Xác định sự hiện diện DNA thai tự do trong máu mẹ bằng kỹ thuật MSP kết hợp tạo dòng giải trình tự

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ
BẰNG KỸ THUẬT MSP KẾT HỢP TẠO DÒNG GIẢI TRÌNH TỰ
Lương Bắc An*,***, Lê Thị Xuân Thảo*, Nguyễn Khắc Hân Hoan**, Lê Quang Thanh**,
Đỗ Thị Thanh Thủy*.

TÓM TẮT
Mở đầu: Phân tích DNA thai tự do (cffDNA) trong máu mẹ không chỉ hữu ích trong sàng lọc tiền sản
không xâm lấn (NIPS) một số bất thường lệch bộ nhiễm sắc thể như T21, T18, T13 mà còn hữu ích trong
tầm soát một số bất thường liên kết giới tính, nhóm máu rhesus D (RhD),  -thalassemia, tăng sản tuyến
thượng thận bẩm sinh, loạn dưỡng cơ.... Tất cả những xét nghiệm này đều tập trung vào phát hiện những
trình tự bất thường của thai nhi được di truyền từ bố mẹ. Thai nhi có thừa hưởng những trình tự bất
thường hay không được xác định bằng cách phân tích cffDNA trong huyết tương thai phụ. Tuy nhiên, kết
quả không phát hiện các trình tự bất thường có thể bị tác động bởi các yếu tố như hàm lượng cffDNA quá
thấp hoặc cffDNA bị thoái hoá và thất thoát trong quá trình xử lí mẫu. Chính vì vậy, cần có một dấu ấn xác
định sự hiện diện của cffDNA trong huyết tương thai phụ cho phép kiểm soát các trường hợp âm tính giả.
Mục tiêu: Xác định sự hiện diện của cffDNA thông qua sự khác biệt trạng thái methyl hoá vùng
promoter gen RASSF1A
Phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Tách chiết cfDNA (DNA tự do) từ mẫu huyết tương của
thai phụ. Mẫu cfDNA được xử lí bisulfite trước khi thực hiện phản ứng methylation specific PCR (MSP)
để phát hiện cffDNA trong máu mẹ. Tạo dòng trình tự DNA của thai và DNA của mẹ vào vector. Giải
trình tự xác định các vị trí C-methyl hoá trong DNA thai.
Kết quả: Phát hiện được sự hiện diện cffDNA trong máu mẹ thông qua sự methyl hoá promoter gen
RASSF1A. Tạo dòng thành công vector chứa trình tự DNA của thai và vector chứa trình tự DNA của mẹ.
Kết quả giải trình tự cho thấy toàn bộ 14 vị trí C-methyl hoá trên vùng trình tự DNA của thai đều ở trạng
thái methyl hoá.
Kết luận: Methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A được xem là một dấu ấn để phát hiện sự tồn tại
của cffDNA. Dấu ấn này cho phép phát hiện được những kết quả âm tính giả trong các sàng lọc không xâm

lấn sử dụng cffDNA để phân tích.

Từ khóa: Methylation, RASSF1A, methylation specific PCR (MSP), cfDNA, cffDNA.
ABTRACTS.
IDENTIFICATION THE CIRCULATING FREE FETUS DNA IN MATERNAL BLOOD BY USING
MSP COMBINES CLONING AND SEQUENCING TECHINIQUES.
Luong Bac An, Le Thi Xuan Thao, Nguyen Khac Han Hoan, Le Quang Thanh, Do Thi Thanh Thuy.
Ho Chi Minh City Journal of Medicine *Vol. 22 - No 4- 2018: 367 – 374.
Introduction: Circulating fetal DNA analysis in maternal plasma is useful in the non-invasive prenatal
screening (NIPS) not only the detection of aneuplodies but also identification of sex-linked disorders, fetal rhesus
D (RhD), B-thalassemia and aneuplodies. Many of these applications focus on the detection of paternally inherited
disease-causing sequences in maternal plasma. Whether the fetus has inherited such a sequence is inferred by the
* Đại học Y Dược TP. HCM, ** Bệnh viện Từ Dũ Tp. HCM, *** Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Tp.HCM.
Tác giả liên lạc: CN. Lương Bắc An
ĐT: 0933.908.241
Email:

368


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018

Nghiên cứu Y học

presence or absence of the target sequence in maternal plasma, but the absence of such a sequence in maternal
plasma could alternatively be a result of low cffDNA concentrations or cffDNA loss during samples processing.
Thus, the availability of a positive control confirming the presence of fetal DNA in the sample would be avoided
false-negative results.
Objectives: Identification of cffDNa in maternal blood through differently methylation status of RASSF1A
promoter.

Methods: A cross-sectional study. CfDNA were extracted, then were treated bisulfate. MSP was carried out
to detect cffDNA in maternal plasma. Cloning and sequencing the MSP products to identify the C-methylation
bases.
Results: we identified the presentation of fetal DNA in maternal blood through methylation of RASSF1A
promoter. We have successfully cloned the fetal DNA and maternal DNA into vector. All 14 CpG sites was
absolute methylation in fetal DNA sequence.
Conclusions: Hypermethylation RASSF1A is a universal marker for fetal DNA and is readily detectable in
maternal plasma. This marker allows the detection of false-negative results when applied to NIPS.
Key words: Methylation, RASSF1A, methylation specific PCR (MSP), cfDNA, NIPS.

ĐẶT VẤN ĐỀ.
Sự hiện diện của DNA thai tự do (cffDNA)
trong máu mẹ đã mở ra cuộc cách mạng trong
sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS). DNA tự
do (cfDNA) là những đoạn DNA nhỏ, tồn tại
trong máu của thai phụ. CfDNA có nguồn gốc từ
các tế bào chết, bị vỡ và giải phóng cfDNA vào
hệ tuần hoàn. Các cfDNA này bắt nguồn từ máu
thai phụ (tế bào mô mỡ hoặc tế bào máu) và từ
thai nhi (tế bào nhau thai). Năm 1997, Lo và cộng
sự đã chứng minh cffDNA tồn tại trong suốt thai
kỳ(5). Các nghiên cứu chỉ ra rằng cffDNA có thể
được tìm thấy vào tuần thứ 7 của thai kỳ và hàm
lượng cffDNA tăng dần theo sự phát triển của
thai, dao động từ 3-13% trong tổng số cfDNA
huyết tương thai phụ tùy theo tuổi thai(8).
CffDNA giảm nhanh chóng sau khi sinh và biến
mất hoàn toàn khoảng 2 giờ sau sinh(6). Đâặc tính
rất hữu ích trong chẩn đoán thai kỳ hiện tại vì
tránh được nhầm lẫn với các thai kỳ trước. Năm

1998, Lo và cộng sự công bố đã tách chiết được
lượng cffDNA khá cao trong máu thai phụ: 3,4
đến 6,2%, cao hơn khoảng 25 lần so với sử dụng
tế bào thai nhi nguyên vẹn trên cùng một lượng

huyết tương của mẹ(6).
Trong hơn một thập kỷ qua, tiềm năng ứng
dụng trong lâm sàng của cffDNA đã được thể
hiện trong các kỹ thuật sàng lọc tiền sản không
xâm lấn (NIPS) một số bất thường lệch bội
nhiễm sắc thể như T21, T18, T1, ngoài ra cffDNA
còn được sử dụng để xác định nhóm máu rhesus
D (RHD) của thai nhi, bệnh lí liên kết với giới
tính, - thalassemia, rối loạn dưỡng cơ, tăng sản
tuyến thượng thận bẩm sinh,…Ngoài ra, hàm
lượng cffDNA cũng có thể sử dụng xác định một
số bất thường tiền sản khác như tiền sản giật,
hay một số bất thường nhau thai(8).
Một thách thức lớn nhất khi phát triển các xét
nghiệm NIPS đó là hàm lượng cffDNA trong
máu mẹ chỉ dao động trong khoảng 3-13% tuỳ
thuộc vào tuổi thai(2). Để phân biệt được cffDNA
và cfDNA thai phụ, ngưới ta thường dựa trên
những đặc điểm di truyền học hoàn toàn khác
biệt giữa mẹ và thai, như sự hiện diện của các gen
trên nhiễm sắc thể (NST) Y hoặc các điểm đa
hình trên cffDNA được thừa hưởng từ người bố
có sự khác biệt so với bộ gen của người mẹ(4,9). Rất
nhiều phương pháp sàng lọc được phát triển từ
rất sớm dựa vào các đặc điểm này của cffDNA,

tuy nhiên kèm theo đó là những hạn chế nhất
định. Đầu tiên, các xét nghiệm sàng lọc phát triển

369


Nghiên cứu Y học
dựa trên sự hiện diện của NST Y chỉ có thể áp
dụng trong trường hợp thai nam. Ngoài ra, khi
kết quả âm tính cần được kiểm tra lại để loại trừ
các khả năng là do mang thai nữ hoặc hàm lượng
cffDNA quá thấp dưới ngưỡng phát hiện của thiết
bị, thậm chí do sự thất thoát cffDNA trong quá
trình thu nhận và xử lí. Thứ hai, phát hiện dựa
vào đặc điểm đa hình thừa hưởng từ bố yêu cầu
phải có thêm thông tin dữ liệu di truyền từ cha và
chỉ có thể áp dụng với số lượng nhỏ đối tượng đã
có các điểm đa hình đặc trưng.
Vì vậy, điều cần thiết cần phải nghiên cứu
những marker có thể phản ánh sự khác biệt giữa
DNA thai và DNA mẹ. Các marker này không
phụ thuộc vào giới tính thai nhi hay dữ liệu di
truyền từ bố. Trong đó, sự khác biệt ngoại di
truyền giữa DNA thai và DNA mẹ đang là lĩnh
vực thu hút được nhiều sự chú ý. Trong đó, một
số gen được methyl hoá hoàn toàn ở DNA mẹ
nhưng không methyl hoá ở tế bào nhau thai như
gen PDE9A, SERPINB5(7). Tuy nhiên, cũng có
những gen có trạng thái methyl hoá hoàn toàn
ngược lại. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử

dụng sự methyl hoá vùng promoter của gen
RASSF1A để chứng minh sự tồn tại của cffDNA
trong huyết tương thai phụ.

ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU.
Thiết kế nghiên cứu
Mô tả cắt ngang.
Phương pháp nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các thai phụ tại Bệnh
viện Từ Dũ trong thời gian từ tháng 10/2017 đến
Bảng 1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Tên primer
RASSF1A-qMF
RASSF1A-qMF
RASSF1A-qUF
RASSF1A-qUR
SP6
T7

370

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018
tháng 5/2018. Nghiên cứu của chúng tôi sẽ sử
dụng ống Streck BCT để thu nhận mẫu máu. Thai
phụ được lấy 10ml máu chứa trong ống Streck
BCT, lập tức đảo ống 180o khoảng 10 lần để máu
trộn đều với các chất bảo quản bên trong ống.
Nếu chưa xử lý kịp thời, có thể lưu mẫu ở nhiệt độ

phòng (18oC-25oC) trong vòng 14 ngày. Li tâm
ống máu với tốc độ 1.600 rpm trong 10 phút ở
nhiệt độ phòng. Sau đó nhẹ nhàng hút lớp huyết
tương phía trên, chú ý không chạm phần buffy
coat. Li tâm lần 2 huyết tương vừa thu được với
tốc độ 13.000 rpm trong 10 phút, ở 4oC, thu dịch
nổi. Mẫu huyết tương được trữ trong tủ -80oC.
Mẫu huyết tương sau đó được tách chiết bằng
bộ kít QIAamp Circulating Nucleic acid
(QIAgen). CfDNA thu được trữ -30oC sẵn sàng để
tiến hành các bước phân tích tiếp theo.
Nghiên cứu thực hiện tại Trung tâm Y Sinh
học Phân tử - Đại học Y Dược TP. HCM.

Kiểm tra mồi
Cặp mồi cho phản ứng MSP tham khảo theo
nghiên cứu của Dennis Lo và cộng sự(1). Mồi
RASSF1A-qMF/R có đầu 3’ được thiết kế bắt cặp
bổ sung đặc hiệu tại vị trí C-methyl hoá, giúp
khuếch đại chính xác những đoạn DNA bị
methyl hoá. Mồi RASSF1A-qUF/R có đầu 3’ được
thiết kế bắt cặp bổ sung đặc hiệu tại các vị trí Ckhông methyl hoá. Các cặp mồi được chúng tôi
kiểm tra về khả năng bắt cặp bằng phần mềm
CLC MainWorkbench (QIA). Nhiệt độ nóng chảy
(Tm) được kiểm tra bằng Tm Tool
( />
Trình tự (5’-3’)
CGTGTTAACGCGTTGCGTATC
TACGTAACAAACCCCACGAAGTAAAAACG
GGTTGGAGTGTGTTAATGTGTTGTGTATT

TACATAACAAACCCCACAAACTAAAAACA
TAAATCCACTGTGATATCTT
ATTATGCTGAGTGATATCCC

o

Tm ( C)
66,36
68,78
67,18
65,18
54,79
57,97

Kích thước PCR (bp)
104
112
Tuỳ thuộc đoạn chèn


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018
Biến đổi các gốc CpG của cfDNA
CfDNA được tiến hành xử lí với sodium
bisulfite để biến đổi toàn bộ các vị trí Cytosine
(C-) không methyl hoá. Dưới tác dụng của
sodium bisulfite tất cả các vị trí C- không methyl
hoá sẽ chuyển hoá thành uracil trong khi đó các
C-methyl hoá sẽ không bị biến đổi. Kết thúc qui
trình, trình tự DNA có sự thay đổi, điều này phụ
thuộc vào tình trạng methyl hoá tại các vị trí

cystosine. Chúng tôi tiến hành chuyển đổi trình
tự các cfDNA thu được bằng bộ kít EZ DNA
Methylation-Direct TM kit (Zymo Research). Bộ
kít EZ DNA Methylation-Direct TM có chứa
sodium bisulfite có tác dụng chuyển đổi gốc
cytosine chưa methyl hóa thành gốc uracil, còn
các gốc cytosine đã methyl hóa được giữ nguyên.
Vì vậy, có thể phân biệt được cffDNA trong
huyết tương mẹ. Quy trình tiến hành theo hướng
dẫn của nhà sản xuất.
Phản ứng MSP (Methylation Specific PCR)
Phản ứng MSP được thiết lập để khuếch đại
những đoạn DNA chứa các gốc CpG được methyl
hoá (DNA thai) bằng cặp mồi RASSF1A-qMF/R.
Tương tự, phản ứng MSP được thiết lập để
khuếch đại những đoạn DNA chứa các gốc CpG
không methyl hoá (DNA mẹ) bằng cặp mồi
RASSF1A-qUF/R. Ngoài ra, để chứng minh độ
đặc hiệu của cặp mồi RASSF1A-qMF/R, chúng tôi
thực hiện phản ứng MSP với mẫu DNA nam giới.
Thành phần của phản ứng MSP (bảng 2).
Bảng 2. Thành phần phản ứng MSP
Thành phần

Thể tích (µl)

Nồng độ phản ứng

10X Maxima Buffer

1,5

1X

dNTPs 250nm

1,2

20 nM

Primer F (10µM)

0,75

500 nM

Primer R (10µM)

0,75

500 nM

2+

Mg

1,5

Maxima Taq

0,12

DNA

4

10-30 ng

H2O

5,18

Vừa đủ 15 µl

Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực hiện
trên máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức).
Chu kì nhiệt: khởi đầu tại 95oC trong 4 phút; tiếp
theo với 45 chu kì lặp lại các bước 95oC trong 20

Nghiên cứu Y học
giây, 58 oC trong 20 giây, 72oC trong 20 giây; tiếp
theo với bước nhiệt 72oC trong 3 phút. Sản phẩm
được giữ ở 4oC sau khi chương trình PCR kết
thúc. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên
thạch agarose 2% có thuốc nhuộm GelRed và
quan sát với hệ thống chụp ảnh điện di GelDocItTM (UVP, Mỹ).
Tạo dòng sản phẩm PCR
Chúng tôi sử dụng hệ thống pGEM®T Easy
vector với quy trình theo hướng dẫn của nhà sản
xuất. Vector pGEM®T Easy có chứa vùng trình tự

promoter T7 và SP6 RNA polymerase ở hai bên
vùng gắn chèn DNA đích. Quy trình tóm tắt với
các bước:

Bước 1: Nối sản phẩm PCR với hệ thống vector
Phản ứng nối được thiết lập trong phản ứng
gồm: 5µl 2X Rapid ligation buffer; 1µl pGEM T
Vector (50ng); 1µl T4 DNA ligase (3 Weiss
units/µl) và 2 µl sản phẩm PCR. Phản ứng được
ủ 4oC qua đêm.
Bước 2: Biến nạp vector vào E. coli.
Rã đông tế bào JM109 High Efficiency
Competent trên đá trong 5 phút; trộn đều 2µl
sản phẩm vector đã được nối với 50 µl tế bào đã
rã đông; nhẹ nhàng trộn đều hỗn hợp và đặt trên
đá 20 phút; shock nhiệt tế bào trong 45-50 giây
tại chính xác 42oC, không lắc; ủ trên đá trong 2
phút; bổ sung 900µl môi trường LB đã chuẩn bị
sẵn ở nhiệt độ phòng; ủ tiếp trong 1,5 giờ tại
37oC có lắc nhẹ (~150rpm); hút 100µl dung dịch
được sử dụng trải lên bề mặt thạch LB chuẩn bị
sẵn có chứa ampicillin 100µg/ml, 0,5mM IPTG và
80µg/ml X-Gal; trải đều mặt đĩa và nuôi ủ 37oC
qua đêm.
Bước 3: Chọn lọc khuẩn lạc quan tâm
Đĩa cấy sau khi được ủ qua đêm sẽ hình
thành các khuẩn lạc có màu xanh và trắng. Sử
dụng que cấy cẩn thận thu những khuẩn lạc
trắng đơn lẻ cho vào 600µl môi trường LB có
chứa ampicillin 100µg/ml. Tiếp tục tăng sinh

trong 3 giờ tại 37oC. Ly tâm, thu sinh khối.

371


Nghiên cứu Y học
Bước 4: PCR kiểm tra vùng chứa đoạn chèn.
Sử dụng cặp mồi SP6 và T7 có trình tự nằm
trên vùng promotor RNA polymerase của vector.
Bảng 3: Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc
Thành phần

Thể tích
Nồng độ
(µl)
phản ứng
10X Maxima Buffer
1,5
1X
dNTPs 250nm
1,2
20 nM
Primer RASSF1A-Qmf (10µM)
0,75
500 nM
Primer RASSF1A-qMR (10µM)
0,75
500 nM
2+
Mg

1,5
Maxima Taq
0,12
DNA plasmid
1
50-100 ng
H2O
8,18
Vừa đủ 15 µl

Tiến hành phản ứng PCR bằng các cặp mồi
SP6/T7 (bảng 1). Chương trình PCR như sau: 1
chu kỳ 95oC trong 4 phút, 40 chu kỳ với mỗi chu
kỳ gồm 3 bước: 95oC/20 giây, 48oC/20 giây,
72oC/20 giây và 1 chu kỳ 72oC trong 2 phút. Sau
đó, điện di trên gel 2% tại 100V trong 30 phút để
kiểm tra sản phẩm khuếch đại.
Giải trình tự
Nếu kết quả điện di cho 1 vạch sáng rõ,
đúng kích thước thì sản phẩm PCR được tinh
sạch bằng bộ kít ExoSAP IT express PCR
product cleanup (AB, USA). Sản phẩm được
giải trình tự 2 chiều (xuôi và ngược) lần lượt với
mồi SP6 và T7. Sản phẩm giải trình tự được đọc
bằng hệ thống điện di mao quản ABI 3500 với
thuốc thử ABI PRISM Big Dye Terminator V3.1
Cycle Sequencing Ready reaction (AB, USA).
Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần
mềm CLC Main Workbench với trình tự tham
chiếu của gen RASSF1A tham khảo

(NM_007182.4). Xác định sự tồn tại của các
nucleotide C bị methyl hoá không thay đổi
trong quá trình chuyển đổi gốc CpG.

KẾT QUẢ
Đánh giá hiệu quả cặp mồi
Các cặp mồi tham khảo được kiểm tra bằng
phần mềm CLC MainWorkbench. Trình tự của
các cặp mồi được thay đổi nhằm bắt cặp bổ sung
được với trình tự DNA đã được xử lí bisulfite.
Trình tự mồi RASSF1A-qMF có chứa 5 vị trí CpG

372

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018
được methyl hoá, trong đó vị trí đầu 3’ có chứa 1
nucleotide C-methyl. Trình tự mồi RASF1A-qMR
có chứa 3 vị trí CpG-methyl hoá, trong đó vị trí
đầu 3’ có chứa 1 nucleotide C-methyl hoá, kích
thước sản phẩm khuếch đại 104bp. Các vị trí CpG
nằm phân bố đều trong trình tự mồi, giúp mồi bắt
đặc hiệu hơn (hình 3). Ngoài ra, trình tự mồi
RASSF1A-qUF/R không có chứa các vị trí CpG
methyl hoá được xem là chứng nội kiểm soát quá
trình xử lí bisulfite và đại diện cho sự hiện diện
của cfDNA mẹ với kích thước sản phẩm khuếch
đại 112bp. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) giữa mồi
xuôi và ngược tương đương nhau (bảng1).
Kết quả phản ứng MSP
Các phản ứng MSP được thiết lập với từng

cặp mồi chuyên biệt. Từ hình 1 cho thấy, các
giếng chứng âm (giếng 3 cho cặp mồi RASSF1AqUF/R và giếng 6 cho cặp mồi RASSF1A-qMF/R)
không xuất hiện vạch sản phẩm PCR, chứng tỏ
phản ứng PCR không xảy ra nhiễm. Giếng 4 xuất
hiện vạch chứa sản phẩm khuếch đại của cặp mồi
RASSF1A-qUF/R có kích thước 112bp, chứng
minh quá trình bisulfite xảy ra, ngoài ra đây là
cặp mồi làm chứng nội để kiểm soát phản ứng
MSP. Giếng 5 xuất hiện vạch chứa sản phẩm
khuếch đại của cặp mồi RASSF1A-qMF/R đúng
kích thước 104bp, chứng tỏ phản ứng MSP đã
khuếch đại thành công được các đoạn DNA có
chứa gốc C-methyl hoá. Bước đầu phát hiện được
sự hiện diện của DNA thai. Để khẳng định đây là
DNA thai, chúng tôi tiến hành bước tạo dòng và
giải trình tự sản phẩm PCR của giếng 5.
Để chứng minh sản phẩm ở giếng 5 xuất
phát từ DNA thai, không phải từ mẹ hay nói
cách khác là chứng minh tình trạng methyl hoá
vùng promoter gen RASSF1A chỉ xảy ra ở DNA
thai. Chúng tôi sẽ tiến hành thực hiện phản ứng
MSP trên mẫu DNA nam giới bình thường. Kết
quả cho thấy không xuất hiện vạch sản phẩm khi
khuếch đại bằng cặp mồi RASSF1A-qMF/R
(giếng 1), do đó không có sự methyl hoá xảy ra.
Chứng nội sử dụng cặp mồi RASSF1A-qUF/R
cho sản phẩm có kích thước mong muốn 112bp
(giếng 2).

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018
Kết quả tạo dòng sản phẩm MSP
Do kích thước sản phẩm PCR nhỏ (104bp và
112bp) nên chúng tôi chèn sản phẩm MSP vào
vector pGEM®T Easy, sử dụng cặp mồi có trình tự
trên vector để đọc được toàn bộ đoạn trình tự
được chèn quan tâm. Vector có chứa trình tự mã
hoá gen kháng kháng sinh ampicillin cùng trình
tự promoter T7 và SP6 RNA polymerase ở hai
bên vùng gắn chèn DNA đích, nơi có trình tự mã
hoá của chuỗi -peptide của enzyme galactosidase. Khuẩn E. coli được nuôi trong môi
trường chứa kháng sinh ampicillin, nếu vi khuẩn
có chứa vector biến nạp vào sẽ được chọn lọc lại.
Ngoài ra, quá trình chèn vào khiến bất hoạt sự
hình thành chuỗi -peptide, dẫn đến enzyme galactosidase không còn hoạt tính phân cắt X-Gal
(tạo màu xanh). Do đó, khuẩn lạc màu trắng (mũi
tên đỏ) đại diện cho nhóm có trình tự được gắn
chèn vào vector (hình 2). Khuẩn lạc trắng được sử
dụng trong phản ứng PCR khuẩn lạc. Kết quả
điện di sản phẩm gắn chèn DNA thai (giếng 7)
cho kích thước 281bp và sản phẩm gắn chèn
DNA mẹ (giếng 8) cho kích thước 289bp (hình 1).
Kết quả giải trình tự
Sản phẩm chèn vào vector được tiến hành
giải trình tự 2 chiều với mồi SP6 và T7 nằm trên
trình tự vector. Dựa vào sóng trình tự thu nhận
được, chân sóng không nhiễu, sóng chỉ chứa duy
nhất một đỉnh duy nhất, chứng tỏ chuyển đổi
bisulfite đạt hiệu suất cao. Dựa vào chuỗi trình tự
DNA thai (màu xanh) cho thấy tất cả vị trí Cmethyl hoá (14 vị trí) đều không bị biến đổi sau

quá trình bisulfite. Ngoài ra, tất cả vị trí C-methyl
hoá này đều không bị biến đổi, cho thấy có sự
methyl hoá hoàn toàn của vùng gen RASSF1A.
Tuy nhiên, kết quả giải trình tự mới đại diện cho
một vùng nhỏ (104bp) của promoter gen
RASSF1A nên chưa khẳng định được chỉ số
methyl hoá của vùng promoter gen RASSF1A.

Nghiên cứu Y học
Ngược lại, chuỗi trình tự DNA mẹ (màu đỏ) cho
thấy tất cả các vị trí này đều bị biến đổi hoàn
toàn. Từ đó, chúng tôi kết luận đã phát hiện được
thành công sự hiện diện của DNA thai tự do
trong máu mẹ (hình 3).

Hình 1: - Giếng 1: mồi RASSF1A-qMF/R + DNA
nam; - Giếng 2: mồi RASSF1A-qUF/R và DNA
nam; - Giếng 3 và 6: chứng âm của cặp mồi
RASSF1A-qUF/R và RASSF1A-qMF/R; - Giếng
4: mồi RASSF1A-qUF/R; - Giếng 5: mồi
RASSF1A-qMF/R, - Giếng 7 và 8 lần lượt là sản
phẩm tạo dòng của DNA thai và DNA mẹ.

Hình 2: Kết quả khuẩn lạc chứa vector được chèn

373


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018

Hình 3: Kết quả giải trình tự
nghiệm sàng lọc hay kiểm tra sự hiện diện và số
BÀN LUẬN
lượng cffDNA.
Sự hiện diện của DNA thai tự do trong huyết
Những hướng tiếp cận hiện nay tập trung vào
tương thai phụ đặc biệt hữu ích trong sàng lọc
các trình tự DNA tự do của thai mang đặc điểm
tiền sản như một số hội chứng di truyền liên quan
ngoại di truyền khác biệt so với DNA mẹ. Trong
tới NST giới tính, nhóm máu RhD và đó, sự methyl hoá các gốc CpG tại vùng
thalassemia. Hầu hết các ứng dụng này đều tập
promoter kiểm soát quá trình sự điều hoá biểu
trung vào phát hiện các trình tự gây bệnh di
hiện gen đặc biệt đuợc quan tâm. Một số vùng
truyền từ bố mẹ trong huyết tương thai phụ. Liệu
promoter của gen SERPINB5, PDE9A không
thai nhi có thừa hưởng những trình tự gây bệnh
được methyl hoá trong tế bào nhau thai nhưng lại
hay không sẽ được chứng minh rằng có sự tồn tại
methyl hoá nhiều trong các tế bào máu mẹ. Sự
của các trình tự bất thường trong huyết tương thai
khác biệt này được xem là đối tượng để xác định
phụ, nhưng sự vắng mặt của các trình tự này đôi
sự tồn tại cffDNA. Tuy nhiên, quá trình xử lí
lúc có thể bị thay đổi do hàm lượng cffDNA quá
bisulfite sẽ khiến cho các DNA không methyl
thấp hoặc cffDNA bị thất thoát trong quá trình xử

hoá sẽ bị thái hoá tới 96%(3), trong khi đó hàm
lí mẫu. Do vậy, cần phải có một bước xác định sự
lượng cffDNA thai trong huyết tương thai phụ
hiện diện của DNA tự do của thai trước khi trả kết
chỉ chiếm 8-20% tuỳ tuổi thai(8). Chính vì vậy, sử
quả cho bệnh nhân là âm tính với bệnh lý khảo
dụng các marker không methyl hóa của DNA
sát. Một số trình tự đặc trưng trên NST Y, như là
nhau thai trở thành vấn đề nan giải.
gen SRY hay DYS14, có thể được sử dụng để xác
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn
nhận sự hiện diện của cffDNA. Tuy nhiên, các
marker RASSF1A để phát hiện sự hiện diện
marker này chỉ áp dụng trong trường hợp thai
cffDNA. Marker RASSF1A này thể hiện sự
nam. Một số yếu tố khác có thể áp dụng như sử
methyl hoá hoàn toàn trong tế bào nhau thai, còn
dụng điểm đa hình được di truyền từ bố và mẹ,
trong tế bào máu mẹ thì kết quả nghiên cứu
nhưng các bất lợi có thế xảy ra như dữ liệu di
không thấy có sự methyl hoá (hình 3).
truyền từ người bố có thể không sẵn có; dữ liệu di
truyền của người mẹ cần phải thực hiện thêm
những xét nghiệm khác để có được. Những
marker DNA thai, với đặc trưng độc lập với giới
tính thai và không phụ thuộc vào các đa hình di
truyền từ bố mẹ, có thể được sử dụng trong xét

374

Sự methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A
được cho làm ức chế sự biểu hiện của gen này.
Đây là một gen ức chế khối u, trong nghiên cứu
ung thư, nhiều nghiên cứu đều cho thấy gen
RASSF1A bị methyl hoá, ngăn sự kiểm soát phát


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018

Nghiên cứu Y học

triển của khối u(1). Sự xâm lấn thành tử cung của
lớp nuôi phôi và lớp hợp bào có nhiều sự tương
quan với quá trình xâm lấn mạch và di căn trong
ung thư, quá trình chuyển dạng tế bào EMT
(epithelial mesenchymal transition).

2.

Nghiên cứu xác định được sự hiện diện của
DNA thai tự do trong huyết tương máu mẹ thông
quá sự methyl hoá của gen RASSF1A bằng
phương pháp MSP kết hợp tạo dòng và giải trình
tự. Ngoài ra, trong tương lai ứng dụng marker
RASSF1A trong sàng lọc nhóm máu RhD và các
bất thường di truyền cho phép phát hiện được các
kết quả âm tính giả gây ra bởi hàm lượng cffDNA
thấp hoặc thất thoát trong quá trình xử lí mẫu.

4.

KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã khuếch đại thành công
cffDNA trong máu mẹ, tạo dòng được đoạn
DNA thai và DNA mẹ vào trong vector và chứng
minh được sự hiện diện của cffDNA trong máu
mẹ bằng phương pháp giải trình tự Sanger.

TÀI LIỆU THAM KHẢO.
1.

3.

5.

6.
7.

8.

9.

Dar P, Curnow KJ., Gross SJ. et al. (2014). Clinical experience
and
follow-up
with
large
scale
single-nucleotide
polymorphismebased noninvasive prenatal aneuploidy testing.

Am J Obstet Gynecol, 211(5):527.e1-527.e17.
Grunau C., Clark SJ., and Rosenthal A. (2001). Bisulfite genomic
sequencing: systematic investigation of critical experimental
parameters. Nucleic Acids Res, 29(13), e65–e65.
Lo YD., Chan KA., Sun H. et al. (2010). Maternal plasma DNA
sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational
profile of the fetus. Sci Transl Med, 2(61), 61ra91–61ra91.
Lo YD., Corbetta N., Chamberlain PF et al. (1997). Presence of
fetal DNA in maternal plasma and serum. The lancet, 350(9076),
485–487.
Lo YD., Zhang J., Leung TN et al (1999). Rapid clearance of fetal
DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet, 64(1), 218–224.
Poon LL., Leung TN., Lau TK. et al (2002). Differential DNA
methylation between fetus and mother as a strategy for
detecting fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem, 48(1), 35–41.
Suzumori N, Ebara T, Yamada T et al (2016). Fetal cell-free DNA
fraction in maternal plasma is affected by fetal trisomy. J Hum
Genet, 61(7), 647.
Zimmermann B, El-Sheikhah A, Nicolaides K. et al. (2005).
Optimized real-time quantitative PCR measurement of male
fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem, 51(9), 1598–1604.

Ngày nhận bài báo:

21/06/2018

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

21/06/2018

Ngày bài báo được đăng:

30/06/2018

Chiu RW., Chim SS., Wong IH. et al. (2007). Hypermethylation
of RASSF1A in human and rhesus placentas. Am J Pathol, 170(3),
941–950.

375