Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------------

LÊ MINH HẢI

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN
Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ
BIỂN NUÔI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN
GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT
VẮC XIN PHÒNG BỆNH

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội, năm 2018


Công trình được hoàn thành tại:
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Phạm Thị Tâm
2. PGS.TS. Tô Long Thành

Phản biện
1.
2.
3.

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ
họp tại Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam

Có thể tìm kiếm luận án tại thư việdn:
1. Thư Viện Quốc Gia Việt Nam
2. Thư viện của Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam có tiềm năng lớn về nuôi trồng thủy sản trên biển, diện tích có khả
năng sử dụng phát triển nuôi cá biển bao gồm các vùng vịnh kín, bãi triều ven biển và
một phần ở các hải đảo, vùng biển hở. Biển Việt Nam có nhiều loài cá phân bố tự
nhiên có thể đưa vào nuôi biển như nhóm cá mú, cá hồng, cá cam, cá tráp, cá giò, cá
vược... Trong chương trình nuôi, đến năm 2020 Việt Nam dự kiến đạt sản lượng
200.000 tấn cá biển nuôi trong đó 50.000 tấn là nuôi theo quy mô lớn [16].
Hiện tại, mô hình nuôi cá lồng bè có giá trị kinh tế cao trên biển đang được áp
dụng phổ biến ở nhiều vùng ven biển nước ta. Tuy nhiên, việc phát triển mô hình
nuôi nhanh về số lượng cũng như về mức độ thâm canh ngày càng cao, tình hình dịch
bệnh gây chết cá hàng loạt cũng đã được ghi nhận ngày càng nhiều với tỉ lệ hao hụt
cao. Vi khuẩn ưa mặn Photobacterium damselae gây bệnh Photobacteriosis hay
Pasteurellosis còn được gọi là xuất huyết nhiễm trùng, hoặc bệnh đốm trắng ở thận
trên cá biển [5].
Vi khuẩn P. damselae có thể tấn công và gây bệnh trên cá biển nuôi ở tất cả
các giai đoạn phát triển của cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương
phẩm. Khi bị bệnh cá có thể biểu hiện ở dạng mãn tính và cấp tính, biểu hiện bệnh
Photobacteriosis như: gây loét trên da, xuất hiện các nốt kem trắng hoặc u hạt
tubercules màu trắng ở một số cơ quan nội tạng, gây hoại tử trong nội tạng, hoại tử
tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng và hoại tử rộng rải [146], [41]. Cá bệnh
có thể chết sau 5-10 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100% gây thiệt hại kinh tế ở các

nước như: Nhât, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ,... Ở Việt Nam, theo
báo của các tác giả Đỗ Thị Hòa và cs năm 2008, cho thấy các loài cá biển nuôi tại
Khánh Hòa, Kiên Giang và các tỉnh phí Bắc đều bị bệnh do vi khuẩn P. damselae và
gây thiệt hại lớn cho người nuôi.
Hiện nay, người nuôi cá biển sử dụng vắc xin để phòng bệnh còn rất ít do các
nghiên cứu và sản xuất còn hạn chế, trên thị trường khan hiếm vắc xin thương mại.
Vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn P.damselae chủ yếu là ở dạng vô hoạt, sử dụng bằng
cách tiêm cho cá, giá thành cao, khó sử dụng cho cá giống kích thước bé. Người nuôi
cá biển, chủ yếu sử dụng kháng sinh để trị bệnh do vi khuẩn P. damselae dẫn đến sự
kháng thuốc, tồn dư kháng sinh trong sản phẩm. Nhằm giảm thiểu việc sử dụng
kháng sinh, thì nghiên cứu tạo vắc xin phòng bệnh là rất cần thiết. Hiện tại, có nhiều
phương pháp để tạo vắc xin, trong đó phương pháp tạo vắc xin nhược độc từ chủng vi
khuẩn nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm là phương pháp phổ biến
và rất hữu hiệu khắc phục được các hạn chế của vắc xin vô hoạt.
Xuất phát từ lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài
cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản
xuất vắc xin phòng bệnh” làm cơ sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc xin phòng
bệnh Photobacteriosis ở cá biển trên quy mô công nghiệp.
2. Mục tiêu đề tài luận án
- Xác định được một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn P. damselae
phân lập từ cá biển Việt Nam.
1


- Tạo được chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh
Photobacteriosis ở cá biển nuôi lồng.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng: Vi khuẩn P. damselae, một số loài cá biển nuôi lồng (cá mú, cá
hồng mỹ, cá bớp (cá giò).

- Phạm vi nghiên cứu: Các vùng ven biển miền Bắc Việt Nam.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học:
- Các kết quả nghiên cứu trong luận án đã xác định được các đặc tính sinh học
của các chủng vi khuẩn P. damselae gây bệnh Photobacteriosis ở cá là cơ sở khoa
học trong nghiên cứu dịch tễ và xây dựng các giải pháp phòng trị bệnh.
- Kết quả tạo vi khuẩn P. damselae giảm độc lực bằng kỹ thuật gây đột biến là
cơ sở cho các nghiên cứu tạo các dòng vi khuẩn đột biến phục vụ cho định hướng sản
xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh cho cá đạt hiệu quả cao.
Ý nghĩa thực tiễn:
Đề tài đã tạo được chủng vi khuẩn P. damselae giảm độc lực, an toàn, có khả
năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ làm nguyên liệu để sản xuất vắc xin phòng bệnh
Photobacteriosis cho cá góp phần tăng sản lượng cá nuôi và phát triển bền vững nghề
nuôi cá biển ở nước ta.
5. Đóng góp mới của đề tài luận án
- Ở Việt Nam đây là công trình nghiên cứu đầu tiên, toàn diện về vi khuẩn
P.damselae gây bệnh trên cá biển nuôi lồng, đã phân lập và xác định được 07 chủng
vi khuẩn, xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn gây bệnh.
- Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn
P.damselae giảm độc lực làm nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh
Photobacteriosis ở cá biển. Thành công của nghiên cứu sẽ góp phần giải quyết vấn đề
một cách đáng kể việc sử dụng kháng sinh dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc và giảm sự
tồn dư kháng sinh trong sản phẩm, nâng giá trị sản phẩm cá biển, tăng năng xuất cá
biển nuôi lồng.
Cấu trúc của luận án:
Luận án chính gồm 111 trang với 16 bảng số liệu và 27 hình. Luận án gồm 5
phần: Mở đầu (3 trang); Tổng quan tài liệu (38 trang); Vật liệu, nội dung và phương
pháp nghiên cứu (12 trang); Kết quả và thảo luận (56 trang); Kết luận và kiến nghị (1
trang). Luận án tham khảo 183 tài liệu trong đó 22 tài liệu tiếng Việt và 161 tài liệu
tiếng Anh.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Trong chương này luận án trình bày về tình hình nuôi cá biển trên thế giới và ở
Việt Nam; một số bệnh thường gặp trên cá biển nuôi, vi khuẩn P. damselae và bệnh
do vi khuẩn P. damselae gây ra trên cá biển: phân loại, đặc điểm hình thái, đặc điểm
sinh lý, sinh hoá, đặc điểm nuôi cấy, khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P.
damselae, đặc điểm dịch tễ, gen độc tố và các yếu tố gây bệnh, dấu hiệu bệnh lý, các
phương pháp phát hiện P. damselae, phòng và điều trị bệnh; Tổng quan về tạo chủng
vi khuẩn nhược độc, các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn: phương pháp vật lý,
2


phương pháp vi sinh vật học , đột biến bằng kháng sinh rifampicin, giảm độc bằng kỹ
thuật gen; Đáp ứng miễn dịch của cá và vắc-xin phòng bệnh: đáp ứng miễn dịch của
cá,vắc xin phòng bệnh cho cá (tình hình nghiên cứu trên thế giới, tình hình nghiên
cứu trong nước).
Vi khuẩn P. damselae có thể tấn công và gây bệnh trên cá biển nuôi ở tất cả
các giai đoạn phát triển của cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương
phẩm. Hiện nay, người nuôi cá biển chủ yếu sử dụng kháng sinh để trị bệnh, nhằm
giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, do đó việc nghiên cứu tạo vắc xin rất cần thiết.
Trong các phương pháp tạo vắc xin, phương pháp tạo chủng vi khuẩn nhược độc
bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm tạo ra vắc xin nhược độc là phương pháp phổ
biến và rất hữu hiệu.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu:
Vi khuẩn P. damselae gây bệnh xuất huyết nhiễm trùng trên cá biển nuôi lồng
tại vùng biển Việt Nam
2.2. Vật liệu nghiên cứu
- Động vật thí nghiệm: Cá mú, cá bớp, cá chẽm, cá hồng nghi mắc bệnh xuất
huyết nhiễm trùng thu tại một số khu vực nuôi cá lồng ở vùng biển Việt Nam. Cá gây
nhiễm: cá mú đã được kiểm tra sạch đối với các loại bệnh, có khối lượng 60 - 80g,

màu sắc tươi sáng, đầy đủ các bộ phận và bơi lội bình thường.
- Hóa chất: Các cặp mồi nhân gen 16S RNA, ureC, , hlyA của các chủng vi
khuẩn P.damselae; Bộ Kit dùng tách chiết DNA, thang DNA chuẩn; Cột Nikel
chelating Resin (Invitrogen); Hóa chất dùng cho nuôi cấy vi khuẩn; Hóa chất tách
chiết DNA; Hóa chất cho phản ứng PCR; Hóa chất thực hiện phản ứng ELISA; Hóa
chất điện di. Các cặp mồi nhân gen 16s RNA, ureC, , hlyA của các chủng vi khuẩn
P.damselae.
- Môi trường và dung dịch nuôi cấy vi khuẩn: BHI, TCBS, KIA, peptone kiềm,
Marine Agar... Môi trường dùng để pha loãng vi khuẩn: Peptone đệm, nước muối
sinh lý. Môi trường dùng cho phản ứng sinh hóa: KIA, Indol, môi trường Muller
Hinton, LB lỏng, BHI...
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập một số chủng vi khuẩn P.damselae từ các mẫu cá nước mặn như cá mú,
cá chẽm, cá hồng và cá bớp tại một số vùng biển ở miền Bắc Việt Nam
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được.
- Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn P. damselae đột biến giảm độc lực
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thu mẫu cá bệnh
Phương pháp thu thập, lấy mẫu áp dụng theo TCVN 5276:1990 (Quyết định số
2920 ngày 30/12/2008 của Bộ trưởng Bộ KHCN về việc công bố tiêu chuẩn Quốc gia).
2.4.2. Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2008; Bùi
Quang Tề, 1998)
2.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae (Wang et al. 2007).
2.4.4. Phương pháp giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn (Đỗ Thị Hòa và cs,
2008; Nguyễn Lân Dũng và cs, 2012)
3


2.4.5. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
(Bakopoulos et al., 1995)

2.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả
năng nhân lên và sinh độc tố gây dung huyết của vi khuẩn (Phạm Công Hoạt,
2012)
2.4.6.1. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ
2.4.6.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH
2.4.6.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của độ mặn
2.4.7. Phương pháp nghiên cứu đặc tính gây bệnh xuất huyết nhiễm trùng trên cá
biển của vi khuẩn P. damselae (Phạm Công Hoạt, 2012)
2.4.8. Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm và xác định LD50 (Reed và
Muench, 1938)
2.4.9. Phương pháp tách chiết DNA (Lawson et al., 1989)
2.4.10. Phương pháp Multiplex PCR phát hiện phân biệt P. damselae subsp.
Damselae và P. damselae subsp. piscicida (Osorio et al., 2000)
2.4.11. Phương pháp PCR phát hiện gen và hlyA
2.4.12. Phương pháp điện di trên agarose (Sambrook và Russell, 2001)
2.4.13. Phương pháp tạo chủng nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm
2.4.13.1. Phương pháp gây giảm độc lực bằng tia cực tím (Preecha et al., 2010).
2.4.13.2. Phương pháp gây giảm độc lực vi khuẩn bằng kháng sinh rifampicin
(Gliniewicz et al., 2015).
2.4.14. Đánh giá khả năng gây dung huyết của các dòng vi khuẩn đột biến giảm độc
lực (Vaca et al., 2009)
2.4.15. Phương pháp mô bệnh học (Mitchell et al., 2004)
2.4.16. Giải trình tự DNA, xử lý và phân tích số liệu trình tự các gen
- Giải trình tự DNA
Sau khi PCR nhân các gen quan tâm trình tự các gen được gửi đến địa chỉ Jalan
SP 2/7, Taman Serdang Perdana, Seksyen 2, Seri Kembangan 43300, Selangor,
Malaysia để giải trình tự.
- Xử lý và phân tích số liệu trình tự các gen
Sử dụng công cụ Clustal omega của phần mềm trực tuyến EMBL-EBI để đánh giá:
Sự sai khác di truyền gen , hlyA của các dòng P.damseale giảm độc lực và chủng gốc và

sự sai khác trong trình tự protein suy diễn từ gen của dòng giảm độc lực.
2.4.17. Phương pháp xác định khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ ở cá của
dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực
2.4.18. Phương pháp ELISA xác định kháng thể đặc hiệu (Yoshihito, 2002).
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damselae
3.1.1. Đặc điểm mẫu cá bệnh
Trong thời gian từ cuối tháng 2 đến tháng 6 năm 2015 tại một số trang trại nuôi cá
biển ở các tỉnh miền Bắc (Hải Phòng;Nam Định; Quảng Ninh), 20 mẫu cá biển (cá
mú 7 mẫu, cá bớp 9, cá vược 2 mẫu, cá hồng 3 mẫu) có dấu hiệu bệnh
Photobacteriosis (được gọi là xuất huyết nhiễm trùng, hoặc bệnh đốm trắng ở thận trên
4


cá biển) như: cá bơi gần mặt nước hoặc bơi sát lưới, chết rải rác, loét trên da, da tối
màu, mang hoại tử, bụng chướng có dấu hiệu bị bệnh (hình 3.1)
a

b

c

Hình 3.1. (a), (b) Mẫu cá mú nghi mắc bệnh Photobacteriosis, thu tại Hải Phòng
(c) Mẫu cá mú không bị bệnh
Trong 20 cá bệnh thu được với biểu hiện bệnh lý bên ngoài khác nhau, tiến
hành giải phẫu cá, chúng tôi thu được 60 mẫu từ các cơ quan gan, thận, lách, tim, não
với các dấu hiệu bị tụ huyết trùng, xuất hiện các nốt kem trắng hoặc u hạt màu trắng
ở các cơ quan nội tạng, hoại tử trong nội tạng .

Hình 3.2. Hình ảnh cơ quan nội tạng cá bị bệnh Photobacteriosis

(1) Gan sưng to và có các đốm nhỏ trên bề mặt
(2) Niêm mạc dạ dày bị viêm nhiễm
(3) Lách sưng và có đốm trắng
(4) Thận sưng và có các đốm trắng
5


3.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên cá biển
nuôi lồng
Bảng 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damsalae từ các mẫu cá biển nghi mắc
Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng)
Các phản ứng sinh hóa
Nguồn
Tên
TT
gốc phân
chủng
lập
1

T1.7

Cá mú
(Thận)

2

T1.8

Cá bớp

(Gan)

3

T4.2

Cá hồng
(Thận)

4

T4.3

5

T4.4

Cá mú
(Thận)
Cá bớp
(Thận)

6

B5.22

7

B10.25 Cá vược
(Lách)

Cá mú
( Gan)

Đặc điểm
vi khuẩn

Catalase Indole

KIA

Khả
năng
dung
huyết
β

Trực
khuẩn,
lưỡng cực,
gram (-)
Trực
khuẩn,
lưỡng cực,
gram (-)
Trực
khuẩn,
gram (-)
Trực khuẩn
gram (-)

Trực khuẩn
gram (-)

+

-

Tùy tiện, lên men
glucose, sinh khí

+

-

Tùy tiện, lên men
glucose, sinh khí

+

+

Không thực hiện

+

-

β

+

-

Tùy tiện, lên men
glucose, sinh khí
Tùy tiện, lên men
glucose, sinh khí

Trực
khuẩn,
lưỡng cực,
gram (-)
Trực khuẩn
gram (-)

+

-

Tùy tiện, lên men
glucose, sinh khí

β

+

-

Tùy tiện, lên men
glucose, sinh khí

α

β

β

Từ 20 mẫu bệnh phẩm ban đầu, chúng tôi phân lập được 07 chủng vi khuẩn P.
damsalae với các đặc điểm hình thái: khuẩn lạc màu trắng đục, vàng sậm hoặc nâu
đỏ, tròn đều, trơn, bóng với kích thước 1- 2 mm (hình 3.3.a), tế bào dạng trực khuẩn,
lượng cực, gram âm (hình 3.3.b).
6


a

b

c

d

T1.7

Hình 3.3. Hình thái vi khuẩn P. damselae
(a): Hình thái khuẩn lạc trên môi trường Marine agar; (b): Hình thái vi khuẩn P.
damselae nhuộm gram soi dưới kính hiển vi quang học (100X); (c), (d): Hình thái khuẩn
lạc khi ria trên môi trường TCBS sau 24 giờ nuôi cấy
Các chủng này đều phát triển tốt, tạo khuẩn lạc màu xanh trên môi trường
TCBS ở điều kiện 28ºC trong 24 – 32 giờ (hình 3.3c). Đặc điểm này tương tự với báo

cáo của Love et al. (1981) và Thyssen et al., (2000) trên TCBS, khuẩn lạc vi khuẩn
P. damselae có màu xanh, tròn, lồi, bóng [111], [166].
Từ kết quả trên cho thấy vi khuẩn P. damselae phân lập được trên các đối tượng: cá
mú, cá hồng, cá vược, cá bớp tại miền BắcViệt Nam
3.1.3. Xác định phân loài P. damselase gây bệnh trên cá biển nuôi lồng bằng
phương pháp sinh học phân tử
Kết quả thực hiện phản ứng multi- PCR khuếch đại 2 gen 16S rRNA và ureC
cho thấy: có 05 chủng chỉ phát hiện thấy 1 đoạn gen có kích thước khoảng 267bp, 02
chủng phát hiện thấy 02 đoạn gen có kích thước khoảng 267bp và 448bp (Hình 3.5).
So sánh với kết quả nghiên cứu của Osorio et al. (2000) [130] và các công bố của tác
giả này năm 1999 [129], Magarinos et al. (1996) [114] cho thấy 05 chủng T1.7,
B5.22, T4.4, B10.25 và T4.2 thuộc phân loài P. damselae subsp. Piscicida, 02 chủng
T1.8 và T4.3 thuộc phân loài P. damselae subsp. Damselae.

7


.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm multi-PCR khuếch đại các gen ureC và 16S rRNA
của vi khuẩn P. damselase
(M: thang chuẩn 100 bp, 1: T1.7, 2: B5.22, 3: T4.4, 4: B10.25, 5: T4.2, 6: T1.8, 7: T4.3)
3.1.4 Nghiên cứu độc lực của các chủng P. damselae phân lập
Độc lực của vi khuẩn được xác định bằng liều gây chết 50% (LD50). Cá thí
nghiệm được gây nhiễm với 07 chủng vi khuẩn phân lập có mật độ là 102-1012
CFU/ml. Tỷ lệ chết của cá được gây nhiễm với các chủng vi khuẩn có sự khác nhau
rõ rệt, xét tỷ lệ gây chết của từng chủng chúng tôi nhận thấy tỉ lệ chết tỉ lệ thuận với
mật độ vi khuẩn tiêm. Áp dụng công thức của Reed-Muynch, liều LD50 của chủng
T1.7 được xác định như sau:
LD50 = 10(a + x)
Trong đó: 10a là độ pha loãng canh khuẩn tại đó số lượng cá sống và chết sau

thí nghiệm là 50%, tương ứng là: 103; x = (Pa- 50)/(Pa- Pu), do đó x= (74,75-50)/
(74,75-45)= 0,83
Như vậy: LD50 của chủng T1.7= 10(3 + 0,83) = 103,83
Tương tự như vậy, liều gây LD50 của các chủng T4.3, T1.8, B5.22, T4.2, T4.4,
B10.25 tương ứng là 104,34, 104,76, 106,52, 106,61, 107,17, 109,28. Kết quả này cho thấy, ba
chủng T1.7, T4.3, T1.8 có độc lực cao hơn các chủng còn lại, trong số đó, hai chủng
T1.8 và T4.3 thuộc phân loài P. damselae subsp. Damselae có độc lực cao nhất,
chủng T1.7 thuộc loài P. damselae subsp. Piscicida có độc lực tương đương với
chủng T1.8. Các chủng còn lại thuộc phân loài P. damselae subsp. Piscicida có độc
lực thấp hơn đáng kể so với 03 chủng nói trên. Labella et al. (2010), nghiên cứu khả
năng gây bệnh của P. damselae subsp. Damselae đã xác định được rằng: chủng có
LD50 là 1x105 CFU là chủng có độc lực mạnh, có khả năng gây chết cá chẽm đỏ sau 2
đến 4 giờ gây nhiễm trong khi các chủng không độc có LD 50 > 108 CFU không gây
chết cá sau khi gây nhiễm [98]. Như vậy, hai chủng P. damselae subsp. Damselae
T1.8 và T4.3 có LD50 bằng 104,76 và 104,34 phân lập được là các chủng có độc lực cao.
8


3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn P. damselae
phân lập được
Kết quả xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi lựa chọn hai chủng đại diện cho 02 phân loài
của P. damselae bao gồm: P. damselae subsp. piscida T1.7 và P. damselae subsp.
damselae T4.3 để nghiên cứu xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả
năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn
3.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và gây
dung huyết của vi khuẩn P. damselae.
Kết quả theo dõi nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn thể hiện trong hình 3.6 và 3.7
và bảng 3.4.

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi
khuẩn P. damselae T1.7

Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi
khuẩn P. damselae T4.3
Sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh sản của
mẫu P. damselae T4.3 khá giống với mẫu P. damselae T1.7. Điều này có thể được
giải thích do sự giống nhau về đặc tính sinh học của các chủng trong cùng một loài.
9


Kết quả kiểm định LSD cho thấy ở các mức nhiệt độ, thời gian nuôi cấy có ảnh
hưởng sinh trưởng của P. damselae, sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p <0,05.
Ở nhiệt độ 4oC và nhiệt độ 40oC vi khuẩn P. damselae T1.7 và T4.3 không
tăng sinh. Ở nhiệt độ 20oC, tốc độ tăng sinh của vi khuẩn P. damselae là tương đối
cao, tăng nhanh và duy trì trạng thái tối ưu ở nhiệt độ 28-37oC. Sự sinh sản của vi
khuẩn đạt trạng thái cực thịnh nhiệt độ 28oC vào thời điểm 48 giờ sau khi nuôi cấy.
Trong thực tế tại các khu vực nuôi cá biển với mật độ cao cũng thường xảy ra dịch
bệnh khi nhiệt độ môi trường có sự biến đổi tăng cao tại thời điểm giao mùa.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng gây dung huyết của vi
khuẩn P. damselae T1.7 và T4.3
Thời
gian
(giờ)

Nhiệt độ ( oC)/ Chủng vi khuẩn
4

20

28

37

40

1

T1.7
-

T4.3
-

T1.7
-

T4.3
-

T1.7
-

T4.3
-

T1.7
-

T4.3
-

T1.7
-

T4.3
-

6

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

12

-

-

-

-

++

++

+

+

-

-

18

-

-

+

+

++

++

+

+

-

-

24

-

-

+

+

+

+

+

+

-

-

36

-

-

+

+

+

+

+

+

-

-

48

-

-

+

+

+

+

+

+

-

-

60

-

-

+

+

+

+

+

+

-

-

Ghi chú: (+): có dung huyết  trung bình; (++): có dung huyết  mạnh (-): không dung
huyết
Kết quả thu được từ thí nghiệm này cho thấy: cả hai chủng vi khuẩn đều sản
sinh độc tố dung huyết trong điều kiện nuôi cấy từ 28 oC- 30oC sau 12 giờ. Ở mức
nhiệt độ 28oC sau 18 giờ sinh độc tố dung huyết, ở 4oC và 40oC các chủng này không
sinh trưởng và không sinh độc tố dung huyết. Ở nhiệt độ lý tưởng cho sự phát triển
của cả 2 vi khuẩn P. damselae T1.7 và T4.3 là 28oC thì khả năng sinh độc tố gây
dung huyết cũng rất cao. Điều này chứng tỏ sự phát triển của vi khuẩn càng mạnh thì
độc tố gây dung huyết mà chúng tiết ra càng cao và chúng có liên quan đến khả năng
gây bệnh trên các đối tượng cá nuôi.
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi
khuẩn P. damselae
Kết quả theo dõi pH thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh độc tố của vi khuẩn
được thể hiện trong hình 3.8 và bảng 3.5.
10

Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của P. damselae
Chủng P. damselae T1.7 sinh trưởng tốt nhất ở khoảng pH từ 8,0 – 8,5 trong khi
chủng P. damselae T4.3 thích nghi với pH thấp hơn ở khoảng 7,5 – 8,0. Kết quả kiểm
định LSD cho thấy ở các độ pH thí nghiệm sinh trưởng của P. damselae, có sự sai khác
ý nghĩa thống kê với p <0,05. Điều này có thể được giải thích là do các vi khuẩn được
phân lập từ các đối tượng sống trong các môi trường khác nhau, do đó khả năng thích
nghi và phát triển của chúng cũng có những sự sai khác nhất định. Hai chủng vi khuẩn
P. damselae T1.7 và T4.3 không sinh độc tố dung huyết ở pH 5 - 6,5; pH từ 7 - 9, cả
hai chủng đều sinh độc tố dung huyết.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn
P. damselae T1.7 và T4.3
Chủng vi khuẩn
pH
P. damselae
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
+
+
+
+
+
T1.7
+

+
+
+
+
T4.3
3.2.3. Ảnh hưởng của độ mặn (NaCl) đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết
của vi khuẩn P. damselae
Kết quả theo dõi được thể hiện trong hình 3.11 và bảng 3.6.

Hình 3.9. Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
P. damselae phân lập
11


Kết quả trong hình 3.9 cho thấy: độ mặn thích hợp nhất cho các chủng vi khuẩn P.
damselae thí nghiệm sinh trưởng là từ 1 – 2,5%, độ mặn càng cao thì khả năng sinh
trưởng của vi khuẩn giảm dần và thấp nhất ở nồng độ 6%. Kết quả kiểm định LSD cho
thấy sinh trưởng của P. damselae ở các nồng muối thí nghiệm có sự sai khác ý nghĩa
thống kê với p <0,05. Hai chủng vi khuẩn này thích nghi tốt trong điều kiện nước mặn và
nước lợ. Ở nồng độ muối từ 1 - 5,5%, chúng đều có thể sản sinh độc tố dung huyết (Bảng
3.6). Như vậy, mặc dù tốc độ tăng trưởng chậm nhưng ở điều kiện bất lợi, mức độ sản
sinh độc tố của P. damselae là không thay đổi. Ở nồng độ muối 6% có thể do vi khuẩn
không tăng trưởng dẫn đến không có độc tố gây dung huyết.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng gây dung huyết của
vi khuẩn P. damselae T1.7 và T4.3
Chủng vi khuẩn
Nồng độ muối NaCl (%)
P. damselae
1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0
T1.7

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
T4.3
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Ghi chú: (+): có dung huyết ; (-): không dung huyết
3.3. Kết quả tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến giảm độc lực
3.3.1. Kết quả tạo và lựa chọn các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae
đột biến
Từ 03 chủng vi khuẩn P. damselae có độc lực cao là T1.7, T1.8, T4.3, chúng
tôi lựa cho chủng T4.3 thuộc phân loài P. damselae subsp. Damselae để thực hiện các
thí nghiệm gây đột biến giảm độc lực nhằm mục đích tạo chủng vắc xin. Kết quả
được trình bày ở bảng 3.7 và bảng 3.8.
Bảng 3.7. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae nhược độc bằng

tác nhân UV
Thời
Số khuẩn
Chủng vi
gian
lạc sống
TT
Hình thái khuẩn lạc
khuẩn
chiếu
sót
(phút) (CFU/đĩa)
T 4.3
1
0
300
Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm
(chủng gốc)
Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,22
T 4.3U1
1
59
1,8mm
Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,23
T 4.3U2
2
56
1,5mm
Trắng, nhám bám chặt vào bề mặt môi
4

T 4.3U3
3
55
trường D = 1-1,3mm
Trắng, nhám bám chặt vào bề mặt môi
5
T 4.3U4
4
25
trường D = 0,8-1,2mm
Trắng, nhám bám chặt vào bề mặt môi
6
T 4.3U5
5
22
trường D = 0,8-1mm
Trắng, nhám bám chặt vào bề mặt môi
7
T 4.3U6
10
10
trường D = 0,7-1mm
12


Từ kết quả bảng 3.7, chúng tôi lựa chọn 112 dòng tế bào thu được sau đời xử lý
UV thứ 3, với biểu hiện biến đổi hình thái khuẩn lạc để kiểm tra mức độ giảm độc lực.
Bảng 3.8. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae nhược độc bằng tác nhân kháng
sinh Rifampicin

TT

Chủng
vi khuẩn

Nồng độ
kháng
sinh
(µg/ml)

1

T 4.3
(chủng
gốc)

0

300

Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm

2

T 4.3K1

5

107

Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm

3

T 4.3K2

10

98

Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm

4

T 4.3K3

25

77

Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm

5

T 4.3K4

50

53

Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm

T 4.3K5

100

33

Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,41,8mm

7

T 4.3K6

150

25

Trắng,tròn, bóng D = 1,2-1,8mm

8

T 4.3K7

200

17

Trắng, tròn, bóng D = 1,2-1,8mm

9

T 4.3K8

250

8

Trắng, tròn, bóng D = 1,2-1,5mm

6

Số khuẩn
lạc sống
sót
(CFU/đĩa)

Hình thái khuẩn lạc

Từ kết quả trong bảng 3.8, chúng tôi lựa chọn 50 dòng tế bào thu được sau đời
xử lý rifampicin thứ 6, với biểu hiện biến đổi hình thái khuẩn lạc để kiểm tra mức độ
giảm độc lực.
3.3.2. Kết quả đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng vi khuẩn
Photobacterium damselae đột biến
3.3.2.1. Đánh giá mức độ giảm khả năng gây dung huyết của các dòng vi khuẩn
Photobacterium damselae đột biến
Độc tố dung huyết (haemolysis) là một trong những yếu tố gây bệnh chủ yếu
của vi khuẩn P. damselae đối với vật chủ. Kết quả thu được ở bảng 3.9 và hình 3.12.

13

Bảng 3.9. Kết quả khả năng dung huyết của các dòng P. damsela đột biến
Số lượng
Số lượng các dòng gây dung huyết ở các ở các độ pha
Dòng vi
các dòng
loãng độc tố
khuẩn
không gây
¼
1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
dung huyết ½
Vi khuẩn xử
2
lý UV
(T4.3U5, 110 110 110 110 110 110
92
87
72
(n= 112)
T4.3U6)
4
Vi khuẩn xử
(T4.3K6,
lý rifampicin
T4.3K7,
46 46
46 46
46

41
38
35
31
(n=50)
T4.3K8.1,
T4.3K8.2)
Kết quả thu được cho thấy, có 06 dòng vi khuẩn không gây dung huyết trên
thạch máu cừu, trong đó 4 dòng vi khuẩn T4.3K6, T4.3K7, T4.3K8.1, T4.3K8.2 được
tạo ra bởi phương pháp gây đột biến bằng rifampicin, 02 dòng vi khuẩn T4.3U5,
T4.3U6 được tạo ra bởi phương pháp gây đột biến bằng tia UV, 146 dòng vi khuẩn
còn lại có biểu hiện thay đổi hình thái khuẩn lạc đều gây dung huyết trên thạch máu
cừu ở mức độ cao. Hầu hết các dòng này đều gây dung huyết ở nồng độ pha loãng
độc tố là 1/64. Ở các độ pha loãng 1/132, 1/256, 1/512, số lượng các dòng gây dung
huyết giảm, lần lượt là 92, 87, 72 dòng xử lý UV và 38, 35, 31 dòng xử lý rifampicin
(bảng 3.9). Kết quả này chứng tỏ các tác nhân gây đột biến có ảnh hưởng và làm
giảm độc lực của độc tố dung huyết ở một số dòng vi khuẩn được tạo ra, tuy nhiên
mức độ không nhiều. Trong đó 6 dòng vi khuẩn không còn độc tố dung huyết được
sử dụng để đánh giá khả năng gây bệnh trên cá mú để chứng minh mức độ giảm độc
lực của chúng.
3.3.2.2. Đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng vi khuẩn Photobacterium
damselae đột biến
Vi khuẩn không gây dung huyết hồng cầu cừu bao gồm (6 dòng): T4.3K6,
T4.3K7, T4.3K8.1, T4.3K8.2, T4.3U5, T4.3U6 được sử dụng để đánh giá mức độ
giảm độc lực so với dòng tự nhiên T4.3. Nhìn chung, 6 dòng đột biến (T4.3K6,
T4.3K7, T4.3K8.1, T4.3K8.2, T4.3U5, T4.3U6) đều giảm độc lực đáng kể so với
chủng giống gốc. LD cá gây nhiễm với chủng tự nhiên T4.3 có biểu hiện chết nhanh
trong vòng 3-7 ngày, với các đặc điểm đặc trưng của bệnh xuất huyết nhiễm trùng
do vi khuẩn P. damselae gây ra như: cá giảm ăn, hoạt động bơi bị rối loạn. Cơ thể
có màu đen đặc biệt ở vùng lưng và trên các vết thương tổn da, vây có thể sưng lên

và bị lở loét. Mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục, lớp cơ dưới da có nhiều sắc tố melanin
màu đen và thể hiện dấu hiệu hoại tử, có hiện tượng lở loét của lớp biểu bì. Lá lách,
gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử này lan nhanh, hoá lỏng và lá lách sẽ có màu đỏ anh
đào, rồi mất dần hình dạng ban đầu của nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu
vàng. Các cơ quan bên trong khoang bụng xuất huyết, tim cá bị bệnh xuất hiện các
vết nâu đen.
So sánh độc lực của 06 dòng đột biến chúng tôi nhận thấy: dòng T4.3K7 có
LD50= 107,49, 05 dòng T4.3K6, T4.3K8.1, T4.3K8.2, T4.3U5, T4.3U6 có LD50 lần
14


lượt là 109,02, 1010, 1011,03, 1010,07, 1011,02. Theo Esteve et al. (1993), vi khuẩn được
xem như không có độc lực khi có giá trị LD50 ≥ 108 CFU/ml [57]. Kết quả trên chứng
tỏ 05 dòng T4.3K6, T4.3K8.1, T4.3K8.2, T4.3U5, T4.3U6 không còn độc lực. Trong
nghiên cứu này, hai dòng T4.3K8.2, T4.3U6 có giá trị LD50 = 1011,03 và 1011,02 được
chúng tôi lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo xác định đặc điểm sinh hóa,
đặc điểm đột biến, mức độ an toàn và khả năng kích thích miễn dịch đặc hiệu ở cá.
3.3.3. Kết quả đánh giá mức độ an toàn của vi khuẩn Photobacterium damselae đột
biến giảm độc lực trên cá mú
3.3.3.1. Biểu hiện của cá thí nghiệm
Bảng 3.11. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của cá thí nghiệm
Lô đối
Biểu hiện
T4.3 T4.3K8.2 T4.3U6
chứng
Tỷ lệ chết (%)

100

8

4

2

Xuất huyết thân, miệng, mang, vây (%)

100

2

0

0

Hoại tử, lở loét trên thân (%)

100

0

0

0

Mắt đục (%)

100

16

0

0

Phản xạ bắt mồi chậm (%)

100

12

0

0

Thay đổi sắc tố da (%)

100

12

0

0

Thay đổi tập tính bơi lội (%)

100

8

4

2

Với cùng liều gây nhiễm là 100 LD50, các dòng đột biến T4.3K8.2 và T4.3U6
gây chết cá với tỷ lệ tương ứng là: 8% và 4%, cá chết sau gây nhiễm 20-25 ngày và
không có các biểu hiện như mô tả của Hawke, (1996) [81].

Hình 3.13. Biểu hiện bệnh tích bên ngoài của cá mú gây nhiễm chủng
P. damselae T4.3 (liều tiêm 100 LD50, sau 7 ngày)
3.3.3.2. Biểu hiện bệnh tích đại thể
Các tổn thương đại thể ở các lô cá được gây nhiễm bởi chủng P. damselae
tự nhiên T4.3 chủ yếu tập trung ở lách, gan, thận và tim, 100% cá thí nghiệm có
các biểu hiện bệnh tích. Các cơ quan này có biểu hiện sưng to bất thường (gấp 415


10 lần so với đối chứng) và xuất hiện các hạt màu trắng (hình 3.14), tỷ lệ cá có
biểu hiện bệnh tích ở gan chiếm 94%, lách chiếm 96%, thận chiếm 96%, tim
chiếm 30% tương ứng (Bảng 3.12)
Bảng 3.12. Biểu hiện bệnh tích do P. damselae trên cá thí nghiệm
Chủng vi
Số cá có bệnh Tỷ lệ cá có bệnh Cơ quan
Tần suất xuất
khuẩn thí
tích điển hình
tích điển hình
có bệnh
hiện bệnh tích
nghiệm

(n)
(%)
tích
(%)
Gan
94,00
Lách
96,00
T4.3
50
100
Thận
96,00
Tim
30,00
Gan
4,00
Lách
4,00
T4.3K8.2
2
4,00
Thận
4,00
Tim
2,00
Gan
0
Lách
0

T4.3U6
0
0
Thận
0
Tim
0
Gan
0
Lách
0
Đối chứng
0
0
Thận
0
Tim
0
Từ kết quả trong bảng 3.12 và 3.14 cho thấy: các trường hợp cá chết sau khi
gây nhiễm dòng T4.3U6 có thể là do tác động cơ học trong quá trình tiêm chứ không
liên quan đến độc lực của vi khuẩn.

Hình 3.14. Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của
cá gây nhiễm

16


(A: Thận sưng to bất thường, xuất huyết, có các u hạt màu trắng; B, C: Gan sưng bất
thường, có các điểm hoại tử; 1 và 2: Gan cá gây nhiễm chủng P. damselae tự nhiên;

3: Gan cá đối chứng)
3.3.3.3. Biểu hiện bệnh tích vi thể
Bảng 3.13. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của cá thí nghiệm
(Đơn vị tính: %)
Chủng vi khuẩn thí nghiệm
Gan
Lách
Thận
Tim
T4.3
100,00
100,00
100,00
32,00
T4.3K8.2
24,00
22,00
18,00
12,00
T4.3U6
2,00
2,00
2,00
Đối chứng
-

Hình 3.15. Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của cá gây nhiễm
(A: Tổn thương hoại tử trong tổ chức gan cá gây nhiễm chủng T4.3; B) Tổn thương
hoại tử ở mô thận cá gây nhiễm chủng; T1.7 C) Sự tăng sinh của các đại thực bào
trong mô lách ở cá gây nhiễm chủng T4.3U6)

Đối với các lô cá gây nhiễm với hai dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực
T4.3K8.2 và T4.3U6, tỷ lệ cá có bệnh tích giảm rõ rệt. Với các kết quả thu được có
thể thấy, dòng vi khuẩn T4.3U6 an toàn đối với cá thí nghiệm, có thể sử dụng để phát
triển sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm
trùng) ở cá.
3.3.3.4. Đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn sau khi gây nhiễm
Dựa trên các kết quả thu được, chúng tôi đã xác định các chủng phân lập lại có
đặc tính sinh hóa hoàn toàn giống với chủng vi khuẩn sử dụng để gây nhiễm và thuộc
loài P. damselae subsp. Damselae (Bakopoulos et al., 1995) [35].
3.3.4. Kết quả phân tích kiểm tra đột biến của các chủng vi khuẩn Photobacterium
damselae nhược độc
Kết quả PCR khuếch đại các gen độc tố và hlyA được thể hiện trong hình 3.16
và 3.17. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR cho thấy, đã khuếch đại thành công 2 gen
này, với kích thước là 540bp và 1480bp, tương ứng với kích thước lý thuyết của các
17


gen và hlyA.

Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen hlyA của chủng giống gốc
và các dòng gây giảm độc lực
(1: T4.3, 2: T4.3K8.2, 3: T4.3U6, M: 200 bp DNA ladder)

Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen của chủng giống gốc và
các dòng gây giảm độc lực
(1: T4.3, 2: T4.3K8.2, 3: T4.3U6, M: 100 bp DNA ladder)
3.3.4.1. Kết quả phân tích sai khác di truyền của các gene độc tố của các dòng vi
khuẩn P.damselae giảm độc lực
3.3.4.1.1. Gen hlyA
* So sánh trình tự đoạn gen hlyA của các chủng gốc so với các trình tự

tương đồng trên Genbank
Kết quả trong hình 3.18 và bảng 3.15 cho thấy gen hlyA của chủng T4.3
và trình tự hlyA từ Genbank với kích thước gen giống nhau là 1484bp, mức độ tương
đồng của hai trình tự này là 99%. Kết quả này có thể khẳng định đã khuếch đại thành
công gen hlyA.

18


Bảng 3.15. So sánh độ tương đồng gen hlyA Genbank so với chủng P.damselae T4.3
Số hiệu gen

Tổng số Tỉ lệ che Mức ý Độ tương
điểm
phủ
nghĩa
đồng

Chủng

Query_ KF984030.1
P.damselae T4.3
2614
99%
0.0
99%
* So sánh trình tự đoạn gen hlyA và trình tự protein suy diễn của các
chủng đột biến so với các trình tự hlyA và protein suy diễn của chủng gốc
+ Về trình tự nucleotide
So sánh trình tự gen hlyA của 2 dòng đột biến T4.3K8.2 và T4.3U6 với chủng

gốc P.damselae T4.3 thu được kết quả cho thấy gen hlyA của cả 2 dòng đột biến
T4.3K8.2 và T4.3U6 so với chủng gốc T4.3 đều có kích thước 1484bp. Tuy nhiên, ở
dòng T4.3U6 có một số điểm sai khác trong trình tự gen, cụ thể thiếu Thymine và
Guanine ở vị trí 14 và 16, thêm Thymine ở vị trí 912, thêm Cytosine ở vị trí 1378.
Như vậy, xét về trình tự gen, dòng T4.3U6 có sự thay đổi trong gen hlyA đáng kể so
với chủng gốc T4.3. Vùng mã hoá có khởi đầu từ vị trí 842 đến vị trí 1298 với kích
thước 456bp. Từ kết quả phân tích sai khác di truyền cho thấy hiện tượng thêm, mất
một số nucleotide là nguyên nhân làm xuất hiện bộ ba mã hóa kết thúc UGA sớm tại
vị trí 842bp. Với kết quả thu được, chúng tôi nhận định rằng, sự xuất hiện mã kết
thúc sớm tại vị trí 842 của gen hlyA ở dòng T4.3U6 là nguyên nhân tạo nên tính giảm
độc lực ở chủng này so với chủng gốc T4.3 gốc.
Đối với dòng T4.3K8.2, trình tự gen hlyA của dòng này so với chủng gốc T4.3
có sự sai khác trình tự nucleotide ở đoạn từ vị trí 9 – 25, từ 69 – 100, từ 1459 – 1525
và vị trí 1484 tạo nên đột biến dịch khung làm xuất hiện muộn vị trí mã bộ ba mã mở
đầu UAG ở vị trí 25bp tạo nên kích thước đoạn mã hoá protein chỉ đạt 1233 bp.
+ Về trình tự aminoacid
Từ kết quả phân tích, so sánh trình tự gen hlyA ở hai dòng giảm độc lực T4.3U6
và T4.3K8.2 so với chủng gốc P.damselae T4.3, bằng việc sử dụng phần mềm CLC
genomics Workbench 8.5 xây dựng được trình tự protein suy diễn của gen hlyA.
Kết quả cho thấy, trình tự aminoacid của hai dòng giảm độc lực T4.3U6 và
T4.3K8.2 so với chủng gốc P.damselae T4.3 có sự sai khác rõ rệt. Trình tự protein
suy diễn gen hlyA của dòng T4.3K8.2 xuất hiện bộ ba mã hóa kết thúc tại vị trí amino
acid 486 và trình tự protein suy diễn của dòng T4.3U6 xuất hiện vị trí bộ ba mã hóa
kết thúc dịch mã protein xuất hiện sớm ở vị trí amino acid 198. Các kết quả này là
minh chứng để chứng tỏ có hiện tượng đột biến gen độc tố hlyA ở hai dòng vi khuẩn
giảm độc lực T4.3U6 và T4.3K8.2.
Mặc dù vậy, như dẫn chứng ở trên, khả năng dung huyết hồng cầu cá và hồng
cầu cừu có thể là sự kết hợp của gen hlyA và . Vì vậy, chúng tôi tiếp tục kiểm tra sự
đột biến của gen của hai dòng dòng giảm độc lực T4.3U6 và T4.3K8.2 so với chủng
gốc P.damselae T4.3.

19


3.3.4.1.2. Gen
* So sánh trình tự đoạn gen của các chủng gốc so với trình tự trên
Genbank
Kết quả trong hình 3.24 và bảng 3.16 cho thấy gen của chủng gốc P.damselae
T4.3 và trình tự gen của Genbank có kích thước gen bằng nhau là 540 bp, mức độ
tương đồng của hai trình tự này là 100%. Kết quả này có thể khẳng định đã khuếch
đại thành công gen .
Bảng 3.16. So sánh độ tương đồng gen Genbank so với chủng
P.damselae T4.3
Số hiệu gen

Chủng

Tổng
số
điểm

Query_KX589487.1

P.damselae T4.3

2614

Tỉ lệ
che
phủ

Mức ý
nghĩa

Độ
tương
đồng

99%

0.0

100%

* So sánh trình tự đoạn gen của các dòng đột biến với chủng gốc
So sánh với các trình tự gen của các dòng đột biến T4.3K8.2 và T4.3U6 với
trình tự của chủng gốc T4.3 cho thấy dòng T4.3K8.2 tương đồng 100% so với chủng
gốc, dòng T4.3U6 có sự khác biệt đáng kể một số vị trí trong khoảng 415 đến 530 bp
do xuất hiện Guanine ở vị trí 415 tạo nên đột biến dịch khung dẫn đến xuất hiện mã
bộ ba kết thúc sớm UAA trong vùng mã hóa protein dẫn đến vùng mã hóa protein chỉ
kéo dài từ vị trí 1 đến 427bp ngắn hơn kích thước bình thường 540bp (Hình 3.23).
* So sánh trình tự protein suy diễn mã hóa bởi gen của các dòng đột biến
với chủng gốc
Từ trình tự trong gen ở các dòng T4.3K8.2 và T4.3U6 so với chủng gốc T4.3 nhóm
nghiên cứu đã xây dựng và so sánh trình tự protein suy diễn gen của các chủng này.
Kết quả trong hình 3.24 cho thấy, trình tự aminoacid của dòng giảm độc lực
T4.3U6 có sai khác khá lớn so với chủng gốc P.damselae T4.3, xuất hiện bộ ba mã
hóa kết thúc tại vị trí aminoacid số 142 trong khi đó trình tự aminoacid của dòng
T4.3K8.2 không có sự khác biệt so với chủng gốc. Từ kết quả trong hình 3.25 và 3.26
chứng tỏ, có hiện tượng đột biến ở dòng T4.3U6, cùng với kết quả phân tích sự sai
khác về trình tự gen hlyA ở dòng vi khuẩn này, chúng tôi có thể đi đến kết luận rằng,

sự giảm độc lực ở dòng T4.3U6 là do hiện tượng đột biến các gen độc tố gây nên.
Kết quả thu được trong nghiên cứu này cho thấy: hai dòng vi khuẩn T4.3K8.2
và T4.3U6 đột biến giảm độc lực và không có còn khả năng gây dung huyết hồng cầu
cừu có chứa gen mã hóa damselysin, tuy nhiên yếu tố này không quyết định tới khả
năng gây dung huyết của các dòng đột biến cũng như chủng giống gốc T4.3. Như
vậy, so sánh kết quả phân tích đột biến trong gen hlyA và của chủng giống gốc T4.3
và hai dòng đột biến giảm độc lực T4.3K8.2 và T4.3U6 với khả năng gây dung huyết
20


hồng cầu cừu và mức độ an toàn của các dòng đột biến chúng tôi có thể kết luận rằng:
gen hlyA quyết định độc lực của chủng P. damselae subsp. damselae T4.3. Dưới tác
động của tia cực tím và kháng sinh rifampicin, sự đột biến gen này dẫn tới thay đổi về
cấu trúc của phân tử protein được mã hóa độc tố gây dung huyết và là nguyên nhân
gây mất độc lực của các dòng vi khuẩn T4.3K8.2 và T4.3U6.
3.4. Nghiên cứu mức độ tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn P. damsalae
đột biến giảm độc lực
3.4.1. Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể đặc hiệu
Hàm lượng kháng thể đặc hiệu ở cá sau khi được tiêm vi khuẩn nhược độc và
vô hoạt được đánh giá bằng phương pháp ELISA. Kết quả trình bày trong hình 3.25.

Hình 3.25. Biến thiên mức độ hình thành kháng thể đặc hiệu ở cá được tiêm vi khuẩn
nhược độc và vô hoạt
( Độ pha loãng huyết thanh: 1/200; (1): vi khuẩn nhược độc, (2): vi khuẩn vô hoạt;
A+E: 108CFU/ml, B+F: 107CFU/ml, C+G: 106CFU/ml, D+H: 105CFU/ml)
Ở các lô cá được tiêm vi khuẩn nhược độc, mức độ hình thành kháng thể ở các
lô cá là tương tự nhau, đồng thời đáp ứng miễn dịch ở cá được duy trì trong suốt 120
ngày theo dõi thí nghiệm. Với liều tiêm từ 108-105CFU/ml, giá trị OD đạt được của
tất cả các lô thí nghiệm dao động trong khoảng 0,38-0,395 trong suốt 120 ngày sau
khi gây miễn dịch. Đối với các lô cá được tiêm vi khuẩn vô hoạt, mức độ hình thành

kháng thể của cá đạt cao nhất ở ngày thứ 30 sau khi tiêm và giảm nhanh chóng trong
quá trình theo dõi thí nghiệm và đạt mức tối thiểu sau 90 gây miễn dịch.
3.4.3. Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể bảo hộ
Kết quả phân lập vi khuẩn P. damselae gây bệnh xuất huyết nhiễm trùng ở cá
biển chúng tôi đã thu được 05 chủng vi khuẩn T1.7, T4.2, T4.4, B5.22, B10.25 thuộc
phân loài P. damselae subsp. Piscida và 02 chủng vi khuẩn T4.3 và T1.8 thuộc phân
21


loài P. damselae subsp. Damselae. Như vậy, có thể kết luận sơ bộ rằng bệnh xuất
huyết nhiễm trùng trên cá biển ở Việt Nam có thể do cả 2 phân loài P. damselae gây
nên. Vì vậy, vắc xin phòng bệnh nhất thiết phải có khả năng kích thích tạo miễn dịch
đối với cả hai tác nhân này.
Để đánh giá khả năng tạo kháng thể bảo hộ của dòng P. damselae subsp.
Damselae T4.3U6, hai chủng vi khuẩn T1.7 và T1.8 có độc lực cao (LD50= 103,38 và
104,76) thuộc 2 phân loài P. damselae subsp. Piscida và P. damselae subsp.
Damselae được sử dụng để thử thách công cường độc, liều thử thách là 5x108 (tương
đương với 5x1000LD50). Kết quả đánh giá mức độ kích thích tạo kháng thể bảo hộ
của dòng vi khuẩn P. damselae T4.3U6 được trình bày ở hình 3.26 và 3.27.

Hình 3.26. Tỷ lệ sống của cá được công cường độc với chủng T1.8 sau khi tiêm vi
khuẩn nhược độc và vô hoạt
(Liều công cường độc: 5x108 CFU/con; Liều gây miễn dịch: A+E: 108CFU/ml, B+F:
107CFU/ml, C+G: 106CFU/ml, D+H: 105CFU/ml; (I): Gây miễn dịch với vi khuẩn
nhược độc T4.3U6; (II) Gây miễn dịch với vi khuẩn T4.3)

22


Hình 3.27. Tỷ lệ sống của cá được công cường độc với chủng T1.7 sau khi tiêm vi

khuẩn nhược độc và vô hoạt
(Liều công cường độc: 5x108 CFU/con; Liều gây miễn dịch: A+E: 108CFU/ml, B+F:
107CFU/ml, C+G: 106CFU/ml, D+H: 105CFU/ml; (I): Gây miễn dịch với vi khuẩn
nhược độc T4.3U6; (II) Gây miễn dịch với vi khuẩn T4.3)
Số liệu trong hình 3.28 và hình 3.29 cho thấy: vi khuẩn nhược độc P. damselae
T4.3U6 có khả năng bảo hộ cá đối với bệnh tụ huyết trùng do các phân loài P.
damselae subsp. Damselae và P. damselae subsp. Piscida gây ra.Từ kết quả thu
được của thí nghiệm nghiên cứu mức độ an toàn, khả năng tạo kháng thể bảo hộ của
dòng vi khuẩn nhược độc hiệu quả vượt trội của việc sử dụng vi khuẩn nhược độc P.
damselae subsp. Damselae T4.3 chúng tôi có thể kết luận: chủng vi khuẩn này có thể
sử dụng đề sản xuất vắc-xin phòng bệnh xuất huyết nhiễm trùng cho cá biển, mật độ
vi khuẩn thích hợp để sản xuất vắc-xin là 107 CFU/ml.

23