Phát hiện đột biến gen gây bệnh Alpha Thalassemia

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC

PHÁT HIỆN ðỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH ALPHA THALASSEMIA
Bùi Thị Minh Phượng, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn,
Trần Thị Thúy Hằng, Trần Vân Khánh
Trường ðại học Y Hà Nội
Alpha thalassemia (α thalassemia) là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường gây nên do giảm hoặc
mất hoàn toàn sự tổng hợp chuỗi α glob in. Cho ñến nay, hơn 35 loại ñột biến ñược phát hiện trên gen α
globin gây bệnh α thalassemia. Nghiên cứu ñược thực hiện nhằm xác ñịnh một số ñột biến phổ b iến trên gen
α globin ở bệnh nhân α thalassemia b ằng kỹ thuật Multiplex ARMS - PCR. 33 b ệnh nhân ñược chẩn ñoán
xác ñịnh là α thalassemia ñược lựa chọn vào nghiên cứu ñể xác ñịnh ñột b iến. Kết quả cho thấy 27/33
trường hợp mang ñột b iến chiếm 82,82% với 3 loại ñột b iến phổ biến trên gen α globin. ðột b iến SEA 54,7%,
α4.2 (28,6%), α3.7 (16,7%), chưa phát hiện ñược ñột biến THAI, FIL..
Từ khóa: Alpha thalassemia, Multiplex PCR

I. ðẶT VẤN ðỀ
Alpha thalassemia (α thalassemia) là bệnh
di truyền lặn nhiễm sắc thể t hường do ñột
biến gen α globin, gây giảm hoặc mất hoàn
toàn sự tổng hợp chuỗi globin α. ðây là một
trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất,
phân bố trên toàn thế giới cũng như ở Việt
Nam và khu vực châu Á [1]. Theo thống kê: tỷ
lệ người mang gen ñột biến mất ñoạn lớn
dạng SEA (ðông Nam Á) là cao nhất (tỷ lệ
90% - 95%), Bắc Thái Lan (14%), Nam Trung
Quốc (5,0 - 8.8%), Hồng K ông (4,5%), Trung
tâm Thái Lan (3,7%) và dạng Bắc ðài Loan
(3,5%) [1; 2]. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu
ñã công bố có 3 ñột biến gây ra bệnh α thalassemia gồm SEA, α4.2, α3.7, chưa phát hiện
ñột biến THA I, FIL [3; 4]. Alpha thalassemia là

bệnh thiếu máu tan máu nặng và chư a có

sống phụ thuộc vào việc truyền máu và t hải
sắt suốt ñời, người bệnh có chất lượng cuộc
sống thấp ñồng thời là gánh nặng cho gia ñình
và xã hội [3; 4]. Xác ñịnh ñột biến gen trên
bệnh nhân ñể tiến tới phát hiện người lành
mang gen bệnh và chẩn ñoán trước sinh
nhằm có nhữ ng tư vấn di t ruyền t hích hợp
ñóng vai trò quan trọng giúp ngăn ngừa và
làm giảm tỷ lệ mắc bệnh. Phương pháp multiplex ARMS - P CR ñã ñược sử dụng rộng rãi
ñể phát hiện ñột biến gen gây bệnh α thalassemia do ñộ chính xác cao, giá thành rẻ và ít
phức tạp [5]. Xuất phát từ thực tiễn trên,
nghiên cứu ñược tiến hành với mục tiêu: Xác
ñịnh một số ñột biến phổ biến trên gen α globin ở bệnh nhân α thalassemia bằng kỹ thuật
multiplex ARMS - PCR.

II. ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

phương pháp ñiều trị triệt ñể. Alpha thalassemia thể nặng và trung bình thường biểu
hiện thiếu máu từ trung bình ñến nặng, cuộc

1. ðối tượng
33 bệnh nhân ñược chẩn ñoán mắc bệnh α
thalassemia tại Khoa Huyết học, Truyền máu,
Bệnh viện B ạch Mai và Bệnh viện Huyết học,

ðịa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu
Gen - Protein, Trường ðại học Y Hà Nội
Email:

Ngày nhận: 22/7/2015
Ngày ñược chấp thuận: 9/9/2015

8

Truyền máu Trung ương dựa vào triệu chứng
lâm sàng và cận lâm sàng ñiển hình. Nghiên
cứu có sử dung DNA của người bình thườ ng
ñể làm mẫu ñối chứng.
TCNCYH 96 (4) - 2015


2015

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
2. Phương pháp

diện của các alen ñột biến ñược biểu hiện
bằng sản phẩm DNA khuyếch ñại với các kích

2.1. K& thu*t tách chi.t DNA

thước khác nhau ñã biết trước (biểu ñồ 1) [5].

+ DNA ñược tách chiết từ máu ngoại vi của
bệnh nhân α thalassemia sử dụng Kit tách
chiết của hãng QIAGEN (ðức).
+ Kiểm tra nồng ñộ và ñộ tinh sạch của
DNA ñược tách chiết bằng phương pháp ño
quang trên máy NanoDrop: nồng ñộ DNA 300380ng/ml, ñánh giá ñộ tinh sạch bằng tỷ lệ

A260nm /A280nm = 1.8.
2.2. K& thu*t multiplex ARMS - PCR

2.2.1. Thiết k ế mồi
Mồi ñược thiết kế nhằm phát hiện 5 ñột
biến t hường gặp tại Việt Nam với các mồi ñặc
hiệu bổ sung với ñột biến. Các ñột biến là:
α3.7, α4.2 , SEA, FIL & THAI.
- Mồi LIS: Khuy ếch ñại một ñoạn gen tổng
hợp protein lis 1. ðây là protein có trong mọi
tế bào, không phụ thuộc vào thể loại, trạng
thái hoạt ñộng hay nguồn gốc nên nó c hỉ là

Kỹ thuật multiplex A RMS - P CR ñược

gen nội chuẩn, dùng ñể kiểm tra chất lượng

dùng ñể sàng lọc sự hiện diện của nhiều ñột

thao tác thực hiện và qui trình, kích t hước

biến trong cùng một phản ứng. Mỗi phản ứng

2.3kb.
- Mồi α2: Xác ñịnh thể của ñột biến xuất

sẽ dùng mồi ñặc hiệu có trình tự ñầu 3 bổ
sung với alen ñột biến và một mồi chung

hiện trên bản ñồ ñiện di chỉ khi ñột biến có

ngược chiều với mồi ñặc hiệu alen. Sự hiện

kiểu gen dị hợp tử, kích thước khoảng 1.8kb.

Sơ ñồ 1. Tổ hợp gen α globin và vị trí các mồi xác ñịnh ñột biến
A, Vị trí các mồi xác ñịnh ñột biến; B, chiều dài tương ứng của các ñột biến mất ñoạn lớ n
(α3. 7, α 4.2 , SEA, FIL & THA I). Cặp mồi ñể xác ñịnh ñột biến phải dài hơn ñoạn gen bị ñột biến
và nằm ngoài vị trí ñoạn gen ñột biến (ví dụ cặp mồi THA I-F và THAI-R dùng ñể xác ñịnh ñột biến
THAI hoặc FIL - F và FIL - R dùng ñể xác ñịnh ñột biến FIL...).
2.2.2. Kỹ thuật multiplex A RMS - PCR

trong 15 phút 40 giây, bám mồi 65o trong 90

Thành phần phản ứng gồm: nước cất 3µl,

giây, kéo dài 72o C trong 2 phút 30 giây,cuối

master Mix Quiagen Taq 6µl, DNA 2µl, DMSO

cùng là kéo dài 72oC trong 5 phút. Sau khi

1µl, primer LIS 1µl, primer α2/α3.7 1µl, primer

nhân DNA ñích, ñiện di sản phẩm DNA trên

α2 1µl, primer α4.2 1µl, primer SE R 1µl,

agarose gel 2% và phân tích kết quả.

primer THA I 1µl, primer FIL 1µl. Thực hiện 35

3. ðạo ñức trong nghiên cứu

o

chu kỳ gồm các giai ñoạn duỗi xoắn ở 95 C

TCNCYH 96 (4) - 2015

Các ñối tượng tham gia hoàn toàn tự nguyện
9


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi không ñồng ý tham gia nghiên cứu. Các thông tin liên quan
ñến bệnh nhân ñược ñảm bảo bí mật.

III. KẾT QUẢ
Trong số 33 bệnh nhân, ñã phát hiện ñược 27/33 (82,82%) bệnh nhân có ñột biến mất ñoạn
trên gen α globin gây bệnh α thalassemia.
Bảng 1. Các loại ñột biến và kiểu gen phát hiện trên gen α globin
Dạng ñột biến
SEA
Dị hợp tử ñơn
(n = 9)

ðồng hợp tử
(n = 4)

Kiểu gen

Số lượng

α SEAα//α SEAα

7

α 4.2

4.2

2

3.7

3.7

α α//α α

α 3.7

α α//α α

0

SEA

α SEAα SEA//αα

3

α 4.2

α 4.2α 4.2//αα

1

3.7 3.7

α 3.7
Dị hợp tử kép
(n = 14)

4.2

α α //αα
SEA SEA

α

4.2

SEA/α 4.2

α

//α α

7

SEA/α 3.7

α SEAα SEA//α 3.7α

5

α 4.2/α 3.7

α 3.7α//α4.2α

2

Bệnh nhân có ñột biến
Tổng

0

27

Bệnh nhân không phát hiện thấy ñột biến

6
33

Các ñột biến t hườ ng gặp t rên gen α globin ở nhóm nghiên cứ u là ñột biến SEA, α4.2, α3.7.
Bệnh nhân có thể có ñột biến dị hợp tử ñơn, ñồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép kết hợp.

Biểu ñồ 1. Tỷ lệ các thể bệnh α Thalassemia
10

TCNCYH 96 (4) - 2015


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
Trong số 27 trường hợp phát hiện ñược ñột biến có 4 trường hợ p (15%) bệnh nhân có ñột
biến ñồng hợp tử, 9 trường hợ p (33% ) ñột biến dị hợp tử và 14 (52%) dị hợp tử kết hợp. Tất cả
14 trường hợ p dị hợp tử kép gây thể HbH.

Biểu ñồ 2. Tỷ lệ các ñột biến bệnh nhân α Thalassemia
Trong số 3 loại ñột biến phát hiện ñược có 23 trường hợp ñột biến SEA chiếm 54,7%; 12
trường hợp mắc ñột biến α4.2 chiếm 28,6%; 7 trường hợp ñột biến α3.7 chiếm 16,7%.

IV. BÀN LUẬN

có sự khác biệt so với nghiên cứu của Lý Thị

dụng ñể phát hiện 5 loại ñột biến phổ biến gây

Thanh Hà (5,9%), nghiên cứu ở Malaysia

bệnh α thalassemia. Nhóm nghiên cứu ñã sử

(0,25% ) và nghiên cứu ở Chines (1,36%) [7;

dụng kỹ thuật Multiplex ARMS - P CR và ñã
phát hiện ñược 27/33 trường hợp bệnh nhân

9; 10]. ðột biến α 3.7 chiếm tỷ lệ 16,7% cũng
tương ñối cao hơn s o với nghiên cứu của Lý

có ñột biến chiếm 82,82%.

Thị Thanh Hà (không phát hiện ñược), nghiên

Mẫu nghiên cứu của chúng tôi ñều là thể
HbH (dị hợ p tử kép), t hể dị hợp tử ñơn, và

cứu ở Malaysia (8% ) và nghiên cứu ở Chines
(2,7%) [3; 11].

ñồng hợp tử vì tất cả các bệnh nhân ñều trong

Chưa t ìm thấy ñột biến THAI, FIL nào trong

tình trạng thiếu máu nặng, thiếu máu vừa các

các bệnh nhân nghiên cứu. Kết quả này

chỉ số xét nghiệm ñều giảm, kết quả ñiện di

tương ñương với kết quả c ủa Lý Thị Thanh

huyết sắc tố HbA1 < 97%, HbA2 < 3%, có HbH

Hà. ðiều này chứng tỏ ñột biến Thai và ñột

ở các thể HbH ñã ñược phát hiện gen ñột biến

biến FIL chưa phát hiện thấy ở Việt Nam. Hai

tương ứng với ñặc ñiểm của bệnh [2; 6].

loại ñột biến này thường có ở tộc người Thái

ðột biến SEA chiếm tỷ lệ cao nhất 54,7%

2015

ðột biến α 4.2 chiếm tỷ lệ cao thứ 2: 28,6%

Kỹ thuật Multiplex ARMS - PCR ñược sử

Lan và Philipphin [12; 13].

cũng tương ứng nghiên cứu của Lý Thị Thanh

Ngoài các loại ñột biến t rên nghiên cứu

Hà và cộng sự là 58,8%. Tuy nhiên, kết quả

của Lý Thị Thanh Hà còn phát hiện ñược

này có sự khác biệt với nghiên cứu ở

thêm 2 loại ñột biến ñiểm là HbQs và HbCs

Malaysia (0, 5%) và ở Chines (1,36%). ðiều
này cho thấy ở Việt Nam ñột biến SEA chiếm

[3]. Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi c hưa
tìm ñược 2 loại ñột biến này. Vì thời gian

chủ yếu [3; 7; 8].

nghiên cứu chưa ñủ nên chúng tôi sẽ tiếp tục

TCNCYH 96 (4) - 2015

11


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
nghiên cứu ñể t ìm thêm c ác loại ñột biến
khác. Do ñặc ñiểm phân bố các gen α globin
trên nhiễm sắc thể, nên sự biểu hiện các thể
bệnh ña dạng hơn β Thalassemia. Có 4 t hể
α 1, α 2, thể HbH, thể Bart’s. Trong ñó thể α
ñồng hợ p tử chiếm 15%, dị hợp tử ñơn chiếm
33%, dị hợp tử kép (HbH) chiếm 52%. Theo
Schneider và cs thì ở người Mỹ da ñen tỷ lệ
mang gen α Thalaasemia là từ 2 ñến 7%,
nhưng hầu hết rất ít gặp bệnh HbH [7; 14; 15].
Việc xuất hiện bệnh HbH không những chỉ
phụ

thuộc

vào

người

mang

gen

α

Thalassemia (ñể những người này có k hả
năng kết hôn với nhau) mà còn phụ thuộc vào
kiểu gen α 1 cis hay α 1 trans có mặt trong quần
thể [16].

V. KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Công Khanh (2008). Bệnh
hemoglobin. Huyết học lâm s àng nhi k hoa Nhà xuất bản Y học, 127 - 146.
2. Nguyễn Công Khanh (1993). Tần suất
bệnh hemoglobin ở Việt Nam. Y học Việt
Nam, 174 (8), 11 - 16.
3. Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc,
Nguyễn Thị Phương Mai và cộng sự (2010).
Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong
chẩn ñoán trước và sau sinh bệnh alpha
Thalassemia tại bệnh viên Nhi Trung ương.
Tạp chí Nhi k hoa, 3(3), 337 - 342.
4. Bạch Quốc Tuyên., ðặng ðức Quý,
Nguyễn ðình Lượng (1974). Một số trường
hợp huyết sắc tố bình thường phát hiện ở

bệnh viện Bạch Mai. Công trình nghiên c ứu
huyết học và truyền máu 1963 - 1974, Nhà

Nghiên cứu ñã phát hiện ñược 27/33
trường hợp mang gen ñột biến với 3 loại ñột

xuất bản Y học, Hà Nội.

biến trong ñó:

jindadamrongwech, Suporn Chuncharunee

ðột biến SEA 23/42 c hiếm tỷ lệ cao nhất là
54,7%. ðột biến α4.2 chiếm tỷ lệ 28,6% và

et al (2012). Multiplex A RMS - PCR A nalysis

16,7% ñột biến α3.7.

nal of Hematology and Tranfusion Medicine,

Trong số 27 bệnh nhân phát hiện mang ñột
biến trên gen α-globin phát hiện ñược 15%

5.

Anchalee

Thedsawad,

Sumalee

for Nineteen β - Thalassemia Mutation. Jour22 (1), 1 - 38.
6. Chui DH, Waye JS (1998). Hydrops

ñồng hợp tử; 33% mang dị hợp tử ñơn và

fetalis

52% dị hợp tử kép.

emerging health care problem. Blood, 91,

Lời cảm ơn

caused

by

alpha-thalassemia:

an

2213 - 2222.
7. H.M. Aderson. H.M. Ranney (1990).

Huyết học, Truyền máu, B ệnh viện Bạch Mai

Southeast Asian Iminmgarant: The new thalassemia in American, S eminars in Hemat ol-

và B ệnh viện Huyết học, Truyền máu Trung

ogy, 27, 239 - 246.

Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Khoa

ương ñã giúp ñỡ trong quá trình thực hiện

8. Flatz G (1965). Hemoglobinophathiess

nghiên cứu. ðề tài ñược thực hiện với sự hỗ

in Thai Lhann. Br. J. Haematol, 11, 216 - 217.

trợ kinh phí của ñề tài nhánh cấp nhà nước
“Nghiên cứu một số chỉ số sinh học, trình tự

9. David J. R (1977). The moleculer
mechanism of α thalassemia in the black.

gen ty thể người Việt Nam trưở ng thành và

Blood, 50, 105.

ñột biến gen gây bệnh thalassemia” thuộc ñề

10. Die sseroth A (1976). Hemoglobin syn-

tài nhiệm vụ Quỹ gen “ðánh giá ñặc ñiểm di

thesis in somatic cell hy brid: independent seg-

truyền người Việt Nam”.
12

TCNCYH 96 (4) - 2015


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
regation of the human alpha and bet a globin

lassemia ở Hà Nội. Luận văn Tiến sỹ k hoa

gene. Science, 191, 1262.

học, Trường ñại học Y Hà Nội, 36 - 42.

11. Embury S.H (1979). Organization of

14. Hurst d (1991). Anaemia and hemoglo-

the α globin gen in the chines α thalassemia

bin parties in Southeast Asian refugee c hil-

syndromes. J.Clin.Invest, 63.
12. Chui DH, Waye JS (1998). Hydrops

dren. The J.of Paediatrics, 102 (5), 692.

fetalis

caused

by

alpha-thalassemia,

an

emerging health care problem. Blood, 91,
2213 - 2222.

15. David J. R (1977). The moleculer
mechanism of α thalassemia in the black.
Blood, 50, 105.

13. Dương Bá Trực (1996). ðặc ñiểm lâm

16. Told D.Lai MCS, Braga C.A, Soo N.H

sàng và huy ết học bệnh HbH ở trẻ em Việt

(1969). Alpha thalassemia in Chinese cord

Nam, Bước ñầu tìm hiểu tần suất alpha tha-

blood studies. Br J.Haemat ol, 16, 551 - 556.

Summary

MOLECULAR DIAGNOSIS OF ALPHA-THALASSEMIA BY
MULTIPLEX ARMS-PCR
Alpha-thalassemia (α -thalassemia) is an autosomal recessive blood disorder that is characterized by an absence or a reduction in α-globin chain synthesis. More than 35 different mutations
located within the α-globin gene are currently recognized throughout t he world as causes for
α-thalassemia. The purpose of this study is to detect common mutations in α-globin using
Multiplex ARMS - P CR. 33 unrelat ed patients with α-thalassemia were selected for this study. The
results showed that 27 out of 33 patients having mutation, it accounted for 82.82% with 3 common
mutations in α-globin gene. The most frequent mutations are SEA 54.7%, α4.2 (28.6%), α3.7
(16.7% ).
Keywords: Alpha thalassemia, Multiplex PCR

2015

TCNCYH 96 (4) - 2015

13