Xây dựng quy trình định lượng Geniposid trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GENIPOSID
TRONG CAO KHÔ DÀNH DÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
Trần Thanh Tâm*, Nguyễn Đức Hạnh**, Huỳnh Trần Quốc Dũng***, Nguyễn Đức Tuấn**

TÓMTẮT
Mở đầu – Mục tiêu: Quả Dành dành (Gardenia Fructus) với thành phần hóa học đặc trưng là các
iridoid glycosid (trong đó 2 hoạt chất có hàm lượng cao là geniposid và gardenosid) được sử dụng từ bao đời
nay với tác dụng điều trị tăng huyết áp. Dược điển Trung Quốc 2015 sử dụng geniposid là chất đánh dấu
để kiểm nghiệm dược liệu Dành dành. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố quy trình
định lượng geniposid trong cao khô Dành dành. Vì vậy, việc xây dựng quy trình định lượng geniposid
trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC là cần thiết, góp phần kiểm soát chất lượng nguyên liệu
cao khô Dành dành trước khi đưa vào sản xuất thành phẩm.
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Cao khô Dành dành do công ty cổ phần BV
Pharma cung cấp. Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện sắc ký như pha động, cột sắc ký để phân
tách geniposid trong cao khô Dành dành; Khảo sát một số điều kiện chiết gineposid trong cao khô Dành dành như
dung môi chiết, tỷ lệ cao và dung môi, thời gian chiết siêu âm; Thẩm định quy trình định lượng geniposid trong
cao khô dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD theo hướng dẫn của ICH bao gồm tính phù hợp hệ thống,
tính chọn lọc, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính xác, độ đúng và độ bền.
Kết quả: Đã xác định được được điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng geniposid trong cao khô
Dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD như sau: cột sắc ký Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm),
bước sóng phát hiện 240 nm, pha động acetonitril – nước (15:85), thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ dòng
1,0 ml/phút. Quy trình phân tích đã được thẩm định đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, tính
tuyến tính (ŷ = 0,4761x, R2 = 1,0000; 19,4 - 193,8 ppm) và miền giá trị (61 – 92 ppm), độ lặp lại (RSD
= 0,57%), độ chính xác trung gian (RSD = 0,49 %), độ đúng với tỷ lệ hồi phục trong khoảng 100,27 –
101,46% và độ bền với sự thay đổi cho phép thành phần acetonitril trong pha động là ± 4%.
Kết luận: Quy trình định lượng geniposid trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD
đã được xây dựng và thẩm định thành công. Quy trình này có thể được áp dụng để định lượng geniposid

trong cao khô Dành dành, góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng từ khâu nguyên liệu ban đầu.
Từ khóa: Gardenia Fructus, geniposid

ABSTRACT
DEVELOPMENT OF HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF GENIPOSIDE
IN GARDENIA FRUCTUS DRY EXTRACT
Tran Thanh Tam, Nguyen Duc Hanh, Huynh Tran Quoc Dung, Nguyen Duc Tuan
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 132 – 142
Background – Objectives: Gardenia Fructus has iridoid glycosides as the special chemical
components in which geniposide and gardenoside have high content. Gardenia Fructus have been used for
*

Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Đồng Tháp
Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
***Bệnh viện Y học cổ truyền TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
ĐT: 0913799068

**

132

Email:

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

treatment of hypertension for many years. In the Chinese Pharmacopoeia, the quality control index of
Gardenia jasminoides is the content of geniposide. So far, there has been no publication for quantitative
determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract. Therefore, this study was carried out with the
aim of HPLC method development for determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract that
contribute to quality control of the input herbal materials.
Method: The object of this study is Gardenia Fructus dry extract, which was supplied by BV Pharma
joint-stock company. Method: Several chromatographic conditions such as mobile phase and C18 column
with different suppliers for separation of geniposide in Gardenia Fructus dry extract, and several extraction
conditions such as solvent, ratio of solvent and dry extract, and extraction time by ultrasonic, were
investigated. Finally, the analytical procedure was validated according to ICH guidelines, including system
suitability, selectivity, linearity and range, precision, accuracy and ruggedness.
Results: The appropriate chromatographic conditions for quantification of geniposide in Gardenia
Fructus dry extract were obtained on Gemini-NX C18 column (250 x 4.6 mm; 5 µm), DAD detector with
detection wavelength at 240 nm, mixture of acetonitrile and water (15:85) as mobile phase, injection volume
of 20 µL, flow rate of 1.0 ml/min. Validation results showed that the method was suitable for the HPLC
system, selective, linear (ŷ = 0.4761x, R2 = 1.0000, 19.4 – 193.8 ppm) and range (61 – 92 ppm),
repeatability (RSD = 0.57%), intermediate precision (RSD = 0,49%), accurate with the recoveries in the
range of 100.27 – 101.46% of the expected values. The method was also ruggedness with the accepted
fluctuation of acetonitrile within  4% in mobile phase.
Conclusion: The RP-HPLC method for determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract
was successfully developed and validated. The method can be applied for quantification of geniposide in
Gardenia Fructus dry extracts that contribute to quality control of the input herbal materials.
Keywords: Gardenia Fructus, geniposide.

ĐẶTVẤNĐỀ
Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.,
Rubiaceae), một loài cây được trồng và phát
triển rất tốt ở các tỉnh miền Bắc nước ta, nổi
bật bởi màu lá xanh bóng và hoa thơm trắng

ngần. Đặc biệt, quả Dành dành với thành phần
hóa học đặc trưng là các iridoid glycosid
(trong đó 2 hoạt chất có hàm lượng cao là
geniposid và gardenosid) đã được sử dụng từ
lâu đời như một phương thuốc quý trong việc
điều trị các bệnh như viêm gan, hạ huyết áp,
đái tháo đường, lợi tiểu(4)…Dược điển Trung
Quốc 2015 sử dụng geniposid là chất đánh
dấu để kiểm nghiệm dược liệu Dành dành.
Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong
nước công bố quy trình định lượng geniposid
trong cao khô Dành dành. Vì vậy, việc xây
dựng quy trình định lượng geniposid trong
cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC

Chuyên Đề Dược

là cần thiết, góp phần kiểm soát chất lượng
nguyên liệu cao khô Dành dành trước khi đưa
vào sản xuất thành phẩm.

ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
Đối tượng nghiên cứu
Cao khô Dành dành do công ty cổ phần BV
Pharma cung cấp.
Nguyên vật liệu

Chất đối chiếu
Geniposid (GP), hàm lượng 99,26%, do
Ban Nghiên Cứu Khoa Học – Thư Viện, Đại

học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cung cấp.
Trang thiết bị
Hệ thống UHPLC Dionex Ultimate 3000,
detector DAD – 3000 RS, cột sắc ký Gemini NX
C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Gemini
NX C18 (4,0 x 3,0 mm; 5 µm), cột Zorbax XDB
C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Zorbax

133


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

XDB C18 (12,5 x 4,6 mm; 5 µm), cân phân tích
A&D GH-202, bể siêu âm S60H – Elma.

lệ và chiết bằng phương pháp siêu âm

Hóa chất và dung mô
Acetonitril và methanol đạt tiêu chuẩn
dùng trong sắc ký lỏng (Merck) và nước cất 2
lần đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng.

Chọn tỷ lệ cao và dung môi chiết theo tiêu chí

Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát điều kiện HPLC định lượng

geniposid trong cao khô Dành dành:
Dựa vào cấu trúc hóa học của GP và tham
khảo một số tài liệu(3,5), kỹ thuật sắc ký lỏng
hiệu năng cao pha đảo với đầu dò DAD đã
được lựa chọn với điều kiện sắc ký ban đầu
như sau: cột pha đảo C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)
và tiền cột tương ứng, thể tích tiêm 20 µl, bước
sóng phát hiện là bước sóng hấp thụ cực đại
của geniposid, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, pha
động: acetonitril – nước. Tiến hành khảo sát
pha động và cột sắc ký. Qua các khảo sát thực
nghiệm, chọn được điều kiện sắc ký thích hợp
sao cho pic geniposid đạt độ tinh khiết (theo
phổ UV-Vis), tách hoàn toàn khỏi các pic tạp
(nếu có) và có hệ số bất đối nằm trong khoảng
0,8 – 1,5.
Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Khảo sát dung môi chiết GP
Chiết cùng một lượng cao với các dung môi
khác nhau như methanol, methanol 70%, 50%,
30% (tỷ lệ cao và dung môi chiết cố định) bằng
siêu âm trong 10 phút, chuẩn bị 3 mẫu thử
riêng biệt cho từng dung môi. Tiến hành sắc ký
các dịch chiết. Chọn dung môi chiết GP theo các
tiêu chí sau: diện tích pic và chiều cao pic lớn
nhất, hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5;
độ phân giải lớn hơn 1,5; pic GP tinh khiết (theo
phổ UV-Vis) và nồng độ methanol cao.
Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP

trong 10 phút. Tiến hành sắc ký dịch chiết.
sau: hàm lượng GP chiết được cao nhất và
chiều cao pic GP trong khoảng 0,2 – 0,8 AU.
Khảo sát thời gian chiết
Từ tỷ lệ cao và dung môi chiết đã được
lựa chọn, tiến hành chiết siêu âm ở các thời
điểm 3, 5, và 10 phút. Chuẩn bị 3 mẫu thử
riêng biệt cho từng thời điểm. Tiến hành sắc
ký các dịch chiết. Chọn thời gian chiết cho
hàm lượng GP chiết được cao nhất.

Thẩm định quy trình định lượng GP trong
cao khô Dành dành
Quy trình định lượng geniposid trong cao
Dành dành được thẩm định theo hướng dẫn
của ICH(2) về tính phù hợp hệ thống, tính chọn
lọc, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính
xác, độ đúng và độ bền.
Chuẩn bị mẫu
Mẫu đối chiếu GP gốc: Hòa tan một lượng
chất đối chiếu GP trong methanol 50% để
được dung dịch có nồng độ khoảng 2600 ppm.
Mẫu đối chiếu GP: Pha loãng mẫu đối chiếu GP
gốc với methanol 50% để thu được mẫu đối
chiếu GP có nồng độ khoảng 77,5 ppm. Mẫu
thử: Được chuẩn bị dựa vào các điều kiện khảo
sát quy trình xử lý mẫu. Mẫu trắng: dung môi
chiết và pha động.

KẾTQUẢ

Khảo sát điều kiện HPLC định lượng
geniposid trong cao khô Dành dành
Tiến hành khảo sát pha động acetonitril và
nước với các tỷ lệ khác nhau. Hình 1 minh họa

Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết đã

sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử và phổ UV

được lựa chọn theo các tỷ lệ 1:1, 1:2 và 1:4.

tại thời gian lưu của GP với tỷ lệ pha động

Chuẩn bị 3 mẫu thử riêng biệt cho từng tỷ

acetonitril – nước (15:85).

134

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

Hình 1: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử và phổ UV tại thời gian lưu của GP.
các pic tạp khác. Như vậy, pha động ACN –
Nhận xét: Phổ UV tại thời gian lưu GP của
H2O (15:85) được lựa chọn.

mẫu đối chiếu có một cực đại hấp thụ tại 240
nm nên được lựa chọn để định lượng GP. Pic
GP đạt độ tinh khiết (peak purity match =
1000), có hệ số bất đối là 1,1 và tách hoàn toàn

Hình 2 và Bảng 1 minh họa kết quả khảo
sát cột sắc ký pha đảo C18 từ hai nguồn cung
cấp khác nhau.

Hình 2: Sắc ký đồ mẫu thử khảo sát cột sắc ký

Chuyên Đề Dược

135


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

Bảng 1: Thông số sắc ký của GP tương ứng với cột sắc ký khảo sát (n=3)
Cột
Zorbax XDB C18
Gemini NX C18

tR
(Phút)
7,047
7,389

S
(mAU*phút)
75,825
75,653

H
(mAU)
377,258
442,885

As

Rs1

Rs2

Nbk

Độ tinh
khiết

1,4
1,1

3,4
3,4

4,9
4,7

8765
12538

1000
1000

Rs1: độ phân giải giữa GP và pic liền trước. Rs2: độ phân giải giửa GP và pic liền sau.

Nhận xét: Pic GP đạt độ tinh khiết, có thời
gian lưu (tR), diện tích pic (S) và độ phân giải
không khác nhau nhiều giữa hai cột. Với cột
Gemini NX C18, hệ số bất đối (As) pic GP là
1,1; số đĩa lý thuyết biểu kiến (Nbk) lớn hơn,
chiều cao pic (H) GP gấp 1,2 lần so với cột
Zorbax XDB C18. Như vậy, cột Gemini NX
C18 được lựa chọn.

Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Khảo sát dung môi chiết GP
Hình 3 và Bảng 2 minh họa kết quả khảo
sát dung môi chiết GP.
Dung môi chiết
Methanol
Methanol 70%
Methanol 50%
Methanol 30%

Hàm lượng GP (mg/g)
116,84

128,56
142,24
142,19

Hình 3: Hàm lượng GP chiết được với các dung môi chiết khác nhau
Bảng 2: Thông số sắc ký của GP tương ứng với dung môi chiết khảo sát (n=3)
Dung môi
Methanol
Methanol 70%
Methanol 50%
Methanol 30%

tR
(phút)
7,328
7,343
7,354
7,355

S
(mAU*phút)
31,528
34,688
38,329
38,162

Nhận xét: Cả 4 dung môi methanol,
methanol 70%, 50%, 30% đều chiết được GP,
tuy nhiên diện tích và chiều cao pic GP chiết
được tăng dần theo thứ tự methanol <

methanol 70% < methanol 50 %  methanol
30%; Pic GP đều tinh khiết, đạt hệ số bất đối
và tách hoàn toàn các pic tạp. Như vậy,
methanol 50% được chọn làm dung môi chiết
GP trong cao Dành dành.

136

H
(mAU)
157,172
201,762
227,751
227,243

As

Rs1

Rs2

Nbk

Độ tinh khiết

0,94
1,05
1,06
1,07

4,0
4,5
4,4
4,4

3,5
4,6
4,8
4,8

8878
12194
12715
12808

1000
1000
1000
1000

Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP
Hình 4 và Bảng 3 minh họa kết quả khảo
sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP.
Tỷ lệ cao và dung môi
(mg/ml)
1:1
1:2
1:4

Hàm lượng GP

(mg/g)
142,27
142,24
142,36

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

Hình 4: Hàm lượng GP chiết được với tỷ lệ cao và dung môi chiết khác nhau
Bảng 3: Thông số sắc ký của GP tương ứng với tỷ lệ cao và dung môi chiết khác nhau (n=3)
Tỷ̉ ̣ lệ cao và dung môi
chiết (mg/ml)
1:1
1:2
1:4

tR
(Phút)
7,344
7,354
7,343

S
(mAU*phút)
76,931
38,329

19,129

H
(mAU)
448,304
227,751
114,887

Nhận xét: Các thông số sắc ký của GP đều
đạt và hàm lượng GP chiết được với các tỷ lệ
cao và dung môi chiết khảo sát đều tương
đương nhau, khi tiến hành sắc ký dịch chiết
lần 2 không phát hiện GP, chứng tỏ GP đã
được chiết kiệt từ cao khô Dành dành. Với tỷ
lệ cao và dung môi chiết 1:2, chiều cao pic GP
khoảng 227 mAU là cao nhất khi qui về tỷ lệ
cao và dung môi chiết 1:1. Ngoài ra, tín hiệu
chiều cao khoảng 0,23 AU cũng là tín hiệu
nằm trong khoảng tuyến tính theo định luật
Lambert-Beer khi sử dụng đầu dò DAD và

As

Rs1

Rs2

Nbk

Độ tinh khiết

1,06
1,06
1,06

4,6
4,4
4,6

4,7
4,8
5,2

12781
12715
12915

1000
1000
1000

thích hợp cho quá trình định lượng trên nền
cao dược liệu. Như vậy, tỷ lệ cao và dung môi
chiết 1:2 được lựa chọn.

Khảo sát thời gian chiết siêu âm
Hình 5 và Bảng 4 minh họa kết quả khảo
sát thời gian chiết GP trong cao Dành dành.
Thời gian chiết siêu âm
3 phút

5 phút
10 phút

Hàm lượng GP (mg/g)
142,24
142,15
142,24

Hình 5: Hàm lượng GP chiết được với thời gian chiết khác nhau

Chuyên Đề Dược

137


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

Bảng 4: Thông số sắc ký của GP tương ứng với thời gian chiết khác nhau (n=3)
Thời gian chiết
siêu âm
3 phút
5 phút
10 phút

tR
(Phút)
7,344
7,341

7,354

*

S
(mAU*phút)
38,330
38,407
38,329

H
(mAU)
228,556
228,172
227,751

As

Rs1

Rs2

Nbk

Độ tinh khiết

1,06
1,05
1,06

4,6
4,7
4,4

4,7
4,8
4,8

12781
12690
12715

1000
1000
1000

Nhận xét: Hàm lượng GP chiết được với

sắc ký Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm),

thời gian chiết khảo sát đều tương đương

đầu dò DAD với bước sóng phát hiện 240 nm,

nhau. Như vậy, thời gian chiết siêu âm 3 phút

thể tích tiêm 20 µl, pha động ACN – H2O

được lựa chọn.

(15:85, tt/tt), tốc độ dòng 1 ml/phút, thời gian

Tóm lại, geniposid trong cao khô Dành

sắc ký 11 phút.

dành được chiết với tỷ lệ cao và methanol 50%

Thẩm định quy trình

là 1:2, chiết 1 lần bằng phương pháp siêu âm

Tính phù hợp hệ thống
Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống
được trình bày trong Bảng 5.

trong 3 phút. Điều kiện sắc ký thích hợp để
định lượng GP trong cao khô Dành dành là cột

Bảng 5: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu đối chiếu GP và mẫu thử (n=6)
Mẫu
Đối chiếu
Thử

Giá trị thống
kê
TB
RSD
TB
RSD

tR
(Phút)
7,373
0,10%
7,373
0,13%

S
(mAU*phút)
37,028
0,14%
36,686
0,09%

H
(mAU)
218,613
0,30%
216,835
0,39%

As

Rs1

Rs2

1,1
1,1

0

Nbk
12791

4,5

7,2

12712

Nhận xét: RSD của thời gian lưu, diện

của pic GP trong mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ

tích và chiều cao pic GP của mẫu đối chiếu

mẫu thử xuất hiện pic có thời gian lưu

và mẫu thử đều nhỏ hơn 2,0%; Độ phân giải

tương đương với pic GP trong sắc ký đồ

pic GP trong mẫu thử lớn hơn 1,5 và hệ số bất

mẫu đối chiếu. Trên sắc ký đồ mẫu thử,

đối pic GP nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Như

pic GP tách hoàn toàn các pic tạp. Khi

vậy, quy trình định lượng GP trong cao khô

thêm chất đối chiếu GP vào mẫu thử thì

Dành dành đạt tính phù hợp hệ thống.

diện tích và chiều cao pic GP tăng. Phổ

Tính chọn lọc

UV tại thời gian lưu GP của mẫu thử và

Hình 6 minh họa kết quả khảo sát tính

mẫu đối chiếu giống nhau và có cùng cực

chọn lọc của quy trình định lượng GP

đại hấp thụ tại 240 nm. Pic GP trong sắc

trong cao khô Dành dành. Kết quả khảo

ký đồ mẫu đối chiếu và mẫu thử đều tinh

sát tính chọn lọc cho thấy sắc ký đồ mẫu

khiết (theo phổ UV). Như vậy, quy trình

trắng không xuất hiện pic trong khoảng

định lượng GP trong cao khô Dành dành

thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu

đạt tính chọn lọc.

138

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

Hình 6: Kết quả khảo sát tính chọn lọc của phương pháp định lượng GP. (a)mẫu trắng, (b) mẫu đối chiếu,
(c) mẫu thử, (d) mẫu thử thêm chất đối chiếu, (e) phổ UV tại thời gian lưu GP của mẫu đối chiếu, (f) phổ
UV tại thời gian lưu GP của mẫu thử, (g) sắc ký đồ 3 chiều mẫu đối chiếu, (h) sắc ký đồ 3 chiều mẫu thử

Chuyên Đề Dược

139


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Tính tuyến tính

Kết quả khảo sát mối tương quan giữa
diện tích pic và nồng độ GP được trình bày
trong Bảng 6.
Bảng 6: Kết quả khảo sát tính tuyến tính GP
Nồng độ GP
(ppm) - X
19,4
38,8
77,5
116,3
155,0
193,8

Diện tích pic
(mAU*phút) - Y
9,222
18,393
36,973
55,384
73,871
92,198

Nhận xét: Hệ số b = 0,0037 có p = 0,94 >
0,05 nên không có ý nghĩa. Hệ số tương
quan bình phương r2 = 1,0000  có sự tương
quan tuyến tính giữa nồng độ GP và diện
tích pic.
Vậy phương trình hồi quy xác định nồng

y = 0,4761x +

0,0037
2
R = 1,0000

độ GP theo diện tích pic là ŷ = 0,4761x.

Độ chính xác
Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ chính
xác trung gian của quy trình định lượng GP
trong cao Dành dành được trình bày trong
Bảng 7.

Bảng 7: Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ chính xác trung gian của quy trình định lượng GP trong cao
khô Dành dành (n=9)
Người phân tích 1
Người phân tích 2:
Ngày phân tích: 21/05/2018
Ngày phân tích: 22/05/2018
n
Hệ thống HPLC: Ultimate 3000
Hệ thống HPLC: Ultimate 3000
Khối lượng cao
Diện tích pic
Hàm lượng GP Khối lượng cao
Diện tích pic
Hàm lượng GP
(mg)
(mAU*phút)
(mg/g)
(mg)

(mAU*phút)
(mg/g)
1
19,8
28,386
150,0
20,3
28,748
151,3
2
19,9
28,353
149,1
20,4
28,828
151,0
3
19,7
28,294
150,3
20,3
28,821
151,7
4
24,6
35,278
150,1
25,4
35,867
150,9

5
24,6
35,248
150,0
25,5
35,908
150,5
6
24,5
35,261
150,6
25,2
35,741
151,6
7
29,9
43,253
151,4
31,2
43,802
150,0
8
29,9
43,249
151,4
31,5
44,567
151,2
9
29,8

43,214
151,8
31,2
44,141
151,2
Trung bình: 150,5 (mg/g)
Trung bình: 151,1 (mg/g)
RSD: 0,57%
RSD: 0,37%
Kết quả phân tích của 02 người phân tích
- Trung bình: 150,8 (mg/g)
- RSD: 0,49%
Độ sai khác kết quả định lượng trung bình
- Giữa hai người phân tích: 0,26%
- Giữa người phân tích với kết quả trung bình của cả hai người phân tích
+ Người phân tích 1: -0,18%
+ Người phân tích 2: +0,08%

Nhận xét: RSD của hàm lượng GP trong

Độ đúng

cao khô Dành dành của 9 mẫu thử của từng

Kết quả thẩm định độ đúng của quy

người phân tích đều nhỏ hơn 2,0%; Độ sai lệch

trình định lượng GP trong cao Dành dành

hàm lượng GP giữa 2 người phân tích đều nhỏ

được trình bày Bảng 8.

hơn 2,0%. Như vậy, quy trình định lượng GP
trong cao khô Dành dành đạt độ chính xác.

140

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

Bảng 8: Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình định lượng GP trong cao khô Dành dành (n=9)
Mẫu

n

80%

1
2
3

Khối lượng
cao (mg)
25,0

25,1
25,0

100%

1
2
3

25,1
25,0
25,3

120%

1
2
3

25,1
25,0
24,9

Lượng chất đối chiếu
thêm vào (mg)
3,10
3,10
3,10
TB
RSD

3,76
3,76
3,76
TB
RSD
4,52
4,52
4,52
TB
RSD

Nhận xét: Tại mỗi mức nồng độ, tỷ lệ thu
hồi đều nằm trong khoảng 98 – 102% và
RSD của GP tại mỗi mức nồng độ đều nhỏ
hơn 2,0%. Như vậy, quy trình định lượng
GP trong cao khô Dành dành đạt độ đúng.
Dựa theo kết quả thẩm định độ chính xác và

Diện tích pic
(mAU*phút)
65,486
65,422
65,506

Lượng chất đối chiếu
tìm lại (mg)

72,259
72,305
72,271

3,81
3,83
3,78

79,563
79,464
79,469

4,58
4,58
4,60

3,11
3,09
3,12

Tỷ lệ
thu hồi (%)
100,47
99,77
100,54
100,26
0,43%
101,35
101,88
100,58
101,27
0,64%
101,28

101,38
101,73
101,46
0,23%

độ đúng, miền giá trị của quy trình định
lượng từ 61 – 92 ppm.

Độ bền
Kết quả thẩm định độ bền được trình bày
trong Hình 7 và Bảng 9.

Hình 7: Sắc ký đồ mẫu thử cao Dành dành trong thẩm định độ bền
Bảng 9: Thông số sắc ký của GP trong thẩm định độ bền (n=3)
Pha động ACN – H2O Giá trị thống
(tt/tt)
kê
11:89
19:81

TB
RSD
TB
RSD

tR
(Phút)
14,496
0,11%
4,722

0,21%

S
(mAU*phút)
34,962
0,08%
35,462
0,12%

H
(mAU)
100,430
0,63%
350,982
0,47%

As

Rs1

Rs2

Nbk

1,1

5,3

5,5

11621

1,1

1,5

4,4

14345

Nhận xét: Khi thay đổi tỷ lệ ACN ± 4%
so với điều kiện pha động ban đầu thì các
thông số sắc ký vẫn đáp ứng yêu cầu về tính
phù hợp hệ thống.

đạt tính phù hợp hệ thống, có tính chọn lọc,
khoảng tuyến tính rộng, đạt độ chính xác và độ
đúng theo Hướng dẫn của ICH.

Như vậy, quy trình định lượng GP trong cao
khô Dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD

Phổ UV tại thời gian lưu của GP trong
khoảng bước sóng 200 – 400 nm có 1 cực đại

Chuyên Đề Dược

BÀNLUẬN

141

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

hấp thụ tại 240 nm, nên được chọn làm bước
sóng để định lượng GP, bước sóng này tương
tự với bước sóng được sử dụng để định lượng
GP trong dịch chiết quả Dành dành(1,3,5). Kết
quả khảo sát cột sắc ký cho thấy cột Gemini
NX C18 thích hợp hơn cho quá trình định
lượng GP trong cao khô Dành dành so với cột
Zorbax Eclipse XDB C18 (chỉ ổn định trong
khoảng pH 2 – 9). Điều này có thể được giải
thích là do cột Gemini được sản xuất theo
công nghệ TWIN - NX (Two-In-One): trong
giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất hạt
silica, một lớp silica hữu cơ đặc biệt được
thêm vào để tạo ra một loại hạt hoàn toàn mới
với cấu trúc silica bên trong không bị biến đổi
nên vẫn duy trì được độ bền cơ học để cho
hiệu năng tốt, trong khi lớp silica hữu cơ bên
ngoài sẽ bảo vệ các phân tử silica khỏi các tác
nhân hóa học. Những liên kết chéo silosan
được thay thế bằng liên kết với gốc ethylen
nên giúp hạt silica bền vững hơn trong môi
trường pH cao. Thêm vào đó, việc liên kết
giữa nhóm trimethylsilosan và nhóm silanol
tự do dẫn đến nhóm silanol không thể tương

tác với chất phân tích nên cải thiện tình trạng
pic bị kéo đuôi.
Cao khô Dành dành được chiết bằng dung
môi nước, nên dung môi methanol với các
nồng độ khác nhau (100%, 70%, 50%, 30%)
được sử dụng làm dung môi chiết xuất GP để
giảm tạp phân cực, nồng độ methanol càng
cao, tạp phân cực trong dịch chiết sẽ càng
giảm. Các kết quả khảo sát ban đầu trong việc
lựa chọn dung môi chiết bằng phương pháp
sắc ký lớp mỏng cho thấy các dịch chiết có
cường độ màu của vết GP, số lượng tạp và
cường độ màu của tạp không khác nhau. Tuy
nhiên, khi phân tích các dịch chiết bằng

142

phương pháp HPLC đã thấy sự khác biệt về
hàm lượng GP chiết được của các dung môi.

KẾTLUẬN
Quy trình định lượng geniposid trong cao
khô Dành dành bằng phương pháp HPLC với
đầu dò DAD đã được xây dựng và thẩm định,
sử dụng chương trình rửa giải đẳng dòng và
pha động đơn giản (acetonitril và nước).
Quy trình đã được chứng minh đạt tính
chọn lọc, tính phù hợp hệ thống, tính tuyến
tính (ŷ = 0,4761x, R2 = 1,0000; 19,4 – 193,8 ppm)
và miền giá trị (61 – 92 ppm), độ lặp lại

(RSD = 0,57%), độ chính xác trung gian
(RSD = 0,49 %), độ đúng với tỷ lệ hồi phục
trong khoảng 100,27 – 101,46% và độ bền với
sự thay đổi cho phép thành phần acetonitril
trong pha động là ± 4%. Quy trình này có thể
được áp dụng để định lượng geniposid
trong cao khô Dành dành, góp phần vào
công tác kiểm tra chất lượng từ khâu
nguyên liệu ban đầu.

TÀILIỆUTHAMKHẢO
1.
2.
3.
4.

5.

Bộ Y tế (2017). Dược điển Việt Nam V, tr. 1132-1133. Nhà
xuất bản Y học Hà Nội, Hà Nội.
ICH Harmonised tripartite guideline (2005). Validation of
analytical procedures: text and methodology, pp. 1 – 13.
Pharmacopedia of The people’s Republic of China (2015),
pp. 182-183, 207-208.
Viện Dược liệu (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở
Việt Nam, tập 1, tr. 596-600, 800-807. Nhà xuất bản Khoa
học và Kỹ thuật, Hà Nội.
Wang XS, Wu YF, Dai SL, Chen R, Shao Y (2012).
Ultrasound-assisted extraction of geniposide from Gardenia
jasminoides. Ultrasonics Sonochemistry, 19: pp. 1155–1159.

Ngày nhận bài báo:

18/10/2018

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

01/11/2018

Ngày bài báo được đăng:

15/03/2019

Chuyên Đề Dược