Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
===o0o===

PHAN THỊ ANH

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG GIẢI
PHÓNG THUỐC CURCUMIN CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Xuân Thành

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài
“Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc Curcumin của màng
Cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường”, với lòng kính trọng và
biết ơn sâu sắc em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:
TS. Nguyễn Xuân Thành - Người đã hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em
trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này.
Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô làm việc tại Viện Nghiên cứu
khoa học và Ứng dụng - trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các thầy cô và
các bạn sinh viên đang học tập và làm việc tại Bộ môn Sinh lý người và động
vật, khoa Sinh -KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ nhiệt

tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên
cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, những người thân, bạn bè đã
quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 21 tháng 04 năm 2017
Sinh viên

Phan Thị Anh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật.
Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu
thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa
đặt, không trùng với kết quả đã công bố. Trong tài liệu này tôi có sử dụng
một số tài liệu của một số tác giả, tôi xin phép tác giả để bổ sung cho khóa
luận của mình.
Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 21 tháng 04 năm 2017
Sinh viên

Phan Thị Anh


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
A. xylinum

: Acetobacter xylinum

CNM

: Cao nấm men

CV

: Cellulose vi khuẩn

MT1

: Môi trường 1

MT2

: Môi trường 2

MT3

: Môi trường 3

CNM

: Cao nấm men OD

: Optical density UV – vis
Ultraviolet visible

:

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài........................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 3
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 5
1.1. Tổng quan về CVK .................................................................................... 5
1.1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum ....................................................... 5
1.1.2. Đặc điểm của A. xylinum .......................................................................................... 5
1.1.3. Cấu trúc đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum ............................. 6
1.1.4. Tính chất độc đáo của CVK .................................................................................... 6
1.1.5. Sinh tổng hợp CVK ....................................................................................................... 7
1.1.6. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ........................................................................... 7
1.1.7. Các phương pháp sản xuất CVK từ A. xylinum........................................... 8
1.2. Tổng quan về tính chất CUR.................................................................... 10
1.2.1. Sơ lược về thuốc CUR .............................................................................................. 10
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc CUR................................ 13
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 16
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 16
2.1.1.Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................................... 16
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 16
2.2.1. Chuẩn bị màng CVK.................................................................................................. 16
2.2.2. Phương pháp dựng đường chuẩn ...................................................................... 19
2.2.3. Chuẩn bị bộ đệm .......................................................................................................... 20
2.2.4. Chế tạo màng CVK nạp CUR .............................................................................. 21
2.2.5. Xác định lượng CUR nạp vào màng CVK .................................................... 21
2.2.6. Xác định lượng thuốc giải phóng của màng CVK nạp thuốc CUR 21

2.2.7. Phương pháp xử lý thống kê ................................................................................. 23
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 24


3.1. Kết quả tạo màng và xử lý màng CVK từ các môi trường khác nhau ..... 24
3.1.1. Thu màng CVK từ các môi trường lên men .................................................. 24
3.1.2. Quá trình xử lý màng CVK trước khi hấp thu thuốc .............................. 25
3.1.3. Xác định điều kiện nuôi cấy để có độ dày màng CVK thích hợp .... 25
3.1.4. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK ............................................................ 27
3.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc của các màng CVK ............................................. 28
3.2.1. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng cao nấm men ........................................ 28
3.2.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng nước dừa già ........................................ 29
3.2.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng nước vo gạo .......................................... 31
3.3. So sánh tỷ lệ giải phóng thuốc của các màng CVK lên men từ các môi
trường khác nhau............................................................................................. 32
3.4. Đánh giá động dược học giải phóng của thuốc CUR từ màng CVK....... 33
Kết luận ........................................................................................................... 38
Kiến nghị ......................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 39


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy A. xylinum tạo màng CVK............................ 17
Bảng 2.2. Mật độ quang của dung dịch CUR ở các nồng độ (mg/ml) khác
nhau (n = 3) ..................................................................................................... 19
Bảng 2.3. Môi trường đệm PBS...................................................................... 20
Bảng 3.1. Kết quả thu màng CVK tươi ở các độ dày khác nhau .................... 26
Bảng 3.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc CUR (%) từ màng CVK lên men từ môi
trường CNM (n =3) ......................................................................................... 28
Bảng 3.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc CUR (%) từ màng CVK lên men từ môi

trường nước dừa già (n =3) ............................................................................. 29
Bảng 3.4. Tỷ lệ giải phóng thuốc CUR (%) từ màng CVK lên men từ môi
trường nước vo gạo (n=3) ............................................................................... 31
2

Bảng 3.5. Hệ số tương quan (R ), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ
giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau của màng CNM (n =3)
......................................................................................................................... 34
2

Bảng 3.6. Hệ số tương quan (R ), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ
giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau của màng nước dừa già
(n =3) ............................................................................................................... 35
2

Bảng 3.7. Hệ số tương quan (R ), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ
giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau của màng nước vo gạo
(n =3) ............................................................................................................... 36


DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ
Hình 1.1. Cấu trúc CUR 1,7 - bis (4 - hydroxy - 3 - metoxyphenyl) - 1,6 heptadien - 3,5 - dione..................................................................................... 11
Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn của CUR .............................................. 20
Hình 3.1. Màng CVK lên men từ môi trường nước dừa già........................... 24
Hình 3.2. Màng CVK lên men từ môi trường nước vo gạo............................ 24
Hình 3.3. Màng CVK lên men từ môi trường CNM....................................... 24
Hình 3.4. Các quy trình xử lý màng CVK ...................................................... 25
Hình 3.5. Kết quả tìm sự hiện diện của Glucose trong dịch chiết màng CVK27
Hình 3.6. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng CNM với độ dày 0.5cm và 1cm .. 28
Hình 3.7. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng nước dừa với độ dày 0.3cm và

0.5cm ............................................................................................................... 29
Hình 3.8. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng nước vo gạo với độ dày 0.3cm và
1cm .................................................................................................................. 32
Sơ đồ 2.1. Quy trình tinh chế màng CVK....................................................... 18


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong những năm gần đây đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các
vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo,
tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Một trong những vật
liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là Cellulose. Vật liệu này
vượt trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [15]. Trong đó,
Cellulose vi khuẩn hay màng sinh học (CVK) là đối tượng của nhiều nghiên
cứu ứng dụng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài. Đây là
một loại nguyên liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực
phẩm, y học, mỹ phẩm, ...Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng CVK được
tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công
nghiệp. Về mặt tính chất, CVK có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các
loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
Ngoài ra, CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn
định về kích thước và hướng. CVK còn là một mạng polyme sinh học có khả
năng giữ nước rất lớn, có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích
đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ học cao) [5].
Ngoài ra, màng CVK còn là hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn
cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và sự tác động của UV, có tiềm
năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống vận chuyển thuốc, cho cả thẩm
thấu qua da, qua đường miệng và mô - kỹ thuật, và một số ứng dụng y sinh
học khác [5, 6, 9, 28],…
Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng CVK

làm hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc có
hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường.
Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng CVK nạp thuốc là khả năng chữa lành

1


vết thương, đặc tính bảo vệ, khả năng hấp thu dịch tiết với việc giải phóng các
loại thuốc trị liệu có liên quan. Hầu hết các chế phẩm đắp qua da được sản
xuất bởi các vật liệu khác nhau. Do đó, một hệ thống nạp thuốc có khả năng
giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chí một lớp duy nhất có thể đơn
giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí [5, 26].
Curcumin (CUR) có nguồn gốc từ các gia vị nghệ - thực phẩm phổ biến
được sử dụng trong nhiều thế kỷ như một phương thuốc cho nhiều bệnh.
Nghiên cứu khoa học rộng lớn trong thập kỷ qua đã thể hiện khả năng của
hợp chất này để điều chỉnh nhiều mục tiêu của tế bào và do đó có giá trị
phòng ngừa và điều trị chống lại một loạt các bệnh.
Trong những năm gần đây, các tác dụng dược lý tiềm năng của CUR
trong các bệnh viêm, bệnh tim mạch, ung thư, bệnh Alzheimer và các chứng
rối loạn thần kinh đã được chứng minh. Tuy nhiên, các ứng dụng lâm sàng
của CUR hạn chế do nhược điểm chính của nó như sự bất ổn, độ hòa tan thấp,
khả dụng sinh học kém và quá trình chuyển hóa nhanh chóng [27].
CUR - một hợp chất polyphenolic sở hữu tác dụng dược lý khác nhau
bao gồm chống viêm, chống oxy hóa, chống tiền tăng sinh và các hoạt động
chống tạo mạch. Mặc dù hiệu quả và độ an toàn của nó đã được chứng minh,
hạn chế sinh khả dụng CUR tiếp tục được nhấn mạnh như là một mối quan
tâm chính. Nồng độ CUR trong huyết thanh và mô thấp, không phân biệt
đường dùng, quá trình chuyển hóa nhanh chóng và loại trừ những yếu tố quan
trọng làm giảm bớt khả năng sinh khả dụng của CUR [8].
Thử nghiệm lâm sàng đã chỉ ra rằng chất CUR là an toàn ngay cả ở liều

cao (12 g/ngày) ở người nhưng biểu hiện sinh khả dụng kém. Lý do chính hấp
thu vào mức độ huyết tương và mô thấp của CUR là do kém hấp thu, chuyển
hóa nhanh chóng, và loại bỏ hệ thống nhanh chóng. Để cải thiện sinh khả
dụng của CUR, nhiều phương pháp đã được thực hiện [8].


Từ các nghiên cứu về màng CVK và một số hạn chế của CUR trong quá
trình điều trị, xét thấy đây là hướng nghiên cứu mới và triển vọng. Đó là lý do
chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc
Curcumin của màng Cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường.”
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nuôi và thu sản phẩm màng CVK từ chủng
Acetobacter xylinum.
- Thiết kế các hệ thống gồm CVK được nạp thuốc từ một số môi trường
và so sánh khả năng giải phóng thuốc CUR của các hệ thống giải phóng kéo
dài trong các môi trường pH khác nhau.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng và xử lý màng CVK.
- Thiết kế, chế tạo màng CVK nạp CUR.
- Khảo sát so sánh khả năng giải phóng của các màng CVK - CUR in
vitro.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK làm từ môi trường nước dừa già,
nước vo gạo và môi trường chuẩn (cao nấm men), thuốc CUR tinh khiết 95%.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng
thí nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Sinh lý người và động vật
khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Viện Nghiên cứu
khoa học và Ứng dụng -trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.

 Ý nghĩa khoa học: Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.
Việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK vào việc khắc phục hạn chế của
thuốc CUR sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới không chỉ dừng lại ở việc
khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng trên nhiều các loại
thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển hơn.


Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của màng
CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả màng
CVK, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều các lĩnh
vực khác nhau.
 Ý nghĩa thực tiễn:
+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter
xylinum.
+ Từ các màng CVK đã được tạo ra được dùng làm các hệ thống giải
phóng thuốc.
+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về CVK
1.1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum
Acetobacter xylinum (A. xylinum) thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi
Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, là loại hiếu khí bắt buộc, có nhu mao và
sản xuất cellulose ngoại bào [5].
Theo khóa phân loại của Bergey [20], A. xylinum thuộc:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ : Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae

1.1.2. Đặc điểm của A. xylinum
* Đặc điểm hình thái:
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0.6 – 0.8 µm, dài khoảng 2 - 3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram
âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào
già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biển đổi: tế bào
dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [5].
* Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A. xylinum:
Vi khuẩn có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng
catalase dương tính, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, không tạo sắc
tố nâu, có khả năng tổng hợp cellulose, chuyển hóa glucose thành acid,
chuyển hóa glycerol thành dihydroaceton.
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc
vào chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất.


Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 - 30°C; vi khuẩn tăng
trưởng trong khoảng pH từ 3 - 8, pH tối ưu để sản xuất cellulose là 5.5 [5, 20].
1.1.3. Cấu trúc đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum
- Màng CVK cấu tạo bởi những chuỗi polimer β - 1,4 - glucopyranose
không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản
của CVK giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc
đại thể [13, 28].
- Theo AJ. Brown (1886), CVK gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là
hemicellulose, đường kính 1.5nm, kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với
nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng
khoảng 3 - 8nm.
- Đặc tính cấu trúc của CVK phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy:
+ Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh (S - CVK: Static - Cellulose vi
khuẩn), A. xylinum tạo ra cellulose nhiều hơn và tạo thành màng dày trên bề

mặt môi trường. Màng CVK thu được dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả
màu vàng.
+ Khi nuôi cấy động (A - CVK: Agitated - Cellulose vi khuẩn), một
lượng nhỏ cellulose được hình thành dưới dạng huyền phù phân tán trong đó
chuỗi β - 1,4 - glucan xếp một cách ngẫu nhiên. CVK được tạo ra bằng
phương pháp nuôi cấy động dưới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và
không trật tự do sự dao động của môi trường nuôi cấy.
+ Lượng CVK được sinh ra giữa hai phương pháp nuôi cấy động và tĩnh
cũng khác nhau: khối lượng màng khô của phương pháp nuôi cấy động nhỏ
hơn so với nuôi cấy tĩnh [5, 24].
1.1.4. Tính chất độc đáo của CVK
- Độ tinh khiết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó CVK có thể bị vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh [30].


- Độ bền dai cơ học lớn: cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao,
trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể [6, 30].
- Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nước đáng kể,
lực ẩm cao. Màng CVK có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút khoảng
200 lần trọng lượng của nó (Patel & Suresh 2008; Wippermann et al. 2009)
[33].
1.1.5. Sinh tổng hợp CVK
Các vị trí tổng hợp cellulose của A. xylinum là những lỗ nằm trên bề mặt
tế bào, có đường kính 3.5nm sắp xếp song song trên đường thẳng trục dọc của
vi khuẩn. Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10nm chứa các enzym có chức năng
trong sự polyme hóa để tổng hợp cellulose và các protein hỗ trợ liên quan đến
các chức năng khác [5].
A. xylinum hấp thu đường glucose vào trong tế bào, kết hợp với một
acid béo tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào, sau đó tiền chất này được tiết

ra ngoài tế bào cùng với enzym để thực hiện quá trình polyme hóa tạo
cellulose. Các sợi siêu nhỏ 1.5nm tạo nên các dãy glucan tạo thành các sợi,
sau đó kết hợp với nhau thành bó sợi nhỏ. Các bó sợi này sẽ được phun vào
môi trường nuôi cấy [5].
1.1.6. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [5].
A. xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn
cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng là glucose,
fructose, maninol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, galactose, lactose, sucrose
cho hiệu suất thập hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol,
acetate. Việc sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường trong
môi trường còn phụ thuộc vào những chủng A. xylinum khác nhau [5].


Nhu cầu sử dụng đương ở A. xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng
trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng
các sản phẩm: rỉ đường, chất thải trong công nghiệp sản xuất khoai tây và pho
mát, nước dừa già, nước vo gạo, cao nấm men và nước mía... để làm nguyên
liêu nuôi cấy A. xylinum.
1.1.7. Các phương pháp sản xuất CVK từ A. xylinum
1.1.7.1. Lên men tĩnh
Môi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các khay lên
men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các khay được đậy bằng
giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi
trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ thích
hợp cho quá trình lên men 28 - 30ᴼC. Sợi cellulose mới được tổng hợp sẽ di
chuyển lên bề mặt của môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulose nằm
ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí. Cellulose tiếp tục được

tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên. Sau 7 - 10 ngày có thể thu CV [5,
24].
1.1.7.2. Lên men động
Vi khuẩn A. xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy lắc.
Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy đã
chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt ở
28
- 30ᴼC, 180 - 200 vòng/phút. CVK được tạo ra từ môi trường lắc có dạng hạt
nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường.
Lượng O2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và khả
năng tổng hợp CVK của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá trình lên men đạt
hiệu quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử dụng để lên men [5,
24].


1.1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng CVK trong lĩnh vực vận tải
và phân phối thuốc qua da
1.1.8.1. Trên thế giới
Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng
CVK trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [6], trong đó có 9
nghiên cứu với màng CVK tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi
màng CVK và 7 nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite. Như vậy, trong
lĩnh vực này cần tiếp tục được tiến hành nghiên cứu.
Một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng CVK làm hệ
thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc đã cho
thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông
thường. Nghiên cứu của Wei B. và cộng sự (2011) cho thấy màng khô CVK
thu được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng
khuẩn; Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi
2

đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0.116 kg/cm , và tác dụng của
thuốc kéo dài ít nhất 24h chống lại hoạt động của S. aureus và B. Subtilis
[31]. Nghiên cứu khác cho thấy việc sử dụng nanocomposites bạc với CVK
đã cho hiệu quả kháng khuẩn cao [21].
Tiềm năng vận tải và phân phối thuốc của màng CVK qua da đã được
nghiên cứu bằng cách tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và
không được chiếu xạ. CVK không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh
hơn so với ảnh hưởng của CVK chiếu xạ. Kết quả nghiên cứu này cho thấy
màng CVK không chỉ có khả năng vận tải mà còn đề xuất một mô hình cho
giải phóng thuốc qua màng [6]. Việc sử dụng màng CVK cho việc thẩm thấu
qua da của nhiều thuốc, cụ thể là ibuprophen [33], caffeine [24], diclofenac
[25] và sulfadiazine bạc [16] cho kết quả tích cực. Các kết quả nghiên cứu
cho thấy việc bổ sung glycerol vào màng CVK giúp màng linh động hơn và


tạo điều kiện giữ ẩm cho bề mặt da. Tất cả các loại thuốc trên đã được thử
nghiệm in vitro cho thẩm thấu qua da [17] và so sánh với cách thức thông
thường. Kết quả cho thấy ibuprofen là chất ưu mỡ thấm qua màng CVK cao
hơn gần ba lần những quan sát trong gel hoặc các giải pháp PEG400;
lidocaine hydrochloride thẩm thấu qua màng chậm hơn ibuprofen, do màng
CVK có cấu trúc mạng không gian ba chiều phức tạp đã làm cho sự khuếch
tán của thuốc được kéo dài và làm giảm tỷ lệ giải phóng thuốc khi so sánh với
các cách thức thông thường, đây là một lợi thế cho việc điều trị dài hạn của
thuốc mà không gây tình trạng quá mẫn [33]. Luan J. et al. (2012) [16], đã
nghiên cứu màng CVK cho băng vết thương nạp sulfadiazine bạc, một loại
thuốc phổ biến được sử dụng trong điều trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng.
Nó đã được chứng minh rằng sau khi sử dụng màng CVK ngâm tẩm bạc
sulfadiazine, hoạt động kháng khuẩn đối với P. aeruginosa, E. coli và S.
aureus đạt hiệu quả tốt hơn dạng kem bôi thông thường.

1.1.8.2. Tại Việt Nam
Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [5] đã tiến hành nuôi cấy, tinh
chế và thu màng CVK từ A. xylium đạt hiệu cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu
trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng màng CVK điều trị
bỏng với 2 loại màng CVK gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất
kháng khuẩn. Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh
mô tốt hơn hẳn.
1.2. Tổng quan về tính chất CUR
1.2.1. Sơ lược về thuốc CUR
1.2.1.1. Công thức
+ Tên IUPAC: (1E, 6E) - 1,7 - bis (4 - hydroxy - 3 - metoxyphenyl) - 1,6
- heptadien - 3,5 - dione (Anand et al 2007) [2].
Cấu trúc CUR được trình bày trong hình 1.1.


Công thức phân tử: C21H20O6 (CUR I).
+ Phân tử khối: 368,38g/mol.

Hình 1.1. Cấu trúc CUR 1,7 - bis (4 - hydroxy - 3 - metoxyphenyl) - 1,6 heptadien - 3,5 - dione
+ Hiện tại người ta tìm thấy CUR tồn tại ở 4 dạng hợp chất:
- CUR chính thức (còn gọi là CUR I) chiếm 60% tổng lượng CUR.
- Demethoxycurcumin (CUR II) chiếm 24% tổng lượng CUR.
- Bis - demethoxycurcumin (CUR III) chiếm 14% tổng lượng CUR.
- Và một hợp chất mới xuất hiện là cyclocurcumin chiếm khoảng 1%
[1, 2, 3, 8].
1.2.1.2. Nguồn gốc và tính chất
* Nguồn gốc:
CUR là hoạt chất được chiết xuất từ cây Nghệ vàng Curcuma longa L., họ
gừng Zingiberaceae, chiếm 0.3% khối lượng khô của cây Nghệ vàng [3, 7,
18].

Thành phần hóa học của nghệ gồm: nhóm chất màu curcuminoid, tinh
dầu và các hợp chất khác [3].
* Tính chất:
+ Tinh thể nâu đỏ, ánh tím [18].
+ Nhiệt độ nóng chảy: 183ᴼC [1, 2].
+ Độ tan: không tan trong nước, CUR tan trong ethanol [14].


+ Độ hấp thụ: 427nm [22].
+ CUR có thể tồn tại dưới các dạng đồng phân tương hỗ enol hoặc keto.
Đồng phân xeto tồn tại ở dạng rắn còn đồng phân enol tồn tại trong dung
dịch, dạng keto chiếm ưu thế trong các giải pháp có tính axit và trung tính và
dạng enol ổn định trong môi trường kiềm [14, 32].
1.2.1.3. Dược động học và tác dụng
 Dược động học
Sự hấp thu, sinh khả dụng, nghiên cứu sự trao đổi chất, và loại bỏ các
chất CUR có, không may, chỉ hiển thị kém hấp thu, chuyển hóa nhanh chóng,
và loại bỏ CUR là lý do chính cho khả dụng sinh học kém của hợp chất
polyphenolic thú vị này. Những lý do để giảm sinh khả dụng của thuốc trong
cơ thể là do hấp thu kém, tỉ lệ trao đổi chất cao, các sản phẩm trao đổi chất
không hoạt động hoặc giải phóng nhanh chóng ra khỏi cơ thể. Các nghiên cứu
cho đến nay đã gợi ý một hoạt động nội tại mạnh mẽ và, do đó, hiệu quả của
chất CUR như một đại lý trị liệu cho các bệnh khác nhau [22].
Các nghiên cứu trong ba thập kỷ qua liên quan đến sự hấp thu, phân bố,
chuyển hóa và bài tiết chất CUR đã tiết lộ khả năng hấp thu kém và chuyển
hóa nhanh chóng của chất CUR mà giảm bớt nghiêm trọng sinh khả dụng của
nó. Trong phần này, các vấn đề khả dụng sinh học của CUR như độ thấp
trong huyết thanh, phân phối mô hạn chế, quá trình chuyển hóa nhanh chóng
rõ ràng và ngắn nửa cuộc sống được mô tả chi tiết [32].
Rào cản lớn khiến thuốc nghệ CUR chưa được ứng dụng rộng rãi là do

CUR không tan trong nước (độ tan 0.001%), sinh khả dụng thấp [23]. Vì vậy,
khi dùng theo đường uống, CUR hòa tan một phần rất nhỏ vào các dịch thể
của ống tiêu hóa, chỉ 7 - 10% CUR được hấp thụ vào máu, lại bị chuyển hóa
nhanh qua gan, làm cho sinh khả dụng thực tế của CUR chỉ đạt 2 - 3% [22].


Các nghiên cứu dược động học ở động vật đã chứng minh rằng 40 - 85
phần trăm của liều uống CUR đi qua đường tiêu hóa không thay đổi, với hầu
hết các phức flavonoid hấp thu chuyển hóa ở niêm mạc ruột và gan [23].
 Tác dụng
CUR có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, kháng virus và kháng
nấm. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất CUR là không độc hại đối với con
người. CUR gây sức hoạt động chống viêm bằng cách ức chế một số phân tử
khác nhau mà đóng một vai trò quan trọng trong viêm. Củ nghệ có hiệu quả
trong việc giảm viêm sau phẫu thuật. Củ nghệ giúp ngăn ngừa xơ vữa động
mạch bằng cách làm giảm sự hình thành của máu làm các khối [22].
CUR ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Helicobacter pylori gây viêm
loét dạ dày và đã được liên kết với ung thư dạ dày. CUR có thể gắn với các
kim loại nặng như cadmium và chì, do đó làm giảm độc tính của các kim loại
nặng. Thuộc tính này của CUR giải thích hành động bảo vệ của nó đến não.
CUR hoạt động như một chất ức chế cho cyclooxygenase, 5 - lipoxygenase và
glutathione S - transferase [14].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc CUR
1.2.2.1. Trên thế giới
Các tài liệu khoa học trong 20 năm qua trên curcumin cho thấy chất
curcumin có thể là một ứng cử viên mong muốn trong phòng ngừa và điều trị
bệnh ung thư. Số liệu hiện tại (theo cơ sở dữ liệu SciFinder, ngày 23 tháng 8
năm 2011) cho thấy tổng cộng có 12903 lượt truy cập vào "curcumin". Trong
số đó, 60 tài liệu tham khảo là các thử nghiệm lâm sàng, 1094 tài liệu tham
khảo trong một hình thức xem xét và tham khảo 1515 trên các ứng dụng bằng

sáng chế. Có tổng cộng 56 thử nghiệm lâm sàng (giai đoạn I và giai đoạn II)
trên CUR được liệt kê trên trang web của Viện y tế Quốc gia Hoa Kỳ. Trong số
đó, 16 thử nghiệm đã được hoàn thành, ba thử nghiệm đã được chấm dứt, một
người bị thu hồi và phần còn lại của các nghiên cứu đang được thực hiện [26].


Nghiên cứu năm 2011 của Bambang Kuswandi và các cộng sự [10] về
CUR /CV trong việc phát hiện sự hư hỏng của tôm. Công trình này sử dụng
thuốc nhuộm tự nhiên của chất CUR như chất cảm biến để phát hiện các biến
động vô cơ và hữu cơ được sản xuất trong quá trình tăng trưởng của vi khuẩn
trong mẫu tôm. CUR được sử dụng như là thuốc thử cảm biến tự nhiên, là cố
định trên CVK sử dụng hấp thụ như một phương pháp đơn giản cho phép
khối lượng sản xuất của bộ cảm biến chi phí thấp. Như vậy, tất cả các vật liệu
cảm biến có thể ăn được và phù hợp cho các ứng dụng thực phẩm. Các chất
CUR /CVK đã được sử dụng thành công như một cảm biến nhãn dán trên gói
cho một phát hiện hình ảnh của tôm hư hỏng [10].
Nghiên cứu năm 2012 của Min Sun, Xun Su, Buyun Ding, Xiuli He,
Xiuju Liu, Aihua Yu, Hongxiang Lou, Guangxi Zhai về những tiến bộ trong
hệ thống phân phối cho chất CUR dựa trên công nghệ nano [27]. Bài viết này
đánh giá các hệ thống phân phối thuốc mới tiềm năng cho CUR bao gồm các
liposome, hạt nano polyme, hạt nano lipid rắn, mixen, nanosuspensions, dạng
nhũ tương nano, cụm, trong đó cung cấp các kết quả đầy hứa hẹn cho CUR để
cải thiện hoạt động sinh học của nó. Tóm lại, hệ thống phân phối thuốc mới
làm sáng tỏ về sự phát triển của các công thức mới, trong khi đó, nghiên cứu
sâu rộng hơn nên được thực hiện trong tương lai để giải quyết các vấn đề
dược phẩm và ngộ độc [27].
1.2.2.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến CUR
nhưng chủ yếu là các công trình nghiên cứu liên quan đến tách chiết và chế
tạo vật liệu Nano CUR. Tại Hội thảo khoa học “Định hướng phát triển khoa

học và công nghệ vật liệu tiên tiến tại Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh”,
TS. Dương Minh Tâm cho biết Trung tâm Nghiên cứu triển khai Khu


Công nghệ cao TP.HCM đã chế tạo thành công vật liệu nano CUR ở dạng
hòa tan trong dung dịch nước (nồng độ 8% khối lượng) nhằm hướng tới ứng
dụng trong thực phẩm chức năng [4].
Tuy nhiên chưa có công trình nào nghiên cứu sử dụng màng CVK để vận
tải và phân phối thuốc CUR để làm tăng sinh khả dụng của thuốc.


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1.Vật liệu nghiên cứu
- Thuốc CUR (95%) có nguồn gốc từ Ấn Độ. - Etanol 96º có nguồn gốc
Việt Nam.
- Màng CV (99% hàm lượng nước) được sản xuất bằng cách sử dụng vi
khuẩn A. xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP Hà Nội 2) lên
men từ nước dừa già, nước vo gạo, cao nấm men.
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản); Cân phân tích
(Sartorius - Thụy Sỹ); Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA; Buồng cấy
vô trùng (Haraeus); Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức); Khuấy từ gia nhiệt (IKA Đức); Máy rung siêu âm TCP 280; Tủ lạnh Daewoo, Tủ lạnh sâu và nhiều
dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng CVK: Glucose,
Pepton, KH2PO4, (NH4)2SO4, nước dừa, nước vo gạo, cao nấm men, axit
acetic, HCl, NaOH,..đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
+ Nghiên cứu quy trình nuôi cấy A. xylinum với các nguyên liệu có sẵn.
+ Thu sản phẩm CVK từ dịch nuôi cấy và quá trình xử lý.
+ Chế tạo màng sinh học nạp thuốc CUR.

+ Khảo sát và so sánh khả năng giải phóng thuốc từ các màng CVK CUR in vitro ở các môi trường pH khác nhau.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị màng CVK
- A. xylinum được nuôi cấy để tạo màng CVK trong môi trường cải biên
từ môi trường chuẩn Hestrin - Schramm [19] được trình bày trong bảng 2.1.


Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy A. xylinum tạo màng CVK
Môi trường Thành phần

MT1

MT2

MT3

Glucose

20g

30g

30g

Pepton

5g

10g

10g

Diamoni photphat

2.7g

0.3g

0.3g

0.5g

0.5g

Amoni sulfat
Cao nấm men

5g

Acid citric

1.5g

Nước cất 2 lần

1000ml

Nước dừa già

1000ml

Nước vo gạo

1000ml

- Dùng máy khuấy từ để khuấy đều môi trường nuôi cấy (môi trường
chưa có acid acetic và dịch giống) cho đến khi bão hòa.
- Cho dung dịch vào nồi hấp thanh trùng ở 113ᴼC trong 15 phút để diệt
khuẩn và nấm mốc.
- Đặt môi trường tạo màng trong buồng cấy vô trùng, để dưới đèn tím 30
phút. Khi môi trường đã nguội hoặc ở nhiệt độ khoảng 30 - 35ᴼC.
- Sau đó cho dịch giống vào môi trường (10% thể tích của môi trường);
thêm vào môi trường 2% acid axetic để hạn chế nấm.
- Cho dung dịch vào hộp đựng có nắp đậy và đậy kín lại hoặc sử dụng
vải xô để đậy nắp hộp.
* Thực hiện quá trình nuối cấy tĩnh
- Để khay đựng môi trường tạo màng vào nơi thoáng khí, có nhiệt độ ổn
định và không di chuyển dung dịch trong khay từ 6 - 14 ngày để dung dịch
lên màng.