Khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học: Ảnh hưởng của lớp mỏng tế bào lên sự phát sinh hình thái của cây hoa Anh thảo (Cyclamen persicum)

Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

TRƢỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
-------------------

HOÀNG TRẦN MINH THU

ẢNH HƢỞNG CỦA LỚP MỎNG TẾ BÀO LÊN
SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA CÂY HOA
ANH THẢO (Cyclamen persicum)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 29
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà lạt, 5/2009
Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

TRƢỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
-------------------

ẢNH HƢỞNG CỦA LỚP MỎNG TẾ BÀO LÊN
SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA CÂY HOA
ANH THẢO (Cyclamen persicum)

Cán bộ hƣớng dẫn:

TS. Dƣơng Tấn Nhựt
ThS. Nguyễn Văn Bình

Sinh viên thực hiện:

Hoàng Trần Minh Thu

Đà lạt, 5/2009
Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của
tôi. Những kết quả và số liệu trong khóa luận này chƣa
đƣợc ai công bố dƣới bất kỳ hình thức nào. Đây là một
phần nghiên cứu trong đề tài “Nghiên cứu hệ thống tái
sinh và bước đầu chuyển gen vào cây hoa Anh Thảo
(Cyclame spp.)” do ThS. Nguyễn Văn Bình chủ trì,
Viện Sinh học Tây Nguyên cấp kinh phí. Tôi hoàn toàn
chịu trách nhiệm trƣớc nhà trƣờng về lời cam đoan này.

Đà lạt, 24/05/2009
Tác giả

Hoàng Trần Minh Thu

Hoàng Trần Minh Thu

Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

LỜI CẢM ƠN
Tôi rất tâm đắc câu chuyện về hai anh thợ xây khi nói về công việc của mình nhƣ
sau. Khi hai ngƣời đang xây bức tƣờng của một tòa nhà, một ngƣời đi ngang qua và hỏi
anh công nhân thứ nhất: “Anh bạn đang làm gì thế?”. Anh ta nói rằng mình đang trộn hồ,
đặt các viên gạch lên và xây tƣờng: “Công việc này chẳng có gì là thú vị, thậm chí nó còn
chán ngắt, vô cùng cực nhọc và chẳng kiếm đƣợc nhiều tiền”. Ngƣời này bƣớc đến hỏi
anh công nhân thứ hai đang mải mê làm việc cũng cùng câu hỏi trên, nhƣng thật bất ngờ
khi nghe câu trả lời: “Tôi là ngƣời may mắn nhất thế giới vì thành quả công việc của tôi
góp phần tạo nên những công trình kiến trúc quan trọng và đẹp mắt. Tôi biến những viên
gạch nhỏ bé tầm thƣờng này thành những kiệt tác vĩ đại và tồn tại mãi với thời gian”.
Trƣớc hết, em xin tỏ lòng biết ơn đến Thầy – Tiến sĩ Dƣơng Tấn Nhựt. Cảm ơn
những hành trang, kiến thức vô cùng quý giá mà Thầy đã trang bị cho em. Cảm ơn những
đêm không ngủ, những bữa ăn muộn để giúp em hoàn thành tốt luận văn. Cảm ơn Thầy
đã biến những viên gạch ý tƣởng, những viên gạch đam mê khoa học nhỏ bé của chúng
em lớn dần lên. Thật may mắn khi đến cuối chặn đƣờng sinh viên, bắt đầu bƣớc chân vào
đời, em đƣợc gặp Thầy. Thầy không chỉ dạy cho em biết những kiến thức về khoa học mà
Thầy còn dạy em biết về cách sống, đạo làm ngƣời để em dần hoàn thiện con ngƣời mình.
Xin gửi đến Thầy mọi lời chúc tốt đẹp nhất.
Gửi lời cảm ơn chân thành đến Thạc sĩ Nguyễn Văn Bình – ngƣời đã tận tình
hƣớng dẫn em thực hiện đề tài này. Cảm ơn những kinh nghiệm quý báu, những lời
khuyên, lời động viên từ một ngƣời thầy, ngƣời anh nhƣ anh. Nhờ vào đó mà em nhận ra
sự nổ lực của bản thân quan trọng đến vậy. Gửi lời chúc thành công, thành công, thành
công và hạnh phúc nữa sẽ đến với anh.

Hoàng Trần Minh Thu

Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô bộ môn trƣờng Đại Học Đà Lạt đã tạo điều
kiện thuận lợi giúp em thực tập tại Viện Sinh học Tây Nguyên để hoàn thành luận văn
này.
Kế đến, em xin cảm ơn chị Phượng, chị Thu Ba, chị Hiền, anh Luận, anh Nam cũng
nhƣ toàn thể cán bộ, nhân viên phòng Sinh học Phân tử và chọn tạo giống cây trồng thuộc
Viện Sinh học Tây Nguyên đã giúp đỡ rất nhiều trong suốt quá trình em thực hiện khóa
luận này.
Cảm ơn anh Tâm, chị Phượng, anh Bá Nam, anh Tuấn, anh Sơn, anh Tùng, anh
Công, anh Huy. Cảm ơn các bạn Hương, Thùy, Hoàn Anh, Loan, Chiến, Nguyễn, Kha,
Thưởng, Thương, Kim Cương, Thành, các bạn đã luôn bên Thu trong những tháng ngày
vui vẻ nhiều mà vất vả cũng không ít. Đƣợc học tập và làm việc cùng các anh chị và các
bạn, giúp em hiểu không chỉ có kiến thức, sự tận tụy và khéo léo mà cần phải có niềm
đam mê thực sự, niềm đam mê xuất phát từ chính những ngƣời trẻ với sự khát khao thành
công.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba Mẹ, Ba Mẹ đã cho con cuộc sống, cho
con tình thƣơng của một gia đình trọn vẹn. Cảm ơn Hai, Vy, Chi, anh Chương, Ni, Na,
Ford, Euro vì đã là ngƣời một nhà với em. Gửi lời cảm ơn đến những ngƣời bạn vô cùng
thân thiết của Thu: Hải Đường, Anh Thư, Hạ Dung, Đình Nghị, Tiến, Duy Anh đã giúp
đỡ, ủng hộ và luôn bên cạnh Thu. Và con đặc biệt gửi lời cảm ơn đến dì Loan, dì đã giúp
con chuyển sang con đƣờng mới, không dễ dàng, nhƣng nếu đƣợc chọn lại, con vẫn chọn
con đƣờng này.
Đà Lạt, ngày 21 tháng 5 năm 2009

Hoàng Trần Minh Thu

Hoàng Trần Minh Thu

Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

MỤC LỤC
TRANG
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mu ̣c chƣ̃ viế t tắ t .................................................................................................... i
Danh mu ̣c hình............................................................................................................... ii
Danh mục bảng .............................................................................................................. iii
Danh mục biểu đồ .......................................................................................................... iv
Lời mở đầu..................................................................................................................... v

PHẦN 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NHÂN GIỐNG IN VITRO ..................................................................................... 1
1.1.1 Giới thiệu ................................................................................................................. 1
1.1.2 Các bƣớc nhân giống in vitro ................................................................................ 1
1.1.3. Một số kỹ thuật nhân giống in vitro .................................................................... 2
1.1.3.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ................................................................................ 2
1.1.3.2. Nuôi cấy mô sẹo ................................................................................................. 2
1.1.3.3. Nuôi cấy tế bào đơn ........................................................................................... 2
1.1.3.4. Nuôi cấy tế bào trần – chuyển gen................................................................... 3
1.1.3.5. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội ................................................................................ 3
1.2. MỘT SỐ NHƢỢC ĐIỂM ĐÁNG QUAN TÂM CỦA VI NHÂN GIỐNG .......... 3
1.3. HỆ THỐNG NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO .................................................. 4
1.3.1. Giới thiệu ................................................................................................................ 4
1.3.2. Đặc điểm của phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào .................................... 5
1.3.3. Ƣu điểm của phƣơng pháp ................................................................................... 7
1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN IN VITRO

CỦA THỰC VẬT .............................................................................................................. 7
1.4.1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy đến khả năng phát sinh hình thái của cây ............... 7

1.4.2. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng lên sự sinh trƣởng và phát triển của
thực vật .............................................................................................................................. 12
1.4.2.1. Auxin .................................................................................................................... 12
1.4.2.2. Cytokinin ............................................................................................................. 13
1.4.2.3. Ảnh hưởng của TDZ lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật ............ 14
1.5. SƠ LƢỢC VỀ HOA ANH THẢO ......................................................................... 16
1.5.1. Phân loại ................................................................................................................. 16
1.5.2. Đặc điểm của hoa Anh thảo ................................................................................. 16
1.5.3. Giá trị kinh tế của hoa Anh thảo .......................................................................... 17
1.5.4. Những nghiên cứu in vitro đƣợc tiến hành ở hoa Anh thảo .......................... 18

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

PHẦN 2 – VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP
2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI ............................................. 20
2.2. MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI .............................................................................................. 20
2.3. VẬT LIỆU .............................................................................................................. 20
2.3.1. Nguồn mẫu .......................................................................................................... 20
2.3.2. Khử trùng mẫu ..................................................................................................... 21
2.3.3. Môi trƣờng nuôi cấy ............................................................................................ 21
2.3.4. Điều kiện thí nghiệm ........................................................................................... 22
2.4. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ........................................................................... 22
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ các loại auxin (2,4-D, IBA,
NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh

thảo ..................................................................................................................... 22
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D,
IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây
Anh thảo ............................................................................................................. 23
2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của TDZ, BA hoặc Kinetin kết hợp với 2,4-D
lên khả năng tăng sinh mô sẹo của cây hoa Anh thảo in vitro ........................... 25
2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA hoặc NAA
lên khả năng phát sinh chồi của hoa Anh thảo in vitro ...................................... 26
2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của BA và Kinetin lên khả năng tăng sinh và
kéo dài chồi của cây hoa Anh thảo in vitro ........................................................ 27
2.4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của IBA, NAA lên sự hình thành rễ của cây
hoa Anh thảo in vitro .......................................................................................... 28
2.5. PHÂN TÍCH SỐ LIỆU ........................................................................................... 28
2.5.1. Tính trung bình và phƣơng sai của mẫu .............................................................. 28
2.5.2. Vẽ biểu đồ ............................................................................................................ 29

PHẦN 3 – KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ các loại auxin 2,4-D, IBA, NAA
lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo ..... 30
3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D,
IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây
Anh thảo ................................................................................................................ 32
3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của TDZ, BA hoặc Kinetin kết hợp với 2,4-D
lên khả năng tăng sinh mô sẹo của cây hoa Anh thảo in vitro .............................. 36
3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA, NAA lên
khả năng phát sinh chồi cây hoa Anh thảo in vitro ............................................... 40
3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của BA và Kinetin lên khả năng tăng sinh và
kéo dài chồi của cây hoa Anh thảo in vitro ........................................................... 43
3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của IBA và NAA lên sự tạo rễ của cây hoa
Anh thảo in vitro ................................................................................................... 46

PHẦN 4 – KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận................................................................................................................... 50
Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

4.2. Đề nghị ................................................................................................................... 51

PHẦN 5 – TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Tài liệu tiếng Anh
Phụ lục

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

CHỮ VIẾT TẮT
Chất điều hòa sinh trƣởng:
2,4-D

:

2,4-Dicholorophenoxy acetic acid

BA

:

6-Benzyl adenin

GA3

:

Gibberellic acid

IAA

:

Indole-3-acetic acid

IBA

:

Indole-3-butyric acid

NAA

:

α-Naphthalene acetic acid

TDZ

:

Thidiazuron

MS

:

Murashige và Skoog, 1962

1/2 MS

:

Môi trƣờng MS với thành phần khoáng đa lƣợng giảm còn ½

WPM

:

Woody plant medium (môi trƣờng nuôi cấy cây thân gỗ)

TCL

:

Thin cell layer

tTCL

:

Transverse TCL

PGRs

:

Plant growth regulators

lTCL

:

Longitudinal TCL

Môi trƣờng:

Các chữ khác:

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Một số giống hoa Anh thảo (Cyclamen sp.)
Hình 2. Hoa Anh thảo
Hình 3. Cây hoa Anh thảo sử dụng làm nguồn mẫu
Hình 4. Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống hoa Anh thảo (Cyclamen persicum) bằng

phƣơng pháp lớp mỏng tế bào phát hoa
Hình 5. Ảnh hƣởng của các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô
sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo.
Hình 6. Ảnh hƣởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) lên khả
năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây hoa Anh thảo
Hình 7. Ảnh hƣởng của TDZ, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô
sẹo của hoa Anh thảo
Hình 8. Ảnh hƣởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA, NAA lên khả năng phát sinh chồi
của hoa Anh thảo
Hình 9. Ảnh hƣởng của BA và Kinetin lên khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của hoa
Anh thảo.
Hình 10. Ảnh hƣởng của IBA và NAA lên khả năng tăng sinh trƣởng rễ của hoa Anh
thảo
Hình 11. Cấu tạo giải phẫu chồi in vitro của hoa Anh thảo
Hình 12. Hình chụp soi nổi mẫu mô sẹo hoa Anh thảo
Hình 13. Hình chụp soi nổi chồi in vitro hoa Anh thảo

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Nồng độ các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) trong môi trƣờng khởi tạo mô sẹo
Bảng 2.2. Nồng độ TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) trong môi trƣờng
khởi tạo mô sẹo
Bảng 2.3. Nồng độ của TDZ, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D trong môi trƣờng tăng sinh
mô sẹo
Bảng 2.4. Nồng độ của BA, Kinetin kết hợp với IBA hoặc NAA trong môi trƣờng phát
sinh chồi

Bảng 2.5. Nồng độ của BA và Kinetin trong môi trƣờng tăng sinh và kéo dài chồi
Bảng 2.6. Nồng độ của IBA và NAA trong môi trƣờng tạo rễ
Bảng 3.1. Hình thái mô sẹo từ mẫu cấy lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo
trong môi trƣờng bổ sung các loại auxin
Bảng 3.2. Hình thái mô sẹo từ mẫu lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo trong
môi trƣờng bổ sung TDZ kết hợp với các loại auxin
Bảng 3.3. Khả năng tăng sinh mô sẹo của cây hoa Anh thảo trong môi trƣờng bổ sung
TDZ, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D
Bảng 3.4. Khả năng phát sinh chồi từ mô sẹo của cây hoa Anh thảo trong môi trƣờng bổ
sung BA, Kinetin kết hợp với IBA và NAA
Bảng 3.5. Khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của cây hoa Anh thảo trong môi trƣờng có
bổ sung BA và Kinetin
Bảng 3.6. Khả năng tạo rễ từ chồi của hoa Anh thảo trong môi trƣờng có bổ sung IBA
và NAA

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1. So sánh ảnh hƣởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) ở
các nồng độ khác nhau lên sự khởi tạo mô sẹo của hoa Anh thảo
Biểu đồ 2. So sánh ảnh hƣởng của TZD, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ
khác nhau lên sự tăng sinh mô sẹo của hoa Anh thảo
Biểu đồ 3. So sánh ảnh hƣởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA, NAA ở các nồng độ

khác nhau lên sự hình thành chồi của hoa Anh thảo
Biểu đồ 4. So sánh ảnh hƣởng của BA, Kinetin ở các nồng độ khác nhau lên

khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của hoa Anh thảo
Biểu đồ 5. So sánh ảnh hƣởng của IBA và NAA ở các nồng độ khác nhau lên khả năng

tăng sinh trƣởng rễ của hoa Anh thảo

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay khi khoa học kỹ thuật phát triển, đời sống con ngƣời đƣợc nâng cao, các
nhu cầu thẫm mỹ ngày càng đƣợc chú trọng hơn. Nhu cầu chơi và trồng hoa trang trí trở
thành một phần không thể thiếu trong cuộc sống. Trong thế giới hoa muôn màu muôn vẻ,
hoa Anh thảo là một trong những đối tƣợng mới đƣợc biết đến ở nƣớc ta, có giá trị kinh tế
cao và rất đƣợc ƣa chuộng do sự đa dạng về màu sắc, chủng loại, cũng nhƣ hình dáng rất
đặc trƣng và lạ mắt của loài hoa này.
Những tiến bộ trong công nghệ sinh học cùng với những thành tựu trong nuôi cấy
mô và tế bào thực vật là một trong những động lực thúc đẩy chúng ta ngày càng tìm ra
nhiều phƣơng pháp tối ƣu hơn trong nhân giống các loài hoa. Việc ứng dụng công nghệ
sinh học phần lớn là kỹ thuật nuôi cấy mô và các phƣơng pháp sinh học tế bào, kỹ thuật
chuyển gene đã không chỉ rút ngắn quy trình nhân giống mà còn cho phép các nhà khoa
học khắc phục một số vấn đề quan trọng trong nông nghiệp và môi trƣờng. Trong đó, việc
ứng dụng hệ thống lớp mỏng tế bào đã tạo ra bƣớc nhảy vọt mang lại nguồn nguyên liệu
to lớn trong nhân giống.
Các nhà khoa học đã sử dụng nhiều phƣơng thức khác nhau để nghiên cứu về quá
trình phát sinh hình thái từ các bộ phận của cây hoa Anh thảo. Do đó, trong đề tài này,
mục tiêu đặt ra là sử dụng hệ thống lớp mỏng tế bào để khảo sát sự phát sinh hình thái
của cây hoa Anh thảo. Nhờ đó chúng tôi tìm ra môi trƣờng giúp phát sinh hình thái tối
ƣu dựa trên các chất điều hòa sinh trƣởng cần thiết. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trên

giống Cyclamen persicum – đƣợc xem là giống đem lại lợi nhuận nhất. Môi trƣờng khởi
tạo mô sẹo, tăng sinh mô sẹo, hình thành chồi, kéo dài chồi và tạo rễ tối ƣu là những mục
tiêu hàng đầu đặt ra nhằm nâng cao hệ số nhân giống, tạo cây khỏe mạnh và góp phần
giảm giá thành cây trồng cho phù hợp với túi tiền ngƣời chơi hoa. Việc dùng phát hoa làm
nguyên liệu nuôi cấy sẽ giúp nhân giống in vitro hoa Anh thảo thuận lợi và hiệu quả hơn.

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

Phần 1

TỔNG QUAN
TÀI LIỆU

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

1.1. NHÂN GIỐNG IN VITRO
1.1.1 Giới thiệu
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều là thuật ngữ mô tả các
phƣơng thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trƣờng xác
định ở điều kiện vô trùng. Môi trƣờng có các chất dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối
khoáng, vitamin, các hormone sinh trƣởng và đƣờng. Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái
sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô nhƣ lá, thân, hoa hoặc rễ. Trƣớc kia ngƣời ta dùng
phƣơng pháp nuôi cấy tế bào và mô thực vật để nghiên cứu đặc tính cơ bản của tế bào nhƣ
sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hƣởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong

quá trình nuôi cấy.
Trong 30 năm trở lại đây, nuôi cấy mô thực vật đã đạt những thành tựu to lớn trong
việc phục tráng và nhân giống cây sạch bệnh. Phƣơng pháp này có những ƣu điểm sau:
 Tạo đƣợc số lƣợng cây giống lớn và đồng nhất trong thời gian ngắn với diện tích
thí nghiệm nhỏ và có điều kiện lý hóa kiểm soát đƣợc.
 Tạo đƣợc nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt
phấn, chồi phát hoa) mà ngoài tự nhiên không thực hiện đƣợc.
 Tạo cây sạch virus bằng cách nuôi cấy mô phân sinh ngọn.
 Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phƣơng pháp chuyển gen.
1.1.2 Các bƣớc nhân giống in vitro
Nhân giống cây trồng in vitro gồm các bƣớc cơ bản sau:
 Tạo thể nhân giống in vitro.
 Nhân giống in vitro.
 Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro.
 Chuyển cây in vitro ra vƣờn ƣơm.

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

1.1.3. Một số kỹ thuật nhân giống in vitro
1.1.3.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng
Một phƣơng thức nhân giống hiệu quả trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy
đỉnh sinh trƣởng (từ chồi đỉnh và chồi bên). Sau khi vô trùng, mẫu sẽ đƣợc nuôi cấy trên
môi trƣờng thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dƣỡng khoáng vô cơ, hữu cơ hoặc môi
trƣờng khoáng có bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trƣởng,
sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định, mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều
chồi. Chồi tiếp tục phát triển vƣơn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây
con đƣợc chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thƣờng.

1.1.3.2. Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản biệt hóa của
các tế bào đã phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trƣờng có sự hiện diện của
auxin. Mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trƣờng có
chất điều hòa sinh trƣởng thích hợp.
Nuôi cấy mô sẹo đƣợc thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân
giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống nhƣ
cây mẹ. Một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn nuôi cấy đỉnh
sinh trƣởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma cao.
1.1.3.3. Nuôi cấy tế bào đơn
Khối mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng và đƣợc đặt trên máy lắc có tốc
độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào
đơn đƣợc lọc và nuôi cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng để tăng sinh khối. Với các cơ chất
thích hợp đƣợc bổ sung vào trong môi trƣờng, tế bào có khả năng sản xuất các chất có
hoạt tính sinh học. Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trƣờng lỏng, tế bào đơn
đƣợc trải lên môi trƣờng thạch và sau khi môi trƣờng thạch đƣợc bổ sung auxin thì chúng
phát triển thành từng cụm mô sẹo cho đến khi môi trƣờng có tỷ lệ cytokinin/auxin thích
hợp, lúc đó chúng đã có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

1.1.3.4. Nuôi cấy tế bào trần – chuyển gen
Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn đƣợc tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy
trì đầy đủ chức năng sẵn có. Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng
tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở
thực vật). Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung
hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép tạo giống cây trồng mới. Quá trình

dung hợp có thể thực hiện trên hai đối tƣợng cùng loài hay khác loài.
1.1.3.5. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội
Hạt phấn ở thực vật đƣợc nuôi cấy trên những môi trƣờng thích hợp tạo thành cây
hoặc mô sẹo. Mô sẹo đƣợc tái sinh thành cây đơn bội hoàn chỉnh.
1.2. MỘT SỐ NHƢỢC ĐIỂM ĐÁNG QUAN TÂM CỦA VI NHÂN GIỐNG
Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh học thực
vật. Nó là công cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học. Điều quan trọng nhất trong vi
nhân giống là việc nghiên cứu vai trò của các chất điều hòa sinh trƣởng và sự kích thích
hình thành chồi với số lƣợng lớn.
Tuy nhiên, việc ứng dụng các phòng thí nghiệm có công nghệ hiện đại chỉ mới đƣợc
triển khai nhiều nhất trong vi nhân giống trên đối tƣợng cây cảnh trang trí. Vấn đề này
vẫn chƣa có sự thay đổi lớn trong suốt 20 năm qua.
Bên cạnh đó, còn có một số giới hạn khác trong ứng dụng vi nhân giống đối với tất
cả các loài thực vật:
 Giới hạn về sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống, nghĩa là cây con tạo ra
thƣờng ít đồng nhất về mặt kiểu hình.
 Tiến trình nhân giống phức tạp (bao gồm nhiều giai đoạn liên quan nhau và kéo dài
5 – 6 tháng trƣớc khi có thể thích ứng trồng ngoài vƣờn ƣơm).
 Giá thành sản phẩm nhân giống còn khá cao.

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

 Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trƣởng thêm vào môi
trƣờng.
Trong các khó khăn trên, vấn đề hiện đang đƣợc quan tâm nhất là giá thành sản
phẩm còn cao. Theo Kozai và cộng sự (1992), nguyên nhân chính là sự thất thoát do
nhiễm khuẩn và nấm trong quá trình nuôi cấy, tỷ lệ sống sót thấp của cây trong giai đoạn

ra mạ, giá nhân công chiếm 60 – 70% tổng giá thành sản phẩm cần thiết trong quá trình
cấy chuyền mẫu cấy sang môi trƣờng mới, giá thành trang thiết bị (chiếu sáng, bình nuôi
cấy,…) và nguyên liệu cơ bản (đƣờng, agar,…) còn khá cao. Việc cấy chuyền lặp lại
nhiều lần làm giảm đáng kể sức sinh trƣởng và phát triển của thực vật, có khi làm tăng
tính bất thƣờng về di truyền cho tế bào ngay cả sự hình thành rễ chính và rễ thứ cấp có thể
không thành công. Hạn chế nghiêm trọng nhất trong vi nhân giống là tỷ lệ sống sót của
cây thấp sau khi chuyển ra vƣờm ƣơm do sự khác biệt lớn giữa điều kiện môi trƣờng in
vitro và ex vitro và sự cần thiết phải nuôi cấy vô trùng bắt buộc phải sử dụng các trang
thiết bị chuyên biệt và đắt tiền.
Sự gia tăng giá cả trong suốt những năm 80 của thế kỷ XX là nguyên nhân nhiều
phòng thí nghiệm ở nhiều nƣớc phát triển phải đóng cửa. Ở Mỹ, chỉ còn khoảng 150 –
180 phòng thí nghiệm còn hoạt động vào cuối thập niên 80 so với 500 phòng vào đầu thập
niên này.
Tất cả những khó khăn trên đƣợc xem nhƣ trở ngại to lớn cho việc ứng dụng rộng rãi
vi nhân giống trong nhân giống các giống thực vật có chất lƣợng cao.
1.3. HỆ THỐNG NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO
1.3.1. Giới thiệu
Các khái niệm về mạng lƣới ức chế, trong đó sự tăng trƣởng, phát triển và lão hóa
bắt nguồn từ mối tƣơng quan có thể điều chỉnh đƣợc giữa: i) cơ quan, mô, tế bào; ii) các
cụm tế bào khác nhau; iii) các bào quan trong tế bào đã đƣa Trần Thanh Vân đến với khái
niệm hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) vào đầu những năm 70 của thế kỷ XX.

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

Thực vật có khả năng tái chƣơng trình hóa (reprogram) các chƣơng trình biệt hóa sự
phát triển của cơ thể và có khả năng xây dựng quá trình phân chia chức năng mới, cấu
trúc mới (mô sẹo, rễ, chồi, phôi soma và hoa), mẫu phát sinh hình thái mới. Trong trƣờng

hợp hình thành cấu trúc mới là chồi và phôi soma, cá thể mới có thể hình thành mà không
cần quá trình giảm phân và sinh sản hữu tính. Sự phát triển bên trong thực vật đƣợc kiểm
soát về không gian và thời gian trong một mạng lƣới các đơn vị khác nhau: cơ quan, mô
và tế bào. Nếu nhƣ có sự thay đổi trong mạng lƣới này thì sự ức chế ở mức cá thể có thể
xảy ra. Khái niệm về phƣơng pháp TCL là cô lập tế bào từ mạng lƣới ức chế này và tái
chƣơng trình chúng bằng nuôi cấy in vitro (Nhựt và cộng sự, 2003).
1.3.2. Đặc điểm của phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào
Hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) bao gồm các mẫu cấy có kích thƣớc nhỏ đƣợc cắt
ra từ các bộ phận khác nhau của thực vật (thân, lá, rễ, phát hoa, các bộ phận của hoa, lá
mầm, phôi). Nếu mẫu cấy đƣợc cắt theo chiều dọc đƣợc gọi là lTCL, nếu đƣợc cắt theo
chiều ngang gọi là tTCL. Các lTCL (1 mm × 0.5 hay 10 mm) chỉ chứa một loại mô nhƣ
lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp (3 – 6 lớp) của tế bào vỏ, ngƣợc lại các tTCL
(dày khoảng 0,2 đến 0,5 mm hoặc vài mm) bao gồm một số tế bào thuộc các mô khác
nhau (mô biểu bì, mô vỏ, thƣợng tầng, mô ruột hay tế bào nhu mô) (Trần Thanh Vân và
Gendy, 1996). tTCL và lTCL có đặc điểm chung là mỏng. Đặc điểm mỏng đóng vai trò
quan trọng vì các phân tử đánh dấu sự biệt hóa có thể định vị in situ ở những tế bào đích
hay những tế bào đáp ứng. Quá trình định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng
không mong muốn (Trần Thanh Vân, 2003).
Khi cắt mẫu, mô thực vật bị thƣơng, nhiều enzyme hoặc các polysaccharide sinh ra
rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật (Trần Thanh Vân
và Mutaftschiew, 1990). Lý do cơ bản của việc ứng dụng một vài tế bào trong hệ thống
TCL là chúng có mối liên hệ mật thiết với các tế bào bị thƣơng (nơi xảy ra tổng hợp cấu
tạo vách tế bào mới và nơi phóng thích của oligosaccharide) và chất dinh dƣỡng cùng với
các yếu tố khác bên trong môi trƣờng để “kiểm soát” sự phát sinh hình thái. Tuy nhiên,
cũng bởi lý do đó có thể nói chúng khá phụ thuộc vào môi trƣờng. Ngƣợc lại, các mẫu

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

cấy lớn hơn (nhƣ thân hoặc các mảnh lá) cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với
môi trƣờng và chúng có thể chứa các hợp chất nội sinh cao hơn, bao gồm các chất điều
hòa sinh trƣởng thực vật (plant growth regulators – PGRs) nên chúng không phụ thuộc
nhiều vào môi trƣờng.
Một hệ thống đa bào nhƣ hệ thống TCL đƣợc định nghĩa nhƣ trên mang những tổ
chức không gian và thời gian cố hữu. Khác với khi sử dụng một tế bào tách ra hay tế bào
trần, sau khi tách chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào mới với tổ chức
không gian và thời gian khác biệt với sự hỗ trợ trƣớc khi tiến hành quá trình tách ra từ mô
hay cơ quan cho. Hơn nữa, hầu hết các trƣờng hợp trong quá trình phát triển của tế bào
đơn hay tế bào trần có sự hình thành một lƣợng nhỏ mô sẹo, phôi soma trộn lẫn tế bào
không phải là phôi nhƣ các tế bào ống và rễ. Ngƣợc lại, hệ thống TCL có sự hình thành
những thành phần đó với số lƣợng lớn hơn. Không những chúng đƣợc tiếp xúc trực tiếp
với môi trƣờng mà còn đƣợc chƣơng trình hóa một cách riêng biệt hoặc kết hợp tƣơng
ứng với không gian và thời gian (Trần Thanh Vân, 1973; 1974; 1981).
Việc giảm số lƣợng tế bào trong phƣơng pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa quan
trọng vì ảnh hƣởng đến quá trình phát triển hoặc các chƣơng trình biệt hóa mô, cơ quan.
Các chƣơng trình biệt hóa có thể thay đổi từ việc thay đổi mối tƣơng quan giữa cơ quan
và mô nuôi cấy với kích thƣớc của chúng khi nuôi trên môi trƣờng có cùng tính chất. Lát
cắt dọc đƣợc dùng phổ biến và các dạng phát sinh hình thể mong muốn có thể tạo đƣợc
qua việc điều khiển mức độ tác động của các nhân tố ngoại sinh.
Bên cạnh đó, khoảng thời gian để quá trình phát sinh hình thái xuất hiện tƣơng đối
ngắn (trung bình khoảng 14 ngày sau khi cấy). Tần số cũng khá cao, gần 100% mẫu có
phản ứng. Cƣờng độ của các cơ quan đƣợc thiết lập trƣớc, do đó tỷ số giữa số lƣợng tế
bào phản ứng và tế bào hiện diện trên mẫu TCL là rất cao. Ví dụ nhƣ trên một mẫu lTCL
của cây thuốc lá (Nicotiana tobacum) có kích cỡ 1 × 10 mm bao gồm 3 – 6 lớp tế bào
biểu bì và đƣợc thu nhận từ cánh hoa, các cơ quan sau đây đƣợc biệt hóa trực tiếp trên bề
mặt của TCL (mà không trải qua quá trình mô sẹo trung gian): i) 50 hoa trong chƣơng
trình hoa, ii) 500 – 700 chồi trong chƣơng trình chồi, iii) 15 – 20 rễ trong chƣơng trình rễ.

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

Các tính chất mong muốn khác có đƣợc trong phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế
bào là sự đồng nhất về sinh lý, di truyền và có thể ứng dụng phƣơng pháp này cho mọi
thực vật. Tuy nhiên, điều kiện môi trƣờng lý tƣởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu TCL
phụ thuộc vào loài và đòi hỏi chúng ta phải thử nghiệm lại tất cả các điều kiện nuôi cấy in
vitro bao gồm PGRs, chất dinh dƣỡng, ánh sáng, sự thẫm thấu nhiệt độ (Trần Thanh Vân,
1980).
1.3.3. Ƣu điểm của phƣơng pháp
 Diện tích tiếp xúc của mẫu với môi trƣờng lớn nên mẫu dễ dàng hấp thu các chất
dinh dƣỡng từ môi trƣờng.
 Dễ định vị vùng cho phản ứng do chỉ có một lớp mỏng tế bào.
 Lƣợng hormone nội sinh trong mẫu thấp vì thế các chất điều hòa sinh trƣởng thực
vật dễ tác động lên mẫu.
 Mẫu nuôi cấy đồng nhất và nhanh chóng trả lời các cảm ứng.
 Tần số phát sinh cơ quan, việc hình thành phôi thấp.
 Tạo ra thực vật hoàn chỉnh, ít bị biến đổi.
 Không xảy ra sự tƣơng tác giữa các cơ quan và giữa cơ quan với toàn bộ cơ thể
thực vật.
 Nhanh chóng đạt kết quả trong thời gian ngắn.
1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN IN
VITRO CỦA THỰC VẬT
1.4.1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy đến khả năng phát sinh hình thái của cây
Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sự sinh
trƣởng và phát triển in vitro. Những ảnh hƣởng có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sau:

Hoàng Trần Minh Thu

Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

 Kiểu gen
Khả năng tái sinh trong giới thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá mầm thông
thƣờng có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm, cây hạt trần rất khó tái sinh (trừ
khi chúng còn non). Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae, Begoniaceae,
Crassulaceae, Gesneriaceae, Crucferae là những loài dễ tái sinh nhất. Nếu một loài dễ tái
sinh cơ quan trong môi trƣờng tự nhiên (các giống lai Saintpaulia ionantha, Begonia rex,
Streptocarpus) thì hầu nhƣ dễ tái sinh in vitro. Cũng có những trƣờng hợp ngoại lệ nhƣ
những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu nhƣ không có khả năng hình thành
chồi bất định in vivo nhƣng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự
hấp thu các chất điều hòa sinh trƣởng.
 Tuổi của cây
Các mô phôi thƣờng có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc ngƣời ta thƣờng dùng
phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô. Khi cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng
giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn nhƣ trong trƣờng hợp cây bụi. Một
vài ví dụ cụ thể chỉ sự khác nhau về khả năng tái sinh và phân chia tế bào giữa cây già và
cây non in vitro: Hedera helix (Stoutemeyer và Britt, 1965), Lunaria annua (Pierik, 1967)
và Anthurium andreanum (Pierik và cộng sự, 1974). Khi mô phân sinh và chồi đỉnh đƣợc
tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro
tùy vào điều kiện ban đầu. Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già từng bƣớc
đƣợc trẻ hóa do gia tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào. Điều này đƣợc Hackett
(1985) chứng minh trên những đối tƣợng nhƣ Pinus vinifera, Malus sylvestris,
Cryptomeria japonica. Sự hình thành chồi bất định là một trong những phƣơng pháp giúp
trẻ hóa.
 Tuổi của mô và cơ quan
Những mô còn non và mềm thƣờng dễ nuôi cấy hơn những mô cứng nhƣng cũng có
nhiều trƣờng hợp ngoại lệ. Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt hơn những mẫu

cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

bào giảm. Chúng ta cần lƣu ý rằng khả năng tái sinh của những loài khác nhau tăng lên
trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví
dụ nhƣ Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik, 1967), Primula obconica
(Coumans và cộng sự, 1979).
 Tình trạng sinh lý
Tình trạng sinh lý ảnh hƣởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in
vitro. Thông thƣờng các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dƣỡng dễ tái sinh hơn trong
giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dƣỡng tái sinh tốt
hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957). Các chồi của cây trong giai đoạn
ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây không còn
ngủ (vào mùa xuân trƣớc khi chúng bắt đầu phát triển).
 Tình trạng sức khỏe
Vào thời điểm tiến hành nuôi cấy in vitro, nếu sử dụng các bộ phận của các cây
trong tình trạng khỏe mạnh thì khả năng nuôi cấy thành công hơn. Do đó, chúng ta nên
chọn mẫu từ những cây khỏe mạnh nhất làm thí nghiệm vì điều này ảnh hƣởng đến phần
trăm nhiễm và khả năng tái sinh của mẫu sau khi đƣợc tách khỏi cây mẹ.
 Điều kiện phát triển
Các mẫu cấy từ nguồn mẫu trong tự nhiên phản ứng khác với các mẫu cấy từ nguồn
mẫu trong nhà kính. Nhìn chung, những vật liệu từ nhà kính (thon dài và vàng hơn) tái
sinh dễ hơn vật liệu bên ngoài, ví dụ nhƣ cây Rhododendron (Pierik và Steegmans, 1975).
Điều kiện phát triển của những cây nở hoa vào mùa đông nhƣ Begonia có ảnh hƣởng
mạnh đến sự hình thành chồi và rễ bất định trong nuôi cấy in vitro.
 Vị trí của mẫu cấy trên cây

Topophysis là hiện tƣợng mà vị trí của mẫu cấy trên cây có ảnh hƣởng đến sự sinh
trƣởng phát triển in vitro sau khi tách mẫu. Ever (1984) đã khảo sát hiện tƣợng topophysis
ở cây Pseudotsuga menziesii, ông nhận thấy những chồi ban đầu đƣợc tách từ những vị trí
thấp trên cây phát triển trong môi trƣờng in vitro tốt hơn và chồi gốc tăng trƣởng nhanh
Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

hơn chồi nách. Sự hình thành hành bất định của các mẫu cấy lan dạ hƣơng đƣợc tách ra từ
phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng xảy ra tƣơng tự đối với lily
(Robb, 1957). Điều đáng lƣu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc
từ các phần khác nhau của cây nhƣ rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau.
 Kích thước mẫu cấy
Các cấu trúc nhỏ nhƣ tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng
trƣởng hơn những cấu trúc lớn nhƣ thân, lá, củ. Các phần đƣợc tách rời khỏi cây tự nó dự
trữ chất dinh dƣỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích thƣớc càng lớn càng dễ tái sinh
và phát triển. Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh dƣỡng dự trữ nhƣ củ, thân
hành thƣờng dễ tái sinh trên môi trƣờng in vitro hơn những cơ quan ít dự trữ. Đối với
những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bị tổn thƣơng cũng ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh.
Ảnh hƣởng của vết thƣơng lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành Lily đã đƣợc
Aartrijk chứng minh vào năm 1984.
 Vết thương
Sự tổn thƣơng trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh mẫu
cấy. Bề mặt tổn thƣơng tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dƣỡng và các chất điều
hòa sinh trƣởng đồng thời ethylen đƣợc tạo ra nhiều hơn. Ngoài ra, chúng ta có thể tăng
cƣờng sự hình thành rễ bất định bằng vết thƣơng.
 Phương pháp cấy
Các mẫu cấy có thể đƣợc đặt trên môi trƣờng theo nhiều cách khác nhau: có cực
(thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trƣờng) hoặc không cực (cắm phần ngọn xuống

môi trƣờng). Chồi và rễ thƣờng tái sinh dễ và nhanh khi mẫu đƣợc cấy không cực (Pierik
và Steegmans, 1975). Mẫu tái sinh tốt khi đƣợc cung cấp đầy đủ oxy nhƣng những nhân
tố khác cũng đóng vai trò quan trọng. Phần gốc của mẫu cấy không cực có các chất dự trữ
không có khả năng khuếch tán vào trong agar do nó không tiếp xúc với môi trƣờng. Nhƣ
ở trƣờng hợp tất cả cây thuộc họ Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1985), sự tái sinh chỉ

Hoàng Trần Minh Thu


Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09

xảy ra ở phần gốc của vảy hành, do đó, phƣơng pháp cấy không cực dẫn đến sự hình
thành thân hành bất định tốt hơn phƣơng pháp cấy có cực.
 Công tác chuẩn bị
Điều kiện sinh lý của vật liệu ban đầu có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của mẫu cấy
in vitro. Chúng ta có thể thay đổi tình trạng sinh lý của vật liệu ban đầu bằng các biện
pháp sau:
o Phun chất điều hòa sinh trƣởng lên cây mẹ.
o Tiêm chất điều hòa sinh trƣởng vào vật liệu.
o Đặt mẫu cấy ban đầu trong những dung dịch dinh dƣỡng có chất điều hòa sinh
trƣởng (BA, GA3).
 Ảnh hưởng của nguồn carbon dioxid và ánh sáng
Ở những vùng lạnh, những thay đổi trong quá trình sinh trƣởng của mẫu cấy xảy ra
suốt mùa đông có thể giải thích dựa trên những thay đổi bức xạ. Khi giảm 1% ánh sáng sẽ
làm giảm 1% năng suất trong nhà kính nhƣng mối tƣơng quan này không đóng vai trò
trong trƣờng hợp với những cây non (Bruggink, 1987). Những điều kiện ánh sáng trong
nhân giống những cây cấy ghép có thể đem lại nhiều lợi ích không chỉ trong giai đoạn
vƣờm ƣơm mà còn sau khi trồng bên ngoài.
 Ảnh hưởng của nhân tố khoáng
Chất khoáng là một trong những nhóm chất dinh dƣỡng quan trọng cho sự phát triển

in vitro. Có nhiều cách kết hợp muối đa lƣợng và vi lƣợng. Chaussat và cộng sự (1986) đã
phát triển chƣơng trình máy tính để tính toán hàm lƣợng muối cần thiết để tạo thành một
dung dịch dinh dƣỡng với đầy đủ những đặc tính mà chúng ta biết đến (thành phần ion,
nồng độ ion, pH). Ngƣợc lại, từ thành phần dung dịch dinh dƣỡng, chƣơng trình sẽ cho
biết tính chất của dung dịch đó. Thông thƣờng các dung dịch stock đậm đặc đƣợc sử dụng
để chuẩn bị môi trƣờng dinh dƣỡng.

Hoàng Trần Minh Thu