Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Ảnh hưởng của sử dụng kết hợp thuốc bảo vệ thực vật hoạt chất Chlopyrifos ethyl và Fenobucarb đến hoạt tính enzym Cholinesterase cá lóc (Channa striata)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
-oOo-

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Môi trƣờng Đất và Nƣớc
Mã ngành: 9 44 03 03

ẢNH HƢỞNG CỦA SỬ DỤNG KẾT HỢP
THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT HOẠT CHẤT
CHLORPYRIFOS ETHYL VÀ FENOBUCARB
ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYM CHOLINESTERASE
Ở CÁ LĨC (CHANNA STRIATA)

Cần Thơ, 2018
1


DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ
1. Nguyễn Văn Tồn, Đào Trọng Ngữ, Nguyễn Văn Cơng, 2015. Response of
cholinesterase to insecticide Chlorpyrifos ethyl in snakehead fish (channa
striata) in rice field of Vietnamese Mekong Delta. Tạp chí Khoa học và Công
nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Số đặc biệt Vol. 53,
No, 3A, 2015. Trang 277 – 282. ISSN: 0866 – 708X
2. Nguyễn Văn Toàn, Đào Trọng Ngữ, Nguyễn Văn Bé, Phạm Văn Toàn,
Trịnh Diệp Phương Danh và Nguyễn Văn Công, 2017. So sánh ảnh hưởng của
việc sử dụng đơn lẻ và kết hợp hoạt chất Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl cho
lúa đến cholinesterase ở cá lóc (channa striata) sống trên ruộng. Tạp chí Khoa
học Trường Đại học Cần Thơ, Số chuyên đề: Môi trường và biến đổi khí hậu
(2017) (1): Trang 49 – 54. ISSN: 1859 – 2333.
3. Nguyễn Văn Tồn, Nguyễn Văn Cơng, 2017. Ảnh hưởng của hỗn hợp hoạt

chất Fenobucarb và chlorpyrifos ethyl đến hoạt tính cholinesterase ở cá lóc
(channa striata). Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông lâm Nghiệp - Đại học Nơng
Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Số: 5/2017 Trang 66 – 71. ISSN: 1859-1523.
4. Nguyễn Văn Tồn, Nguyễn Văn Cơng, 2018. Hiện trạng sử dụng thuốc
bảo vệ thực vật ở một số vùng canh tác lúa Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp
chí Tài ngun và Mơi trường, Số 5 (283) Kỳ 1 Tháng 3 năm 2018. Trang 26
– 30. ISSN: 1859 – 1477.

2


CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Trong canh tác lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), thuốc bảo vệ
thực vật (BVTV) chứa hoạt chất Chlorpyrifos ethyl (nhóm Lân hữu cơ) và
Fenobucarb (nhóm Carbamate) thường được sử dụng phổ biến (Nguyen Thanh
Tam et al., 2015; Nguyễn Văn Tồn và Nguyễn Văn Cơng, 2018). Trong danh
mục thuốc BVTV cho phép sử dụng năm 2016 có đến 159 tên thuốc thương mại
có chứa Chlorpyrifos ethyl và 39 tên thương mại chứa hoạt chất Fenobucarb (TT
03/2016/TT-BNNPTNT). Các sản phẩm phối trộn sẵn hoạt chất Chlorpyrifos
ethyl với Fenobucarb được sử dụng như: Visa 5GR, Rockfos 550EC, Babsac
600EC, 750EC, Fenfos 650EC, Super Kill Plus 550EC. Ngoài ra, hai đơn chất
này cũng thường được phối trộn khi phun nhằm tiêu diệt cùng lúc rầy nâu và các
loài sâu hại khác nhau (Phạm Văn Toàn, 2013). Dù phun riêng lẻ từng hoạt chất
hay hỗn hợp thì sau cùng các hoạt chất này cùng tồn tại trong thành phần mơi
trường. Do đó, sinh vật trong thực tế thường chịu tác động của nhiều độc chất
khác nhau. Sự phối trộn độc chất có thể làm (i) giảm (tác động đối kháng), (ii)
tăng (tác động hợp lực) hay (iii) khơng ảnh hưởng đến độc tính so với trường hợp
riêng lẻ (Trần Văn Hai, 2005).
Cá lóc (Channa striata) sống ở nhiều loại hình thủy vực, trong đó có đồng

ruộng (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993), nơi mà thuốc BVTV
thường xuyên được sử dụng. Vào mùa mưa, cá thường tìm đến đồng ruộng để
sinh sản (Amilhat and Lorenzen, 2005) nên chúng có nhiều nguy cơ phơi nhiễm
thuốc BVTV. Do đó, cá lóc là một trong những loài thủy sinh vật chịu nhiều tác
động bất lợi do phun thuốc BVTV cho lúa nên được để chọn lựa cho nghiên cứu.
Enzyme Cholinesterase (ChE) có vai trị quan trọng trong điều tiết chức
năng bình thường của quá trình truyền tín hiệu thần kinh qua các tế bào thần kinh
ở động vật sống. ChE rất nhạy cảm với thuốc BVTV gốc Lân hữu cơ và
Carbamate (Stenersen, 2004); khi ChE bị ức chế có thể ảnh hưởng đến hoạt động
hơ hấp, di chuyển, bắt mồi và gây chết sinh vật (Peakall, 1992). Hầu hết các loài
thủy sinh vật chết khi ChE bị ức chế hơn 70% (Fulton and Key, 2001) và ngưỡng
giới hạn sinh học cho phép ChE bị ức chế khơng q 30% mức bình thường
(Aprea et al., 2002). Đo hoạt tính ChE có thể giúp phát hiện sớm ảnh hưởng bất
lợi của môi trường đến sinh vật (Peakall, 1992; Cong et al., 2006). Do vậy, ChE
có thể sử dụng làm chỉ thị cảnh báo ô nhiễm và tác hại của ô nhiễm thuốc BVTV
gốc Lân hữu cơ và Carbamate đến sinh vật. Kỹ thuật tái kích hoạt khi ChE bị ức
chế bởi lân hữu cơ bằng pralidoxime (2-PAM) và phương pháp pha loãng rồi ủ
mẫu ở nhiệt độ và thời gian thích hợp khi ChE bị ức chế bởi Carbamate đã được
đề xuất áp dụng khi khơng có sinh vật đối chứng (Rotenberg, 1995).
Trên thế giới, nhiều nghiên cứu trong điều kiện phịng thí nghiệm và ngồi
thực địa đã sử dụng ChE như chỉ dấu sinh học (Biomarker) cảnh báo nhiễm bẩn
thuốc BVTV (Andresscu et al., 2006; Laetz et al., 2009;…). Những nghiên cứu
bước đầu ở Việt Nam cho thấy có thể sử dụng ChE ở cá chép Cyprinus carpio, cá
3


mè vinh Puntius gonionotus (Đỗ Thị Thanh Hương, 1999; Nguyễn Trọng Hồng
Phúc et al., 2010), cá lóc Channa striata (Cong et al., 2006, 2008), cá rô đồng
Anabas testudineus (Ngô Tố Linh, 2008; Nguyễn Khắc Du, 2010; Nguyen Thanh
Tam et al., 2015) để đánh dấu tác tác hại của nhiễm bẩn thuốc BVTV hoạt chất

Diazinon, Acephate, Isoprocarb, Fenobucarb,… Tuy nhiên, sự tác động của hỗn
hợp thuốc BVTV đến ChE vẫn chưa được tìm hiểu nhiều. Do đó Luận án “Ảnh
hưởng của sử dụng kết hợp thuốc bảo vệ thực vật hoạt chất Chlopyrifos ethyl và
Fenobucarb đến hoạt tính enzym Cholinesterase cá lóc (Channa striata)” đã
được thực hiện.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Xác định nhạy cảm của enzyme cholinesterase ở não cá lóc (C. striata) với
Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb khi phơi nhiễm riêng lẻ và phối trộn để cảnh
báo nhiễm bẩn hai hoạt chất này trong môi trường nước.
Nghiên cứu khả năng áp dụng đo ChE ở não cá lóc như phương pháp sinh
học cảnh báo nhiễm bẩn thuốc BVTV chứa Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Hiện trạng sử dụng thuốc BVTV ở một số vùng canh tác lúa ĐBSCL.
Xác định ảnh hưởng riêng lẽ, hỗn hợp hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và
Fenobucarb đến hoạt tính enzyme Cholinesterase ở não cá Lóc ở điều kiện
phịng thí nghiệm và trên đồng ruộng.
Xác định kỹ thuật tái kích hoạt enzyme Cholinesterase như phương pháp
sinh học để cảnh báo nhiễm bẩn thuốc BVTV Lân hữu cơ và Carbamate.
1.4 Phạm vi và đối tƣợng nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện với sự phối trộn 2 hoạt chất Fenobucarb và
Chlorpyrifos ethyl tác động đến hoạt tính ChE ở não cá lóc ở các mức nồng độ
dưới ngưỡng gây chết ở điều kiện phịng thí nghiệm trường Đại học Cần Thơ và
ruộng lúa ở xã Tân Long, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang.
1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Nghiên cứu cho thấy việc hỗn hợp thuốc bảo vệ thực vật hoạt chất
Fenobucarb với Chlorpyrifos ethyl dù không làm tăng hay giảm tính độc nhưng
gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt tính ChE ở cá lóc hơn trường hợp từng
đơn chất. Qua đó cho thấy thói quen hỗn hợp thuốc khi sử dụng của người canh
tác lúa góp phần đe dọa đến cá lóc nói riêng và động vật nói chung.
Nghiên cứu khẳng định thêm đo ChE ở cá lóc có thể xem như phương

pháp sinh học nhận ra ảnh hưởng của nhiễm bẩn thuốc BVTV lân hữu cơ và
carbamate đến sinh vật.
1.6 Điểm mới của luận án
Luận án cung cấp thông tin cập nhật về các loại thuốc BVTV được sử
dụng phổ biến ở một số vùng chuyên canh lúa Đồng bằng sông Cửu Long. Luận
án cũng cho thấy khi phối trộn hay hỗn hợp thuốc BVTV Chlorpyrifos ethyl và
Fenobucarb làm ảnh hưởng đến ChE cá lóc nghiêm trọng hơn trường hợp đơn lẻ.
Bổ sung phương pháp sinh học cảnh báo tác hại của sử dụng thuốc bảo vệ thực
vật đến cá lóc (C. striata) nói riêng và sinh vật nói chung.
4


CHƢƠNG 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 8 năm 2012 đến tháng 12 năm 2016.
Trong đó, nội dung “Khảo sát tình hình sử dụng thuốc BVTV ở một số vùng
canh tác lúa ở ĐBSCL” được thực hiện ở tỉnh Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp
và Hậu Giang trong thời gian từ 08/2012 đến tháng 02/2013. Các thí nghiệm về
ảnh hưởng của thuốc BVTV Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb đến ChE ở cá lóc
trong điều kiện phịng thí nghiệm được thực hiện tại Khoa Môi trường và Tài
nguyên thiên nhiên – Trường Đại học Cần Thơ. Các thí nghiệm trên đồng ruộng
được thực hiện ở Hậu Giang.
2.2 Sinh vật và thuốc BVTV sử dụng cho thí nghiệm
Cá lóc (Ch. striata) có trọng lượng 2,5 – 3,0 g/con, được thuần dưỡng
trong bể Composite 600 lít ở mật độ 250 - 300 con/bể từ 2 - 3 tuần trước khi bố
trí thí nghiệm. Cá được cho ăn hằng ngày bằng thức ăn viên (Cargill mã số 7574,
400 đạm, kích thước viên 3 mm) với liều lượng 3 - 5% trọng lượng cá. Cá khỏe
mạnh và đồng cỡ mới được chọn cho thí nghiệm.
Thuốc BVTV có tên thương mại Bascide 50EC chứa 50% khối lượng
Fenobucarb và Mondeo 60EC chứa 60% khối lượng Chlorpyrifos ethyl được sử

dụng cho các thí nghiệm trong phịng thí nghiệm và phun trên đồng ruộng.
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Nội dung 1: Khảo sát tình hình sử dụng thuốc BVTV ở một số vùng canh
tác lúa ở ĐBSCL.
Tình hình sử dụng thuốc BVTV tại một số vùng canh tác lúa ở ĐBSCL
được tìm hiểu qua phỏng vấn trực tiếp người dân ở một số huyện thuộc tỉnh Long
An, Đồng Tháp, Tiền Giang và Hậu Giang. Đây là các địa phương canh tác lúa
trọng điểm ở ĐBSCL. Tổng số hộ được phỏng vấn là 939 hộ (Bảng 2.1).
Phiếu phỏng vấn tập trung vào các nội dung như (i) chủng loại thuốc sử
dụng, (ii) mục đích sử dụng, (iii) số lần sử dụng trong vụ, (iv) liều lượng sử dụng,
(v) cách thức sử dụng….
Bảng 2.1:Số hộ được phỏng vấn tình hình sử dụng thuốc BVTV trong canh tác lúa

Tỉnh
Long An
Ðồng Tháp
Tiền Giang
Hậu Giang

Số hộ
300
242
247
150

Tỷ lệ (%)
31,9
25,8
26,3
16,0

2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của phối trộn thuốc BVTV
Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb đến ChE cá lóc điều kiện phịng thí nghiệm
Mười hai (12) nghiệm thức có thuốc và 1 nghiệm thức đối chứng được bố
trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 lần lập lại trong bể composite 100 lít chứa 30L
nước máy (mẫu đối chứng) hoặc dung dịch thuốc (các nghiệm thức chứa thuốc).
Trong 12 nghiệm thức có thuốc gồm 4 mức nồng độ 1%, 2%, 5% và 10% LC505


96giờ của Fenobucarb (tương ứng 36, 72, 180 và 360 µg/L), Chlorpyrifos ethyl
(tương ứng 0,27, 0,54, 1,36 và 2,70 µg/L) và hỗn hợp 2 hoạt chất này. Giá trị
LC50 - 96 giờ của Fenobucarb là 3.630 µg/L (Võ Thị Yến Lam, 2011) và
Chlorpyrifos ethyl là 27,1 µg/L (Nguyễn Anh Tuấn và ctv., 2015). Cá không
được cho ăn suốt 96 giờ phơi nhiễm thuốc.
Dung dịch gốc 30.000µg/L (Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl) được
chuẩn bị từ Bascide 50EC (giả định chứa 50% khối lượng Fenobucarb như nhà
sản xuất ghi trên nhãn) và Mondeo 60EC (giả định chứa 60% khối lượng
Chlorpyrifos ethyl như nhà sản xuất ghi trên nhãn) và các dung dịch thí nghiệm
được chuẩn bị theo cơng thức sau:

Trong đó:
V2: thể tích dung dịch gốc cần lấy;
C1: là nồng độ dung dịch cần chuẩn bị;
V1: thể tích dung dịch bố trí trong bể composite;
C2: nồng độ dung dịch gốc.
Mẫu nước được thu theo phương pháp tổ hợp ở thời điểm 1 và 96 giờ sau
bố trí. Mỗi lần lập lại lấy 1 lít dung dịch mẫu, trộn 3 lít dung dịch mẫu vào thành
1 mẫu và thu 1 lít mẫu cho phân tích nồng độ từng hoạt chất. Mẫu được gửi đến
Trung tâm Kỹ thuật Đo lường chất lượng 3 (QUATEST 3) – Tp. Hồ Chí Minh
để phân tích theo phương pháp sắc ký.

Cho cá tiếp xúc với thuốc trong 96 giờ, sau đó cho ra bể 600 lít (chứa 100
lít nước máy) để theo dõi phục hồi enzyme ChE. Trong giai đoạn theo dõi phục
hồi, cá được thay nước máy mỗi ngày 1 lần (70% lượng nước) vào lúc 16:00 –
16:30 và cho ăn bằng thức ăn viên trong suốt thời gian phục hồi.
Bảng 2.2: Tóm tắt thơng tin bố trí và theo dõi thí nghiệm
Thơng tin
Chlorpyrifos ethyl
Fenobucarb
Đối chứng
3 bể chung
1%LC50 – 96 giờ
3 bể
3 bể
2%LC50 – 96 giờ
3 bể
3 bể
5%LC50 – 96 giờ
3 bể
3 bể
10%LC50 – 96 giờ
3 bể
3 bể
Số cá thả/bể
32 cá/bể
32 cá/bể
Tần suất thu mẫu cá đo
0, 1, 12, 24, 36,
0, 1, 12, 24, 36,
ChE (giờ)
48, 60, 72, 96

48, 60, 72, 96
Số cá thu mỗi lần
02
02
(cá/bể)
Thu mẫu nước đo dư 1 và 96 giờ sau bố
1 và 96 giờ sau
lượng thuốc BVTV
trí
bố trí
Thời gian đo pH, DO,
6:00 – 6:30
6:00 – 6:30
nhiệt độ
14:00 – 14:30
14:00 – 14:30

Hỗn hợp
3 bể
3 bể
3 bể
3 bể
32 cá/bể
0, 1, 12, 24, 36,
48, 60, 72, 96
02
1 và 96 giờ sau
bố trí
6:00 – 6:30
14:00 – 14:30

Mẫu cá sau khi giai đoạn phơi nhiễm được thu ở các thời điểm trước khi
cho thuốc, 1, 12, 24, 36, 48, 60, 72, và 96 giờ sau bố trí. Sau đó cho cá ra mơi
6


trường nước máy và thu mẫu ở thời điểm 1, 3, 5 và 7 ngày để phân tích ChE với
2 cá cho mỗi bể. Các yếu tố môi trường pH, DO và nhiệt độ được đo hàng ngày
vào lúc 6:00 – 6:30 và 14:00 – 14:30.
2.3.3 Nội dung 3: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của phối trộn thuốc
BVTV Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb đến ChE ở cá lóc ngồi đồng ruộng
Chín ruộng ở huyện Phụng Hiệp, Hậu Giang (diện tích từ 2.000 – 2.500
m2) và giữ được nước (9,0±0,4 – 11,3±0,5 cm) được chọn để tiến hành thí
nghiệm trong vụ hè thu năm 2013. Lúa thí nghiệm được sạ trong khoảng 45 ngày
tuổi ở mật độ 22 kg lúa/1.000m2 (Bảng 2.3).
Mỗi ruộng đặt 3 lồng (0,5 x 0,6 x 0,9) m3 bằng lưới kẽm theo đường chéo
của ruộng. Mỗi lồng thả 30 cá, chăm sóc 7 ngày cho quen với điều kiện trên
ruộng rồi cung cấp thuốc Bascide 50EC và Mondeo 60EC để nơng dân phun theo
thói quen của họ. Các ruộng chỉ được phun một lần trong thời gian thí nghiệm ở
liều cao nhất của chỉ dẫn (1,5L/ha đối với Bascide 50EC và 0,8L/ha đối với
Mondeo 60EC).
Bảng 2.3: Tóm tắt thơng tin bố trí và theo dõi thí nghiệm trên ruộng
Thơng tin
Số ruộng
Số lồng/ruộng
Số cá thả/lồng
Tần suất thu mẫu
nước đo thuốc
BVTV
Tần suất thu mẫu

cá đo ChE
Số cá thu ở mỗi
lần (cá/lồng)

Bascide 50EC
03
03
30
Trước bố trí, 1 giờ
và 1, 3 và 5 ngày
sau khi phun
Trước phun, 1, 3,
5, 7 và 14 ngày
sau khi phun

Mondeo 60EC
03
03
30
Trước bố trí, 1 giờ
và 1, 3 và 5 ngày
sau khi phun
Trước phun, 1, 3,
5, 7 và 14 ngày
sau khi phun

Hỗn hợp
03
03
30

Trước bố trí, 1 giờ
và 1, 3 và 5 ngày
sau khi phun
Trước phun, 1, 3,
5, 7, 14 và 21
ngày sau khi phun

02

02

02

Mẫu nước được thu theo phương pháp tổ hợp (dùng cốc 500 mL thu 10
mẫu đơn cho vào xô rồi trộn đều lấy 1lít) và thu ở thời điểm trước khi thả cá, 1
giờ sau phun, 1, 3 và 5 ngày sau phun để phân tích nồng độ hoạt chất
Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl. Mẫu được gửi đến Trung tâm Kỹ thuật Đo
lường chất lượng 3 (QUATEST 3) – Tp. Hồ Chí Minh và được phân tích bằng
phương pháp sắc ký.
Khi thu mẫu cá, cá được đưa vào nước đá để làm chết nhanh, sau đó mổ
lấy não rồi cho vào từng eppendorf, đưa vào Nitơ lỏng làm đông nhanh để hạn
chế ảnh hưởng đến ChE trước khi chuyển về phịng thí nghiệm xử lý và phân tích
ChE. Các yếu tố như: mực nước, nhiệt độ, oxy, pH được đo 01 ngày/lần vào lúc
7:00-8:00 tại nơi đặt lồng cá bằng máy đo nhanh.
2.4 Xử lý mẫu và phân tích ChE, tái kích hoạt
2.4.1 Xử lý mẫu và phân tích ChE
Mẫu được xử lý dựa theo (Cong et al., 2006). Não cá sau khi thu mẫu có
khối lượng trung bình từ 0,04 – 0,05 gram và được nghiền trong dung dịch đệm
7

0,1 M Phosphate buffer pH 7,4. Thể tích dung dịch đệm cho vào đảm bảo tất cả
các não đều có nồng độ 25 mg não/mL dung dịch buffer pH 7,4 (#1,6 – 2,0 ml)
và dung dịch nghiền này được sử dụng để đo ChE xác định tỷ lệ ức chế và thực
hiện tái kích hoạt. Sau mỗi lần nghiền, rửa dụng cụ nghiền bằng nước cất acetone - nước cất. Mẫu được trộn đều và lấy 1 mL dung dịch cho vào eppendorf
rồi ly tâm ở 4oC, tốc độ 2.000 vòng/phút trong 20 phút bằng máy ly tâm Sigma
(Đức). Phần trong phía trên sau khi ly tâm được lấy ra để đo ChE.
2.4.2 Phương pháp tái kích hoạt ChE do ức chế bởi Chlorpyrifos ethyl
Lấy 0,5ml dung dịch mẫu não nghiền cho vào eppendorf, sau đó thêm vào
0,5ml dung dịch 2-PAM 0,6mM (nồng độ 2-PAM sau khi thêm vào là 0,3mM),
trộn đều mẫu và đem ủ ở 37oC bằng bể ủ nhiệt (Memmert, Đức) trong 30 phút
(Cong et al., 2008). Mẫu sau khi ủ đem ly tâm ở 4oC, tốc độ 2.000 vòng/phút
trong 20 phút bằng máy ly tâm Sigma (Đức) rồi lấy phần trong phí trên đo ChE.
2.4.3 Phương pháp tái kích hoạt ChE do ức chế bởi Fenobucarb
Lấy 0,1mL dung dịch mẫu não cho vào eppendorf, sau đó thêm vào 0,9ml
dung dịch buffer pH 7,4, trộn đều mẫu và đem ủ ở 37oC bằng bể ủ nhiệt
(Memmert, Đức) trong thời gian 3,5 giờ. Mẫu sau khi ủ đem ly tâm ở 4oC, tốc độ
2.000 vòng/phút trong 20 phút bằng máy ly tâm Sigma (Đức) và đo ChE
2.4.4 Phương pháp đo ChE
Enzyme ChE được đo bằng máy so màu quang phổ U-2800 (Nhật) ở bước
sóng 412nm trong 200 giây theo phương pháp Ellman et al., (1961). Mỗi mẫu đo
được chuẩn bị bằng cách cho 2,65 mL 0,1M Phosphate bufer pH 7,4 vào cuvest
nhựa, tiếp tục cho 0,1 mL dung dịch 3mM DTNB và 0,05 mL dung dịch 10mM
Acetylthiocholine iodide. Sau đó, cho 0,2 mL dung dịch mẫu não đã ly tâm. Mẫu
trắng cũng cho hoá chất tương tự như mẫu đo ChE nhưng lấy 0,2 mL dung dịch
đệm 0,1M phosphate pH 7,4 thay cho dung dịch mẫu não. Kết quả được ghi nhận
khi hệ số tương quan đạt từ 0,9 trở lên.
2.5 Tính hoạt tính ChE, tỷ lệ ức chế và xử lý kết quả
2.5.1 Xác định hoạt tính ChE
Hoạt tính ChE được tính tốn theo cơng thức sau:

Trong đó:
- HT (hoạt tính ChE): µmol/g/phút
- A: Abs mẫu - Abs blank (Abs/phút)
- Cv: thể tích cuvet hay tổng thể tích dung dịch đo (mL) = 3 mL
- Hv: thể tích dung dịch đệm sử dụng để nghiền mẫu
- E: hệ số=13,6
- L: là hệ số (bằng 1 khi dùng cuvest đáy bằng có cạnh 1 cm để đo mẫu)
- Sv: thể tích mẫu sau ly tâm lấy đo (mL) = 0,2 mL
- Ps: trọng lượng mẫu lấy nghiền (gam).

8


2.5.2 Xác định tỷ lệ ức chế
Trong đó:
- I (%) : tỷ lệ phần trăm bị ức chế
- A: hoạt tính ChE đo ở từng mẫu (µM/g/phút)
- Adc: trung bình hoạt tính ChE ở nghiệm thức đối chứng (µM/g/phút)
2.5.3 Xác định tỷ lệ tái kích hoạt ChE
Trong đó:
- TLTKH (%) : tỷ lệ cá tái kích hoạt
- ChEu: ChE mẫu ủ với 2 – PAM hoặc pha loảng
- ChEku: ChE mẫu nguyên thủy (không ủ với 2 – PAM hoặc pha loảng)
2.5.4 Xử lý kết quả
Số liệu được phân tích phương sai (one-way ANOVA) và dùng kiểm định
Duncan để so sánh giữa các nghiệm thức và Dunnet để so sánh với đối chứng.
Sai khác cho là có ý nghĩa thống kê khi p<0,05. Phần mềm SPSS được sử dụng
để xử lý thống kê.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nội dung 1: Hiện trạng sử dụng thuốc BVTV ở một số vùng canh

tác lúa ở ĐBSCL
3.1.1 Các loại thuốc BVTV được sử dụng cho lúa ở vùng nghiên cứu
Kết quả phỏng vấn người trồng lúa trong vùng nghiên cứu cho thấy có
232 tên thương mại thuốc BVTV với 65 hoạt chất được sử dụng trong canh
tác lúa; trong đó thuốc trừ cơn trùng có 101 tên thương mại (20 hoạt chất),
thuốc trừ bệnh có 54 tên thương mại (18 hoạt chất), thuốc trừ cỏ có 30 tên
thương mại (9 hoạt chất), thuốc trừ ốc có 19 tên thương mại (5 hoạt chất),
thuốc trừ chuột có 7 tên thương mại (6 hoạt chất) và các loại thuốc điều hòa
sinh trưởng với 21 tên thương mại (7 hoạt chất) (Bảng 3.1).
Có sự khác biệt về số lượng hoạt chất thuốc BVTV ở từng tỉnh, cao
nhất là Đồng Tháp, kế đến là Long An, Tiền Giang và thấp nhất là Hậu
Giang. Tuy nhiên, ít có sự khác biệt về số lượng tên thương mại của thuốc
BVTV, dao động từ 130 - 134 tên thương mại, trừ tỉnh Tiền Giang có số
lượng tên thương mại thấp hơn (Bảng 3.1).
Berg (2001) cho thấy vào năm 1999 có 64 loại thuốc BVTV khác
nhau được sử dụng trong canh tác lúa ở Cần Thơ và Tiền Giang; trong đó, có
50% là thuốc trừ cơn trùng, 25% là thuốc trừ bệnh, 25% là thuốc trừ cỏ. Vào
năm 2007 cũng trong vùng nghiên cứu này có 66 loại thuốc BVTV (Berg
and Tam, 2012). Theo Pham Van Toan (2011) có hơn 100 tên thuốc thương
phẩm với hơn 50 hoạt chất khác nhau được nông dân sử dụng. Bùi Thị Nga
và Võ Xuân Hùng (2012) cho thấy có khoảng 27 - 38 hoạt chất với 43 - 75
9


tên thương phẩm thuốc BVTV được sử dụng ở 3 huyện Vị Thủy, Phụng
Hiệp và Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang. Kết quả nghiên cứu trong luận án này có
sự đa dạng hơn về loại thuốc BVTV được sử dụng so với các nghiên cứu
trước đây. Số lượng hoạt chất thuốc BVTV được phép sử dụng trong nông
nghiệp tăng theo thời gian. Theo danh mục thuốc BVTV cho phép sử dụng
năm 2007 thì có 675 hoạt chất được phép sử dụng nhưng năm 2012 là 1.418

hoạt chất. Mặt khác, trong luận án này cỡ mẫu được phỏng vấn lớn hơn và
địa bàn phỏng vấn rộng hơn (4 tỉnh Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp và
Hậu Giang) nên sự đa dạng về các loại thuốc BVTV được sử dụng có nhiều
hơn các nghiên cứu trước đây.
Bảng 3.4: Chủng loại thuốc BVTV sử dụng ở các vùng nghiên cứu
Tỉnh
Long
Tiền
Đồng
Hậu
Nhóm thuốc
An
Giang
Tháp
Giang
Hoạt chất
Trừ cơn trùng
18
20
20
16
Trừ bệnh
13
14
18
9
Trừ cỏ
7
7
8

9
Trừ ốc
5
2
5
2
Trừ chuột
6
5
6
6
Điều hịa sinh trưởng
7
6
6
7
Tổng
56
54
63
49
Tên thƣơng mại
Trừ cơn trùng
63
55
58
47
Trừ bệnh
26
28

31
31
Trừ cỏ
11
11
13
24
Trừ ốc
13
9
13
6
Trừ chuột
5
6
5
4
Điều hòa sinh trưởng
14
11
14
18
Tổng
132
120
134
130

TB vùng
nghiên cứu

20
18
9
5
6
7
65
101
54
30
19
7
21
232

Kết quả khảo sát cho thấy các hoạt chất như Chlorpyrifos ethyl,
Pymetrozine, Fenobucarb, Emamectin, Chlorantramiliprole,…. được sử
dụng với tỷ lệ lần lượt là 14,2%, 13,2%, 12,5%, 8,2% và 6,0%. Thuốc chứa
hoạt chất Fenobucarb với các tên thương mại như Abasa, Bassa, Bassa tigi,
Dybacide, Bascide, Hopkill, Vibasa và chứa hoạt chất Chlorpyrifos ethyl
như B52 – USA, Mondeo 60EC, Dragon, Dragon nông,Wavotox được sử
dụng phổ biến. Hai loại hoạt chất này thường cũng được phối trộn với nhau
để phòng trừ rầy nâu và sâu cuốn lá, nhất là giai đoạn lúa từ 21 – 45 ngày
tuổi. Hai hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb cũng được sử dụng khá
phổ biến trong canh tác lúa (Pham Van Toan, 2011; Berg and Tam, 2012).
Như vậy, nếu so với các nghiên cứu trước đây thì 2 hoạt chất Fenobucarb và
Chlorpyrifos ethyl vẫn còn được sử dụng phổ biến trong canh tác lúa.

10

3.1.2 Tần suất và liều lượng thuốc BVTV sử dụng trong canh tác lúa
3.1.2. 1 Tần suất phun thuốc BVTV trong canh tác lúa
Trung bình số lần phun thuốc BVTV ở tỉnh Tiền Giang là cao nhất
(7,0±1,1 lần/vụ), kế đến là Hậu Giang 6,9±1,6 lần/vụ, Đồng Tháp 6,0±1,2
lần/vụ và thấp nhất là Long An với 5,3±0,9 lần/vụ. Qua đó cho thấy có sự
khác nhau về số lần phun thuốc trong vụ giữa các địa phương.
8

Trừ sâu bện h
Trừ cỏ
Trừ ốc

Tần suất phun (lần/vụ)

6

4

2

0

Long An

Tiền Giang

Đồng Tháp

Hậu Giang

TB vùng NC

Hình 3.1: Tần suất phun các loại thuốc BVTV ở vùng nghiên cứu

Berg (2001) cho thấy trung bình số lần phun thuốc ở Tiền Giang năm
1999 là 8,2 lần/vụ. Nghiên cứu của Pham Van Toan (2011) cho thấy ở 2 tỉnh
Đồng Tháp và Cần Thơ, trung bình tần suất phun xịt thuốc BVTV là 8
lần/vụ. Như vậy, kết quả nghiên cứu trong luận án này cho thấy có giảm thấp
hơn về tần suất phun so với các nghiên cứu gần đây.
3.1.2. 2 Liều lượng sử dụng và phối trộn thuốc BVTV
Kết quả phỏng vấn cho thấy trung bình trong vùng nghiên cứu có
42,7% nơng dân phun bằng chỉ dẫn và 53,7% phun cao hơn chỉ dẫn ghi trên
nhãn thuốc, rất ít (3,6%) phun thấp hơn chỉ dẫn. Khi phân tích riêng theo
từng tỉnh thì tỷ lệ phun thuốc bằng chỉ dẫn ở Long An, Tiền Giang, Đồng
Tháp và Hậu Giang lần lượt là 50%, 16,9%, 38,5% và 76,7%. Trong khi đó
tỷ lệ phun thuốc cao hơn chỉ dẫn ở các tỉnh theo thứ tự trên lần lượt là
49,3%, 72,3%, 61,1% và 20% (Bảng 3.2). Sử dụng thuốc BVTV liều cao
hơn chỉ dẫn vừa làm hao phí thuốc vừa làm tăng nguy cơ gây độc cho sinh
vật trong môi trường. Phun thuốc thấp hơn chỉ dẫn sẽ làm cho sâu bệnh
không chết hết và tăng nguy cơ kháng thuốc. Qua nghiên cứu cho thấy tỷ lệ
sử dụng liều cao hơn chỉ dẫn rất cao (20-72,3%) đặc biệt là tỉnh Tiền Giang
Bảng 3.2: Liều lượng sử dụng thuốc BVTV ở các vùng nghiên cứu
Long
Tiền
Đồng
Hậu
Liều lƣợng phun
An
Giang

Tháp
giang

Ít hơn liều chỉ dẫn
Bằng liều chỉ dẫn
Cao hơn liều chỉ dẫn

0,7
50,0
49,3

10,7
16,9
72,3
11

0,4
38,5
61,1

3,3
76,7
20,0

TB vùng
nghiên cứu

3,6
42,7
53,7

Qua phỏng vấn cho thấy trung bình các vùng nghiên cứu có đến
88,6% số nơng hộ phối trộn các loại thuốc với nhau trước khi phun xịt. Nếu
xét theo từng tỉnh, tỷ lệ phối trộn ở các tỉnh Long An, Đồng Tháp, Tiền
Giang và Hậu Giang lần lượt đạt 93,3%, 91,9%, 89,3% và 72,7%. Thuốc trừ
sâu với các hoạt chất khác nhau thường được phối trộn trước khi phun. Việc
phối trộn các loại thuốc BVTV với nhau có thể làm giảm, tăng hay khơng
thay đổi độc tính của thuốc đối với địch hại (Trần Văn Hai, 2005). Nếu các
loại thuốc có cơ chế tác động khác nhau thì khi phối trội có thể làm cho
nhiều cơ quan, chức năng khác nhau của sinh vật bị ảnh hưởng cùng lúc và
khi đó hậu quả sẽ nghiêm trọng hơn. Ngồi ra, nếu các chất khác nhau có
hiệu lực gây độc ở các thời gian phơi nhiễm khác nhau thì sẽ làm cho sinh
vật bị ảnh hưởng lâu dài vì vừa hết bị tác động của thuốc này lại bắt đầu bị
tác động của thuốc khác (Zeliger, 2008). Trong vùng nghiên cứu tỷ lệ người
dân phối trộn các loại thuốc BVTV trước khi phun cao trong nghiên cứu này
là rất đáng được quan tâm.
Tóm lại, kết quả nghiên cứu ở nội dung 1 nhận thấy các thuốc trừ sâu
chứa hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb được sử dụng khá phổ
biến. Hai hoạt chất này có độ độc cao, cùng cơ chế tác động là gây ức chế
hoạt tính ChE ở sinh vật nên được chọn làm các nguồn gây độc trong các thí
nghiệm ở nội dung 2 và 3. Nông dân thường phối trộn các thuốc BVTV với
nhau (88,6%) nhằm giảm chi phí khi phun và thường phun ở liều lượng bằng
(42,7%) hoặc cao hơn (53,7%) liều lượng hướng dẫn ghi trên nhãn thuốc.
Đây là cơ sở để thực hiện nội dung 2 và 3 nhằm xem xét, đánh giá tác động
riêng lẻ và phối trộn của 2 hoạt chất chất này đến ChE não cá lóc đồng điều
kiện phịng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng.
3.2 Nội dung 2: Ảnh hƣởng của phối trộn thuốc BVTV Chlorpyrifos
ethyl và Fenobucarb đến ChE cá lóc trong điều kiện phịng thí nghiệm
3.2.1 Nhiệt độ, DO, pH trong thí nghiệm

Trong giai đoạn phơi nhiễm thuốc BVTV, nhiệt độ buổi sáng dao
động từ 24,8±0,1 0C đến 26,5±0,1 0C và từ 26,9±0,3 0C đến 28,9±0,2 0C vào
buổi chiều. Oxy hồ tan (DO) ít khác biệt giữa các nghiệm thức và DO buổi
sáng dao động từ 4,0±0,2 - 4,7±0,1 mg/L, có xu hướng cao hơn DO buổi
chiều dao động từ 3,7±0,1 - 4,4±0,2 mg/L. Giá trị pH trung bình tuy có sự
khác biệt giữa các nghiệm thức và giữa hai buổi nhưng không quá 0,5 đơn
vị, dao động từ 7,4±0,1 đến 7,5±0,1.
Sau 96 giờ tiếp xúc với thuốc, cá được cho ra bể composite 600L chứa
100L nước máy (khơng có thuốc BVTV), có sục khí. Nhiệt độ dao động từ
28,0±0,2 oC - 28,9±0,2 oC vào buổi sáng và 28,2±0,2 oC - 29,6±0,2 oC vào
buổi chiều. Hàm lượng DO trong các bể thí nghiệm khi cá ra nước máy cao
hơn giai đoạn cá tiếp xúc thuốc BVTV trong 96 giờ do được sục khí, buổi
sáng dao động từ 6,3±0,1 - 7,1±0,1 mg/L và buổi chiều dao động từ 6,4±0,2
- 7,1±0,1 mg/L. Giá trị pH buổi sáng dao động từ 6,9±0,1 - 7,2±0,1 và buổi
chiều từ 7,0±0,1 - 7,2±0,1.
12


Nhìn chung nhiệt độ, DO và pH trong giai đoạn phơi nhiễm thuốc
BVTV và phục hồi ChE trong nước máy đều nằm trong khoảng thích hợp
cho sự phát triển của cá. Sự ổn định các yếu tố pH, DO và nhiệt độ giữa các
nghiệm thức sẽ làm cho thí nghiệm mang tính đồng nhất cao về mặt mơi
trường nên tác động đồng đều đến sự ức chế ChE.
3.2.2 Nồng độ Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl trong bố trí thí nghiệm
Kết quả phân tích đều khơng phát hiện (dưới ngưỡng phát hiện)
Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl ở nghiệm thức đối chứng. Ở các nghiệm
thức đơn chất, nồng độ sau khi chuẩn bị của Fenobucarb bằng 86,0 – 96,9%
nồng độ lý thuyết (NĐLT) và Chlorpyrifos ethyl bằng 77,8 - 119,9% NĐLT.
Ở các nghiệm thức hỗn hợp, nồng độ Fenobucarb thực tế đạt từ 96,4 109,9% NĐLT; nồng độ Chlorpyrifos ethyl bằng 82,4 - 96,3% NĐLT. Nồng
độ Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl sau khi chuẩn bị dao động xung quanh

giá trị nồng độ lý thuyết. Mặc dù không đúng như nồng độ lý thuyết nhưng
vẫn phù hợp với thiết kế nồng độ tăng theo 1, 2, 5 và 10% LC50-96 giờ của
từng loại thuốc đối với cá lóc.
Bảng 3.3: Nồng độ Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl trong thí nghiệm
Nghiệm thức

ÐC

Fenobucarb
Chlorpyrifos ethyl

1% Fenobucarb
2% Fenobucarb
5% Fenobucarb
10% Fenobucarb
1% Chlorpyrifos ethyl
2% Chlorpyrifos ethyl
5% Chlorpyrifos ethyl
10% Chlorpyrifos ethyl
Fenobucarb
1% Hỗn hợp
Chlorpyrifos ethyl
Fenobucarb
2% Hỗn hợp
Chlorpyrifos ethyl
Fenobucarb
5% Hỗn hợp
Chlorpyrifos ethyl
Fenobucarb
10% Hỗn hợp

Chlorpyrifos ethyl

Nồng độ thuốc BVTV (g/L)
Nồng độ lý
Nồng độ
Nồng độ
thuyết khi
thực tế sau thực tế sau
chuẩn bị khi chuẩn bị
96 giờ
0,00
< DLF
< DLF
0,00
< DLChl
< DLChl
36,00
31,20
5,40
72,00
68,40
11,00
180,00
175,00
49,90
360,00
351,60
69,90
0,27
0,21

< DLChl
0,54
0,47
0,06
1,36
1,63
0,14
2,70
2,48
0,29
36,00
39,90
5,30
0,27
0,26
0,04
72,00
76,70
10,00
0,54
0,48
0,08
180,00
191,60
59,20
1,36
1,12
0,13
360,00
350,11

52,40
2,70
2,29
0,46

DLF = 0,3 g/L, DLChl = 0,03 g/L

Tại thời điểm 96 giờ sau bố trí, nồng độ Fenobucarb ở nghiệm thức
đơn chất giảm từ 71,5 - 83,9% so với nồng độ thực sau khi bố trí. Nghiệm
thức đơn Chlorpyrifos ethyl nồng độ hoạt chất này giảm từ 87,2% - 100%. Ở
dạng hỗn hợp, tỷ lệ giảm nồng độ thuốc mạnh hơn, dao động từ 69,1% 87,0% đối với Fenobucarb và từ 79,9-88,4% đối với Chlorpyrifos ethyl.
13


3.2.3 Ảnh hưởng của phối trộn hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và
Fenobucarb đến ChE ở cá lóc trong điều kiện phịng thí nghiệm
Kết quả phân tích phương sai cho thấy Fenobucarb, Chlorpyrifos
ethyl, thời gian phơi nhiễm có ảnh hưởng đến hoạt tính ChE (p<0,05). Tuy
nhiên, sự tương tác giữa Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl thì khơng có ý
(p>0,05) (Bảng 3.3).
Bảng 3.3: Bảng phân tích phương sai xem xét tác động của Fenobucarb,
Chlorpyrifos ethyl và thời gian phơi nhiễm tác động đến hoạt tính ChE
Nguồn tác động
SS
df MS
F
P
Fenobucarb
663,8 4
165,9 46,5 0,00

Chlorpyrifos ethyl
50,4
4
12,6
3,5
0,01
Thời gian phơi nhiễm
16,0
1
16,0
4,5
0,04
Fenobucarb*Chlorpyrifos ethyl
30,8
4
7,7
2,2
0,07
Fenobucarb*Thời gian phơi nhiễm
310,6 4
77,7
21,7 0,00
Chlorpyrifos ethyl*Thời gian phơi nhiễm 98,4
4
24,6
6,9
0,00
Fenobucarb * Chlorpyrifos ethyl * Thời
gian phơi nhiễm
48,8

4
12,2
3,4
0,01
SS: Tổng bình phương, MS: Trung bình bình phương

 Ở nồng độ 1% LC50 – 96 giờ
Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl, tỷ lệ
ức chế ChE ở tất cả các thời điểm đều khác biệt không có ý nghĩa so với đối
chứng (p>0,05) (Hình 3.2A).
Tỷ lệ ức chế hoạt tính Cholinesterase (%)

Tỷ lệ ức chế hoạt tính Cholinesterase (%)

100
1% Chlorpyrifos Ethyl
1% Fenobucarb
1% HH (Chlor + Feno)

80

60

40

*a

20

0

*ab
b

a
a a

a
ab a

a
a

*
a
a a

b

a
ab

*

a

a
a

a

a
a

a
a

b

a

-20
0

1

12

24

36

48

60

72

96

100

2% Chlorpyrifos Ethyl
2% Fenobucarb
2% HH (Chlor + Feno)

80

60

40

*
*

20
a

0

a
a

b

a

a

b

a

a
ab

a

b

ab
b

b
c

* aa
*
b

a
ab
b

1

12 24 36 48 60 72 96
Thời gian sau khi phơi nhiễm (giờ)

(Hình 3.2A)
(Hình 3.2B)
Hình 3.2: Tỷ lệ ức chế hoạt tính ChE (% so với đối chứng) trong não cá lóc đồng (TB ± SE)

sau khi phơi nhiễm với Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl và hỗn hợp theo thời gian ở mức nồng
độ 1% LC50 - 96 giờ (Hình 3.2A), 2% LC50 - 96 giờ (Hình 3.2B). Trong cùng thời điểm phơi
nhiễm, các số liệu có cùng chữ cái thì khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05, Duncan test). Trong
cùng đường số liệu có dấu * thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05; Dunnet test) so với đối chứng.

Ngược lại, tỷ lệ ức chế ChE ở nghiệm thức Fenobucarb cao nhất
trong 96 giờ phơi nhiễm là 16,1% so với đối chứng (p<0,05) ở thời điểm 1
giờ sau khi tiếp xúc. Đây là nồng độ thấp nhất trong thí nghiệm thấy được
ảnh hưởng của Fenobucarb đến ChE cá lóc (Hình 3.2A). Ở các thời điểm thu
14

a
a
a

-20

0

Thời gian sau khi phơi nhiễm (giờ)

a
a


mẫu còn lại, tỷ lệ ức chế ChE đều thấp và khác biệt khơng có khác biệt có ý
nghĩa so với đối chứng (p>0,05).
Tương tự, ở nghiệm thức hỗn hợp thì tỷ lệ ức chế có sự khác biệt so
với đối chứng (p<0,05) ở thời điểm 1, 48 và 96 giờ lần lượt là 18,7%, 9,6%
và 12,8%.

 Ở mức nồng độ 2% LC50 – 96 giờ
Ở nồng độ này, Chlorpyrifos ethyl gây ức chế 20% ChE cá lóc
(p<0,05) lúc 60 giờ phơi nhiễm (Hình 3.2B). Ở tất cả thời điểm cịn lại, tỷ lệ
ức chế ChE đều khơng khác khác biệt so với đối chứng (p>0,05).
Ở nghiệm thức Fenobucarb, tỷ lệ ức chế ChE cao nhất là 22,2% so
với đối chứng lúc 1 giờ sau phơi nhiễm (p<0,05) nhưng các thời điểm cịn
lại đều khác biệt khơng có ý nghĩa so với đối chứng (p>0,05).
Tương tự, ở nghiệm thức hỗn hợp thì tỷ lệ ức chế ChE ở 1 giờ và 60
giờ lần lượt là 27,3% và 21,9% (Hình 3.2B). Aprea et al., 2001) cho rằng
nếu ChE bị ức chế dưới 30% sẽ không gây hại cho sinh vật. Ở tất cả các
nghiệm thức 1% và 2% LC50-96 giờ dù tỷ lệ ức chế có khác biệt so với đối
chứng nhưng đều thấp hơn 30%. Qua đó cho thấy nồng độ thấp hơn hoặc
bằng 2%LC50-96 giờ của Fenobucarb hay Chlorpyrifos ethyl đều chưa gây
ảnh hưởng có hại đến cá lóc. Tuy nhiên có thể sử dụng đo ChE để chỉ cá đã
bị phơi nhiễm với thuốc.
 Ở nồng độ 5% LC50 – 96 giờ
Ở nồng độ 5% LC50 - 96 giờ fenobucarb và chlorpyrifos ethyl gây ức
chế ChE cá lóc rõ rệt. Ở nghiệm thức đơn Fenobucarb, tỷ lệ ức chế so với
đối chứng ở các thời điểm 1, 12, 24, 36 giờ lần lượt là 46,4%, 50,6%, 36,9%
và 30,2% (p<0,05) (Hình 3.3A). Các thời điểm cịn lại, ChE giảm và khác
biệt khơng có ý nghĩa so với đối chứng (p>0,05).
Ở nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl thì tỷ lệ ức chế ChE tăng dần
theo thời gian và ở các thời điểm 24, 48 và 60 giờ lần lượt đạt 19,4%, 22,2%
và 22% so với đối chứng rồi sau đó giảm dần.
Ở nghiệm thức hỗn hợp, tỷ lệ ức chế ChE giai đoạn từ 1 – 36 giờ có
xu hướng giống sự tác động của đơn chất Fenobucarb nhưng giai đoạn 48 –
96 giờ có xu hướng giống sự tác động của đơn chất Chlorpyrifos ethyl. Cụ
thể ở thời điểm 1 giờ, tỷ lệ ức chế ChE đạt cao nhất là 60%, sau đó giảm dần
ở các thời điểm 12, 24, 36 giờ, lần lượt đạt 41,0%, 37,1% và 31,6% và đều
khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (p<0,05, Dunnet test) (Hình

3.3A). Giai đoạn từ 48 – 96 giờ, tỷ lệ ức chế ChE vẫn tiếp tục suy giảm
nhưng có xu hướng giống tác động của đơn chất Chlorpyrifos ethyl, tỷ lệ ức
chế ChE lần lượt ở các thời điểm 48, 60, 72 và 96 giờ lần lượt là 14,8%,
12,8%, -4,2% và 13,4%.
 Ở nồng độ 10% LC50 – 96 giờ
Đối với nghiệm thức đơn Fenobucarb, tỷ lệ ChE bị ức chế cao nhất ở
thời điểm 1 - 12 giờ sau phơi nhiễm và sau đó có khuynh hướng giảm dần
theo thời gian. Tỷ lệ ức chế ở các thời điểm 1, 12, 24, 36 và 48 giờ lần lượt
15


là 57,8%, 53,8%, 35,8%, 45,6%, 34,9% và khác biệt so với đối chứng
(p<0,05); các thời điểm còn lại (60,72 và 96 giờ), tỷ lệ ức chế ChE tiếp tục
giảm và khơng cịn khác biệt so với đối chứng (p>0,05).
Ở nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl, tỷ lệ ức chế ChE tăng dần và
bắt đầu sai khác so với đối chứng (p<0,05) từ 24 giờ và đạt cao nhất lúc 48
giờ; sau đó giảm dần nhưng vẫn khác biệt so với đối chứng (p<0,05). Cụ thể,
ở các thời điểm 24, 36, 48, 60, 72 và 96 giờ thì tỷ lệ ức chế ChE lần lượt đạt
48,9%, 49,1%, 58,9%, 52,1%, 48,8% và 44,6% (Hình 3.3B).
Ở nghiệm thức hỗn hợp, tỷ lệ ức chế ChE giai đoạn từ 1 – 36 giờ có
xu hướng giống sự tác động của đơn chất Fenobucarb nhưng giai đoạn 48 –
96 giờ có xu hướng giống sự tác động của đơn chất Chlorpyrifos ethyl. Cụ
thể ở thời điểm 1, 12, 24 và 36 giờ, tỷ lệ ức chế ChE lần lượt đạt 51,0%,
56,6%, 52,5%, 54,7% và đều khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng
(p<0,05) (Hình 3.3B). Giai đoạn từ 48 – 96 giờ, tỷ lệ ức chế ChE vẫn tiếp tục
suy giảm nhưng có xu hướng giống tác động của đơn chất Chlorpyrifos
ethyl, tỷ lệ ức chế ChE ở các thời điểm 48, 60, 72 và 96 giờ lần lượt là
53,5%, 44,7%, 43,8% và 41,8% và đều khác biệt có ý nghĩa thống kê so với
đối chứng (p<0,05). Như vậy ở nghiệm thức hỗn hợp, ChE bị ức chế kéo dài
hơn so với với từng đơn chất.

100

5% Chlorpyrifos Ethyl
5% Fenobucarb
5% HH (Chlor + Feno)

80

60
a

*
*

40

a

*

a
a

* a
*
* a
*

a
a

*

b

20

0

*

b
b

a
a

a
ab

a

*

a
ab

b
b

a

b

ab
b

a
a
b

Tỷ lệ ức chế hoạt tính Cholinesterase (%)

Tỷ lệ ức chế hoạt tính Cholinesterase (%)

100

10% Chlorpyrifos Ethyl
10% Fenobucarb
10% HH (Chlor + Feno)

80

60

*

a

* a

*

* a

a

40

* a
* a

* a
* a
*

* a

* a

a

* b

*a

* a
*

b

*

20

b

* a
* a
* a * a
b

b

b

b

0

a
a

a

-20

-20
0

1

12

24

36

48

60

Thời gian sau khi phơi nhiễm (giờ)

72

0

96

1

12

24

36

48

60

72

Thời gian sau khi phơi nhiễm (giờ)

(Hình 3.3A)
(Hình 3.3B)
Hình 3.3: Tỷ lệ ức chế hoạt tính ChE (% so với đối chứng) trong não cá lóc đồng (TB ± SE)
sau khi phơi nhiễm với Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl và hỗn hợp theo thời gian ở mức nồng
độ 5% LC50 - 96 giờ (Hình 3.3A), 10% LC50 - 96 giờ (Hình 3.3B). Trong cùng thời điểm phơi
nhiễm, các số liệu có cùng chữ cái thì khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05, Duncan test). Trong
cùng đường số liệu có dấu * thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05; Dunnet test) so với đối chứng.

Fenobucarb thuộc gốc Carbamate có cơ chế gây ức chế enzyme ChE
nhanh nhưng khơng lâu dài (Stenersen, 2004). Nhóm Alkyl hoặc Aryl của
gốc Carbamate sẽ gắn vào nhóm hoạt động Hydroxyl (-OH) của ChE làm
cho ChE bị carbamyl hóa khơng thể thủy phân Acetylcholine để truyền tín
hiệu thần kinh (Gupta, 2006). Cơ chế tác động này của nhóm Carbamate xảy
ra nhanh dẫn đến thời gian ức chế ChE nhanh trong vài giờ sau khi phơi
16

96


nhiễm (Williams et al., 2000). Nghiên cứu của Cong et al., (2006) đã cho
thấy Fenobucarb gây ức chế ChE ở cá Lóc cao nhất ở 6 giờ sau khi phơi
nhiễm. Trong nghiên cứu này, Fenobucarb gây ức chế ChE ở cá lóc cao
trong khoảng 1 – 12 giờ sau phơi nhiễm.
Chlorpyrifos ethyl là thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ, trong cấu tạo có

gốc P=S (thiono); gốc này khơng gây ức chế trực tiếp ChE mà khi thâm nhập
vào sinh vật sẽ bị chuyển hóa sinh học thành P=O (oxon) mới gây ức chế
ChE (Stenerson, 2004). Q trình chuyển hóa sinh học này diễn ra nhờ hệ
thống enzyme cytochrome P450 (Keizer et al., 1991) nên thường hiệu ứng
tác động chậm. Trong luận án này cho thấy tỷ lệ ức chế ChE ở nghiệm thức
Chlorpyrifos ethyl tăng dần theo thời gian và đạt cao trong khoảng 48 - 60
giờ sau khi phơi nhiễm.
Ở nghiệm thức hỗn hợp, hoạt tính ChE ở cá Lóc chịu tác động của cả
Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl. Giai đoạn 1 -12 giờ, tỷ lệ ức chế ChE ở
nghiệm thức hỗn hợp có xu hướng giống nghiệm thức Fenobucarb (p>0,05)
ở tất cả 4 mức nồng độ. Qua đó có thể kết luận, sự ức chế ChE trong thời
gian 1-12 giờ đầu phơi nhiễm chủ yếu do Fenobucarb gây nên. Sau đó, tỷ lệ
ức chế có xu hướng giống nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl (p>0,05). Kết
quả thể hiện rõ ở 2 mức nồng độ 5% và 10% LC50 – 96 giờ. Như vậy,
nghiên cứu này đã cho thấy khi hỗn hợp hai hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và
Fenobucarb thì khơng làm tăng hay giảm giảm tỷ lệ ức chế ChE cá Lóc so
với từng đơn chất nhưng thời gian ChE bị ức chế ở mức cao kéo dài hơn
thay vì chỉ bị ảnh hưởng của Fenobucarb Chlorpyrifos ethyl. Qua đó cho
thấy có thể hỗn hợp Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl lại với nhau mà khơng
làm tăng hay giảm độc tính của từng hoạt chất.
3.2.4 Phục hồi ChE trong nước máy sau khi phơi nhiễm với Chlorpyrifos
ethyl, Fenobucarb và hỗn hợp hai hoạt chất này
Như đã trình bày và thảo luận mục 3.2.3, ở cả 2 mức nồng độ 1 và 2%
LC50 – 96 giờ, tỷ lệ ức chế ở tất cả các trường hợp sau 96 giờ phơi nhiễm
đều không khác biệt so với đối chứng và giữa các nghiệm thức với nhau
(Hình 4.5A,B), nghĩa là ChE ở các nghiệm thức đã hồn tồn phục hồi. Do
đó theo dõi phục hồi ChE trong nước máy chỉ thực hiện ở nghiệm thức 5%
và 10% LC50 – 96 giờ.
 Ở nồng độ 5% LC50 – 96 giờ
Trước khi ra môi trường nước máy, hoạt tính ChE ở các nghiệm thức

Chlorpyrifos ethyl, Fenobucarb và hỗn hợp lần lượt đạt 88,8%, 101,2% và
86,5% so với đối chứng. Khi cho ra môi trường nước máy, ChE ở tất cả các
nghiệm thức đều tăng và khác biệt khơng có ý nghĩa so với đối chứng
(p>0,05) ở các thời điểm 1, 3, 5 và 7 ngày (Hình 3.4A). Như vậy, ở nồng độ
5% LC50 – 96 giờ, ChE đã phục hồi hồn tồn và khơng có sự khác biệt
giữa các nghiệm thức so với đối chứng.

17


 Ở nồng độ 10% LC50 – 96 giờ
Hoạt tính ChE ở các nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl, Fenobucarb và
hỗn hợp ở thời điểm 96 giờ sau khi phơi nhiễm lần lượt đạt 70,8%, 89,5% và
56,5% so với đối chứng và ở 2 nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl và hỗn hợp
khác biệt so với đối chứng (p<0,05). Sau khi ra môi trường nước máy, hoạt
tính ChE ở các nghiệm thức phục hồi dần nhưng tỷ lệ phục hồi kéo dài và ở
nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl và hỗn hợp; tỷ lệ ức chế vẫn còn khác
biệt so với đối chứng sau 7 ngày. Cụ thể, ở nghiệm thức Fenobucarb, hoạt
tính ChE ở các thời điểm 1, 3, 5 và 7 ngày sau khi ra môi trường nước máy
lần lượt đạt 102,5%, 114,9%, 109,3% và 105,2% so với đối chứng (Hình
3.4B). Như vậy, cá lóc sau khi phơi nhiễm Fenobucarb ở nồng độ 10%LC50
– 96 giờ đã phục hồi hoàn toàn sau 1 ngày cho ra mơi trường nước máy.

Hoạt tính ChE (% đối chứng)

120

140

5% Chlorpyrifos ethyl

5% Fenobucarb
5% HH (Chlor + Feno)

120
Hoạt tính ChE (% đối chứng)

140

100
b
80
60
40
20

10% Chlorpyrifos ethyl
10% Fenobucarb
10% HH (Chlor + Feno)

100

*
*

80
60

*

*

*

*

*

*

*

*

40
20

0

0
0

1

3

5

7

0

1

3

5

7

Thời gian sống trong môi trường nước sạch (ngày)

Thời gian sống trong môi trường nước sạch (ngày)

(Hình 3.4A)

(Hình 3.4B)

Hình 3.4: Hoạt tính ChE (% so với đối chứng) trong não cá lóc đồng (TB ± SE) sau
khi phơi nhiễm với Fenobucarb, Chlorpyrifos Ethyl hay kết hợp hai hoạt chất theo
thời gian ở mức nồng độ 5% (Hình 3.4A) và 10%LC50 - 96 giờ (Hình 3.4B) được
cho ra mơi trường nước máy. Trong cùng thời điểm phơi nhiễm, dấu * chỉ khác biệt có ý
nghĩa thống kê (p<0,05; Dunnet test) so với đối chứng.

Hoạt tính ChE ở nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl ở các thời điểm 1, 3,
5 và 7 ngày sau khi ra môi trường nước máy lần lượt đạt 62,3%, 82,9%,
78,6% và 82,9% so với đối chứng. Ở tất cả các thời điểm, hoạt tính ChE đều
thấp hơn so với đối chứng (p<0,05) (Hình 3.4B). Qua đó cho thấy khi phơi
nhiễm với Chlorpyrifos ethyl ở nồng độ 10% LC50 - 96 giờ thì ChE khó
phục hồi hồn tồn dù sau 1 tuần sống trong mơi trường nước máy.
Thuốc BVTV nhóm Carbamate gây chất ức chế ChE khơng lâu dài,

q trình carbamyl hóa enzyme ChE kết thúc nhanh (Stenersen, 2004). Hơn
nữa liên kết ester giữa gốc hoạt động nhóm Carbamate và nhóm Hydroxyl (OH) của ChE tương đối yếu nên một số ChE có thể được phóng thích từ liên
kết với gốc Carbamate để trở thành enzyme ChE bình thường mà khơng cần
trải qua q trình tổng hợp enzyme ChE mới (Post, 1987). Do đó, enzyme
ChE bị ức chế bởi thuốc BVTV gốc Carbamate có khả năng phục hồi nhanh.
18


Trường hợp Chlorpyrifos ethyl có gốc P=S (thiono) khơng trực tiếp
gây ức chế ChE mà cần thời gian để chuyển thành P=O (oxon) còn gọi là
Chlorpyrifos-oxon và khi kết hợp với enzyme ChE sẽ tạo thành phức hợp
Phosphorylated enzyme và Trychlorpyridinol. Phức hợp Phosphorylated
enzyme thủy phân rất chậm để trở thành Diethylphosphate và enzyem ChE
như ban đầu và một phần Phosphorylated enzyme tạo liên kết vĩnh viễn giữa
Chlorpyrifos-oxon với enzyme ChE và trở nên bất hoạt, không thể phục hồi
hay gọi là sự lão hóa (aging) (Timchalk, 2006). Q trình này xảy ra khi
một nhóm hữu cơ trong hợp chất lân hữu cơ gây ức chế bị mất đi và được
thay thế bởi một nhóm Hydroxyl (-OH) và làm cho liên kết giữa chất ức chế
và ChE bền chặt hơn và không thể bị thủy phân.
Ở nghiệm thức hỗn hợp, hoạt tính ChE của cá phục hồi chậm và có
diễn biến giống với sự phục hồi của nghiệm thức Chlorpyrifos elthyl khi cho
ra môi trường nước máy.
3.3 Nội dung 3: Ảnh hƣởng của sử dụng phối trộn thuốc BVTV
Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb cho lúa đến ChE ở cá Lóc
3.3.1 Nhiệt độ, pH, DO và mực nước trong thời gian thí nghiệm
Nhiệt độ trung bình trên các ruộng phun thuốc chứa hoạt chất
Fenobucarb dao động từ 26,0±0,3 0C đến 28,8±0,3 0C; phun Chlorpyrifos
ethyl dao động từ 26,8±0,3 0C đến 29,3±0,7 0C và khi phun hỗn hợp dao
động từ 27,0±0,6 0C đến 28,4±0,6 0C. Trung bình giá trị pH ở các ruộng
phun thuốc Fenobucarb dao động từ 6,6±0,1 - 6,7±0,1, phun Chlorpyrifos

ethyl dao động từ 6,6±0,1 - 6,8±0,1 và phun hỗn hợp thuốc dao động 6,5±0,1
- 6,8±0,1. Oxy hòa tan ở các ruộng phun thuốc Fenobucarb dao động từ
4,0±1,6 - 4,9±0,2 mg/L; phun Chlorpyrifos ethyl dao động từ 1,1±0,2 1,9±0,7 mg/L và hỗn hợp dao động từ 0,7±0,1 - 1,9±0,5 mg/L.
Tóm lại, các yếu tố nhiệt độ, pH, DO ngoài đồng ruộng dao động
nhiều hơn so với điều kiện phịng thí nghiệm nhưng vẫn thích hợp cho sự
sống và phát triển của cá.
3.3.2 Nồng độ Fenobucarb, Chloryrifos Ethyl trong nước ruộng
Trước khi phun thuốc, nồng độ Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl đều
dưới ngưỡng phát hiện ở tất cả các ruộng. Sau khi phun 1 giờ, nồng độ
Fenobucarb dao động từ 14 - 291g/L (trung bình 81,1g/L) ở ruộng phun
đơn Bascide 50EC và từ 10,5 - 272g/L (trung bình 96,8g/L) ở ruộng phun
hỗn hợp thuốc; trong khi đó nồng độ Chlorpyrifos ethyl dao động từ 1,3 7,1g/L (TB 4,7 g/L) ở ruộng phun đơn Mondeo 60EC và từ 0,2 25,2g/L (TB 9,1g/L) ở ruộng phun hỗn hợp thuốc. Một ngày sau phun,
nồng độ thuốc giảm đáng kể; ở ruộng phun Bascide 50EC Fenobucarb đã
dưới ngưỡng phát hiện (0,3g/L) nhưng ở ruộng phun đơn Chlorpyrifos
ethyl và phun hỗn hợp vẫn còn phát hiện dư lượng thuốc. Những ngày sau
đó, dư lượng tất cả các hoạt chất đều dưới ngưỡng phát hiện (Bảng 3.4).
19


Bảng 3.4: Nồng độ (g/L) thuốc trong nước trên các ruộng thí nghiệm
Thời gian
Sử dụng đơn chất
Sử dụng kết hợp 2 hoạt chất
Fenobucarb Chlorpyrifos ethyl Fenobucarb Chlorpyrifos ethyl
Trước khi phun
1 giờ
< DLF
< DLChl
< DLF
< DLChl

Sau khi phun
1 giờ
14-291
1,3-7,1
10,5-272
0,2-25,2
1 ngày
< DLF
0,3-1,7
3,3-68,8
0,3-0,7
3 ngày
< DLF
< DLChl
< DLF
< DLChl
5 ngày
< DLF
< DLChl
< DLF
< DLChl
DLF = 0,3 g/L, DLChl = 0,03 g/L

Ở các ruộng thí nghiệm, thuốc được phun ở liều cao nhất trên nhãn và
được đong bằng ly nhựa kèm theo chai; nước được đong vào bình phun bằng
cách ước chừng nên khơng thật sự chính xác giữa các ruộng. Mật độ lúa
khơng đồng đều, dao động từ 80-120 cây lúa/m2 cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ
thuốc rơi xuống nước. Mặt đất ruộng không thật sự bằng phẳng dẫn đến độ
sâu ngập khác nhau. Có thể các yếu tố trên là nguyên nhân góp phần gây
biến động nồng độ hai hoạt chất trên ruộng ở 1 giờ sau khi phun.

3.3.3 Ảnh hưởng của sử dụng Bascide 50EC và Mondeo 60EC cho lúa
đến ChE trong não cá lóc
 Ở nghiệm thức chỉ phun Bascide 50EC,
Trước khi phun thuốc Bascide 50EC, trung bình ChE của cá Lóc ở
các ruộng thí nghiệm là 7,3±0,3µM/g/phút. Sau 1 ngày phun thuốc, trung
bình tỷ lệ ChE bị ức chế so với trước phun là 24,2% (p<0,05), dao động từ
24 - 28%. Ở ngày thứ 3 sau khi phun thuốc tỷ lệ ức chế giảm còn 13%
(p<0,05). Kể từ ngày thứ 5 sau khi phun thuốc, ChE đã phục hồi hoàn tồn
(p>0,05) (Hình 3.5). Khơng có cá chết khi phun đơn thuốc Bascide 50EC.
100
e
80

c

Mondeo 60EC
Bascide 50 EC
Mondeo 60EC + Bascide 50EC

de

d
e

Tyû lệ ức chế (%)

e
60

c

d
c

40
c
20

b
a

ab
0

b

b

a

a

a
a

-20
0

5

10

Ngày sau khi phun

15

20

25

Hình 3.5: Hoạt tính ChE trong não cá lóc sống trên các ruộng phun đơn và kết hợp
Bascide 50EC và Mondeo 60EC. Số liệu trình bài trung bìnhSE, n=18. Trong cùng một
đường, các thời điểm thu mẫu có chữ cái giống nhau thì khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê
(p>0,05, Duncan Test).

20


Nồng độ Fenobucarb cao nhất là 14 - 291µg/L (TB 81,1 µg/L) và đây
có thể xem là nồng độ ban đầu cá tiếp xúc với thuốc. Nồng độ này tương
đương 2,2% LC50-96 giờ nhưng mức độ gây ức chế ChE của cá lóc dao
động từ 20-28%, cao hơn so với điều kiện phịng thí nghiệm. Trong điều
kiện phịng thí nghiệm, sau 12 giờ tiếp xúc với Fenobucarb ở nồng độ 2%
LC50-96 giờ thì tỷ lệ ức chế ChE khoảng 16,1%. Sự dao động nhiệt độ và
DO trên ruộng làm tăng xâm nhập Fenobucarb vào cơ thể cá, dẫn đến hậu
quả dẫn tới tăng ức chế ChE so với điều kiện phịng thí nghiệm.
Sự phục hồi nhanh ChE sau khi phơi nhiễm với Fenobucarb như trong
nghiên cứu này cũng đã được cơng bố (Cong et al., 2006). Mặc dù hoạt tính
ChE vẫn giảm so trước khi phun (p<0,05) nhưng tỷ lệ ức chế ChE không
vượt quá 30%. Theo Aprea et al., (2002) khi ChE bị ức chế khơng q 30%

thì sẽ khơng gây ảnh hưởng có hại đến sinh vật. Như vậy phun huốc Bascide
50EC cho lúa gây hại không nghiêm trọng cho cá lóc.
 Ở nghiệm thức phun đơn Mondeo 60EC,
Trước khi phun Mondeo 60EC thì ChE cá Lóc là 10,60,6
µM/g/phút và bị ức chế 73% (p<0,05) sau 1 ngày phun thuốc; tỷ lệ ức chế
tiếp tục tăng đến 79% ở ngày thứ 3 sau khi phun thuốc. Sau đó đã phục hồi
dần nhưng vẫn còn thấp hơn trước khi phun (p<0,05); tỷ lệ ức chế ở ngày
thứ 7, 14 và 21 sau khi phun lần lượt là 51%, 35,4% và 22,4% (Hình 3.5). Tỷ
lệ ức chế ChE khi phun Mondeo 60EC cao hơn khi phun Bascide 50EC rất
nhiều và vẫn còn thấp hơn so với trước khi phun lúc kết thúc thí nghiệm
(p<0,05). Sau 1 ngày phun, có 13% tổng số cá bố trí chết nên khơng cịn đủ
lượng cá để theo dõi cho đến khi ChE phục hồi hoàn toàn như trường hợp
phun Bascide 50EC. Những cá chết đều có tỷ lệ ức chế ChE hơn 70% mức
bình thường. Fulton and Key (2001) cho rằng khi ChE bị ức chế từ 70% trở
lên sẽ làm đa số sinh vật chết. Trong nghiên cứu này có 38,9% cá chết ở
ngày thứ 1 sau phun và hoạt tính ChE của cá Lóc ở ngày thứ 1 và 3 sau khi
phun bị ức chế hơn 70%. Như vậy, không ngoại lệ cá Lóc cũng bị chết khi
ChE bị ức chế hơn 70%. Kết quả này cho thấy sử dụng Mondeo 60EC cho
lúa khơng những đã làm chết cá Lóc mà cịn ảnh hưởng lâu dài đến ChE.
 Ở nghiệm thức sử dụng kết hợp Bascide 50EC và Mondeo 60EC
Trước khi phun thuốc, trung bình ChE cá Lóc là 8,60,4 µM/g/phút.
Tỷ lệ ChE bị ức chế là 73% sau một ngày phun thuốc và tiếp tục gia tăng lên
86% ở ngày thứ 3 và duy trì đến ngày thứ 5; sau đó ChE phục hồi dần nhưng
tỷ lệ ức chế còn cao ở các ngày 7, 14, 21 (Hình 3.5). Nồng độ cao nhất của
Fenobucarb trên ruộng sau 1 giờ phun vẫn không vượt quá 10% LC50 - 96
giờ của hoạt chất này đối với cá lóc nhưng nồng độ cao nhất của
Chlorpyrifos ethyl trên ruộng đã bằng khoảng 93% LC50-96 giờ của đối với
cá. Do đó cá chết có thể do ảnh hưởng chủ yếu của Chlorpyrifos ethyl.
Khi phun đơn lẻ Bascide 50EC thì tỷ lệ ức chế ChE đạt cao nhất ở 1
ngày sau phun rồi sau đó phục hồi dần. Khi phun đơn lẻ Mondeo 60EC thì

tỷ lệ ức chế ChE gia tăng và đạt cực đại ở ngày thứ 3 sau phun. Khi phun kết
21


hợp Bascide 50EC và Mondeo 60EC thì tỷ lệ ChE bị ức chế tương tự như
trường hợp phun đơn lẻ Mondeo 60EC nhưng sau 5 ngày mới có khuynh
hướng phục hồi. Tốc độ phục hồi ChE trường hợp phun kết hợp chậm hơn so
với phun đơn lẻ Bascide 50EC hay Mondeo 60EC. Nồng độ Fenobucarb và
Chlorpyrifos Ethyl sau 1 giờ phun ở nghiệm thức kết hợp cao hơn so với
phun đơn lẻ là nguyên nhân làm tỷ lệ ức chế ChE trong trường hợp này
nghiêm trọng hơn phun đơn lẻ từng hoạt chất.
Sau khi phun thuốc, cá chết xuất hiện ở các ngày 1, 3, 5 và 7 với tỷ lệ
lần lượt là 9%, 4,2%, 2,1% và 0,8% so với tổng số cá thả ban đầu. Hoạt tính
ChE ở các cá chết này đều bị ức chế hơn 70% nên có thể là do ảnh hưởng
của thuốc. Khơng xuất hiện cá chết khi phun đơn lẻ Bascide 50EC cho lúa
nhưng cả 2 trường hợp phun đơn lẻ hay kết hợp Mondeo 60EC với Bascide
50EC đều làm cá chết. Giá trị LC50-96 giờ của Fenobucarb đối với cá lóc là
3.630 g/L bằng 133,9 lần LC50-96 giờ của Chlorpyrifos ethyl (27,1g/L).
Đây là bằng chứng cho thấy Chlorpyrifos ethyl độc với cá lóc hơn
Fenobucarb. Do đó, cá chết trong trường hợp này chủ yếu do Chlorpyrifos
ethyl gây nên.
Ngoài ra, khi hỗn hợp Mondeo 60EC với Bascide 50EC thì khơng làm
tăng hay giảm tỷ lệ ức chế ChE cá lóc so với đơn chất Mondeo 60EC. Nói
cách khác, hoạt lực của thuốc khơng bị ảnh hưởng khi hỗn hợp hai hoạt chất
này lại với nhau. Sự ức chế lâu dài ChE trong thực nghiệm phun kết hợp
Fenobucarb và Chlorpyrifos Ethyl cũng do ảnh hưởng của Chlorpyrifos
Ethyl vì hoạt chất này có thời gian bán hủy lâu hơn Fenobucarb nên vẫn tồn
dư trong đất lúa.
3.3.4 Khả năng tái kích hoạt ChE của cá lóc
3.3.4.1 Khả năng tái kích hoạt ChE bằng 2PAM khi phun Mondeo 60EC

Ở thời điểm 1 ngày sau khi phun, 100% mẫu ủ đều có hoạt tính ChE
cao hơn trước ủ. Tỷ lệ tái kích hoạt ở các đợt thu mẫu giảm dần theo thời
gian sau khi phun có thể do bản thân ChE đã tự phục hồi dần nên dù tái kích
hoạt được nhưng hiệu quả sẽ khơng cao. Ở thời điểm 14 ngày sau khi phun,
mặc dù ChE vẫn còn thấp hơn trước khi phun nhưng mẫu khơng tái kích
hoạt được có thể do sự lão hóa enzyme (Hình 3.6A).
Sanchez-Hernandez et al., (2002) cho rằng việc áp dụng kỹ thuật tái
kích hoạt với 2-PAM cịn phụ thuộc vào thời gian phơi nhiễm, thời gian ức
chế kéo dài đã làm lão hóa các liên kết và ngăn cản q trình tái kích hoạt.
Q trình “lão hóa” (aging) của các enzyme bị phosphoryl hóa do sự mất đi
của một nhóm alkyl trong hợp chất lân hữu cơ, từ đó cản trở khả năng tái
kích hoạt của 2-PAM đến các enzyme (Sanchez-Hernandez et al., 2002).
Cong et al., (2008) cũng cho thấy sự lão hóa ChE xảy ra sau khi cá lóc phơi
nhiễm với lân hữu cơ Diazinon 14 ngày. Hóa chất 2-PAM có tác dụng giải
độc bằng cơ chế hình thành liên kết với lân hữu cơ để làm giảm ái lực liên
kết giữa lân hữu cơ và ChE; từ đó có thể tách phân tử lân hữu cơ ra khỏi
ChE giúp ChE phục hồi hoạt tính. Tuy nhiên, khi tiếp xúc với lân hữu cơ
22


trong thời gian dài, nếu quá trình thủy phân tự nhiên làm mất đi một một
nhóm alkyl trong phân tử lân hữu cơ thì sẽ hình thành liên kết bền chặt với
ChE và không thể phục hồi, kể cả khi dùng 2-PAM.
12

12
ChE
ChE + 2PAM

Häoạt tính ChE (µM/g/phút )

10
a
b

bc

8

b
b

d

6

cd

d
c

4
d
d

2

ChE
ChE + 2PAM
ChE + Pha lỗng

a

Hoạt tính ChE (% đối chứng)

a

10

a
a

b

b

8

c

6

c

c

d

d
de

de
e
d

d
0

c

d

4

2

c
b

c

d

0
0

2

4

6

8

10

12

14

16

Thời gian sau khi phun (ngày)

0

5

10

15

20

Thời gian sau khi phun (ngày)

(Hình 3.6A)

(Hình 3.6B)

Hình 3.6: Hoạt tính ChE cá Lóc so với trước khi xử lý với 2-PAM trong phun đơn lẻ
Mondeo 60EC (Hình 3.6A) và so với trước khi xử lý 2-PAM và pha loãng mẫu trong
phun hỗn hợp Bascide 50EC và Mondeo 60EC cho lúa (Hình 3.6B). Trong cùng thời
điểm phơi nhiễm, các đường có cùng chữ cái thì khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05,
Duncan test).

3.3.4.2 Khả năng tái kích hoạt ChE bằng 2PAM và pha lỗng khi phun hỗn
hợp thuốc Bascide 50EC và Mondeo 60EC
Đối với mẫu pha lỗng, hoạt tính ChE ít khác biệt so với mẫu khơng
xử lý bằng 2-PAM, hoạt tính ChE ở các thời điểm 1, 3, 5, 7, 14 và 21 ngày
lần lượt đạt 2,6±0,3, 1,5±0,2, 1,2±0,1, 1,7±0,2, 4,7±0,6 và 8,2±0,4
µM/g/phút. Như vậy, tái kích hoạt bằng phương pháp pha lỗng mẫu khơng
thể hiện rõ, cao hơn từ 1 – 1,3 lần so với mẫu khơng xử lý nhưng khác biệt
khơng có ý nghĩa thống kê (Hình 3.6B). Theo Fukuto (1990) thuốc trừ sâu
Carbamate không gây ức chế ChE nghiêm trọng và kéo dài như thuốc trừ sâu
lân hữu cơ. Kết quả ở mục 3.3.1 cũng cho thấy phun Fenobucarb cho lúa
theo liều chỉ dẫn gây ức chế ChE cá lóc cao nhất là 24,2% ở thời điểm 1
ngày sau khi phun; sau đó ChE nhanh chóng phục hồi và chỉ cịn bị ức chế
khoảng 13% ở ngày thứ 3. Do đó tỷ lệ tái kích hoạt bằng kỹ thuật pha lỗng
đạt hiệu quả rất thấp.
Kết quả trên cho thấy tái kích hoạt bằng 2-PAM trong trường hợp bị
ức chế bởi Chlorpyrifos ethyl đạt mức cao nhất sau giai đoạn từ 1 – 5 ngày
cá phơi nhiễm với thuốc. Tái kích hoạt bằng phương pháp pha lỗng mẫu
khơng thể hiện rõ nên khó có thể áp dụng. Do đó thời điểm thích hợp nhất để
chẩn đốn mơi trường có ơ nhiễm thuốc bảo vệ thực vật gốc Lân hữu cơ hay
không là trong vòng 1 – 5 ngày sau khi cá tiếp xúc với thuốc. Nếu cho cá
tiếp xúc trong thời gian quá ngắn thì chưa đủ thời gian để gây ảnh hưởng đến
ChE cịn nếu phơi nhiễm q lâu thì ChE bị ức chế đã tự phục hồi dần hoặc
xảy ra hiện tượng lão hóa enzyme nên tỷ lệ tái kích hoạt giảm.
23

25


3.4 Đề xuất khả năng áp dụng đo ChE để cảnh báo nhiễm bẩn thuốc BVTV
Trong điều kiện phịng thí nghiệm, tỷ lệ ChE bị ức chế thể hiện rỏ liên
quan với nồng độ Fenobucarb hay Chlorpyrifos ethyl; gia tăng nồng độ
thuốc thì tỷ lệ ChE bị ức chế tăng hay hoạt tính ChE càng thấp. Qua đó cho
thấy đo ChE ở não cá có thể chỉ được mức độ nhiễm bẩn thuốc BVTV. Vấn
đề cần lưu ý ở đây là xác định thời gian phơi nhiễm cần thiết để đo ChE. Kết
quả cho thấy đối với Fenobucarb thì thời gian phơi nhiễm để ChE bị ức chế
cao nhất là 1 - 12 giờ sau tiếp xúc, trong khi Chlorpyrifos ethyl là 48 - 60
giờ. Sau các thời điểm này thì ChE đã có xu hướng phục hồi nên việc đo
ChE để chỉ mức độ nhiễm bẩn thuốc BVTV là khơng chính xác.
Ở điều kiện ruộng lúa, sau một ngày phun thuốc Fenoucarb,
Chlorpyrifos ethyl hay hỗn hợp 2 hoạt chất này cho lúa đều làm ảnh hưởng
đáng để đến ChE cá lóc. Thời điểm ảnh hưởng nhiều nhất đến ChE của
Fenobucarb là 1 ngày sau khi phun, trong khi đó phun riêng lẻ Chlorpyrifos
ethyl hay hỗn hợp Chlorpyrifos ethyl với Fenobucarb thì tỷ lệ ức chế cao
nhất là 3 ngày sau khi phun. Nếu cho cá phơi nhiễm trong thời gian ngắn thì
chưa thấy ảnh hưởng của thuốc và nếu phơi nhiễm quá lâu thì ChE đã phục
hồi nên kết quả đo sẽ không phản ánh tốt mức độ ô nhiễm. Kết quả (Hình
3.5) cho thấy chọn thời điểm 1 ngày sau phun để đo ChE là tối ưu nhất cho
phun riêng lẻ Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl hay hỗn hợp hai hoạt chất này.
Khi áp dụng phương pháp thông thường để đo ChE thì cần phải có
mẫu đối chứng hoặc thơng tin nền về hoạt tính ChE của cá lóc hay sinh vật
được chọn để quan trắc. Như vậy, việc nghiên cứu thơng tin nền về hoạt tính
ChE của sinh vật cần phải tiến hành bằng cách đo ChE của nhiều sinh vật ở
các điều kiện khác nhau như nhóm tuổi, kích cỡ, giới tính, … hoặc phải có
mẫu đối chứng cho mỗi lần đo. Áp dụng phương pháp này sẽ cần nhiều sinh

vật và tốn khá nhiều thời gian, kinh phí.
Khi áp dụng kỹ thuật tái kích hoạt sẽ có nhiều ưu điểm hơn. Chỉ cần
đo ChE của chính sinh vật nên sẽ không cần sinh vật đối chứng và loại bỏ
ảnh hưởng của tuổi, giới tính… Trong kỹ thuật này cần lưu ý chọn nồng độ
hóa chất tái kích hoạt cho hợp lý, nếu quá cao sẽ làm ChE bị ức chế và thấp
thì sẽ khơng tái kích hoạt được. Nếu phát hiện đa số mẫu có ChE sau khi tái
kích hoạt cao hơn trước khi áp dụng thì có thể kết luận sinh vật đã bị phơi
nhiễm lân hữu cơ. Kết quả cũng cho thấy sau 1 ngày phơi nhiễm cho tỷ lệ tái
kích hoạt là cao nhất nên chọn thời điểm phơi nhiễm này là hợp lý nhất và
hạn chế tình trạng lão hóa enzyme mà khơng tái kích hoạt được. Quy trình
tái kích hoạt được bằng 2-PAM được tóm lược ở hình 3.8 và phương pháp
được mô tả ở mục 2.4.2.

24


Cho sinh vật phơi nhiễm môi trường cần
quan trắc trong 1 ngày
Thu mẫu, lấy não đem nghiền ở nồng độ

≤25 mg não/mL

Lấy 0,5 ml mẫu não đã nghiền
+0,5 ml dung dịch 0,6mM
2-PAM và trộn cho đều

Lấy 0,5 ml mẫu não đã nghiền
+0,5 ml dung dịch đệm pH 7,4
và trộn cho đều

Đem ủ ở 370C trong 30 phút
Đem ly tâm ở 40C trong 20
phút ở tốc độ 2.000 vòng/phút

Đem ly tâm ở 40C trong 20
phút ở tốc độ 2.000 vòng/phút

Lấy phần trong phía trên đo
ChE bằng máy so màu ở bước
sóng 412 nm theo phương
pháp Ellman et al., (1961)

Lấy phần trong phía trên đo
ChE bằng máy so màu ở bước
sóng 412 nm theo phương
pháp Ellman et al., (1961)

So sánh kết quả ChE mẫu có 2-PAM với
mẫu khơng có 2-PAM

Đa số mẫu trộn với 2-PAM có ChE
≤ với ChE khơng trộn 2-PAM

Đa số mẫu trộn với 2-PAM có ChE
> với ChE khơng trộn 2-PAM

Môi trường chưa nhiễm bẩn
thuốc BVTV gốc lân hữu cơ

Mơi trường đã nhiễm bẩn

thuốc BVTV gốc lân hữu cơ

Hình 3.8: Quy trình áp dụng đo ChE trong cảnh báo nhiễm bẩn và ảnh hưởng của
thuốc BVTV gốc lân hữu cơ đến sinh vật

Chƣơng 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
4.1 Kết luận
Có 232 tên thương mại thuốc BVTV với 65 hoạt chất khác nhau được
nông dân sử dụng ở trong canh tác lúa ở vùng nghiên cứu. Trung bình thuốc
BVTV được phun khoảng 6,0 lần/vụ và số lần phun thuốc trừ sâu bệnh là
cao nhất (4 lần/vụ), kế đến là trừ cỏ, trừ ốc (khoảng 1,0 lần/vụ). Đa số nông
dân hỗn hợp nhiều loại thuốc trừ sâu với nhau hoặc thuốc trừ sâu với trừ
25