Tăng hệ số nhân nhanh chồi cây hoa Salem tím (Limonium sinuatum L. Mill) bằng cách sử dụng kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và Adenine trong nuôi cấy in vitro

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226

TĂNG HỆ SỐ NHÂN NHANH CHỒI CÂY HOA SALEM TÍM
(Limonium sinuatum L. Mill) BẰNG CÁCH SỬ DỤNG KẾT HỢP CÁC CHẤT ĐIỀU
HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ADENINE TRONG NUÔI CẤY IN VITRO
Nguyễn Thị Huyền Trang*, Lê Thị Thủy Tiên
Trường Đại học bách khoa, ĐHQG tp Hồ Chí Minh,
TÓM TẮT: Để góp phần tìm ra môi trường tối ưu cho mục đích nhân giống cây hoa salem tím
(Limonium sinuatum L. Mill) in vitro, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát độ tuổi sinh lý thích
hợp của mẫu cấy, ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật, GA3 và adenine lên giai đoạn nhân
chồi. Môi trường được sử dụng là môi trường MS cơ bản, có bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l
sucrose và 6 g/l agar. Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày, cường độ chiếu sáng
2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC. Nguyên liệu thích hợp nhất được lựa chọn là chồi của cây con in vitro 6
tuần tuổi. Qua khảo sát về vai trò của cytokinin lên sự tạo chồi, chúng tôi nhận thấy kinetin nồng độ 4
mg/l có tác động kích thích tạo chồi cao nhất (5,6 chồi/mẫu cấy) sau 8 tuần nuôi cấy. Sự kết hợp giữa
kinetin nồng độ 4 mg/l với các loại auxin khác nhau (IBA, NAA và 2,4-D) không làm tăng hiệu quả tạo
chồi so với kinetin riêng lẻ nhưng chồi mới hình thành có kích thước lớn. Sự hiện diện của GA3/adenine
giúp tăng hiệu quả tạo chồi. Kết quả khảo sát cho thấy 4 mg/l kinetin kết hợp với 10 mg/l GA3 hoặc 10
mg/l adenine có hiệu quả tạo chồi cao với số lượng chồi trung bình hình thành trên một mẫu cấy lần lượt
là 7,8 và 9,73 chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
Từ khóa: Limonium sinuatum, 2,4-D, adenine, BA, GA3, IBA, kinetin, NAA
MỞ ĐẦU

Salem có tên khoa học là Limonium
sinuatum L. Mill, thuộc họ Bạch hoa đan
(Plumbaginaceae). Chi Limonium có khoảng
150 loài hoang dã [3]. Salem xuất xứ từ Địa
Trung Hải và đã có mặt ở Đà Lạt từ trước năm
1975. Vùng trồng hoa salem phổ biến tại Đà Lạt
là Đa Thiện, Thái Phiên và nhiều nơi khác. Trên
thế giới, đã có nhiều tác giả tiến hành nghiên

cứu đối tượng này như nuôi cấy tế bào để khảo
sát khả năng tái sinh [3], loại bỏ vi khuẩn ký
sinh gây hoại tử ở lá trong vi nhân giống [9] hay
tạo cây lai giữa 2 loại Limonium perezii và
Limonium sinuatum [5]. Trong vài năm gần đây,
một bộ phận nông dân tại Đà Lạt sử dụng các
giống hoa đã bị thoái hóa, trong đó có salem,
dẫn đến sản lượng thấp, màu sắc và độ bền kém.
Bên cạnh đó, nguồn giống chưa được chủ động,
cho nên, khi thị trường cần số lượng lớn thì sản
xuất không đáp ứng được [8]. Phương pháp vi
nhân giống là phương pháp hiệu quả không
những tạo số lượng cây giống lớn, không những
ổn định về mặt di truyền, mà còn nâng cao chất
lượng cây giống. Xuất phát từ yêu cầu thực tế
nhằm sản xuất một lượng lớn cây giống salem
có chất lượng cao và ổn định, đề tài được thực
hiện với mục đích khảo sát ảnh hưởng của một

số yếu tố lên sự nhân chồi của cây salem in
vitro, là giai đoạn quan trọng trong công tác vi
nhân giống.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu
Chồi của cây con in vitro được sử dụng để
làm vật liệu thí nghiệm. Hạt giống tạo cây con
là hạt giống hoa salem thương mại được cung
cấp bởi công ty TNHH Hạt Giống Hoa Việt
Nam, mã số: FVN STA011 Golf Dark Blue,

Hoa Kỳ.
Phương pháp
Môi trường nhân chồi là môi trường
Murashige và Skoog (1962) (MS) [6] bổ sung
100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose, 6 g/l agar
và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác
nhau. Các môi trường này được chỉnh về pH 5,8
trước khi hấp tiệt trùng ở 121ºC, 1 atm trong
thời gian 15 phút.
Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện
chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng
2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC.
Khử trùng hạt
Hạt được khử trùng với dung dịch Javel
thương mại 50% trong thời gian 7 phút. Môi
219


Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien

trường gieo hạt là môi trường MS bổ sung 100
mg/l myo-inositol, 20 g/l sucrose và 6 g/l agar.

chất được khảo sát là: GA3 nồng độ 3; 5; 7 và 10
mg/l và Adenine nồng độ 5; 10; 15 và 20 mg/l.

Khảo sát tuổi sinh lý thích hợp của mẫu cấy
cho sự tạo chồi
Chồi của cây con 4; 6 và 8 tuần tuổi được
nuôi cấy trên môi trường nhân chồi là môi

trường MS bổ sung 4 mg/l kinetin, 100 mg/l
myo-inositol, 30 g/l sucrose và 6 g/l agar. Kết
quả về độ tuổi sinh lý thích hợp nhất cho sự tạo
chồi sẽ được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm
khảo sát nhân chồi trong báo cáo này.

Phân tích và xử lý số liệu
Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng mẫu tạo chồi, số
lượng chồi hình thành và hình thái chồi sau 4; 6
và 8 tuần nuôi cấy.

Ảnh hưởng của cytokinin lên sự tạo chồi
Mẫu cấy là chồi của cây con có tuổi sinh lý
thích hợp là kết quả ở thí nghiệm trước được
nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA (0; 0,2;
0,5; 1; 2; 3; 4 mg/l) hoặc kinetin (0,5; 1; 2; 3; 4;
5 mg/l) nhằm tìm ra loại và nồng độ cytokinin
thích hợp cho việc nhân chồi cây salem. Kết quả
cytokinin thích hợp cho sự cảm ứng tạo chồi
cây salem sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm
tiếp theo.
Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa cytokinin và
auxin lên sự tạo chồi
Các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực
vật được sử dụng trong thí nghiệm này là IBA;
2,4-D và NAA ở các nồng độ 0,05; 0,1 và 0,2
mg/l kết hợp với loại cytokinin có nồng độ cảm
ứng tạo chồi hiệu quả nhất thu được từ thí
nghiệm khảo sát ảnh hưởng của cytokinin. So
sánh hiệu quả tạo chồi trên các môi trường khảo

sát với môi trường chỉ bổ sung cytokinin riêng
lẻ. Môi trường có kết quả tạo chồi cao nhất sẽ
được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Ảnh hưởng của GA3, adenine lên sự tạo chồi
GA3 và adenine được bổ sung riêng lẻ vào
môi trường MS có sự hiện diện của chất điều hòa
sinh trưởng thực vật cảm ứng tạo chồi hiệu quả
nhất từ các thí nghiệm trước. Nồng độ của các

Mỗi thí nghiệm được thực hiện với 5 bình,
mỗi bình chứa 3 mẫu cấy.
Số liệu được ghi nhận và xử lý bằng phần
mềm SPSS theo phương pháp Duncan ở mức ý
nghĩa 0,05.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khảo sát độ tuổi sinh lý thích hợp của mẫu
cấy cho sự tạo chồi
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nhân
giống in vitro thường được nhắc đến như thành
phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, mẫu cấy.
Trong đó, yếu tố mẫu cấy có thể chia làm hai
nhóm: lựa chọn mẫu cấy và xử lý mẫu cấy. Các
nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ
quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn
sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu.
Trong báo cáo này, chúng tôi tiến hành khảo sát
trên nguồn mẫu là hạt, do đó độ tuổi sinh lý của
mẫu cấy có thể sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả nhân
chồi khi nuôi cấy.

Ba độ tuổi sinh lý khác nhau được khảo sát
và ghi nhận kết quả sau 4; 6 và 8 tuần nuôi cấy
trên môi trường có bổ sung 4 mg/l kinetin được
trình bày trong bảng 1. Kết quả cho thấy, có sự
khác biệt rõ rệt về khả năng tạo chồi giữa những
mẫu cấy có độ tuổi khác nhau. Mẫu cấy 6 tuần
tuổi có khả năng tạo chồi cao nhất với số lượng
chồi trên một mẫu cấy ban đầu là 5,87 chồi sau
8 tuần nuôi cấy (hình 1b). Tỷ lệ tạo chồi của
mẫu cấy 6 tuần tuổi cũng cao hơn so với mẫu
cấy 4 và 8 tuần tuổi.

Bảng 1. Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu cấy đến hiệu quả nhân chồi
Sau 4 tuần
Sau 6 tuần
Tuổi của
mẫu cấy
Tỉ lệ tạo
Số lượng
Tỉ lệ tạo
Số lượng
(tuần)
chồi (%)
chồi/mẫu
chồi (%)
chồi/mẫu
4 tuần
13,33a*
1,13a
66,67a

2,53a
6 tuần
80,00b
2,67b
93,33b
4,20b
8 tuần
6,67a
1,07a
13,33c
1,33c

Sau 8 tuần
Tỉ lệ tạo
Số lượng
chồi (%)
chồi/mẫu
80,00a
5,27a
100,00b
5,87a
40,00c
2,13b

Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan.

220


TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226

Quan sát hình thái mẫu cấy sau 4 tuần nuôi
cấy trên môi trường có bổ sung 4 mg/l kinetin,
chúng tôi nhận thấy mẫu cấy ban đầu không có
sự gia tăng kích thước, các lá mới hình thành có
kích thước đều nhau, chiều dài dưới 1 cm. Chồi
mới xuất hiện ở nách lá và gốc của chồi ban đầu
(hình 1a). Điều này chứng minh sự hiện diện
của kinetin trong môi trường nuôi cấy có tác
động ức chế hiện tượng ưu tính ngọn để kích
thích sự hình thành và tăng trưởng của các chồi
mới, tạo cụm chồi.
Ở các mẫu cấy 8 tuần tuổi sau 8 tuần nuôi
cấy, chồi ban đầu tiếp tục gia tăng chiều cao và
tạo lá mới (hình 1c). Như vậy, ở nhóm mẫu cấy

này hiện tượng ưu tính ngọn của chồi ban đầu
không bị ức chế hoàn toàn, chồi mới hình thành
chủ yếu ở nách lá. Đây có lẽ là nguyên nhân
làm cho số lượng chồi mới hình thành thấp hơn
so với mẫu cấy 4 và 6 tuần tuổi.
Như vậy, mẫu cấy chồi từ cây con 6 tuần
tuổi có tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi cao, số lượng chồi
mới hình thành cũng cao hơn mẫu cấy 4 tuần và
8 tuần tuổi (hình 1a, b, c) nên được lựa chọn để
tiến hành các thí nghiệm tiếp theo nhằm tìm ra
môi trường hiệu quả cho việc nhân giống cây
hoa salem.
Ảnh hưởng của cytokinin lên sự tạo chồi

Bảng 2. Ảnh hưởng của kinetin đến sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi từ cây con 6 tuần tuổi
Cytokinin
Sau 4 tuần
Sau 6 tuần
Sau 8 tuần
BA
Kinetin Tỉ lệ tạo
Số lượng
Tỉ lệ tạo
Số lượng
Tỉ lệ tạo
Số lượng
(mg/l) (mg/l)
chồi (%)
chồi/mẫu
chồi (%)
chồi/mẫu
chồi (%)
chồi/mẫu
0,00a*
1,00a
0,00a
1,00a
0,00a
1,00a
0,2
20,00b
1,20a
20,00b
1,27a

20,00c
1,27a
0,5
6,67a
1,07a
20,00b
1,20a
20,00c
1,20a
1
0,00a
1,00a
6,67a
1,07a
6,67ab
1,07a
2
0,00a
1,00a
0,00a
1,00a
0,00a
1,00a
3
6,67a
1,07a
6,67a
1,07a
6,67ab
1,07a

4
0,00a
1,00a
0,00a
1,00a
0,00a
1,00a
0,2
0,00a
1,00a
0,00a
1,00a
0,00a
1,00a
0,5
0,00a
1,00a
0,00a
1,00a
0,00a
1,00a
1
0,00a
1,00a
0,00a
1,00a
13,33bc
1,13a
2
46,67de

2,13b
66,67c
3,00b
93,33d
3,93b
3
53,33e
2,13b
73,33c
3,07b
93,33d
4,80bc
4
86,67f
2,27b
86,67d
3,73b
100,00d
5,60c
5
33,33c
2,07b
93,33d
3,60b
100,00d
5,73c
Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan.

Sau 8 tuần khảo sát trên môi trường bổ sung
chất điều hòa sinh trưởng thực vật là BA cảm

ứng tạo chồi không hiệu quả. Tỷ lệ mẫu cấy tạo
chồi và số lượng chồi trên một mẫu cấy cao
nhất ở các môi trường có bổ sung 0,2 mg/l BA
nhưng với tỷ lệ tạo chồi và số lượng chồi trung
bình đều thấp (20,00% và 1,27 chồi/mẫu cấy),
không có sự khác biệt về mặt thống kê so với
mẫu đối chứng (hình 1i).
Kết quả thể hiện ở bảng 2 cho thấy, kinetin
có hiệu quả cao trong sự tạo chồi cây hoa salem.
Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi và số lượng chồi tăng

dần khi nồng độ kinetin tăng, đặc biệt trong
khoảng nồng độ từ 2 đến 5 mg/l. Nghiệm thức bổ
sung 1 mg/l kinetin cho kết quả tạo chồi thấp và
tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi chỉ đạt 13,33%. Các nồng
độ còn lại có hiệu quả tạo chồi cao hơn đặc biệt
là kinetin nồng độ 5 mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) và
tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi 100% sau 8 tuần nuôi cấy.
Tuy nhiên nồng độ kinetin 5 mg/l là nồng độ cao,
có thể gây ra những biến dị không mong muốn,
khi quan sát mẫu cấy cũng phát hiện có những
biểu hiện bất thường về hình thái. Ở nghiệm thức
sử dụng 4 mg/l kinetin, số lượng chồi tạo thành
221


Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien

trên một mẫu cấy ban đầu là 5,60 chồi/mẫu cấy,
khác biệt không có ý nghĩa với kinetin nồng độ 5

mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) và tỉ lệ tạo chồi cũng
đạt 100%.
Trong nghiên cứu về nhân giống cây
Limonium cavanillesii Erben của Amo-Marco et
al. (1998) [1], kinetin là loại cytokinin có kết
quả nhân chồi tốt nhất với khoảng nồng độ từ 2
đến 5 mg/l. Trong báo cáo này, tác giả cũng
khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi
của mẫu cấy và cho kết quả cao nhất trong
khoảng nồng độ BA là 0,1 đến 0,5 mg/l nhưng
kết quả này thấp hơn trên môi trường bổ sung
kinetin nồng độ từ 2 đến 5 mg/l. Ở các nồng độ
BA cao hơn mà tác giả khảo sát (1; 2; 5 mg/l)
cho tỷ lệ tạo chồi và số chồi trung bình giảm.
Tomoko Igawa et al. (2002) [3] cũng sử dụng
BA trong nghiên cứu tái sinh cây từ nuôi cấy tế
bào cây Limonium sinuatum Mill ở nồng độ 0,1
và 1,0 mg/l nhưng chồi chỉ hình thành mới trên
môi trường bổ sung 0,1 mg/l BA với tỷ lệ tạo
chồi chỉ đạt 3,3% và số chồi mới hình thành
trung bình là 0,3 chồi. Trong kết quả của Jeong
et al. (2001) [4] khi khảo sát ảnh hưởng của một

số cytokinin riêng lẻ và kết hợp với auxin lên sự
tạo chồi của cây Limonium sinuatum cũng cho
thấy BA riêng lẻ cảm ứng tốt hơn ở nồng độ
thấp 1,11 µM (tương ứng 0,25 mg/l) và giảm
dần khi tăng nồng độ BA lên. Ở nồng độ 8,88
µM BA (tương ứng 2 mg/l) thì không có chồi
mới được hình thành. Báo cáo này cũng cho

thấy BA không hiệu quả trong cảm ứng sự nhân
chồi trên đối tượng này.
Như vậy các báo cáo trên đều cho thấy với
đối tượng là Limonium sinuatum thì BA riêng lẻ
chỉ có thể cảm ứng tạo chồi ở nồng độ thấp
nhưng không hiệu quả vì tỷ lệ tạo chồi và số
lượng chồi hình thành đều ít và thấp hơn các
chất cảm ứng khác cùng khảo sát. Điều này phù
hợp với số liệu mà chúng tôi đã thu nhận được
là BA không thích hợp để cảm ứng với đối
tượng này, kinetin cảm ứng tạo chồi hiệu quả ở
nồng độ 4 và 5 mg/l. Do đó chúng tôi chọn
kinetin nồng độ 4 mg/l để tiếp tục các thí
nghiệm tiếp theo.
Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa cytokinin và
auxin lên sự tạo chồi

Bảng 3. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa auxin và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là
chồi từ cây con 6 tuần tuổi
Auxin (mg/l)
Kinetin
(mg/l)

IBA

2,4-D

NAA

4

-

-

-

Sau 4 tuần
Số
Tỉ lệ tạo
lượng
chồi
chồi/
(%)
mẫu
86,67a* 2,27ab

Sau 6 tuần
Số
Tỉ lệ tạo
lượng
chồi (%)
chồi/
mẫu
86,67bc
3,73c

Sau 8 tuần
Số
Tỉ lệ tạo lượng

chồi (%)
chồi/
mẫu
100,00a
5,60d

4

0,05

-

-

66,67b

2,67a

100,00a

4,07c

100,00a

5,27d

4

0,1

-

-

66,67b

1,93ab

86,67bc

3,33c

100,00a

5,07d

4

0,2

-

-

60,00bc

2,20ab

86,67bc

3,73c

93,33ab

4,93d

4

-

0,05

-

53,33cd

1,80ab

80,00cd

3,47c

93,33ab

5,20d

4

-

0,1

-

40,00ef

1,53b

73,33d

2,80c

86,67b

4,67d

4

-

0,2

-

33,33f

1,47b

80,00cd

2,80c

86,67b

4,53d

4

-

-

0,05

46,67de

1,67b

86,67bc

3,87c

86,67b

4,20d

4

-

-

0,1

53,33cd

1,87ab

93,33ab

3,40c

100,00a

4,73d

4

-

-

0,2

60,00bc

2,20ab

80,00cd

3,40c

100,00a

4,47d

Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan.

222


TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226

Auxin khi kết hợp với cytokinin sẽ giúp sự
tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới
mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Gaspar et
al. (2003) [2] cho rằng các thí nghiệm tạo chồi
bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng
cytokinin nồng độ cao và auxin nồng độ từ thấp
đến trung bình. Do đó, các auxin trong thí
nghiệm này được sử dụng ở nồng độ thấp nhằm
khảo sát tác động của sự phối hợp giữa auxin và
kinetin trên sự tạo chồi cây hoa salem.
Sau 8 tuần khảo sát trên các môi trường bổ
sung auxin với loại và nồng độ khác nhau, hiệu
quả tạo chồi cao nhất lần lượt ở các nghiệm
thức có 0,05 mg/l IBA (5,27 chồi/mẫu cấy),
0,05 mg/l 2,4-D (5,20 chồi/mẫu cấy) và 0,1
mg/l NAA (4,73 chồi/mẫu cấy) (bảng 3). Tuy
nhiên, số lượng chồi tạo thành trung bình trên

một mẫu cấy ban đầu ở các môi trường này đều
thấp hơn môi trường chỉ bổ sung kinetin riêng lẻ
và các sự khác biệt này là không có ý nghĩa.
Như vậy, khi kết hợp với 4 mg/l kinetin thì sự
hiện diện của auxin không giúp nâng cao hiệu
quả tạo chồi của cây hoa salem.
IBA là loại auxin có độ bền không cao, sau
30 ngày ngoài sáng nồng độ IBA có thể giảm đi
60% [7]. Trong khi đó, khi quan sát nhận thấy
mẫu cấy chồi cây salem có biểu hiện đáp ứng
tạo chồi dưới tác động của chất điều hòa sinh
trưởng thực vật sau 3 tuần nuôi cấy. Như vậy,
mẫu cấy cần thời gian cảm ứng dài và trong

khoảng thời gian này IBA có thể đã bị giảm
hoạt tính nên tác động của IBA đến mẫu cấy
không rõ rệt.
Trên môi trường có sự hiện diện của 2,4-D,
có sự hình thành các mô sẹo nhỏ ở cuống lá, nơi
tiếp xúc với môi trường nuôi cấy (hình 1e). Mô
sẹo khi mới xuất hiện có màu trắng, sau đó bị
nâu hóa. 2,4-D là một loại auxin mạnh, có vai
trò quan trọng trong sự kích thích sự phân chia
của tế bào tạo mô sẹo. Tuy vậy, số lượng mô
sẹo hình thành trong thí nghiệm này ít do 2,4-D
chỉ được sử dụng với nồng độ thấp.
Về hình thái mẫu cấy, các chồi mới tạo thành
ở tất cả các môi trường bổ sung auxin đều có
kích thước lớn hơn các chồi được tạo thành trên
môi trường chỉ bổ sung 4 mg/l kinetin. Trong đó,

chiều cao của chồi mới hình thành trên môi
trường bổ sung NAA lớn hơn chồi trên môi
trường có bổ sung IBA hay 2,4-D (Hình 1d, e, f).
Ở nhiều loài thực vật, việc kết hợp auxin ở nồng
độ thấp với cytokinin giúp nâng cao hiệu quả tạo
chồi. Nhưng trong nghiên cứu này, với cả 3 loại
auxin đã được tiến hành khảo sát là 2,4-D, NAA
và IBA thì kết quả đều không có sự khác biệt
hoặc thấp hơn so với khi sử dụng kinetin riêng lẻ.
Tuy nhiên, việc sử dụng auxin kết hợp với
kinetin giúp các chồi mới hình thành có kích
thước lớn, dễ tách ra thành từng chồi riêng biệt
để chuyển sang môi trường tạo rễ.
Ảnh hưởng của GA3 lên sự tạo chồi

Bảng 4. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa GA3 và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi
từ cây con 6 tuần tuổi
Kinetin
(mg/l)

GA3
(mg/l)

4
4
4
4
4

3

5
7
10

Sau 4 tuần
Tỉ lệ tạo
Số lượng
chồi (%)
chồi/ mẫu
86,67a*
2,27a
26,67b
1,40b
33,33bc
1,53b
53,33d
1,73ab
40,00cd
1,60ab

Sau 6 tuần
Tỉ lệ tạo
Số lượng
chồi (%) chồi/ mẫu
86,67a
3,73c
100,00b
4,13c
100,00b
4,27c

93,33ab
4,00c
100,00b
4,73c

Sau 8 tuần
Tỉ lệ tạo
Số lượng
chồi (%)
chồi/ mẫu
100,00a
5,60d
100,00a
5,87d
100,00a
6,27de
100,00a
6,53de
100,00a
7,80e

Các chữ cái a,b,c… thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 05 theo phương pháp Duncan.

Có nhiều kết quả khác nhau về tác động của
GA3 trên các đối tượng mẫu cấy khác nhau.
Mẫu cấy thực vật nói chung tăng trưởng và phát
triển không cần đến sự hiện diện của gibberellin

trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, sự tăng
trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và chồi bên

cũng có thể gia tăng khi bổ sung thêm
gibberellin. Ở một số loài thực vật, acid
223


Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien

gibberellic riêng lẻ cũng có thể cảm ứng sự tạo
chồi bất định như ở mô sẹo Ranunculus
scleratus hay thay thế cho vai trò của auxin
trong quá trình cảm ứng tạo chồi [7]. Trong thí
nghiệm này, GA3 được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy cùng với 4 mg/l kinetin nhằm khảo sát
tác động hỗ trợ của gibberellin với kinetin trong
sự cảm ứng tạo chồi ở cây hoa salem.
Kết quả ghi nhận cho thấy môi trường cảm
ứng tạo chồi với sự hiện diện của 4 mg/l kinetin
và GA3 ở các nồng độ 3; 5; 7 và 10 mg/l đều
cho hiệu quả tạo chồi cao hơn trên môi trường
chỉ bổ sung kinetin riêng lẻ (Bảng 4). Kết quả
cao nhất trong thí nghiệm này là môi trường bổ
sung 10 mg/l GA3 (7,80 chồi/mẫu cấy). Các
chồi mới được tạo thành (Hình 1g) có kích
thước lớn hơn so với chồi trên môi trường chỉ
có kinetin (số liệu cụ thể không được đưa ra).

Từ những kết quả thu được trong nghiên
cứu này, chúng tôi nhận thấy sự kết hợp giữa 4
mg/l kinetin và GA3 giúp tăng hệ số nhân chồi
của cây hoa salem. Số lượng chồi mới hình

thành tăng theo sự gia tăng nồng độ của GA3.
Không chỉ thu được số lượng chồi lớn hơn trên
mỗi mẫu cấy mà kích thước chồi mới hình
thành cũng gia tăng, chồi khỏe, dễ tách thành
chồi đơn.
Ảnh hưởng của adenine lên sự tạo chồi
Trong một số trường hợp, người ta thường
phối hợp cytokinin với adenine để cảm ứng sự
tạo chồi. Trong các thí nghiệm nuôi cấy
Begonia, thuốc lá, cây du, Plumbago indica thì
chỉ cần một mình adenine cũng đủ cảm ứng tạo
chồi (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên,
2006) [7].

Bảng 5. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa adenine và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là
chồi từ cây con 6 tuần tuổi
Sau 4 tuần
Sau 6 tuần
Sau 8 tuần
Kinetin Adenine
Tỉ lệ
Tỉ lệ
Tỉ lệ
Số lượng
Số lượng
Số lượng
(mg/l)
(mg/l)
tạo chồi
tạo chồi

tạo chồi
chồi/ mẫu
chồi/ mẫu
chồi/ mẫu
(%)
(%)
(%)
4
86,67a*
2,27a
86,67a
3,73bc
100,00a
5,60d
4
5
20,00b
1,60a
100,00b
4,93bc
100,00a
7,73de
4
10
66,67d
2,20a
100,00b
5,20b
100,00a
9,73e

4
15
46,67e
1,93a
100,00b
4,67bc
100,00a
7,60de
4
20
33,33b
1,60a
100,00b
3,53c
100,00a
5,53d
Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan.

Kết quả thí nghiệm cho thấy sự kết hợp
giữa 4 mg/l kinetin với adenine giúp làm tăng
hiệu quả tạo chồi so với chỉ sử dụng kinetin
riêng lẻ (Bảng 5). Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi đạt
100% ở tuần nuôi cấy thứ 6 với tất cả các nồng
độ adenine khảo sát. Số lượng chồi được tạo
mới cao hơn so với đối chứng khi kết hợp 4
mg/l kinetin với adenine nồng độ 5; 10 và 15
mg/l. Trong đó, nồng độ adenine thích hợp nhất
là 10 mg/l với số lượng chồi trung bình hình
thành từ một mẫu cấy ban đầu là 9,73 chồi.
Nồng độ adenine cao hơn 10 mg/l làm giảm khả

năng tạo chồi của mẫu cấy. Chồi mới hình thành
có hình thái bình thường và kích thước lớn hơn
so với đối chứng ở tất cả các nồng độ (hình 1h).
Việc sử dụng kết hợp adenine với kinetin
224

cho kết quả tạo chồi tăng cao có thể được giải
thích qua vai trò là tiền chất trong con đường
sinh tổng hợp cytokinin của adenine. Như vậy,
việc bổ sung adenine vào môi trường kết hợp
với kinetin làm tăng hiệu quả tạo chồi.
KẾT LUẬN

Như vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi
đã xác định được mẫu cấy thích hợp cho mục
đích nhân chồi là chồi từ cây con in vitro 6 tuần
tuổi. Ở các nồng độ kinetin khảo sát, kinetin
nồng độ 4 mg/l thích hợp nhất cho sự tạo chồi.
Sự hiện diện của các loại auxin IBA, 2,4-D và
NAA ở các nồng độ 0,05; 0,1 và 0,2 mg/l đều
không làm tăng hiệu quả tạo chồi nhưng giúp
gia tăng kích thước chồi mới tạo thành so với


TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226

môi trường chỉ bổ sung 4 mg/l kinetin. Adenine
và gibberellin đều có tác động kích thích sự tạo
chồi khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
kết hợp với 4 mg/l kinetin. Không chỉ giúp nâng

cao số lượng chồi mới, cả 2 chất này đều thúc
đẩy sự tăng trưởng của chồi mới.

Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm
ơn Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Bộ môn
Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa và
Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công
nghệ Tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới
đã hỗ trợ trang thiết bị để hoàn thành đề tài này.

Hình 1. Sự tạo chồi từ mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy (thang đo 1cm)
a. Mẫu cấy 4 tuần tuổi trên môi trường MS + 4 mg/l kinetin; b. Mẫu cấy 6 tuần tuổi trên môi trường MS + 4
mg/l kinetin; c. Mẫu cấy 8 tuần tuổi trên môi trường MS + 4 mg/l kinetin; d. 4 mg/l kinetin + 0,05 mg/l IBA;
e. 4 mg/l kinetin + 0,05 mg/l 2,4-D; f. 4 mg/l kinetin + 0,1 mg/l NAA; g. 4 mg/l kinetin + 10 mg/l gibberellin;
h. 4 mg/l kinetin + 10 mg/l adenine; i. 0,2 mg/l BA.
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Amo-Marco J. B. and Ibanez M. R., 1998.
Micropropagation of Limonium cavanillesii
Erben,
a
threatened
statice,from
inflorescence stems. Plant Growth Regul.,
24: 49-54.
2. Gaspar T., Kevers C., Faivre-Rampant O.,
Crèvecoeur M., Penel C., Gerppin H. and
Dommes J., 2003. Changing concept in
plant hormone action. In Vitro Cell Dev. Pl.,
39(2):85-106.

3. Igawa T., Hoshina Y. and Mii M., 2002.
Effcient plant regeneration from cell

cultures of ornamental Statice, Limonium
sinuatum Mill. In Vitro Cell Dev. Pl., 38:
157-162.
4. Jeong J. H., Murthy H. N. and Paek K. Y.,
2001. High frequency adventitious shoot
induction and plant regeneration from
leaves of statice. Plant Cell Tiss Org., 65:
123-128.
5. Morgan E. R., Burge G. K., Seelye J. F.,
Hopping M. E. and Grant J. E., 1998.
Production of interspecific hybrids between
Limonium perezii (Stapf) Hubb. and
Limonium sinuatum (L.) Mill. Euphytica.,
102: 109-115.
225


Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien

6. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised
medium for rapid growth and Bio-assays
with tobacco tissue cultures. Phys Plant, 15:
473-497.
7. Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên,
2006. Công nghệ tế bào. Nxb. Đại học quốc
gia tp Hồ Chí Minh.
8. Phạm S., 2007. Những giải pháp mở rộng

thị trường tiêu thụ sản phẩm hoa cắt cành ở

Đà Lạt - Lâm Đồng: 333-339. Hội nghị
khoa học Công nghệ sinh học thực vật trong
công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa.
Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội.
9. Tsu-Hwie A. L., Nai-Wen H. and Rey-Yuh
W., 2005. Control of leaf-tip necrosis of
micropropagated ornamental Satice by
elimination of endophytic bacteria. In Vitro
Cell Dev. Pl., 41: 546-549.

HIGH FREQUENCY SHOOT REGENERATION OF DARK BLUE STATICE
(Limonium sinuatum L. Mill) BY COMBINING PHYTOHORMONES
WITH ADENINE IN IN VITRO CULTURE
Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien
Ho Chi Minh city University of Technology
SUMMARY
In the purpose of optimizing the micropropagation of dark blue Statice (Limonium sinuatum L. Mill), the
appropriate age of explants, the effects of phytohormones, GA3 and adenine on Statice shooting were studied.
MS medium (Murashige and Skoog, 1962) with 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l saccharose, 6 g/l agar was used
in all experiments. The cultures were in 16h photoperiod, light intensity of 2800 lux and at a temperature of
25 ± 2ºC. The best suitable explants were shoots from six-week seedlings in vitro. In the influence of
cytokinin, 4 mg/l kinetin was the best result for statice shooting (5.6 shoots per explant) after 8 weeks of
culture. The number of shoots per explant on MS medium supplemented with 4 mg/l kinetin and auxin (IBA,
NAA or 2,4-D) was lower than MS medium with 4 mg/l kinetin but the size of shoots was raised. The
presence of GA3/adenine increased shoot sprouting. The combination of 4 mg/l kinetin with 10 mg/l GA3 or
10 mg/l adenine raised the number of shoots per explant (7.8 and 9.73 shoots per explant, respectively) after 8
weeks of culture.
Keywords: Limonium sinuatum, 2,4-D, adenine, BA, GA3, IBA, kinetin, NAA

Ngày nhận bài: 21-6-2012

226