Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự nhiên (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae)

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO CHIẾT
THẠCH HỘC NUÔI CẤY MÔ VÀ THẠCH HỘC TỰ NHIÊN
(DENDROBIUM NOBILE LINDL. ORCHIDACEAE)
*

Lâm Cẩm Tiên , Trần Công Luận**

TÓM TẮT
Tình hình chung và mục tiêu nghiên cứu: Hiện nay Thạch hộc là dượcliệu quý hiếm, được đưa vào sách
đỏ, cần được bảo tồn. Nên xu hướng mới là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với
lượng lớn và chất lượng cao. Bước đầu làm rõ tính an toàn vàthành phần hoạt chất có trong Thạch hộc nuôi cấy
mô và Thạch hộc trồng tự nhiên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu độc tính cấp và khảo sát sơ bộ thành phần hóa
học của cao chiết Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộctự nhiên (Kim thoa Thạch hộc) (Dendrobium nobile Lindl.
Orchidaceae).
Phương pháp nghiên cứu: Thử nghiệm độc tính cấp đường uống để xác định LD50 theo phương pháp
Karber-Behrens. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của dược liệu và cao chiết cồn 60% Thạch hộc bằng các phản
ứng hóa học đặc trưng và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. Tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu được kiểm nghiệm theo
DĐVN IV.
Kết quả: Xác định được Dmax cao Thạch hộc nuôi cấy là 25 g cao/kg (tương đương 126,45 g dược liệu khô)
và cao Thạch hộc tự nhiên là 28,6 g cao/kg (tương đương 348,78 g dược liệu khô). Sơ bộ thành phần hóa thực vật
của 2 mẫu dược liệu đều có tinh dầu, triterpenoid, acid hữu cơ, polyuronid, alkaloid và saponin. Định lượng cao
Thạch hộc nuôi cấy mô có hàm lượng alkaloid là 3,22% và saponin 15,61%. Cao Thạch hộc tự nhiên có hàm
lượng alkaloid là 2,6% và saponin 11,71%.
Kết luận: Liều lượng Thạch hộc sử dụng mỗi ngày là khoảng 6 - 12g dược liệu khô, dùng Thạch hộc nuôi cấy
và Thạch hộc tự nhiên với liều gấp 10,5 lần và 29 lần liều thường sử dụng hàng ngày vẫn cho thấy khoảng cách
an toàn rộng. Sơ bộ thành phần hóa học của dược liệu và cao chiết của Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự
nhiên giống nhau. Định lượng cao Thạch hộc nuôi cấy mô có hàm lượng alkaloid cao gấp 1,2 lần và hàm lượng

saponin cao gấp1,3 lần cao Thạch hộc tự nhiên.
Từ khóa: Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae, Thạch hộc tự nhiên, Thạch hộc nuôi cấy mô, sắc ký lớp
mỏng, sơ bộ thành phần hóa học.

ABSTRACT
PRINCIPAL SURVEY CHEMICAL COMPONENTS OF EXTRACTIONS OF TISSUE CULTURE
DENDROBIUM AND WILD DENDROBIUM (DENDROBIUM NOBILE LINDL. ORCHIDACEAE)
Lam Cam Tien, Tran Cong Luan
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 70 –77
Background and Objectives: Wild dendrobium (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae) is a rare plant
that has been proven to have potent antioxidant efficacy in the experiment and the current trend is to apply plant
biotechnology to produce medicinal sources with a large and high quality. In order to clarify the safety and survey
the active ingredients of tissue culture dendrobium andwild dendrobium, we conducted a study on acute toxicity
and principal investigations of the chemical compositions of tissue culture dendrobium and wild dendrobium.
Methods: In vivo acute toxicity test is conducted using Karber-Behrens method to determine


**
Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y dược TP. HCM
Đại học Công nghệ Miền Đông
Tác giả liên lạc: ThS. BS. Lâm Cẩm Tiên
ĐT: 01699940841
Email:

70


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018

Nghiên cứu Y học

LD50.Preliminary analysis of chemical compositions and 60% alcohol extraction of dendrobium by specific
chemical reactions and thin layer chromatography. Quality standards of materials are tested according to
Vietnamese Pharmacopoeia IV.
Results: The Dmax of alcohol extraction of tissue culture dendrobium was determined to be 25 g/kg
(equivalent to 126.45 g dried herb) and Dmax of extraction of wild dendrobium was 28.6 g/kg (equivalent to 348.78
g dried herb). The phytochemical compositions of two herbs are essential oils, triterpenoids, organic acids,
polyuronids, alkaloids and saponins. Quantitative analysis of extraction of tissue culture dendrobium contains
3.22% alkaloid and 15.61% saponin; extraction of wild dendrobium contains 2.6% alkaloid and 11.71% saponin.
Conclusions: The amount of dendrobium used per day is about 6 - 12 g driedherb, when the tissue culture
dendrobium and wild dendrobium usedwith dosesat 10.5 times and 29 times higher than daily dose, it still
showswide safe range. Preliminary chemical compositions of herbs and extracts of dendrobium are similar.
Thealkaloid level and saponin level of extraction of tissue culture dendrobium is 1.2 times higher and 1.3 times
higher than wild dendrobium.
Keywords: Dendrobium nobile Lindl.Orchidaceae, wild dendrobium, tissue culture dendrobium, thin layer
chromatography, chemical compositions.
thạch hộc tự nhiên (Dendrobium nobile Lindl.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Orchidaceae)”.
Đã từ rất lâu, Thạch hộc (Dendrobium nobile
ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCÚU
Lindl. Orchidaceae) là một trong những dược
liệu quý, đã được Trung Quốc sử dụng như
Đối tượng nghiên cứu
thuốc giảm đau, hạ sốt, kích thích dạ dày, để cải
Thạch hộc nuôi cấy môđược công ty cổ phần
thiện cảm giác ngon miệng, kích thích tiết nước
khoa học công nghệ Anh Đào, số 1031, Nguyễn
bọt, điều trị các bệnh khác nhau, như viêm dạ
Hữu Thọ, ấp 2, xã Long Thới, huyện Nhà bè, TP.

dày, đái tháo đường, lão hóa da, và bệnh tim
HCM cung cấp. Mẫu được cấy từ thân Thạch
mạch, mà phần lớn các bệnh này được cho là liên
hộc, nuôi trong ống nghiệm trong 5 tháng với
quan chặt chẽ với sự rối loạn trao đổi chất làm
môi trường sử dụng là MS (Mac Conkey phóng thích ra các gốc tự, Thạch hộc có tác dụng
Sabouraud) bổ sung 30 g/l đường, 8 g/l agar, 50
chống lại sự rối loạn trong việc tạo ra gốc tự do(3).
g/l khoai tây, 200 ml/l nước dừa, 1 g/l than hoạt
Một số nghiên cứu nước ngoài đã chứng
minh Thạch hộc có tác dụng kháng viêm, chống
tế bào ung thư, chống đột biến gen điều hòa
miễn dịch,…gần đây còn cho thấy tác dụng
chống oxy hóa trên in vitro(5).

tính, mẫu được nuôi cấy trong điều kiện pH 5,75,8, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường
độ 2000 - 3000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, và độ ẩm
trung bình 50 - 60%. Mẫu được sấy khô ở nhiệt
độ 45 - 50oC và được bảo quản trong hộp kín.

Hiện nay Thạch hộc là thực vật quý hiếm,
được đưa vào sách đỏ, cần được bảo tồn, nên xu
hướng mới là áp dụng công nghệ sinh học thực
vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn và chất
lượng cao(7).

Thạch hộc tự nhiên được vườn lan tại xã
Qui Đức, huyện Bình Chánh, TP. HCM cung
cấp. Mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 45 - 50oC và
được định danh tại Trung Tâm Sâm và Dược

Liệu TP. HCM.

Để góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa
học và tính an toàn của Thạch hộc nuôi cấy mô.
Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên
cứu độc tính cấp và khảo sát sơ bộ thành phần
hóa học của cao chiết thạch hộc nuôi cấy mô và

Phương tiện
Hóa chất: thuốc thử Bouchardat,Mayer,
Dragendorff; hệ dung môi khai triển: Toluen ethyl acetate - acid formic (2:7:1), Chloroform methanol (9:1), Chloroform - methanol -

71


Nghiên cứu Y học
ammoniac (40:5:1).
Thiết bị: Tủ sấy Memmert (Germany), cân kĩ
thuật Mettler Toledo AB204, máy cô giảm áp
Buchi waterbath B-480, đèn soi UV Desaga.
Động vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, khỏe
mạnh, đồng đều về giới, 6-8 tuần tuổi, trọng
lượng 20 ± 2g, cung cấp bởi Viện Pasteur TP. Hồ
Chí Minh. Trong suốt quá trình thử nghiệm
chuột được nuôi với thức ăn viên và điều kiện
môi trường ổn định.

Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập.

Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp(4)
Thử nghiệm thực hiện qua 2 giai đoạn:

Giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều 2 chuột)
Khởi đầu từ liều cao nhất có thể bơm được
qua kim đầu tù cho uống. Xác định liều LD0 (liều
tối đa không gây chết) và liều LD100 (liều tối thiểu
gây chết 100%).
Giai đoạn xác định (mỗi lô dò liều 6 chuột)
Chuột được chia lô và cho sử dụng thuốc ở
các liều trong khoảng LD0 và LD100 chia theo cấp
số nhân. Theo dõi các biểu hiện về hành vi và
vận động của chuột trong vòng 72 giờ sau khi
dùng thuốc. Ghi nhận số chuột chết trong từng
lô. Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp
Karber-Behrens.
Phương pháp nghiên cứu hóa học
Thử tinh khiết dược liệu theo DĐVN IV. Xác
định độ ẩm, độ tro, định lượng các chất chiết
trong dược liệu(2).
Định tính sơ bộ bằng phản ứng hóa học:
Dựa vào giáo trình thực tập Dược liệu của bộ
môn Dược liệu Đại học Y Dược Thành phố Hồ
Chí Minh(1).
Chiết xuất cao, xác định độ ẩm, độ tro,
định tính bằng phương pháp hóa học và sắc
ký lớp mỏng, định lượng bằng phương pháp
cân 2 cao chiết:
Chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với

72

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018
ethanol 60%: Dược liệu (Thạch hộc tự nhiên hoặc
thạch hộc nuôi cấy) sau được làm ẩm với cồn
60% theo tỉ lệ (1:1), sau đó cho vào bình ngấm
kiệt, cho cồn 60% cách mặt dược liệu 10 cm rồi
đậy kín để yên trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, rút
dịch chiết với tốc độ 2,3 ml/phút. Dịch chiết thu
được cô quay chân không thu hồi dung môi thu
được các cao.
Định tính bằng phương pháp hóa học: hợp
chất alkaloid với thuốc thử Bouchardat, Mayer,
Dragendorff; hợp chất saponin với phản ứng tạo
bọt và phản ứng Libermann Burchard. Định tính
bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung
môi khai triển: Toluen - ethyl acetate - acid
formic (2:7:1), Chloroform - methanol (9:1),
Chloroform – methanol - ammoniac (40:5:1).
Định lượng hợp chất alkaloid và saponin
trong 2 mẫu cao bằng phương pháp cân.

Hợp chất alkaloid
Cân chính xác khoảng 3 g dược liệu cho vào
bình tam giác 250 ml, thêm 50 ml H2SO4 5%,
siêu âm nóng 30 phút (50 ml x 8 lần), lọc. Dịch
nước acid được kiềm hóa bằng dung dịch
NH4OH đậm đặc đến pH 9 - 10. Dịch nước kiềm
hóa được lắc với chloroform (10 - 12 lần, mỗi lần

20 ml). Tập trung dịch chiết chloroform, rửa lại
bằng nước cất (30 ml x 3 lần). Cô quay thu hồi
dịch chloroform đến cắn. Cắn được sấy chân
không, cân đến khối lượng không đổi, tính kết
quả xác định hàm lượng alkaloid toàn phần. Kết
quả định lượng lặp lại 3 lần lấy trung bình.
Hợp chất saponin
Cân chính xác khoảng 3 g dược liệu cho vào
bình soxhlet, chiết với 20 x 10 ml MeOH cho đến
kiệt saponin. Dịch MeOH được cô giảm áp cho
đến cắn, hoà cắn với 50 ml nước cất. Dịch nước
được lắc với ether (6 - 7 lần, mỗi lần 20 ml) cho
đến khi lớp ether không màu hoặc màu rất nhạt.
Gạn bỏ lớp ether, lớp nước được lắc với n-BuOH
bão hoà nước cho đến kiệt saponin (khoảng 12
lần, mỗi lần 20 ml). Tập trung dịch chiết nBuOH, rửa với nước cất (30 ml x 3 lần), cô giảm
áp thu hồi n-BuOH cho đến cắn, làm khô trong


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018
tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi thu
được saponin toàn phần. Cân và tính hàm lượng
saponin toàn phần trong dược liệu. Tiến hành
định lượng 3 lần, lấy giá trị trung bình.

KẾT QUẢ
Thử nghiệm độc tính cấp của cao Thạch hộc
nuôi cấy (cao 1) và cao Thạch hộc tự nhiên (cao 2)
Bảng 1. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của cao 1 và cao 2
Lô thử

Số chuột Số chuột Số chuột Phân suất
đực (con) cái (con) chết trong lô tử vong
(con)
(%)
Sơ khởi
2
2
0
0
Xác định
6
6
0
0

Cao 1: liều tối đa bơm qua kim theo đường
uống là 25 g cao/kg chuột với thể tích 20 ml/kg
thể trọng chuột. Cao 2: liều tối đa bơm qua kim
theo đường uống là 28,6 g cao/kg chuột với thể
tích 20 ml/kg thể trọng chuột.
Trong thời gian 72 giờ và 2 tuần quan sát,
không ghi nhận bất kỳ dấu hiệu bất thường nào
xảy ra trên chuột thử nghiệm. Tất cả các chuột
đều ăn uống và hoạt động bình thường, không
có chuột chết. Sau 2 tuần theo dõi, mổ chuột ở tất
cả các lô không thấy bất kỳ thay đổi bệnh lý nào
về hình thái đại thể của các cơ quan tim, gan,
thận, bàng quang và hệ thống tiêu hóa.
Do đó, không tìm được LD50 và xác định

được Dmax là 25 g cao/kg chuột đối với cao 1
(tương đương 126,45 g dược liệu khô) và 28,6g
cao/kg chuột đối với cao 2 (tương đương 348,78g
dược liệu khô).
Như vậy, cao Thạch hộc nuôi cấy và cao
Thạch hộc tự nhiên không thể hiện độc tính cấp
đường uống với liều tối đa có thể cho chuột
uống. Điều này cho phép chúng ta nhận định
rằng cao Thạch hộc nuôi cấy và cao Thạch hộc tự
nhiên sử dụng trong thử nghiệm có độ an toàn
khá cao trên động vật thử nghiệm.
Khảo sát hóa học

Phân tích sơ bộ
Kết quả phân tích sơ bộ cho thấy thành phần
hóa học của (Dendrobium nobile Lindl.

Nghiên cứu Y học
Orchidaceae) cả mẫu nuôi cấy và tự nhiên đều
có các nhóm hoạt chất: tinh dầu, triterpenoid,
acid hữu cơ, polyuronid, alkaloid và saponin.
Bảng 2. Kết quả phân tích thành phần hóa thực vật
Nhóm hợp
chất
Tinh dầu
Chất béo
Carotenoid
Triterpenoid
Alkaloid
Cournarin

Anthraquinon
Flavonoid
Glycosid tim
Tannin
Các chất khử
Acid hữu cơ
Saponin
Polyuronid
Steroid

Kết quả định tính chung
Thạch hộc nuôi cấy
Thạch hộc tự
mô
nhiên
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-

Thử tinh khiết

Độ ẩm trung bình của dược liệu Thạch hộc
nuôi cấy mô là 9,47% ± 0,09; Thạch hộc tự nhiên
là 10,70% ± 0,11.
Độ tro toàn phần trung bình của dược liệu
Thạch hộc nuôi cấy mô là 4,52% ± 0,03; Thạch
hộc tự nhiên là 5,79% ± 0,05.
Độ tro không tan trong acid hydrochloric
trung bình của dược liệu Thạch hộc nuôi cấy mô
là 0,6% ± 0,01; Thạch hộc tự nhiên là 0,8% ± 0,05.

Định tính bằng phương pháp hóa học
Dịch chiết từ Thạch hộc tự nhiên và Thạch
hộc nuôi cấy môt đều cho phản ứng dương tính
với các thuốc thử của hợp chất alkaloid.
Bảng 3. Phản ứng hóa học định tính alkaloid trong
nguyên liệu
Thạch hộc
nuôi cấy

Thạch hộc tự
nhiên

Ống 1: dịch acid (đối chứng) Vàng trong
Vàng trong
Ống 2: dịch acid + TT Mayer Tủa vàng nhạt Tủa vàng nhạt
Ống 3: dịch acid + TT
Tủa đỏ cam Tủa đỏ cam
Dragendroff
Ống 4: dịch acid + TT
Tủa đỏ nâu

Tủa đỏ nâu
Bouchardat

73


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018

Nghiên cứu Y học
Dịch chiết từ Thạch hộc tự nhiên và Thạch
hộc nuôi cấy mô đều cho phản ứng dương tính

với phản ứng tạo bọt (lớp bọt bền hơn 30 phút).

Bảng 4. Phản ứng hóa học định tính saponin trong nguyên liệu
Thạch hộc nuôi cấy mô

Phản ứng
Phản ứng tạo bọt

Ống chứng
Không tạo bọt

Phản ứng Libermann Burchard Trắng trong

Ống mẫu thử

Ống chứng

Bọt bền trong 30 phút

Không tạo bọt

Bọt bền trong 30 phút

Vòng ngăn cách màu nâu đỏ

Trắng trong

Vòng ngăn cách màu nâu đỏ

Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Bảng 5. Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất saponin
trong nguyên liệu
Thạch hộc nuôi
cấy
Rf = 0,63
Toluen - ethyl acetate acid formic (2:7:1)
Rf = 0,81
Chloroform - methanol
Rf = 0,46
(9:1)
Rf = 0,81

Thạch hộc tự nhiên

Thạch hộc tự
nhiên
Rf = 0,63
Rf = 0,81

Rf = 0,46
Rf = 0,81

Nhận xét: trên sắc kí đồ, Thạch hộc nuôi
cấy và tự nhiên có các vết có Rf và màu sắc
tương đồng.

Ống mẫu thử

Xác định sự hiện diện của hợp chất alkaloid
Bảng 6. Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất alkaloid
trong nguyên liệu
Thạch hộc
nuôi cấy

Thạch hộc tự
nhiên

Rf = 0,71

Rf = 0,71

Chloroform: methanol:
ammoniac (40:5:1)

Nhận xét: trên sắc kí đồ, Thạch hộc nuôi cấy
mô có các vết có Rf và màu sắc tương đồng với
các vết của Thạch hộc tự nhiên.

Định lượng

Bảng 7. Định lượng alkaloid trong nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy mô và tự nhiên
Thạch hộc nuôi cấy

Thạch hộc tự nhiên

Mẫu 1

Mẫu 2

Mẫu 3

Mẫu 1

Mẫu 2

Mẫu 3

Khối lượng mẫu thử (g)

3,0026

3,0012

3,0026

3,0046

3,0018

3,0022

Cắn alkaloid (g)

0,0277

0,0251

0,0262

0,0160

0,0146

0,0169

Hàm lượng alkaloid (%)

1,02

0,92

0,96

0,60

0,54

0,63

Trung bình (%)

0,97 % ± 0,03

0,59 % ± 0,03

Bảng 8. Định lượng saponin trong nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy mô và tự nhiên

Khối lượng mẫu thử (g)
Cắn saponin (g)
Hàm lượng saponin (%)
Trung bình (%)

Thạch hộc nuôi cấy
Mẫu 1
Mẫu 2
3,0021
3,0018
0,0986
0,1014
3,63
3,73
3,71 % ± 0,04

Mẫu 3
3,0042
0,1025
3,77

Thạch hộc tự nhiên
Mẫu 1

Mẫu 2
Mẫu 3
3,0030
3,0012
3,0001
0,0603
0,0605
0,0578
2,25
2,26
2,16
2,22 % ± 0,03

Chiết xuất cao

thơm nhẹ, vị ngọt.

Thạch hộc nuôi cấy mô với khối lượng dược
liệu là 850g thu được 180g cao, hiệu suất đạt
được là 19,77%. Thạch hộc tự nhiên với khối
lượng dược liệu là 700g thu được 72g cao, hiệu
suất đạt được là 8,2%.

Thử tinh khiết
Độ tan: cả 2 mẫu cao thạch hộc nuối cấy mô
và Thạch hộc tự nhiên đều tan trong 20ml nước.

Tiêu chuẩn hóa cao chiết

Hình thức cảm quan

Hai cao đều có thể chất quánh, màu đen, mùi

74

Độ ẩm trung bình của cao Thạch hộc nuôi
cấy mô là 13,83% ± 0,15, Thạch hộc tự nhiên là
15,51% ± 0,03.
Độ tro toàn phần trung bình của cao Thạch
hộc nuôi cấy mô là 4,22% ± 0,02, Thạch hộc tự
nhiên là 3,91% ± 0,02.


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018

Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc
nuôi cấy
tự nhiên

Định tính bằng phương pháp hóa học
Bảng 9. Phản ứng hóa học định tính alkaloid trong cao

Bouchardat
Ống 4: dịch acid + TT
Mayer

Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc
nuôi cấy
tự nhiên
Ống 1: dịch chiết cao (đối
chứng)

Ống 2: dịch chiết cao +
TT Dragendroff
Ống 3: dịch acid + TT

Vàng trong

Vàng trong

Tủa đỏ cam

Tủa đỏ cam

Tủa đỏ nâu

Tủa đỏ nâu

Nghiên cứu Y học

Tủa vàng nhạt

Tủa vàng nhạt

Nhận xét: dịch chiết cao Thạch hộc tự nhiên
và cao Thạch hộc nuôi cấy mô đều cho phản ứng
dương tính với các thuốc thử của hợp chất alkaloid.

Bảng 10. Phản ứng hóa học định tính saponin trong cao
Cao Thạch hộc nuôi cấy mô

Phản ứng

Ống chứng
Phản ứng tạo bọt

Không tạo bọt

Phản ứng Libermann Burchard Trắng trong

Cao Thạch hộc tự nhiên

Ống mẫu thử

Ống chứng

Bọt bền trong 30 phút

Không tạo bọt

Bọt bền trong 30 phút

Vòng ngăn cách màu nâu đỏ

Trắng trong

Vòng ngăn cách màu nâu đỏ

Nhận xét: dịch chiết cao Thạch hộc tự nhiên
và cao Thạch hộc nuôi cấy đều cho phản ứng
dương tính với phản ứng tạo bọt và phản ứng
Libermann Buchard.

Đ ị nh tính bằ ng phư ơ ng pháp sắ c ký
lớ p mỏ ng
Trên sắc kí đồ, nguyên liệu nuôi cấy có 2 vết
có Rf và màu sắc tương đồng với vết của cao
nuôi cấy mô, nguyên liệu tự nhiên có 2 vết có Rf

Ống mẫu thử

và màu sắc tương đồng với vết của cao tự nhiên,
cao tự nhiên có 6 vết có Rf và màu sắc tương
đồng với vết của cao nuôi cấy mô (Bảng 11).
Trên sắc kí đồ, nguyên liệu nuôi cấy mô có
vết có Rf và màu sắc tương đồng với vết của cao
nuôi cấy mô, nguyên liệu tự nhiên có vết có Rf
và màu sắc tương đồng với vết của cao tự nhiên,
cao tự nhiên có vết có Rf và màu sắc tương đồng
với vết của cao nuôi cấy mô (Bảng 12).

Bảng 11. Sắc ký lớp mỏng định tính alkaloid trong cao
Nhóm 1

Nhóm 2
Nhóm 3
Dược liệu
Cao Thạch hộc Dược liệu Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc
Cao Thạch hộc
Thạch hộc nuôi
tự nhiên
Thạch học tự nuôi cấy mô

tự nhiên
nuôi cấy mô
cấy mô
nhiên
Chloroform:
methanol: ammoniac
(40:5:1)

Rf = 0,65
Rf = 0,71

Rf = 0,65
Rf = 0,71

Rf = 0,65
Rf = 0,71

Rf = 0,65
Rf = 0,71

Rf = 0,65
Rf = 0,71

Rf = 0,65
Rf = 0,71

Bảng 12. Sắc ký lớp mỏng định tính saponin trong cao

Chloroform:
methanol

(9:1)

Nhóm 1
Nhóm 2
Nhóm 3
Cao Thạch hộc Dược liệu Thạch Cao Thạch hộc Dược liệu Thạch Cao Thạch hộc Cao Thạch hộc
nuôi cấy mô hộc nuôi cấy mô
tự nhiên
học tự nhiên
nuôi cấy mô
tự nhiên
Rf = 0,44
Rf = 0,44
Rf = 0,44
Rf = 0,44
Rf = 0,46
Rf = 0,46
Rf = 0,52
Rf = 0,52
Rf = 0,52
Rf = 0,52
Rf = 0,68
Rf = 0,68
Rf = 0,82
Rf = 0,82
Rf = 0,82
Rf = 0,82
Rf = 0,94
Rf = 0,94

Định lượng
Bảng 13. Định lượng alkaloid trong nguyên liệu cao Thạch hộc nuôi cấy mô và tự nhiên

Khối lượng mẫu thử (g)
Cắn alkaloid (g)
Hàm lượng alkaloid (%)
Trung bình (%)

Cao Thạch hộc nuôi cấy
Mẫu 1
Mẫu 2
Mẫu 3
1,0031
1,0028
1,0011
0,0277
0,0280
0,0261
3,27
3,30
3,09
3,22 % ± 0,07

Cao Thạch hộc tự nhiên
Mẫu 1
Mẫu 2
Mẫu 3
1,0032
1,0038
1,0011

0,0227
0,0237
0,0211
2,63
2,74
2,45
2,60 % ± 0,08

75


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018

Nghiên cứu Y học

Bảng 14. Định lượng saponin trong nguyên liệu cao Thạch hộc nuôi cấy mô và tự nhiên

Khối lượng mẫu thử (g)
Cắn saponin (g)
Hàm lượng saponin (%)
Trung bình (%)

Cao Thạch hộc nuôi cấy
Mẫu 1
Mẫu 2
Mẫu 3
0,502
0,5005
0,5012
0,0651

0,0670
0,0662
15,35
15,84
15,63
15,61% ± 0,14

BÀN LUẬN
Trong thử nghiệm độc tính cấp, liều cao nhất
có thể bơm được qua kim đầu tù cho chuột uống
là 25 g cao/kg chuột (tương đương 116,87 g
cao/kg người, khoảng 126,45 g dược liệu khô)
đối với cao Thạch hộc nuôi cấy mô và 28,6 g
cao/kg chuột (tương đương 133,7 g cao/kg người,
khoảng 348,78 g dược liệu khô) đối với cao
Thạch hộc tự nhiên. Ở liều này, thuốc ở dạng
hỗn dịch rất đậm đặc vừa đủ qua đầu kim để có
thể bơm thuốc vào dạ dày chuột. Sau khi uống
thuốc, chuột vẫn ăn uống, hoạt động và bài tiết
bình thường, không thấy có biểu hiện ngộ độc ở
chuột và không có chuột nào chết trong vòng 72
giờ và suốt 2 tuần tiếp theo sau khi uống thuốc.
Do đó chưa xác định được độc tính cấp và chưa
tính được LD50 của cao trên chuột nhắt trắng
theo đường uống. Theo liều lượng sử dụng
trong DĐVN IV, cây thuốc và động vật làm
thuốc Việt Nam (Viện dược liệu), các đơn thuốc
kinh nghiệm, khối lượng dược liệu Thạch hộc sử
dụng mỗi ngày khoảng 6 - 12 g dược liệu khô.
Thạch hộc nuôi cấy và Thạch hộc tự nhiên dùng

liều duy nhất với lượng gấp 10,5 lần và 29 lần
lượng thường sử dụng, cho thấy khoảng cách an
toàn rộng.
Hiện nay Thạch hộc là dược liệu quý hiếm,
được đưa vào sách đỏ, cần được bảo tồn(7). Nên
xu hướng mới là áp dụng công nghệ sinh học
thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn và
chất lượng cao(6). Tuy nhiên chưa có nghiên cứu
so sánh hoạt chất hóa học trong Thạch hộc nuôi
cấy và Thạch hộc tự nhiên. Do đó cần làm rõ các
hoạt chất có trong các sản phẩm Thạch hộc nuôi
cấy mô từ việc áp dụng công nghệ sinh vật thực
vật so với Thạch hộc trồng tự nhiên để chủ động

76

Cao Thạch hộc tự nhiên
Mẫu 1
Mẫu 2
Mẫu 3
0,5018
0,5006
0,5022
0,0508
0,0494
0,0516
11,75
11,45
11,92
11,71% ± 0,14

tạo được nguồn dược liệu quý hiếm và đạt chất
lượng cao.
Qua Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
của 2 mẫu dược liệu đều có tinh dầu,
triterpenoid, acid hữu cơ, polyuronid, alkaloid
và saponin, ta thấy có sự tương đồng về các
thành phần hóa học của 2 mẫu Thạch hộc nuôi
cấy và Thạch hộc tự nhiên.Khảo sát một số tiêu
chuẩn của cao chiết cồn mẫu Thạch hộc nuôi cấy
mô và mẫu tự nhiên về hình thức cảm quan, độ
tan trong nước, độ ẩm, độ tro toàn phần đạt theo
tiêu chuẩn cơ sở. Định tính bằng phương pháp
hóa học và sắc ký lớp mỏng đã chứng minh
được trong cả 2 mẫu cao đều có hợp chất
alkaloid và hợp chất saponin. Kết quả này cũng
phù hợp với báo cáo của Wang X. K.và cộng sự
trong Thạch hộc tự nhiên có hợp chất Alkaloid
(Dendrobin)(8).
Định lượng cao Thạch hộc nuôi cấy mô có
3,22% alkaloid và 15,61% saponin. Cao Thạch
hộc tự nhiên có 2,6% alkaloid và 11,71% saponin.
Điều này cho thấy cao Thạch hộc nuôi cấy mô có
hàm lượng alkaloid cao gấp 1,2 và hàm lượng
saponin cao gấp1,3 lần cao Thạch hộc tự nhiên.
Việc phân tích sơ bộ thành phần hợp chất
trong nguyên liệu Thạch hộc cũng như cao
Thạch hộc góp phần tạo cơ sở cho việc phân tích
xác định cấu trúc các hợp chất chính alkaloid và
saponin trong Thạch hộc. Và việc định lượng 2

hợp chất alkaloid và saponin bằng phương pháp
cân tạo tiền đề cho việc xây dựng qui trình định
lượng sắc ký cao hơn.
Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên
cứu về tính an toàn và tác dụng dược lý của
Thạch hộc nuôi cấy mô.


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018
KẾT LUẬN
Độc tính cấp 2 cao: Cả 2 mẫu cao không gây
biểu hiện độc tính cấp ở liều tối đa có thể cho
uống. Cao Thạch hộc nuôi cấy mô có Dmax là 25
g cao/kg chuột, cao Thạch hộc tự nhiên có Dmax
là 28,6 g cao/kg chuột.
So sánh thành phần hóa học của cao Thạch
hộc nuôi cấy mô và cao Thạch hộc tự nhiên:định
tính cả 2 cao đều có hàm lượng alkaloid và
saponin, định lượng cao Thạch hộc nuôi cấy mô
có hàm lượng alkaloid và saponin cao hơn so với
cao Thạch hộc tự nhiên.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.

Nghiên cứu Y học
3.

China’s Pharmarcopoiea, Part One (1977). The People’s Health

Sciences Publication C. Beijing (Peking), China, pp. 145.
4. Đỗ Trung Đàm (1996). Phương pháp xác định độc tính cấp của
thuốc. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 6-24, 50-57.
5. Lee YH, Jong DP, Nam IB, Shin IK, Byung ZA (1995). "In Vitro
and In Vivo Antitumoral Phenanthrenes from the Aerial Parts of
Dendrobium nobile". Planta Medica; 61(2): 178-180.
6. Viện Dược Liệu (2011). Công Trình Nghiên Cứu Khoa Học Viện
Dược Liệu 2006-2011. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, tr.164-169.
7. Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2007). Sách Đỏ Việt
Nam. NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ, tr. 57-60.
8. Wang XK, Zhao T, Che CH (1985). “Dendrobine and 3Hydroxy-2-Oxodendrobine from Dendrobium nobile”. Journal of
Natural Produm; 48(5): 796-801.

Ngày nhận bài báo:

25/04/2017

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

20/06/2018

Ngày bài báo được đăng:

20/09/2018

Bộ môn Dược liệu (2011). Phương pháp nghiên cứu dược liệu
(tài liệu lưu hành nội bộ). Đại học Y Dược TP. HCM, tr. 1 – 16.
Bộ Y Tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. NXB Y học, tr. 894-895.

77