất cả các lô vacxin nhũ hoá. Như vậy, quá trình

nhũ hóa vacxin đạt yêu cầu.
4.3.3. Kết quả nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS
4.3.3.1. Kết quả kiểm tra vô trùng và thuần khiết của vacxin vô hoạt PRRS
Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin vô hoạt PRRS
Kết quả kiểm tra vô trùng được áp dụng theo TCVN 8684:2011. Đến ngày thứ 14,
tất cả các môi trường thử nghiệm đều trong suốt, mầu sắc môi trường không đổi, chứng
tỏ lô vacxin mà chúng tôi sản xuất ra đạt tiêu chuẩn về vô trùng.
Kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vacxin vô hoạt PRRS
Kết quả kiểm tra các virus ngoại lai đều cho kết quả âm tính bằng phương pháp
PCR hoặc RT-PCR. Như vậy trong thành phần môi trường của các lô vacxin vô hoạt
PRRS không bị tạp nhiễm các thành phần khác từ môi trường bên ngoài như vi khuẩn,
nấm mốc, Mycoplasma và virus ngoại lai. Do đó, lô vacxin mà chúng tôi sản xuất đạt
tiêu chuẩn về vô trùng, thuần khiết.
4.3.3.2. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin vô hoạt PRRS
Kết quả kiểm tra an toàn thấy rằng, ở liều tiêm gấp 2 lần vacxin vô hoạt PRRS,
lợn thí nghiệm đều sống khoẻ mạnh, ăn uống bình thường, không có phản ứng cục bộ,
không sốt. Như vậy, vacxin vô hoạt PRRS đạt chỉ tiêu an toàn.
4.3.3.3. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin vô hoạt PRRS
Vacxin vô hoạt PRRS được kiểm nghiệm chỉ tiêu hiệu lực theo TCVN868513:2014 bằng phương pháp trọng tài. Qua kết quả ở bảng 4.17, lợn thí nghiệm của cả
3 lô vacxin không có biểu hiện bệnh lý, lợn khoẻ mạnh, ăn uống bình thường, chứng
tỏ kháng thể kháng PRRSV có trong máu của các lợn thí nghiệm được tiêm vacxin
vô hoạt PRRS đủ khả năng bảo hộ cho đàn lợn. Ngược lại ở lô đối chứng tất cả lợn
ốm nặng (với biểu hiện lâm sàng: bỏ ăn, sốt cao, ỉa chảy…) 1 lợn bị chết, mổ khám
thấy có những biến đổi bệnh tích đặc trưng của PRRS.
23