Phát hiện đột biến p.R132H của gen IDH1 trong u thần kinh đệm bằng kỹ thuật ASO-PCR

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015

Nghiên cứu Y học

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN p.R132H CỦA GEN IDH1
TRONG U THẦN KINH ĐỆM BẰNG KỸ THUẬT ASO-PCR
Hoàng Anh Vũ*, Đỗ Phú Quang**, Trần Minh Thông***

TÓM TẮT
Mục tiêu: Đột biến các gen IDH là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng trong u thần kinh đệm
(UTKĐ). Đột biến p.R132H của gen IDH1 do thay đổi từ guanine thành adenine tại nucleotide 395 là thường
gặp nhất trong những đột biến này. Chúng tôi xây dựng quy trình kỹ thuật ASO-PCR để xác định được đột biến
này trên bệnh phẩm mô vùi nến của UTKĐ.
Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu được thực hiện trên 33 mẫu UTKĐ từ Bệnh Viện Chợ Rẫy. Mẫu
được tách chiết DNA bằng bộ kít ReliaprepTM FFPE gDNA Miniprep System (Promega, Mỹ). Kỹ thuật giải trình
tự DNA được thực hiện trên một số mẫu đầu tiên để chọn chứng dương có mang đột biến p.R132H. Mồi đặc
hiệu cho alen mang đột biến được thiết kế và tối ưu hóa điều kiện ASO-PCR trên chứng dương và ứng dụng vào
xác định đột biến cho những mẫu còn lại trong nghiên cứu.
Kết quả: ASO-PCR sử dụng 3 mồi trong cùng một phản ứng cho phép khuếch đại đặc hiệu những mẫu có
mang đột biến p.R132H, được kiểm chứng bằng giải trình tự DNA. Chúng tôi phát hiện 11 trường hợp đột biến
trong 28 mẫu UTKĐ độ II và III (39,3%), nhưng không có đột biến nào trong 5 trường hợp UTKĐ độ I hoặc IV.
Kết luận: ASO-PCR có thể được sử dụng trong bước sàng lọc đột biến p.R132H của gen IDH1 trong
UTKĐ.
Từ khóa: U thần kinh đệm, gen IDH1, đột biến, ASO-PCR.

ABSTRACT
DETECTION OF IDH1 GENE MUTATION (p.R132H) IN GLIOMAS BY ASO-PCR
Hoang Anh Vu, Do Phu Quang, Tran Minh Thong
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - No 5 - 2015: 281 - 285
Objectives: IDH gene mutational status is one of the important prognostic factors in gliomas. The p.R132H
mutation in IDH1 gene due to a substitution from guanine to adenine at nucleotide 395 is the most common of

these mutations. We establish an ASO-PCR procedure to identify this mutation from paraffin blocks of gliomas.
Materials and Methods: The study was performed with 33 glioma samples collected from Cho Ray
Hospital. Samples were DNA extracted using FFPE gDNA ReliaprepTM Miniprep System kit from Promega,
USA. Some first samples were investigated by DNA sequencing technique to select positive control carrying
p.R132H mutation. Specific primer for mutant allele was designed and ASO-PCR conditions with positive
control were optimized and applied to verify the mutation in the remaining samples.
Results: ASO-PCR using 3 primers in one reaction allows amplifying specifically p.R132H mutant
samples, confirmed by DNA sequencing. We detected 11 mutations in 28 cases of WHO grade II and III gliomas
(39.3%), but not any mutation in 5 cases of WHO grade I and IV gliomas (glioblastoma).
Conclusion: ASO-PCR can be used in the screening step of IDH1 gene mutations (p.R132H) in gliomas.
Key words: Gliomas, IDH1 gene, mutations, ASO-PCR.
*

Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
***
Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Pháp Việt.
Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Chợ Rẫy.
Tác giả liên lạc: TS.BS. Hoàng Anh Vũ
ĐT: 0122-2993537, Email:
**

281


Nghiên cứu Y học
ĐẶT VẤN ĐỀ
U thần kinh đệm (UTKĐ, glioma) là những
khối u nội sọ nguyên phát thường gặp nhất,
chiếm 80% các trường hợp u não ác tính và 30%
các trường hợp u của hệ thần kinh trung ương

nói chung. Mặc dù tương đối hiếm, chúng vẫn
gây ra tỷ lệ mắc bệnh và tử vong đáng kể; tại Mỹ
tỷ lệ mắc u não nguyên phát là 18,1/100.000 dân
mỗi năm, và tỷ lệ sống còn tương ứng với 2, 5, 10
và 20 năm lần lượt là 62%, 54%, 45% và 30%(6). Ở
Việt Nam, theo nghiên cứu của tác giả Trần
Minh Thông, trong thời gian 1/2000-7/2007 tại
Bệnh viện Chợ Rẫy có 1187 trường hợp u sao bào
được chẩn đoán và phẫu thuật, trong đó u sao
bào độ ác cao (u sao bào thoái sản, u nguyên bào
thần kinh đệm) chiếm 56%(10).
Sự khác biệt giữa thương tổn lành tính và ác
tính là ít rõ ràng trong u não hơn trong các u của
cơ quan khác. Một số UTKĐ có đặc điểm mô học
lành tính, bao gồm chỉ số phân bào thấp, tính
đồng dạng của tế bào cao, và tăng trưởng chậm,
lại có thể xâm nhập mô não, từ đó dẫn đến các
biểu hiện lâm sàng nghiêm trọng và tiên lượng
xấu. Tuy nhiên, cho đến nay mọi kết luận về
chẩn đoán và tiên lượng đều phụ thuộc vào
quyết định chủ quan của các nhà giải phẫu bệnh,
nên vẫn còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế. Vì
thế, việc nghiên cứu tìm ra các dấu ấn sinh học
khách quan hơn, giúp tiên lượng bệnh là rất
quan trọng. Gần đây, người ta có thể chia UTKĐ
thành 5 nhóm chính(4) dựa trên 3 dấu ấn của khối
u là đột biến vùng khởi động gen TERT, đột biến
các gen IDH và mất đoạn đồng thời của nhiễm
sắc thể 1p và 19q. Sự phân chia này có ý nghĩa về
mặt tiên lượng bệnh và hứa hẹn sẽ sớm được

đưa vào ứng dụng trong lâm sàng.
Trong UTKĐ, các đột biến gen IDH được xác
định xảy ra ở gen IDH1 hoặc IDH2. Hơn 90% các
đột biến được ghi nhận trên gen IDH1, tập trung
tại codon R132 của exon 4, với các loại khác nhau
được mô tả như sau: đột biến thay thế p.R132H
(c.395G>A) thường gặp nhất, chiếm khoảng
92,4%, theo sau là p.R132C (3,2%), p.R132G

282

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015
(2,1%), p.R132S (1,6%) và p.R132L (<1%). Đột
biến p.R132V hiếm gặp, ban đầu được đề xuất
như là đột biến soma, nhưng sau đó được xem là
tình trạng đa hình đơn nucleotide. Trong UTKĐ,
sự có mặt của đột biến IDH1 tỷ lệ nghịch với độ
ác tính mô học trong chẩn đoán giải phẫu bệnh,
theo đó các khối u thường phát triển chậm và ít
xâm lấn hơn so với các trường hợp không mang
đột biến. Vì vậy, đột biến IDH1 được xem là một
dấu ấn quan trọng cho chẩn đoán và tiên lượng
tốt đối với các bệnh nhân mắc UTKĐ.
Để phát hiện được tất cả các dạng đột biến
đa dạng của gen IDH1, kỹ thuật giải trình tự
DNA được cho là thích hợp nhất. Tuy nhiên, đây
là kỹ thuật phức tạp và tốn kém, chỉ phù hợp cho
các cơ sở nghiên cứu được trang bị tốt. Với từng
đột biến cụ thể, người ta có thể phát hiện chúng
bằng kỹ thuật ASO-PCR (allele-specific

oligonucleotide polymerase chain reaction)(3).
Cho đến nay, tại Việt Nam rất ít báo cáo đề cập
đến đột biến gen trong UTKĐ. Trong nghiên cứu
này chúng tôi bước đầu thiết lập điều kiện ASOPCR để phát hiện loại đột biến thường gặp nhất
của gen IDH1 trong UTKĐ là p.R132H
(c.395G>A), làm cơ sở cho việc triển khai nghiên
cứu sâu rộng hơn các dấu ấn sinh học có giá trị
trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh này trên
bệnh nhân Việt Nam.

ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
Đối tượng
Chúng tôi tiến hành khảo sát đột biến gen
IDH1 cho những bệnh phẩm được chẩn đoán là
u sao bào (một loại u điển hình trong UTKĐ) với
cấp độ từ I đến IV được lưu trữ tại Khoa Giải
Phẫu Bệnh - Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ
Chí Minh, trong giai đoạn từ tháng 12/2013 đến
tháng 06/2015. Nghiên cứu đột biến gen được
thực hiện tại Trung tâm Y Sinh Học Phân Tử Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.

Phương pháp
Tách chiết genomic DNA
Bệnh phẩm là mô vùi nến đã sử dụng để


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015
chẩn đoán giải phẫu bệnh. Các mẫu được chọn
khi tiêu bản nhuộm HE có ít nhất 50% số tế bào
u. Genomic DNA được tách chiết bằng bộ kít

ReliaprepTM FFPE gDNA Miniprep System
(Promega, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng của nhà
sản xuất.

Khuếch đại exon 4 của gen IDH1 bằng kỹ thuật
PCR
Một cặp mồi được thiết kế bằng phần mềm
CLC Main Workbench dựa trên trình tự chuẩn
của gen IDH1 mang accession number
NG_023319 trong GenBank để khuếch đại exon 4
có mang codon R132. Trình tự mồi xuôi IDH1-F:
5’-GTGGAAATCACCAAATGGCA-3’;
mồi
ngược:
IDH1-R:
5’AGATACCAAAAGATAAGAAT-3’). Mồi được
đặt tổng hợp bởi Integrated DNA Technologies
(Mỹ). Kỹ thuật PCR được thực hiện với cặp mồi
đặc hiệu đã được thiết kế và bộ kit TaKaRa
TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản).
Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực hiện
trên máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức),
bao gồm giai đoạn biến tính DNA ban đầu ở
980C trong 3 phút. Tiếp theo, phản ứng tổng hợp
chuỗi DNA được thực hiện với 50 chu kỳ gồm 3
bước: biến tính ở 980C trong 10 giây, thực hiện
phản ứng lai ở 540C trong 20 giây, sau đó là tổng
hợp mạch mới ở 720C trong 30 giây. Phản ứng
được kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở
720C trong 2 phút. Sản phẩm PCR được phát

hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,5% có
nhuộm ethidium bromide và quan sát với hệ
thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ).
Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng
QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Mỹ) theo
hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và được
kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 1,5%.
Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA
Sản phẩm PCR đã được tinh sạch được chạy
phản ứng cycle sequencing với BigDye
terminator v3.1 (Applied Biosystem, Mỹ) theo cả
2 chiều xuôi và ngược, sau đó được kết tủa bằng
ethanol, hòa tan trong Hi-Di formamide, biến

Nghiên cứu Y học
tính 2 phút ở 960C và làm lạnh đột ngột trong đá
bào. Trình tự DNA được xác định bằng máy giải
trình tự ABI 3130 Genetic Analyzer với POP-7
polymer và capillary 50 cm. Kết quả được phân
tích bằng phần mềm CLC Main Workbench.

Thiết kế mồi cho ASO-PCR
Mồi
xuôi
IDH1-MUF
(5’AAACCTATCATCATAGGCCA-3’), bổ sung
đặc hiệu với alen mang đột biến c.395G>A, được
chúng tôi thiết kế và tổng hợp bởi Integrated
DNA Technologies (Mỹ). Trong mồi IDH1-MUF,
vị trí nucleotide đầu tiên của đầu tận 3’ đã được

thay thế từ G sang A. Đồng thời, để tăng tính đặc
hiệu của mồi, vị trí nucleotide thứ 3 của đầu tận
3’ cũng đã được thay thế từ T sang C(5).

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Đặc điểm mẫu nghiên cứu
Có tất cả 33 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân
được chọn vào nghiên cứu, gồm 16 nam và 17
nữ. Bệnh nhân nhỏ tuổi nhất là 6 tuổi, lớn nhất là
55 tuổi, với số trung vị là 30,5 tuổi. Vì mục tiêu
chính của nghiên cứu là thiết lập kỹ thuật phát
hiện đột biến bằng ASO-PCR nên chúng tôi tập
trung chọn những mẫu bệnh phẩm được xếp
loại độ mô học có tần suất đột biến cao nhất: 3
mẫu độ I, 15 mẫu độ II, 13 mẫu độ III và 2 mẫu
độ IV.

Phát hiện đột biến IDH1 bằng kỹ thuật giải
trình tự DNA
Trong giai đoạn đầu của nghiên cứu này,
chúng tôi cần phát hiện được mẫu chứng dương
có mang đột biến c.395G>A (p.R132H) để tiến
hành chuẩn hóa điều kiện ASO-PCR. Exon 4 của
gen IDH1 có mang codon R132 được khuếch đại
từ DNA của 12 mẫu bệnh phẩm, sau đó được
giải trình tự theo hai chiều. Chúng tôi phát hiện
3 mẫu có mang đột biến gen IDH1 tại codon
R132 (Hình 1), trong đó 1 trường hợp đột biến
c.394C>G (p.R132G) và 2 trường hợp đột biến
c.395G>A (p.R132H). Một trong hai mẫu có đột

biến c.395G>A được sử dụng cho nghiên cứu
tiếp theo.

283


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015
Sử dụng quy trình ASO-PCR đã được tối ưu
hóa, chúng tôi tiến hành khảo sát đột biến
c.395G>A cho 21 mẫu UTKĐ còn lại. Hình 2B
minh họa hình ảnh điện di một số sản phẩm
ASO-PCR, trong đó mẫu không có đột biến chỉ
biểu hiện 1 sản phẩm 240 bp, trong khi mẫu
mang đột biến có cả 2 sản phẩm 240 bp và 137
bp. Trong số 21 mẫu được khảo sát bằng ASOPCR, chúng tôi phát hiện thêm 9 trường hợp có
mang đột biến c.395G>A. Các kết quả này hoàn
toàn phù hợp sau khi được kiểm chứng lại bằng
giải trình tự DNA các sản phẩm 240 bp đã được
tách ra từ băng điện di.

Hình 1: Hai kiểu đột biến gen IDH1 được phát hiện
bằng giải trình tự DNA

Phát hiện đột biến IDH1 bằng kỹ thuật
ASO-PCR
Kỹ thuật ASO-PCR lần đầu tiên được mô
tả trong nghiên cứu các tế bào ác tính ở bệnh
nhân đa u tủy(2). Đây là kỹ thuật rất nhạy, cho

phép phát hiện bất thường về gen của 1 tế bào
ác tính trong quần thể 104-105 tế bào bình
thường(2,7). Để thực hiện ASO-PCR phát hiện
đột biến p.132RH của gen IDH1 trong UTKĐ,
chúng tôi dùng 3 mồi trong cùng 1 phản ứng
khuếch đại gen (Hình 2A). Mồi IDH1-F và
IDH1-R đóng vai trò của chứng nội tại, tạo sản
phẩm có kích thước 240 bp. Chỉ có những mẫu
khuếch đại được đoạn gen này mới được đánh
giá tiếp theo xem có hay không có mang đột
biến c.395G>A. Vì mồi IDH1-MUF được thiết
kế bổ sung đặc hiệu với alen đột biến nên cặp
mồi IDH1-MUF và IDH1-R chỉ hoạt động để
tạo sản phẩm 137 bp trên những mẫu có mang
đột biến c.395G>A. Chúng tôi đã thay đổi các
tỷ lệ khác nhau của 3 mồi trong mỗi phản ứng
và nhận thấy tỷ lệ hoạt động tốt nhất là IDH1F/IDH1-MUF/IDH1-R = 1/2/2, với nhiệt độ bắt
cặp tối ưu được xác định ở 540C.

284

Như vậy, chúng tôi đã phát hiện 12 trường
hợp có mang đột biến ở codon R132 của gen
IDH1 trong tổng số 33 mẫu UTKĐ, chiếm tỷ lệ
chung là 36,4% (1 trường hợp p.R132G và 11
trường hợp p.R132H). Đột biến p.R132H chỉ
được phát hiện trên các mẫu UTKĐ độ II (6/15
hay 40%) và độ III (5/13 hay 38,5%); 5 mẫu độ I
và IV không phát hiện có đột biến. Mặc dù
nghiên cứu này có số mẫu nhỏ, nhưng bước

đầu cho thấy đột biến gen IDH1 chủ yếu gặp ở
UTKĐ độ II và III (11/28 hay 39,3%), phù hợp
với kết quả của nhiều nghiên cứu khác trên
thế giới(4,9,12).
Ngoài đột biến p.R132H của gen IDH1, giải
trình tự DNA sẽ cho phép xác định được những
đột biến khác của gen IDH1 và IDH2(8,11). Tuy
nhiên, kỹ thuật ASO-PCR của chúng tôi có thể
được lựa chọn như phương pháp sàng lọc ban
đầu giúp phát hiện khoảng 40% các trường hợp
có mang đột biến. Kỹ thuật này có những lợi
điểm chính là chính xác, nhanh chóng và dễ thực
hiện(1). Với hệ thống khuếch đại gen thường quy
sẵn có trong nhiều cơ sở giải phẫu bệnh có kèm
chẩn đoán phân tử, toàn bộ quy trình kỹ thuật
chẩn đoán đột biến bằng ASO-PCR có thể thực
hiện trong vòng 1 ngày làm việc. Trong thời gian
tới, ASO-PCR kết hợp với giải trình tự DNA sẽ
được chúng tôi tiến hành trên nghiên cứu với số
mẫu lớn hơn để đánh giá chính xác giá trị tiên
lượng của đột biến các gen IDH trong UTKĐ.


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015

Nghiên cứu Y học

Hình 2: (A) ASO-PCR được thực hiện bằng 3 mồi, trong đó mồi IDH1-MUF chỉ khuếch đại alen đột biến. (B)
Hình điện di sản phẩm ASO-PCR (giếng 2-15) với băng 240 bp là chứng nội và băng 137 bp là sản phẩm tương
ứng với những mẫu có đột biến p.R132H. Giếng 1: thang chuẩn DNA; giếng 16: nước.

KẾT LUẬN
Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình
ASO-PCR giúp xác định được đột biến p.R132H
của gen IDH1 thường gặp nhất trong UTKĐ. Kết
quả bước đầu phát hiện 39,3% mẫu UTKĐ độ II
và III có mang đột biến, làm cơ sở cho những
nghiên cứu sâu hơn, quy mô lớn hơn về đột biến
các gen IDH trong UTKĐ.

6.

7.

8.

9.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.

4.

5.

Ashraf S, Noguera NI, Di Giandomenico J, et al (2013). Rapid

detection of IDH2 (R140Q and R172K) mutations in acute
myeloid leukemia. Ann Hematol;92(10):1319-23.
Billadeau D, Quam L, Thomas W, et al (1992). Detection and
quantitation of malignant cells in the peripheral blood of
multiple myeloma patients. Blood;80(7):1818-24.
Dahse R, Berndt A, Dahse AK, et al (2008). Two allele-specific
PCR assays for screening epidermal growth factor receptor
gene hotspot mutations in lung adenocarcinoma. Mol Med
Report;1(1):45-50.
Eckel-Passow JE, Lachance DH, Molinaro AM, et al (2015).
Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter
Mutations in Tumors. N Engl J Med;372(26):2499-508.
Liu J, Huang S, Sun M, et al (2012). An improved allelespecific PCR primer design method for SNP marker analysis
and its application. Plant Methods;8(1):34.

10.
11.

12.

Porter KR, McCarthy BJ, Freels S, et al (2010). Prevalence
estimates for primary brain tumors in the United States by
age, gender, behavior, and histology. Neuro Oncol;12(6):520-7.
Roche-Lestienne C, Soenen-Cornu V, Grardel-Duflos N, et al
(2002). Several types of mutations of the ABL gene can be
found in chronic myeloid leukemia patients resistant to
STI571, and they can pre-exist to the onset of treatment.
Blood;100(3):1014-8.
Sanson M, Marie Y, Paris S, et al (2009). Isocitrate
dehydrogenase 1 codon 132 mutation is an important

prognostic biomarker in gliomas. J Clin Oncol;27(25):4150-4.
Sonoda Y, Kumabe T, Nakamura T, et al (2009). Analysis of
IDH1 and IDH2 mutations in Japanese glioma patients.
Cancer Sci;100(10):1996-8.
Trần Minh Thông (2007). Đặc điểm giải phẫu bệnh của 1187
ca u sao bào. Tạp chí Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh;11(3):41-46.
Van Den Bent Mj, Dubbink HJ, Marie Y, et al (2010). IDH1 and
IDH2 mutations are prognostic but not predictive for outcome
in anaplastic oligodendroglial tumors: a report of the
European Organization for Research and Treatment of Cancer
Brain Tumor Group. Clin Cancer Res;16(5):1597-604.
Verhaak RG, Hoadley KA, Purdom E, et al (2010). Integrated
genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of
glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA,
IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell;17(1):98–110.

Ngày nhận bài báo:

20/08/15

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

01/06/2015

Ngày bài báo được đăng:

05/09/2015

285