Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) đối với hoạt chất quinclorac ở Đồng bằng Sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
Mã ngành: 9620112

LÊ DUY
NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG VÀ CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC
CỦA CỎ LỒNG VỰC NƯỚC (Echinochloa crus-galli (L.)
Beauv.) ĐỐI VỚI HOẠT CHẤT QUINCLORAC
TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

Cần Thơ, 2018


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Minh Chơn

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ
cấp trường
Họp tại: Hội trường …….; Khoa………………..…….
……………………; Trường Đại học Cần Thơ.
Vào lúc ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm …..

Phản biện 1: ………………………………………………
Phản biện 2: ………………………………………………
Phản biện 3: : ………………………………………………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ.
Thư viện Quốc gia Việt Nam.


CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ

1. Duy Le, C. M. Nguyen, R. K. Mann, C. N. Yerkes and B. V.
N. Kumar. 2017. Genetic diversity and herbicide resistance of
15 Echinochloa crus-galli populations to quinclorac in
Mekong Delta of Vietnam and Arkansas of United States.
Journal of Plant Biotechnology, 44: 472-477.
2. Duy Le, C. M. Nguyen, R. K. Mann, B. V. N. Kumar and
M. Morell. 2018. Efficacy of Rinskor (florpyrauxifen-benzyl
ester) on Herbicide Resistant Barnyardgrass (Echinochloa
crus-galli) in Rice Fields of Mekong Delta, Vietnam. Journal
of Crop Science and Biotechnology, 21: 75-81.
3. Duy Le, C. M. Nguyen, B. V. N. Kumar and R. K. Mann.
2018. Weed management practices to control herbicideresistant Echinochloa crus galli in rice in Mekong Delta,
Vietnam. Research On Crops , 19: 20-27.


Chương 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cỏ lồng vực (Echinochloa crus-galli) được xem là một trong
những loài cỏ dại quan trọng nhất trên ruộng lúa, do là cây C4 nên cỏ
lồng vực có khả năng phát triển lấn át cây lúa trên ruộng. Ngoài ra cỏ
lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) và cỏ lồng vực cạn
(Echinochloa colona) còn có khả năng “bắt chước” hình thái của cây
lúa ở giai đoạn đầu. Do đó, việc phân biệt và nhổ cỏ bằng tay ở giai
đoạn này trở nên khó khăn hơn. Sử dụng thuốc cỏ là một biện pháp

giúp kiểm soát cỏ lồng vực một cách hiệu quả, tuy nhiên, cỏ lồng vực
kháng thuốc đã trở thành vấn đề nghiêm trọng trên ruộng lúa. Cỏ lồng
vực có khả năng kháng với nhiều hoạt chất trừ cỏ trên thị trường.
Trong điều kiện hiện nay việc nghiên cứu sâu hơn về tính kháng thuốc
của cỏ lồng vực là cần thiết. Do đó, luận văn “Nghiên cứu tính kháng
và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli)
đối với hoạt chất quinclorac ở Đồng bằng Sông Cửu Long” đã được
thực hiện.
1.2 Mục tiêu của luận văn
(1) Đánh giá đa dạng hình thái và đa dạng di truyền của quẩn
thể cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) ở Đồng bằng Sông Cửu Long
(ĐBSCL).
(2) Đánh giá tính kháng của cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) với
bispyribac, penoxsulam và quinclorac trên ruộng lúa ở ĐBSCL.
(3) Giải thích cơ chế kháng quinclorac ở mức sinh hóa và mức
độ di truyền phân tử của cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli).
1.3 Các nghiên cứu của luận văn
(1) Khảo sát tập quán canh tác lúa và quản lý cỏ dại ở ruộng lúa
tại ĐBSCL.
(2) Đánh giá sự đa dạng của quần thể cỏ lồng vực (Echinochloa
spp.) ĐBSCL.
(3) Đánh giá mức độ kháng bispyribac-sodium, penoxsulam và
quinclorac của các mẫu cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) bằng phương
pháp thử bằng dãy nồng độ của thuốc.

1


(4) Đánh giá hiệu quả của, hoạt chất trừ cỏ mới chuyên dùng
cho cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) kháng thuốc để kiểm soát quần

thể cỏ lồng vực kháng thuốc.
(5) Dùng phân tích RAPD để đánh giá đa dạng gene của quần
thể cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli), sự tương quan giữa
các quần thể cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) kháng
quinclorac và khoảng cách gene giữa các quần thể cỏ lồng vực nước
(Echinochloa crus-galli) ở ĐBSCL.
(6) Đo lường hoạt tính của enzyme β-cyanoalanine synthase
(CAS) trong mô lá cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) để tìm
ra cơ chế kháng quinclorac ở mức sinh hóa của cỏ lồng vực nước.
1.4 Thời gian và địa điểm
Luận văn được tiến hành từ 2014 đến 2018.
Thí nghiệm 1; 2 và 3 được tiến hành tại khoa Nông nghiệp và
Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ; Nghiên cứu 4; 5 và 6 được tiến
hành tại Trung tâm nghiên cứu của Dow AgroSciences tại
Indianapolis, Indiana, Hoa Kỳ.
1.5 Tính mới của nghiên cứu
Các nghiên cứu trong luận văn đã xác nhận sự tồn tại của các
quần thể cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) kháng thuốc cỏ ở ĐBSCL.
Nghiên cứu này còn đánh giá sự tương quan giữa tập quán quản
lý cỏ của nông dân và tính kháng thuốc của cỏ, và từ đó đưa ra được
giải pháp thực tiễn để quản lý cỏ hiệu quả.
Cơ chế kháng quinclorac của cỏ lồng vực được xác định và
phân tích sâu ở mức enzyme và di truyền phân tử, thông qua đo lường
mức hoạt động của enzyme giải độc quinclorac và mức độ biểu hiện
gene trên cỏ lồng vực. Kết quả này cung cấp thông tin quan trọng và
đặt nền móng cho những nghiên cứu sâu hơn và sự kháng thuốc ở cỏ
lồng vực.
1.6 Bố cục luận văn
Luận văn bao gồm 102 trang (21 bảng, 38 hình và 202 tài liệu
tham khảo). Trong đó, phần Giới thiệu: 3 trang, Tổng quan tài liệu: 33

trang; Phương tiện và Phương pháp: 18 trang; Kết quả và Thảo luận:
43 trang; Kết luận và đề nghị: 2 trang; Tài liệu tham khảo: 18 trang;
Phụ lục: 42 trang, bao gồm số liệu và hình ảnh.
2


CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Chi Echinochloa gồm hơn 250 loài và hầu hết đều là cỏ dại. Cỏ
lồng vực (Echinochloa spp.) là cây C4 đơn tử diệp, bắt nguồn từ châu
Âu và đã được phát hiện khắp thế giới. Hình thái của Echinochloa
spp. có mức đa dạng cao, trong nhiều trường hợp thường nhằm lẫn
các loài với nhau. Ruộng lúa ở châu Á có 3 loại cỏ lồng vực chủ yếu,
Echinochloa crus-galli, Echinocloa colona, và Echinochloa
glabrescens, các loài này đều được tìm thấy ở Việt Nam.
Thuốc cỏ bispyribac và penoxsulam là hai hoạt chất trừ cỏ
nhóm ức chế enzyme ALS phổ biến trên ruộng lúa, hai hoạt chất này
được sử dụng phổ biến để quản lý lồng vực ở Việt Nam. Quinclorac
là thuốc cỏ nhóm auxin tổng hợp, các thương phẩm chứa quinclorac
được sử dụng rộng để kiểm soát cỏ lồng vực trên ruộng lúa. Rinskor
là hoạt chất mới thuộc nhóm auxin tổng hợp, hoạt chất này chưa được
sử dụng để trừ cỏ ở Việt Nam từ thời điểm bắt đầu luận văn này vào
năm 2014.
Hạt cỏ từ 78 quần thể cỏ lồng vực được thu thập từ ruộng lúa ở
7 tỉnh ĐBSCL. Cây con được trồng từ các hạt thu thập được và sau đó
được xử lý bằng thuốc bispyribac, penoxsulam, quinclorac và rinskor
để xác định liều gây chết 90% quần thể (LD90) và mức độ kháng thuốc
của quần thể. Các nghiên cứu tiếp theo được thực hiện nhằm tìm hiểu
về độ đa dạng di truyền và cơ chế kháng thuốc quinclorac của cỏ, 15
quần thể được chọn để phân tích khoảng cách di truyền bằng phương
pháp RAPD. Hoạt động của CAS cũng được phân tích để xác định

hàm lượng enzyme trong mô lá của 5 quần thể cỏ khác nhau dưới tác
động của quinclorac. Ngoài ra mức thể hiện của mRNA của gene quy
định enzyme cyanoalanide synthase của 5 quần thể cỏ đã được phân
tích bằng phương pháp so sánh 2−ΔCt. Hoạt động của enzyme và mức
thể hiện của mRNA tương ứng trong 5 quần thể đã được đối chiếu để
tìm sự liên quan giữa hai yếu tố này trong mô cỏ sau khi xử lý thuốc.
Kết quả của nghiên cứu này cung cấp thêm kiến thức về cơ chế kháng
quinclorac của cỏ lồng vực.

3


CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thí nghiệm 1. Khảo sát hoạt động canh tác lúa và kiểm soát
cỏ dại ở ĐBSCL, Việt Nam.
Mục tiêu của nghiên cứu: Điều tra tập quán của nông dân về
quản lý cỏ dại trên ruộng lúa ở ĐBCSL.
Hạt của cỏ lồng vực được thu từ 90 ruộng lúa. Sau khi kiểm tra
tỉ lệ nảy mầm trong nhà kính, 78 mẫu được chọn làm thí nghiệm.
Trong công đoạn thu hạt cỏ từ ruộng lúa, đồng thời phỏng tập quán
canh tác của nông dân, 9 câu hỏi sau được dùng trong khảo sát:
- Số vụ lúa canh tác trong năm
- Diện tích ruộng lúa (ha)
- Số lần phun thuốc cỏ mỗi vụ
- Điều kiện quản lý nước tưới
- Hiểu biết về các loại cỏ dại quan trọng trên ruộng lúa
- Những loại thuốc trừ cỏ quan trọng cho cỏ lồng vực.
- Chi phí quản lý cỏ dại cho 1 ha/vụ
- Chi phí phun thuốc cho 1 ha/vụ
- Chi phí nhổ cỏ 1 ha/vụ

Bộ câu hỏi trên được thiết kể để lấy được những thông tin quan
trọng về điều kiện tại ruộng lúa, tập quán quản lý cỏ của nông dân, bộ
câu hỏi trên được hỏi sau khi thu mẫu hạt cỏ trên từng ruộng.
Phân tích thống kê
Sau khi kiểm tra chéo, những thông tin không đủ tin cậy hoặc
không rõ ràng được loại bỏ khỏi bộ số liệu. Bộ số liệu sau cùng được
phân tích với trả lời từ 71 nông dân.
Dữ liệu được phân tích với giá trị trung bình được so sánh bằng
kiểm định Tukey-Kramer test ở mức α=0,05. Phân tích Phương sai
một chiều (Oneway ANOVA) với t-test ở mức P<0,05 được dùng để
phân tích tương quan giữa diện tích ruộng lúa và tập quán nhổ cỏ tay.
Phân tích thống kê bằng phần mềm JMP Pro 13 (SAS).

4


3.2 Thí nghiệm 2. Phân loại quần thể cỏ Echinochloa spp. bằng
đặc điểm hình thái
Mục tiêu nghiên cứu
Phân loại các quần thể Echinochloa spp. bằng các đặc điểm
phân loại đã được công bố trước đó. Mục tiêu của nghiên cứu này là
xây dựng cơ sở dữ liệu về sự đa dạng của các quần thể Echinochloa
spp. ở ĐBSCL trước khi tiến hành nghiên cứu về cơ chế kháng thuốc
của cỏ lồng vực (Echinochloa crus-galli).
Từng loài trong các mẫu cỏ lồng vực thu được được xác định
dựa vào khóa phân loại được đề xuất bởi Pignatty và Carretero – khóa
phân loại được kiểm chứng lại với các đánh giá dựa trên phân tích di
truyền bởi Tabacchi et al. (2006). Các đặc điểm hình thái sau được
ghi nhận: (1) Chiều cao cây: đo từ gốc cây đến lá trên cùng lúc 56
ngày sau nảy mầm; (2) Trọng lượng khô: sinh khối khô (phần trên mặt

đất) lúc 56 ngày sau khi gieo được đo bằng cách phơi cây trong vòng
7 ngày đến khi trọng lượng không thay đổi; (3) Màu sắc đốt thân gốc:
quan sát màu sắc của đốt thân gốc của cây con là xanh lá hay màu đỏ.
(4) Số đốt thân: số đốt được đếm lúc 56 ngày sau nảy mầm; (5) Thời
gian trổ bông: thời gian từ lúc nảy mầm đến lúc hoa đầu tiên nở hoàn
toàn. (6) Chu kỳ sinh trưởng: thời gian từ lúc nảy mầm đến khi hạt
chín; (7) Hình thái bông: chụp hình bông và hạt, sau đó sử dụng tài
liệu tham khảo để xác định tên loài; (8) Định danh dựa trên hình thái
và khóa phân loại nhằm giảm thiểu khả năng sai sót trong khi lựa chọn
mẫu cho các phân tích enzyme và di truyền phân tử về sau. Các thông
tin thu được ban đầu sẽ được sàng lọc để chọn ra quần thể để xác định
đa dạng di truyền, hoạt động enzyme và mức thể hiện gene dưới tác
động của quinclorac.
Phân tích thống kê
Trung bình được so sánh bằng kiểm định Tukey-Kramer test ở
mức α=0,05. Phương sai một chiều (one way ANOVA) với t-test ở
mức P<0,05. Các phân tích được thực hiện bằng phần mềm JMP Pro
13 (SAS).

5


3.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ kháng thuốc của các quần thể
Echinochloa spp. với 3 hoạt chất bispyribac-sodium, penoxsulam
và quinclorac
Mục tiêu của nghiên cứu
Sử dụng phương pháp thử thuốc theo dãy nồng độ để xác định
các quần thể mẫn cảm và quần thể kháng của cỏ lồng vực ở ĐBSCLvà
đánh giá mức kháng của các quần thể với 3 hoạt chất bispyribac,
penoxsulam và quinclorac.

Đánh giá mức kháng thuốc
Ở giai đoạn 3-4 lá, cây cỏ lồng vực được phun lên lá bằng các
loại hoạt chất bispyribac (10% SC), penoxsulam (2.5% OD) và
quinclorac (25% SC) ở 6 liều 0,25X, 0,5X, 1,0X, 2,0X, 4,0X và 8,0X,
với X là liều được khuyến cáo, liều khuyến cáo của bispyribac là 25
g/ha, penoxsulam là 12,5 g/ha, và quinclorac là 250 g/ha.
Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 4 lặp lại. Một
chậu 1 lặp lại và 10 cây 1 chậu.
Thuốc cỏ được phun trong buồng phun thuốc (Máy phun
chuyên dụng SB-8, Devries Manufacturing), áp lực phun chỉnh về
mức 300 L/ha với áp lực 140 kPa. 14 ngày sau phun, tỉ lệ chết được
ghi nhận bằng cách đếm cây còn sống và cây chết hoàn toàn. Các kết
quả ghi nhận được dùng để tính toán giá trị LD90 của từng quần thể
bằng mô hình hồi quy không tuyến tính sử dụng bốn thông số điều
chỉnh (four parameters) của phần mềm GraphPad Prism 7.02 (San
Diego, CA) software. Tính kháng đơn hoặc kháng đa hoạt chất được
tính toán dựa vào đáp ứng của từng quần thể với từng hoạt chất.
Phương pháp tính toán được trình bày chi tiết ở phần xử lý số liệu.
Phân tích thống kê
Tỉ lệ chết theo liều thuốc cỏ được dùng để tính theo hàm sau:
𝑎−𝑏
𝑦=𝑎+
(𝑙𝑜𝑔
𝐿𝐷90−𝑥)∗𝑒
1 + 10
Y: tỉ lệ chết; X: liều quinclorac; LD90: liều dự kiến giết 90% cá thể
trong quần thể; a: ngưỡng dưới; b: ngưỡng trên; e: độ dốc của đồ thị
Tính kháng của cỏ lồng vực được phân hạng theo phần trăm cá
thể bị chết ở liều khuyến cáo. Bảng phân hạng R được dùng dựa theo
nghiên cứu của Moss et al. (2007). Trong đó, quần thể mẫn cảm (S)

6


có tỉ lệ chết khoảng 81-100%; R? (có thể đã kháng thuốc) cho mức
kiểm soát 72-80%; RR có tỉ lệ chết khoảng 36-71% và RRR có tỉ lệ
chết khoảng 0-35%. Sự tương quan giữa các nhân tố thí nghiệm được
phân tích bằng phương pháp hồi quy và tương quan Pearson. Phân
tích hồi quy và đường hồi quy được xử lý bằng phần mềm JPM Pro
13 (SAS).
3.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá hiệu quả của hoạt chất rinskor cho
quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc.
Mục tiêu nghiên cứu
Sau khi sàng lọc tính kháng với các hoạt chất bispyribac,
penoxsulam và quinclorac, 78 quần thể cỏ lồng vực được xử lý thuốc
bằng cách phun lên lá với rinskor 2.5% với liều 0,25X, 0,5X, 1,0X,
2,0X, 4,0X và 8,0X. Liều 1,0X là 25 g/ha. Phần trăm (%) cỏ chết được
ghi nhận lúc 14 ngày sau xử lý thuốc.
Kết quả của thí nghiệm này được dùng để đưa ra khuyến nghị
về giải pháp kiểm soát cỏ lồng vực hiệu quả ở ĐBSCL
Phân tích thống kê
Phương pháp tính giá trị LD90 và mức kháng thuốc giống với
phương pháp được dùng ở thí nghiệm 3.
3.5 Thí nghiệm 5: So sánh hoạt tính của enzyme β-cyanoalanine
(CAS) ở quần thể cỏ lồng vực nước mẫn cảm và quần thể cỏ lồng
vực kháng quinclorac để nghiên cứu cơ chế kháng ở mức sinh hóa
Mục tiêu của nghiên cứu
Xác định mức độ kháng của các quần thể cỏ lồng vực nước
bằng mức biểu hiện của β-cyanoalanine trong mô lá của cây sống sót
trong thí nghiệm thử dãy nồng độ với quinclorac.
Chọn quần thể để phân tích và phương pháp xử lý thuốc

Chọn 5 quần thể cỏ lồng vực nước thể hiện tính ổn định cao
nhất với các kiểm tra tính kháng và mẫn cảm quinclorac cho phân tích
enzyme. Ở giai đoạn 3-4 lá, các cây được chọn được xử lý bằng cách
phun quinclorac lên lá với liều 125 g/ha (1/2 liều khuyến cáo để đảm
bảo xử lý thuốc không giết cây mẫn cảm trong quá trình thí nghiệm).
Thuốc cỏ được phun trong buồng phun thuốc (Máy phun
chuyên dụng SB-8, Devries Manufacturing), áp lực phun chỉnh về
mức 300 L/ha với áp lực 140 kPa. Mẫu lúa giống IR50404 ở giai đoạn
7


3-4 lá và 2 quần thể cỏ lồng vực được xác định là kháng và mẫn cảm
quinclorac được thu từ Arkansas Hoa Kỳ cũng được đưa vào thí
nghiệm để phân tích hoạt tính enzyme.
Xác định hoạt tính enzyme CAS trong mô lá
Hoạt tính của enzyme CAS trong mô lá cỏ lồng vực nước được
phân tích bằng phương pháp của Chon et al. (2008):
- 1 gram lá tươi từ 4 cây trong mỗi quần thể được thu lúc 1 giờ
và 3 ngày sau khi phun thuốc
- Mẫu lá được ngâm và đông lạnh nhanh bằng nitơ lỏng sau đó
được nghiền với TissueLyzer II (Qigen), mô lá được trộn đều ở
mức 30 vòng lắc trong 1 giây trong vòng 1 phút. Quá trình trộn
này được tiến hành 2 lần và đảo chiều 2 lần để đảm bảo mẫu
trộn đồng đều.
- Ly tâm 10,000 g trong 10 phút ở 4oC.
- Thêm 2,5 mL dung dịch 100 M Tris buffer (pH=8,5) vào từng
vi ống chứa 1 g mẫu mô lá đã được trộn đều.
- Phần dịch trích được dùng để phân tích enzyme.
- 100 mM dung dịch Tris buffer (pH=8,5) được dùng để chuẩn
bị 2 dung dịch 25 mM NaCN và 5mM L-cysteine.

- Dịch trích được để trong 10 phút ở nhiệt độ 30oC, sau đó trộn
với 0,5 ml dịch trích enzyme, 2 ml NaCN, 2 ml L-cysteine và
được ủ 30oC trong 60 phút.
- Sau khi ủ, 1 ml dung dịch được chuyển vào ống ly tâm chứa
sẵn 0,1 ml dung dịch 0,03 M FeCl3 trong dung dịch 1,2 N HCl
và 0,1 ml dung dịch 0,02 M N,N-dimethyl-p-phenylenediamine
sulfate trong dung dịch 7,2 N HCl.
- Mẫu được trữ trong tối trong vòng 20 phút và ly tâm ở 1020 g
trong 5 phút để protein lắng tụ dưới đáy ống.
- Quá trình khử methylene blue bằng hydrogen sulfide được
dùng để xác định hoạt tính của CAS trong mô lá.
- Hoạt tính của enzyme được xác định bằng chỉ số hấp thu
methylene blue ở bước sóng 650 nm và Na2S được dùng làm
thang chuẩn.

8


Hoạt tính của enzyme được thể hiện bằng đơn vị nmol H2S/g lá
tươi/phút. Mỗi mẫu được thực hiện với 4 lặp lại.
Phân tích thống kê
Phân tích enzyme được bố trí hoàn toàn ngẫu nghiên, mỗi mẫu
gồm 4 lặp lại. Dữ liệu của 4 lặp lại được phân tích bằng Tukey-Kramer
Test ở mức α=0,05. Phân tích dữ liệu bằng JPM Pro 13 (SAS).
3.6 Thí nghiệm 6: Xác định đa dạng di truyền giữa quần thể cỏ
lồng vực kháng thuốc và quần thể cỏ mẫn cảm ở ĐBSCL.
Mục tiêu nghiên cứu
Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
được dùng để đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần thể để cung
cấp thông tin giá trị về mức phổ biến và sự phân bố của quần thể cỏ

kháng quinclorac ở ĐBSCL.
Vật liệu nghiên cứu
Từ kết quả của nghiên cứu hình thái, hạt của 15 quần thể cỏ
lồng vực (Echinochloa spp.) được chọn lại. Quá trình chọn lọc dựa
vào từng nhóm loài cỏ và tính kháng quinclorac. 4 quần thể của mỗi
nhóm cỏ được chọn và chỉ chọn quần thể có tính ổn định cao trong
các đợt thử về tính kháng và tính mẫn cảm với quinclorac. Cỏ được
trồng trong nhà kính, thu mẫu lá từ cây mẫu đại diện quần thể vào giai
đoạn 3-4 lá thật.
Phân tách DNA từ mô lá
DNA từ nhân tế bào được trích từ mô lá theo quy trình DNAzol
Reagent (CAS No. 593-84-0, Invitrogen, Thermo Scientific Corp.,
Waltham, MA) như sau:
- Mô lá tươi (1 g) từ cây đại diện của mỗi quần thể được nghiền
nhuyễn trong dung dịch ni tơ lỏng để chuẩn bị trích DNA.
- Mỗi mẫu được nghiền bằng cối và chày sứ, 100g mẫu trộn đều
được chuyển vào ống ly tâm có chứa sẵn DNAzol (1,5 mL) và
RNAse (150 µL).
- Hỗn hợp được trộn và lắc đều trong 5 phút ở 25oC.
- Chloroform (900 µL) được thêm vào và trộn đều trong 5 phút
ở 25oC.
- Hỗn hợp được ly tâm 12000 g trong 10 phút. Phần dịch lỏng
được chuyển sang ống mới.
-

9


- Phần dung dịch được trộn với 100% ethanol (700 µL) để kết
tủa DNA.

- Ống được lật ngược 6-8 lần ở nhiệt độ phòng (25oC) trong 5
phút và ly tâm lại ở mức 5000 g trong 5 phút để lắng DNA.
- DNA kết tủa được rửa sạch bằng dung dịch với tỉ lệ 1:0,75 (v/v)
DNAzol và 100% ethanol (900 µL) bằng cách lắc nhẹ trong 10
giây.
- Dung dịch rửa DNAzol được loại bỏ và thay bằng 75% ethanol
(700 µL, pha bằng nước không chứa nuclease).
- Hỗn hợp được ly tâm ở mức 5000 g trong 4 phút.
- Ethanol sau đó được loại bỏ và tủa DNA được để khô tự nhiên
trong 1-2 phút.
- Mẫu DNA sau đó được hòa tan bằng 50 µL TE buffer, pH 8,0.
- Nổng độ DNA và độ tinh khiết sau đó được kiểm tra bằng cách
đo quang phổ qua máy NanoDrop (Thermo Scientific Corp,
USA).
Phương pháp phân tích đa dạng di truyền RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA)
40 đoạn mồi oligonucleotide 10 bp (được tổng hợp bởi công ty
Integrated DNA Technology, Inc., Coralville, IA) được dùng để phân
tích RAPD.
Tất cả đoạn mồi được dùng cho 15 quần thể Echinochloa spp.
và đánh giá tính lặp lại, độ phân giải và tính đa hình. Dung dịch PCR
Master mix gồm 2,7 µL H20, 1 µL PCR buffer (Invitrogen Cat. No.
18067-017), 80 µL MgCl2, 5 µM primer, 0,25 µL template DNA, 0,05
µL Taq polymerase (0,5 units), và 1 µL dNTP.
PCR được thực hiện bằng máy LightCycler 480 II (Roche
Molecular Diagnostics, Indianapolis, IN) bằng các bước sau:
- Ủ ở 94oC trong 2 phút
- 45 chu kỳ ở nhiệt độ 94oC trong 45 s (ramp rate 4,8oC/s)
- 38oC trong 5 phút (ramp rate of 2,5oC/s)
- 72oC trong 2 phút (ramp rate 4,7oC/s), và 72oC trong 7 phút

- Sản phẩm PCR được phân tích bằng máy LabChip GXII
(PerkinElmer, Waltham, MA)
10


Phân tích thống kê
Khoảng cách di truyền và cây phả hệ của 15 quần thể E. crusgalli dựa trên kết quả điện di của PCR và 6 bộ mồi. Mỗi mẫu điện di,
có băng là 1, không có là 0. Ma trận tương đồng (similarity matrix)
được tính toán bằng Simple Matching Coefficient (SMC) (Sneath &
Sokal 1973). Khoảng cách gene được tính toán bằng công thức 1SMC. Dùng chương trình NT-SYS 2.1 để vẽ cây phả hệ bằng phương
pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method Average).
3.7 Thí nghiệm 7: Đo lường mức thể hiện của mRNA của gene
CAS trong quần thể cỏ lồng vực kháng và mẫn cảm quinclorac.
Mục tiêu của nghiên cứu
Đo lường mức độ biểu hiện của mRNA từ CAS gene trong quần
thể cỏ lồng vực đã được sàng lọc và cây lúa để hiểu về cơ chế kháng
bằng CAS enzyme của quần thể kháng và mẫn cảm.
Quy trình phân tích RT-qPCR
Hai bộ mồi và mẫu dò để phóng đại từng gene được thiết kế
dựa vào trình tự đã biết của enzyme β-cyanoalanine synthase
(LOC100682425) từ lúa mì (Triticum aestivum) và β-Actin synthase
(HQ395760.1) của Echinochloa crus-galli trong bộ cơ sở dữ liệu của
Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Quốc Gia Hoa Kỳ (National Center
for Biotechnology Information, U.S).
Tất cả mẫu dò được thiết kế bằng FAM fluorophore và phản
ứng singleplex. 10 µL dung dịch phản ứng gồm 1,8 µL PCR grade
H20, 5,0 µL Roche Probes Master Mix (11636103001) (Roche), 0,4
µM Forward Primer 0,4 µM Reverse Primer, 0,2 µM Probe và 2,0 µL
dung dịch 1:2 diluted cDNA. Khay Roche 384 giếng được dùng cho
phản ứng qPCR bằng máy Roche Light Cycler 480II. Quy trình PCR

được tiến hành như Bảng 3.2.
Bảng 3.2 Chuỗi phản ứng PCR
Giai đoạn
Hoạt hóa enzyme
Tách chuỗi DNA
Nối chuỗi DNA
Kéo dài
Hạ nhiệt

Nhiệt độ
95oC
95oC
60oC
72oC
45oC

11

Thời gian
10 phút
10 giây
35 giây
1 giây
1 giây

Số chu kỳ
1
40
1

Cơ chế kháng quinclorac chính của cỏ lồng vực nước là kháng
bằng cách phân giải thuốc thông qua cơ chế sinh hóa, không phải
kháng thông qua đột biến của vị trí thuốc gắn vào. Hiện nay, thông tin
về trình tự gen của cỏ lồng vực nước vẫn còn hạn chế. Do đó, việc
giải trình tự của gene quy định vị trí thuốc gắn vào trong các quần thể
kháng quinclorac và mẫn cảm quinclorac sẽ không đủ để giải thích cơ
chế kháng thuốc.
Phương pháp so sánh 2−ΔCt được sử dụng để tính toán mức thể
hiện của CAS gene (Livak và Schmittgen, 2001), gene β-Actin được
sử dụng làm gene tham chiếu. Để đảm bảo không bị nhiễm DNA,
phương pháp no-RT (NRT) đã được sử dụng cho từng mẫu.
Phân tích thống kê
Bốn lặp lại được sử dụng cho mỗi mẫu mRNA. Phần mềm
LC480 (LightRoch) được sử dụng để quản lý số liệu của quá trình thể
hiện gene và vẽ đồ thị cần thiết trong các phân tích. Phần mềm JMP
Pro 13 (SAS software) được sử dụng để thực hiện phân tích Student’s
t-test để so sánh nhóm đối chứng và nhóm được xử lý quinclorac trong
từng mẫu. β-Actin được sử dụng làm gene so sánh để phân tích những
tác động nếu có của quinclorac lên quá trình thể hiện của gene CAS
giá trị Ct của β-Actin được chuyển đổi thành dạng giá trị tuyến tính
bằng cách sử dụng công thức 2-Ct (Livak và Schmittgen, 2001) và giá
trị này được so sánh với nhóm đối chứng và nhóm được xử lý
quinclorac bằng phép kiểm định Student’s t-test (P<0,05).
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thí nghiệm 1. Tập quán sử dụng thuốc cỏ và quản lý cỏ dại
trên ruộng lúa tại ĐBSCL
4.1.1 Tập quán canh tác lúa
Số vụ lúa trung bình mỗi năm tại các địa phương trong nghiên
cứu là 2,7 vụ lúa mỗi năm, kích thước ruộng trung bình khoảng 1,5ha

mỗi ruộng. Số lần phun thuốc cỏ trung bình trong mỗi vụ khoảng 2,3
lần, đánh giá mức điểm trung bình về quản lý nước trong khu vực điều
tra khoảng 2,2 trên thang điểm 1-3, điều này cho thấy đa số các địa
phương đều có thể chủ động quản lý nước tốt.

12


Bảng 4.1: Tập quán canh tác lúa và quản lý cỏ dại tại ĐBSCL
Tỉnh
An Giang
Cần Thơ
Hậu Giang
Kiên Giang
Long An
Tiền Giang
Vĩnh Long
Trung bình
F
CV(%)

Mùa
vụ/năm
2,3c
2,5bc
2,7abc
3,0a
3,0a
3,0a
3,0a

2,7
*
14,5

Diện tích
(ha)
1,6bc
0,9c
1,1c
2,3ab
2,9a
1,3c
0,7c
1,5
*
46,4

Số lần phun
thuốc cỏ/vụ
2,2ab
2,2ab
2,5ab
2,5ab
2,7a
2,0b
2,1ab
2,3
*
25,4

Quản lý
nước*
2,5
1,9
2,2
2,2
2,1
2,8
2,2
2,2
ns
29,7

lơi, mặt bằng ruộng tốt và chủ động được quản lý nước trên ruộng, 2=trung
bình, mặt bằng ruộng tốt và chủ động được nước, nhưng đất không giữ nước tốt,
3=khó khăn, mặt bằng ruộng không bằng phẳng, khó quản lý nước trên ruộng; Các
giá trị trung bình mang các chữ cái bắt đầu giống nhau không khác biệt có ý nghĩa
thống kê ở mức P<0,05 (phép kiểm định Tukey-Kramer).
*1=thuận

4.1.2 Những loài cỏ quan trọng trên ruộng lúa tại ĐBSCL
Bảng 4.3 Phản hồi của nông dân về những loài cỏ khó quản lý bằng
thuốc cỏ và cần nhổ lại bằng tay trên ruộng lúa
Loài cỏ

Số phản hồi

Echinochloa spp.
Fimbristylis miliacea
Leptochloa chinensis

Cyperus spp.
Broadleaf weeds
Tổng cộng

26
12
12
7
4
71

Đánh giá mức độ
quan trọng (%)
42,6
19,7
19,7
11,5
6,6
100%

Cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) là loài cỏ quan
trọng nhất trên ruộng lúa trong điều tra, vì cỏ lồng vực có khả năng
phát triển sinh khối lớn vượt trội so với các loài khác, ngoài ra cỏ lồng
vực còn cho thấy mức độ chống chịu cao đối với nhiều loại thuốc cỏ,
đặc biệt trong điều kiện khó quản lý nước trên ruộng, khi điều kiện
quản lý nước khó khăn sẽ giúp cỏ nảy mầm nhiều đợt và rất khó để
quản lý hiệu quả.
4.1.3 Quản lý cỏ sót và chi phí quản lý cỏ dại trên ruộng lúa tại
ĐBSCL

13


Chi phí trung bình để quản lý cỏ dại tại ĐBSCL khoảng
2.740.000 VND mỗi vụ (Bảng 4.5). Chi phí bao gồm 990.000 VND
cho thuốc cỏ và 1.750.000 VND cho nhổ cỏ bằng tay mỗi vụ, tương
ứng với 654.000 VND và 1.330.000 VND trên mỗi hecta.
Bảng 4.5 Chi phí quản lý cỏ dại trên ruộng lúa tại ĐBSCL
Địa
phương
AG
CT
HG
KG
LA
TG
VL
Avg
F
CV(%)

Chi
phí
quản
lý cỏ
2,75ab
2,05b
1,93b
2,99ab
4,11a

3,36ab
1,83b
2,74
*
16,5

Chi phí
trên
hecta
1,79ab
2,27ab
1,8b
1,34b
1,41b
2,94a
2,35ab
1,99
*
11,3

Chi phí
thuốc
cỏ mỗi
vụ
1,05abc
0,66bc
0,89abc
1,34ab
1,39a
1,06abc

0,51c
0,99
*
17,8

Chi phí
thuốc
cỏ/ha

Chi phí
nhổ cỏ
tay/vụ

Chi phí
nhổ cỏ
tay/ha

0,59ab
0,73ab
0,82a
0,59ab
0,48b
0,715ab
0,64ab
0,65
*
5,4

1,7
1,38

1,03
1,65
2,72
2,29
1,34
1,75
ns
9,6

1,20ab
1,53ab
0,98b
0,75b
0,93b
2,23a
1,71ab
1,33
*
9,2

AG: An Giang, CT: Cần Thơ, HG: Hậu Giang, KG: Kiên Giang, LA: Long An,
TG:Tiền Giang, VL: Vĩnh Long
Đơn vị trong bảng tương ứng với 1.000.000 VND; Các giá trị trung bình mang các
chữ cái bắt đầu giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức P<0,05 (phép
kiểm định Tukey-Kramer).

4.2 Thí nghiệm 2. Kiểu hình và phân phố của Echinochloa spp. tại
ĐBSCL
Đặc điểm kiểu hình của cây
Chiều cao trung bình của cây nhóm 2 là 13,6 cm, cây thuộc

nhóm 2 là nhóm có chiều cao lớn nhất trong cả 3 nhóm. Chiều cao của
nhóm 1 và nhóm 3 khoảng 107,4 cm và 113,6 cm. Cân nặng thân của
cây trong nhóm 2 cũng tương ứng với chiều cao cây, đây là nhóm có
cân nặng trung bình cao nhất trong 3 nhóm, ngoài ra nhóm 2 cũng trổ
bông chậm hơn so với 2 nhóm còn lại. Thời gian sinh trưởng của nhóm
2 vào khoảng 93,4 ngày, cao hơn so với nhóm 1 (80,9 ngày) và nhóm
3 (87,6 ngày). Số lóng trên thân của 3 nhóm không có sự khác biệt
đáng kể, số lóng trung bình của 3 nhóm cỏ vào khoảng 6,3-6,7 lóng ở
giai đoạn trưởng thành.

14


Bảng 4.6 Đặc điểm hình thái của cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) được
thu thập tại ĐBSCL
N
Nhóm 1
Nhóm 2
Nhóm 3
F
CV (%)

41
25
12

Màu
gốc
Đỏ
Xanh

Xanh
-

PH
(cm)
107,4b
134,6a
113,6b
*
9,8

SDW
(g)
14,2b
20,9a
16,4b
*
14,9

PE
(ngày)
49,2b
53,1a
47,3b
*
11,6

GD
(ngày)
80,9b

93,4a
87,6ab
*
8,1

ND
(số)
6,3
6,7
6,7
ns
7,5

PH (Chiều cao cây); SDW (Trọng lượng khô của thân), PE (thời điểm trổ bông), GD
(thời gian sinh trưởng), ND (số lóng trên thân); Các giá trị trung bình mang các chữ
cái bắt đầu giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức P<0,05. (phép
kiểm định Tukey-Kramer).

4.3 Thí nghiệm 3. Tính kháng thuốc của cỏ lồng vực (Echinochloa
spp.) ở ĐBSCL
4.3.1 Tính kháng đơn và kháng đa của các quần thể cỏ lồng vực
(Echinochloa spp.) trong nghiên cứu
Cỏ lồng vực kháng thuốc đã được tìm thấy tại tất cả các địa
phương được nghiên cứu, các quần thể cỏ được kiểm tra cho thấy cỏ
có khả năng kháng với ít nhất một loại thuốc được thử nghiệm, phần
trăm quần thể kháng thuốc chiếm khoảng 33,3% đến 89,4% trên tổng
số mẫu thu được tại địa phương. Các quần thế có biểu hiện của kháng
chéo và kháng đa cũng được tìm thấy trong nghiên cứu.
Bảng 4.10 Phần trăm cỏ kháng thuốc đối với bispyribac, penoxsulam
và quinclorac ở các tỉnh thành

RR và RRR (%)

Bis
Pen
Quin
Bis-Pen
Bis-Quin
Pen-Quin
Bis-PenQuin
N
% số mẫu

An
Giang
0,0
16,6
33,3
16,6
16,6
16,6

Cần
Thơ
12,5
6,2
31,2
0,0
18,7
6,2

Hậu
Giang
5,8
17,6
11,7
35,2
5,8
17,6

Kiên
Giang
0,0
20,0
20,0
0,0
20,0
20,0

Long
An
14,2
14,3
14,3
0,0
28,5
0,0

Tiền
Giang
16,7

16,7
16,7
16,7
0,0
0,0

Vĩnh
Long
0,0
50,0
50,0
0,0
0,0
0,0

0,0

25,0

5,8

20,0

28,6

33,3

0,00

12

50

16
87,5

17
89,4

5
80

7
87,5

6
60

4
33,3

15


Diện tích ruộng (ha)

4.3.2 Tương quan giữa kích thước ruộng và tập quán nhổ cỏ tay
Kết quả nghiên cứu cho thấy kích thước ruộng có ảnh hưởng
đến tập quán nhổ cỏ tay trên ruộng lúa tại ĐBSCL (phương sai một
chiều t-test, P<0,05), nông dân sở hữu diện tích đồng ruộng lớn có xu
hướng nhổ cỏ ít hơn so với nông dân có ruộng nhỏ (Hình 4.7). Tổng

cộng 31/76 nông dân được phỏng vấn có diện tích cánh đồng >1,5 ha,
67,7% trong số đó không thực hiện nhổ cỏ tay sau khi phun thuốc cỏ,
chi phí cao cho việc nhổ cỏ tay trên diện tích lớn là nguyên nhân chính
cho sự khác biệt này.

Không

Có
Nhổ cỏ tay

Hình 4.7 Tương quan giữa kích thước ruộng và nhổ cỏ tay
4.3.3 Ảnh hưởng của nhổ cỏ tay lên mức độ kháng thuốc của cỏ
lồng vực (Echinochloa spp.) tại ĐBSCL
Những ruộng không có nhổ cỏ tay có cỏ kháng thuốc ở mức
cao hơn so với những ruộng có nhổ cỏ tay(Hình 4.8). Mức độ kháng
thuốc trung bình ở 15 ruộng không có nhổ tay là 4,8 so với mức 3,1
của những ruộng có nhổ cỏ tay sau khi phun thuốc.

16


Mức độ kháng thuốc

Không

Nhổ cỏ tay

Có

Hình 4.8 Ảnh hưởng của nhổ cỏ tay lên mức độ kháng thuốc cỏ của

cỏ trên ruộng
4.4 Thí nghiệm 4. Hiệu lực trừ cỏ lồng vực của thuốc rinskor tại
ĐBSCL
4.4.1 Hiệu lực của thuốc rinskor trên 3 nhóm cỏ lồng vực
(Echinochloa spp.) thu thập tại ĐBSCL
Bảng 4.13 Giá trị LD90 trung bình của quần thể cỏ lồng vực đối với
bispyribac, penoxsulam, quinclorac và rinskor
An Giang
Cần Thơ
Hậu Giang
Kiên Giang
Long An
Tiền Giang
Vĩnh Long
Trung bình
F
CV(%)

Bispyribac
23,3b
34,0ab
36,4a
40,3a
35,9a
27,2b
34,4ab
33,1
*
34,9

LD90 (g/ha)
Penoxsulam
Quinclorac
11,9
495ab
16,5
844a
16,7
545ab
14,7
384ab
16,1
593ab
13,0
341b
16,1
439ab
15,1
520,2
ns
*
38,8
93,2

Rinskor
19,3
15,6
17,9
17,8
18,8

16,4
15,1
17,1
ns
43,4

Các giá trị trung bình mang các chữ cái bắt đầu giống nhau không khác biệt có ý
nghĩa thống kê ở mức P<0,05 (phép kiểm định Tukey-Kramer).
*: khác biệt có ý nghĩa ở mức 5%, ns:khác biệt không có ý nghĩa thống kê
Liều khuyến cáo của các loại thuốc: bispyribac liều 25 g/ha; penoxsulam liều 12,5
g/ha; quinclorac liều 250 g/ha; rinskor liều 25 g/ha

17


Giá trị LD90 trung bình của rinskor trên các quần thể thu thập
được khoảng từ 15,1 đến 19,3 g/ha, giá trị này không có sự khác biệt
giữa các vùng khác nhau (Bảng 4.13).
4.4.2 Hiệu lực của bispyribac, penoxsulam và quinclorac trên các
quần thể cỏ lồng vực (E. crus-galli) mẫn cảm so với những quần
thể cỏ kháng thuốc
Hiệu lực của bispyribac, penoxsulam và quinclorac trên các
quần thể cỏ kháng thuốc đã bị giảm so với hiệu lực trên các quần thể
cỏ mẫm cảm. Liều khuyến cáo của 3 loại thuốc có thể phòng trừ 91,3100% quần thể mẫn cảm, tuy nhiên chỉ có thể phòng trừ được 40,753,3% quần thể cỏ kháng. Liều càng cao cho thấy phản ứng liều càng
thấp, hiệu lực trừ cỏ chỉ tăng 6% ở liều cao gấp 4 lần so với liều cao
gấp đôi liều khuyến cáo.
Bảng 4.15 Phần trăm cây chết của quần thể mẫn cảm (S) và quần thể
kháng (R) khi được xử lý bằng thuốc bispyribac, penoxsulam và
quinclorac
% cây chết ở các liều khác nhau

φ

Liều
Thuốc
Bispyribac-S
Penoxsulam-S
Quinclorac-S
Bispyribac-R
Penoxsulam-R
Quinclorac-R
F
CV(%)

0,25X

0,5X

1,0X

2,0X

4,0X

8,0X

20,3a 43,7b
27a 52,7ab
22,6a 64,3a
4,6b 10,3c
8,3b 17,0c

5,0b 18,7c

91,3a
97,3a
98,3a
51,7b
40,7b
53,3b

99,3a
99,0a
100a
74,3b
63,3b
81,3b

100
100
100
88,0
94,0
88,0

100
99,7
100
97,0
99,7
98,0

*

*

*

*

ns

ns

7,2

5,7

10,2

6,9

5,2

4,1

φ 0,25X=25%

liều khuyến cáo; 1X=liều khuyến cáo; 8,0X=800% của liều khuyến
cáo. Các giá trị trung bình mang các chữ cái bắt đầu giống nhau không khác biệt
có ý nghĩa thống kê ở mức P<0,05 (phép kiểm định Tukey-Kramer).
Liều khuyến cáo của các loại thuốc: bispyribac liều 25 g/ha; penoxsulam liều 12,5

g/ha; quinclorac liều 250 g/ha; rinskor liều 25 g/ha

18


4.4.3 Hiệu lực của rinskor trên các quần thể cỏ lồng vực đã xác
định mẫn cảm hoặc kháng bispyribac, penoxsulam và quinclorac
Hiệu lực của rinskor trên các quần thể cỏ mẫn cảm với
bispyribac, penoxsulam và quinclorac được trình bày trong Bảng 4.16.
Liều 1,0X của rinskor có thể diệt được 94,3% đến 100% quần thể cỏ,
không phân biệt tình trạng kháng hay mẫn cảm với các loại thuốc
khác. Không có khác biệt về hiệu lực trừ cỏ ở liều 1,0X đến 8,0X, điều
này cho thấy rằng rinskor ở liều khuyến cáo rất hiệu quả trên các quần
thể cỏ lồng vực được thu thập.
Bảng 4.16. Phần trăm cây chết của quần thể mẫn cảm (S) và quần thể
kháng (R) khi được xử lý bằng thuốc rinskor ở liều khác nhau
% cây chết ở các liều khác nhau
Liềuφ

0,25X

0,5X

1,0X

2,0X

4,0X

8,0X

Thuốc
Rinskor_Bispyribac-S
31,0a
Rinskor_Penoxsulam-S 26,3ab
Rinskor_Quinclorac-S 27,3ab
Rinskor_Bispyribac-R
33,0a
Rinskor_Penoxsulam-R 18,0b
Rinskor_Quinclorac-R
17,3b

84,0a
83,7a
84,3a
81,7a
70,0b
76,0b

100
98,0
96,3
95,7
94,3
98,3

100
100
100
100

100
100

100
100
100
99,3
100
100

100
100
100
100
100
100

*

*

ns

ns

ns

ns

11,4

8,4

8,1

0

4,4

0

F
CV(%)
φ 0,25X=25% liều

khuyến cáo; 1X=liều khuyến cáo; 8,0X=800% của liều khuyến cáo.
Các giá trị trung bình mang các chữ cái bắt đầu giống nhau không khác biệt có ý
nghĩa thống kê ở mức P<0,05 (phép kiểm định Tukey-Kramer). Liều khuyến cáo của
rinskor: 25 g/ha

4.5 Mức độ đa dạng di truyền của 15 quần thể cỏ lồng vực tại Việt
Nam và Hoa Kỳ được phân tích bằng phương pháp RAPD
Kết quả phân tích RAPD trên 15 quần thể cỏ lồng vực
Trong tổng số 40 đoạn mồi oligonucleotide được sử dụng, có 6
đoạn mồi sinh ra băng đa hình và kết quả ổn định giữa các quần thể.
Sáu đoạn mồi bao gồm OP-E01, OP-H02, OP-N07, OPH02, DAS04
và DAS08 (Bảng 4.17). Các đoạn mồi này tạo ra 55 băng với kích
thước từ 50 đến 1367bp; số băng đa hình trung bình trên mỗi đoạn
mồi là 7,7.
19

Bảng 4.17 Sáu đoạn mồi cho ra các băng đa hình trên 15 quần thể cỏ
lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) *
STT

Tên

Trình tự
5’-3’

1
2
3
4
5
6
N

OP-E01
OP-H02
OP-N07
OP-K20
DAS04
DAS08

CCCAAGGTCC
TCGGACGTGA
CAGCCCAGAG
GTGTCGCGAG

TGAGGAGGAG
AACGTCTGCC

Số băng

Số băng đa
hình

% băng đa
hình

8
10
9
9
10
9
55

7
9
6
8
10
6
46

87,5 %
90,0 %
66,7 %

88,9 %
100 %
66,7 %
-

*Đoạn mồi 1-3 được trích dẫn trong nghiên cứu của Rutledge et al. (2000), đoạn mồi
4 được trích dẫn trong nghiên cứu của Kil-Ung et al. (1998), đoạn mồi 5-6 có trình
tự ngẫu nhiên

Cây phả hệ của 15 quần thể được chia thành 2 nhánh lớn
(cluster) với khoảng cách di truyền giữa 2 nhánh là 0,39 (Hình 4.11).
Nhánh 1 có 12 quần thể và nhánh 2 có 3 quần thể.

Khoảng cách di truyền

Hình 4.11 Cây phả hệ của 15 quần thể cỏ lồng vực nước
(Echinochloa crus-galli) ở Việt Nam (CT-10, KG-01, TG-03, HG06, HG-02, CT-08, HG-03, CT-04, VL-03, HG-01, CT-02, CT-01,
VL-01) và Hoa Kỳ (A-S, AR)
Cây phả hệ được xây dựng bởi phương pháp UPGMA (Unweighted pair group
method average) và khoảng cách di truyền được tính bởi công thức 1-SMC

20


-1 100 ug
-1 minuteug/phút)
(nmol
của CAS
động
Hoạt

CAS
activity
(nmol
HH
2S2S/s/100
1)

Kết quả lần nữa cho thấy mức độ đa dạng di truyền rất cao trong
quần thể cỏ tại ĐBSCL, rất khó để phân biệt các loài nếu chỉ dựa vào
kiểu hình, nhiều loài trong nhóm lồng vực đã bị nhầm lẫn với nhau.
Các phương pháp phân tích di truyền phân tử rất quan trọng trong việc
phân biệt và định danh loài cỏ lồng vực.
4.6 Cơ chế sinh hóa và di truyền phân tử của cỏ lồng vực kháng
quinclorac
4.6.1 Mức độ hoạt động của β-CAS trong 5 quần thể cỏ lồng vực
a
a

c d cd de
e

c d cd d

đối
1h chứng
control
sau 1 giờ

bc c c c

c

c
bc

b

b

a a

b
b

c

Oryza sativa
11hgiờ
sau
treated
xử lý

đối
3d chứng
control
sau 3 ngày

33dngày
sau
treated

xử lý

Hình 4.15 Hoạt động của enzyme CAS (nmol H2S/100ug/phút)
trong lá cỏ lồng vực nước sau khi xử lý quinclorac. Số liệu được
thu thập vào thời điểm 1h và 3 ngày sau xử lý
Số liệu được phân tích bằng Student’s t-test để so sánh giá trị trung bình của nhóm
được xử lý thuốc so với đối chứng trong từng quần thể (P<0,05) (n=4). Giá trị trung
bình được trình bày với giá trị + sai số chuẩn. Dấu * được sử dụng để chỉ khác biệt
có ý nghĩa.

Ở thời điểm 3 ngày sau khi xử lý thuốc cỏ cho thấy enzyme
giải độc trong 2 quần thể cỏ mẫn cảm Ech_01 và Ech_02 vào khoảng
1,1 và 2,5 nmol H2S/100 ug/phút, mức độ này tương ứng với mức tăng
34% và 18% so với đối chứng. Mặt khác, mức độ hoạt động của
enzyme trong 3 quần thể cỏ kháng thuốc đã tăng 45% và 74% so với
đối chứng, mức độ hoạt động của enzyme trong 2 quần thể cỏ kháng
thuốc cao nhất Ech_04 và Ech_05 lần lượt đạt 951% và 1873% cao
hơn so với quần thể cỏ mẫn cảm Ech_01, điều này cho thấy những
21


phun quinclorac

Đối chứng

phun quinclorac

Đối chứng

phun quinclorac

Đối chứng

phun quinclorac

Đối chứng

phun quinclorac

Đối chứng

phun quinclorac

Đối chứng

Mức độ thể hiện gene của CAS so với B-Actin

quần thể cỏ kháng đó có khả năng phân giải quinclorac cao hơn rất
nhiều so với các quần thể mẫn cảm.
4.6.2 Mức độ thể hiện của CAS trong lá cây sau khi xử lý
quinclorac
Thời điểm 1 giờ sau xử lý
Ở thời điểm một giờ sau xử lý quinlorac trên lá, hai quần thể
mẫn cảm với quinclorac (Ech_01 và Ech_02) cho mức độ thể hiện của
CAS giữa nhóm xử lý và không xử lý không có khác biệt (Hình 4.16).

Hình 4.16 Mức độ thể hiện của CAS cho thấy sụt giảm ở 1 giờ sau
khi xử lý quinclorac trên các quần thể kháng (R) Ech_03, Ech_04,
Ech_05 và Oryza sativa, tuy nhiên vẫn không thay đổi trong hai
quần thể mẫn cảm (S) Ech_01 và Ech_02

Số liệu được phân tích bằng Student’s t-test để so sánh giá trị trung bình của nhóm
được xử lý thuốc so với đối chứng trong từng quần thể (P<0,05) (n=4). Giá trị trung
bình được trình bày với giá trị + sai số chuẩn. Dấu * được sử dụng để chỉ khác biệt
có ý nghĩa.

Thời điểm 3 ngày sau xử lý
Ở thời điểm 3 ngày sau xử lý, mức độ thể hiện của CAS không
thay đổi giữa tất cả quần thể được xử lý và không xử lý, tuy nhiên
mức độ hoạt động của enzyme CAS trong các quần thể được xử lý
thuốc thì lại tăng cao hơn so với đối chứng. Dựa trên điểm này có thể
giả thuyết rằng các quần thể mẫn cảm phản ứng chậm hơn trong việc

22