Xây dựng quy trình định lượng các flavonoid và acid clorogenic trong Nữ lang (Valeriana hardwickii) bằng UHPLC-MS

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC FLAVONOID
VÀ ACID CLOROGENIC TRONG NỮ LANG (VALERIANA HARDWICKII)
BẰNG UHPLC-MS
Huỳnh Lời*, Nguyễn Thùy Vi*, Trần Hùng**

TÓMTẮT
Mở đầu: Nữ lang (Valeriana hardwickii Wall. Caprifoliaceae) đã được dùng từ lâu trong y học cổ
truyền để điều trị mất ngủ, chống co giật, chống mệt mỏi và rối loạn chu kỳ kinh nguyệt. Ngoài ra, dược
liệu này còn dùng ngoài để điều trị côn trùng đốt và các bệnh ngoài da. Cho tới nay, các công trình nghiên
cứu về Nữ lang chủ yếu là phân tích các thành phần bay hơi. Ngoài ra, các thành phần khác được phân lập
như các iridoid, flavonoid, triterpen. Về định tính, định lượng, chưa có nhiều tài liệu công bố.
Mục tiêu: Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng quy trình định lượng các flavonoid có trong
Nữ lang bao gồm linarin, neobudofficid, rhoifolin và acid clorogenic bằng phương pháp UHPLC-MS.
Phương pháp xây dựng giúp cho việc kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho Dược Điển Việt Nam.
Nguyên liệu và phương pháp: Nguyên liệu là cây Nữ lang (V. hardwickii) thu hái mọc hoang tại
Cổng Trời (vùng Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt vào tháng 4/2015. Nguyên liệu được định danh bằng
cách so sánh về mô tả hình thái thực vật với các thông tin trên các tài liệu tham khảo thực vật học chuyên
ngành. Mẫu Valeriana officinalis được thu thập tại vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna, Cộng hòa
Áo đuợc thu vào tháng 4 năm 2015. Hệ dung môi và điều kiện MS được tối ưu hóa. Phương pháp được
đánh giá với tính tương thích hệ thống, tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ theo hướng dẫn
của ICH.
Kết quả: Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic 0,1% (A) – a. formic 0,1% trong acetonitril (B),
gradient từ 90% A đến 5% A, thời gian phân tích 14 phút, tốc độ dòng là 0,7 ml/phút và nhiệt độ cột là
30oC và thể tích tiêm mẫu là 3 ml. Điều kiện phân tích khối phổ được thiết lập với thông số capillary voltage
ở 0,8 kV; cone voltage là 15 eV, nhiệt độ của mao quản được duy trì ở 350 ºC. Tốc độ khí khử dung môi
(desolvation gas) là 300 L/h. Phổ khối của các chất phân tích được ghi nhận ở chế độ ion dương (positive).
Sắc kí đồ của các chất phân tích được theo dõi ở cả hai chế độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z 1001000) và SIR (single ion recording). Chế độ SIR của acid clorogenic ở m/z 355,31; rhoifolin ở m/z 579,52;

neobudofficid ở m/z 739,69; và linarin ở m/z 593,54. Tính tương thích hệ thống đạt với thông số thời gian
lưu và diện tích đỉnh các pic nhỏ hơn 2%. Tính tuyến tính với R2 ~ 0,999 và khoảng tuyến tính các hợp chất
có nồng độ 0,7-120 mg/ml. Kết quả cho thấy có sự lặp lại trong phương pháp phân tích bằng UHPLC-MS
với RSD% < 5%. Tỷ lệ phục hồi 99-106%. Giới hạn phát hiện là của a. clorogenic, rhoifolin, neobudofficid,
linarin lần lượt là 0,029; 0,0010; 0,00020; 0,015 mg/ml. Acid clorogenic có trong các bộ phận của V.
hardwickii bao gồm lá là 1,76%, trong thân là 8,23% và trong rễ là 1,68%, hàm lượng các flavonoid trong
lá V. hardwickii bao gồm rhoifolin là 0,86%, neobudofficid là 0,19% và linarin là 1,95%. Acid clorogenic
trong rễ và lá của V. officinalis cũng được định lượng với hàm lượng lần lượt là 5,3% và 1,45%.
Kết luận: Phương pháp UHPLC-MS đã được xây dựng và được đánh giá theo hướng dẫn của ICH.
Các điều kiện phân tích đã được thiết lập bao gồm các điều kiện về phổ khối, tính tương thích hệ thống tính
*

Trung Tâm Khoa Học Công Nghệ Dược Sài Gòn (SAPHARCEN), Đại học Y Dược Thành phố. Hồ Chí Minh
Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Hùng
ĐT: 02838295641
Email:
**

12

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng. Hàm lượng các hợp chất đã được định lượng bao gồm acid clorogenic,
rhoifolin, neobudofficid, và linarin trong V. hardwickii và acid clorogenic trong V. officinalis.

Từ khóa: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS

ABSTRACT
QUANTITATIVE ANALYSIS OF FLAVONOIDS AND CHLOROGENIC ACID IN VALERIANA
HARDWICKII BY UHPLC-MS
Huynh Loi, Nguyen Thuy Vi, Tran Hung
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 12 – 23
Background and objectives: V. hardwickii, “Nữ lang in Vietnamese”, are used in Vietnam as a
traditional medicine with anti-convulsant, sedative, anti-fatigue, and anti-dysmenorrheal properties. The
topical uses of aerial parts are the treatment of insect bites and various skin diseases. Volatile compounds
were reported. Flavonoids, iridoids, terpenoids are also isolated from Valeriana hardwickii. The aim of this
study was to develop the UHPLC-MS method for quantitative analysis of flavonoids including linarin,
neobudofficide, rhoifolin and chlorogenic acid from Valeriana hardwickii.
Material and method: Nữ lang (Valeriana hardwickii) was collected in Cổng Trời (Bidoup - núi Bà),
Đà Lạt in April 2015. V. officinalis was colleced in Botanic Garden of Vetmeduni – Vienna in April 2015.
The mobile phase and MS conditon were optimized. The analytical method was validated for system
suitability, linearity, precision, accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ)
according to International Council on Harmonization (ICH) Guidelines.
Results: The method was developed using mobile phase including formic acid 0.1% (A) – formic acid
0.1% in acetonitril (B), gradient from 90% A to 5% A, 14 min run time, 0.7 ml/min flow rate, 30oC
column temperature, 3 ml injection volume. MS condition were set as 0.8 kV capillary voltage; 15 eV cone
voltage, 350 ºC capillary temperature, 300 L/h desolvation gas, ESI+-MS mode, full scan at m/z 100-1000,
SIR (single ion recording) mode. Chromatogram was recorded at m/z 355.31 for chlorogenic acid; at m/z
579.52 for rhoifolin; at m/z 739.69 for neobudofficid; and at 593.54 for linarin. System is suitable for
analysis with RSD of retension time and peak area below 2%. The method was found to be linear within the
ranges of 0.7-120 mg/ml and R2 ~ 0,999. The precision was determined with RSD < 5%. The LOD was
0.029; 0.0010; 0.00020; and 0.015 mg/ml for chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin
respectively. The recovery ranged 99-106%. The content of chlorogenic acid is 1.76%, 8.23% and 1.68% in
leaves, stems and roots, respectively. The content of flavonoids in leaves including rhoifolin, neobudofficid,
and linarin is 0.86%, 0.19% and 1.95%, respectively. Acid clorogenic from the roots and leaves of V.

officinalis was also determined with the content of 5.3% and 1.45%, respectively.
Conclusions: The UHPLC-MS method was successfully developed and validated. The MS condition
was optimized. System suitability, linearity, range, precision, recovery was determined. The content of
chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin in Valeriana hardwickii was also determined.
Chlorogenic acid in V. officinalis was successful quantitative.
Key words: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS
xếp vào họ Caprifoliaceae (họ Cơm cháy)(21,22).
ĐẶTVẤNĐỀ
Ở châu Á, chi Valeriana có các loài V.
Chi Valeriana trước đây thuộc họ
pseudofficinalis, V. fauriei, V. jatamansi, V.
Valerianaceae (họ Nữ lang) và hiện nay được
hardwickii, Nardostachys jatamansi(2,3,18,19). Ở

Chuyên Đề Dược

13


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

nước ta có 2 loài: V. hardwickii (Nữ lang) và V.
jatamansi (Sì to)(22). Thành phần hóa học chi
Valeriana yếu chứa tinh dầu, iridoid
(valepotriat), triterpenoid, flavonoid, acid
phenol, lignan, alkaloid. Ngoài ra còn có
amino acid (arginin, GABA, glutamin,
tyrosin), acid béo, cholin và các chất vô cơ

khác(10). Trên thế giới V. hardwickii mọc ở Ấn
Độ, Trung Quốc, Mianma, Malaysia,
Indonesia. Ở nuớc ta, Nữ lang (V. hardwickii)
mọc ở Ô Quý Hồ, Tả Giàng Phình, núi Hàm
Rồng, Xà Xén, Sapa, Hà Giang (Đồng Văn,
Mèo Vạc), Quảng Nam (Trà My: Ngọc Linh),
Kon Tum (Đắk Tô: Ngọc Linh), Lâm Đồng (Đà
Lạt)(8). Cho đến nay, nghiên cứu hoá học trên
loài V. hardwickii không nhiều. Năm 1989, Đỗ
Ngọc Thanh và cộng sự đã phân lập được 2
thành phần từ V. hardwickii ký hiệu là N1, N2
và chưa xác định được cấu trúc(9). Thành phần
chính trong tinh dầu V. hardwickii var.
arnottiana là valeracetat và hàm lượng tinh dầu
là 0,3%(20). Tinh dầu V. hardwickii mọc ở
Hymalaya thành phần chính là methyl
linoleate(16). Tinh dầu trong Valeriana hardwickii
ở Việt nam có thành phần chủ yếu là bornyl
acetat(13). Về phân lập, có 2 công trình nghiên
cứu trên cây này. Epoxysesquithujen được
phân lập trong tinh dầu V. hardwickii var.
hardwickii(6). Các chất sitosterol, daucosterol,
syzalterin, 6-methylapigenin, 5-hydroxy-7,4'dimethoxyflavon,
genkwanin,
acacetin,
apigenin,
quercetin,
tricin,
farrerol,
sosakuranetin;

5,3',4'-trihydroxy-7methoxyflavanon,
linarin,
neobudofficid,
neodiosmin, rhoifolin, valeclorin, isovaleroxy
valtrat hydrin, acid oleanolic, acid ursolic,
bornyl ferulat, bornyl caffeat cũng được phân
lập từ V. hardwickii(5,12). Cho đến nay, ít có công
trình nghiên cứu về tác dụng sinh học của V.
hardwickii. Cao chiết thân rễ V. hardwickii gây
ra sự ức chế phụ thuộc nồng độ sự co thắt tự
phát hay sự co thắt gây bởi kali trên ruột chay
thỏ, do đó thể hiện tác dụng chống co thắt(1).
Các cao chiết từ V. hardwickii bao gồm cao

14

nước, cao ethanol 45% và cao DCM có tác
dụng an thần, giải lo âu(1) . Thử nghiệm trên
dòng tế bào NB18TG2, linarin và
isovaleroxy valtrat hydrin được phân lập
từ V. hardwickii không có độc tính trên
dòng tế bào này(14) . Theo y học cổ truyền,
Nữ lang có vị ngọt, đắng, tính bình, tác
động vào 2 kinh: tâm, can. Cây có tác dụng
ninh tâm, an thần, hoạt huyết, thông
kinh (8) . Hoạt chất từ thân rễ dùng làm
thuốc thần kinh tim, chống co thắt; cả cây
dùng làm thuốc chữa phong thấp, đau dạ
dày, điều kinh, sốt ở trẻ em(23) . Ở Ấn Độ,
thân rễ của V. hardwickii được dùng như

thân rễ V. officinalis để chữa hysteria, động
kinh, chứng múa giật, chứng loạn thần
kinh, chấn thương thời chiến, chứng loạn
thần kinh chức năng. Thân rễ cũng dùng để
làm hương liệu. Ở Trung Quốc, toàn cây và
thân rễ được dùng trị thần kinh suy nhược
và mất ngủ; có nơi dùng trị kinh nguyệt
không đều, đòn ngã tổn thương và phong
thấp đau xương(22). Ở Pakistan, Miến Điện
và Srilanka, V. hardwickii được sử dụng để
làm gia vị cũng như làm thuốc. Nữ lang
được dùng làm thuốc toát mồ hôi, phòng
bệnh phát lại có định kỳ, chất kích thích,
thuốc bổ não, thuốc chống động kinh, thuốc
tẩy giun, thuốc an thần, lợi tiểu, thuốc kích
thích tình dục, thuốc điều kinh, chống co
thắt, trị tiêu chảy(1). Nữ lang V. hardwickii
được dùng với liều 10 g hãm với 100 ml
nước sôi, để nguội uống trong ngày hoặc
nghiền dược liệu thành bột uống với liều 1-4
g/ ngày, có thể thái nhỏ dược liệu, ngâm cồn
60% với tỷ lệ 1/5, ngày dùng 2-10 g pha
loãng, ngoài ra còn dùng dạng cao mềm,
ngày dùng 1-4 g(8). Cho đến nay, công trình
nghiên cứu về phân tích định lượng các
thành phần trong Valeriana hardwickii chưa
đuợc công bố. Công trình nghiên cứu này là
lần đầu tiên công bố về định lượng các
flavonoid, acid clorogenic trong V. hardwickii
bằng UHPLC-MS.

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

NGUYÊNLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU

acetonitril ở các tỷ lệ sao cho sự tách và độ cân

Nguyênliệu

đối của đỉnh đạt yêu cầu định lượng.

Nguyên liệu là cây Nữ lang (V. hardwickii)
thu hái mọc hoang tại Cổng Trời (vùng
Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt. Nguyên
liệu được định danh bằng cách so sánh về
mô tả hình thái thực vật với các thông tin
trên các tài liệu tham khảo thực vật học
chuyên ngành(8). Mẫu Nữ lang V. hardwickii
được thu hái 4/2015 và được lưu tại Bộ môn
Dược liệu, Khoa dược, Đại học Y Dược TP.
Hồ Chí Minh số lưu mẫu 01-BMDL.
Mẫu Valeriana officinalis được thu thập tại
vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna,
Cộng hòa Áo đuợc thu vào tháng 4 năm 2015.
Mẫu được lưu tại Viện thực vật ứng dụng và

dược
liệu
(Applied
Botany
and
Pharmacognosy) thuộc trường Vetmeduni với
số lưu IAB2012-VAL01.
Dung môi, hóa chất

Các điều kiện sắc ký được khảo sát trên hai
kỹ thuật rửa giải đẳng dòng (isocratic) và
chương trình dung môi (gradient) để chọn
điều kiện sắc ký có sự phân tách các pic.

Khảo sát điều kiện MS
Điều kiện MS được điều chỉnh bằng thủ
công sao cho ion hóa tốt nhất. Các thông số
được thăm dò bao gồm điện thế cone (cone
voltage), điện thế mao quả (capillary voltage),
nhiệt độ của mao quản, phương thức chọn ion
(positive hay negative).
Khảo sát tính tương thích hệ thống
Tiến hành: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối
chiếu có cùng nồng độ, cùng điều kiện.
Yêu cầu: RSD của thời gian lưu; diện tích
pic cần định lượng phải ≤ 2%; hệ số bất đối
(AF) từ 0,5-1,5 và độ phân giải giữa các pic cần
định lượng Rs ≥ 1,5(4,7).

Acid formic, acetonitril được cung cấp bời

Merck (Đức). Acid clorogenic được cung cấp
bởi Merck (Đức), rhoifolin, neobudofficid và
linarin là các hợp chất đối chiếu phân lập
trong nghiên cứu trước đây(12), độ tinh khiết
HPLC lần lượt là 97,2%, 99,2% và 98,4%.

Tính đặc hiệu
Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu,
mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối chiếu.

Trang thiết bị nghiên cứu

trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ

Hệ UHPLC Waters® model Acquity® Hclass với đầu dò MS QDa (REF186006511), cột
Cortes® C18 (50 × 4,6 mm, 2,7 µm). Phần mềm
Empower 3.

của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương

Phương pháp nghiên cứu

được chuẩn hóa so với mẫu thử ban đầu.

Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu

Tính tuyến tính

Sắc ký đồ mẫu trắng không có các tín hiệu
tại thời gian lưu của các pic cần định lượng

ứng với sắc ký đồ của mẫu đối chiếu. Khi thêm
một lượng chất đối chiếu vào mẫu thử thì có sự
tăng về diện tích pic hoặc tỷ số diện tích pic

Khảo sát lần lượt các dung môi là MeOH

Pha các hợp chất cần định lượng trong

với nồng độ khác nhau, điều kiện nhiệt độ,

MeOH để có dung dịch với nồng độ tăng dần.

thời gian chiết và số lần chiết sao cho các điều

Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.

kiện chiết cho hiệu suất chiết cao nhất.

Khảo sát pha động và kỹ thuật rửa giải
Khảo sát trên hai dung môi là acid formic

Kết quả được đánh giá bằng cách tính
đường hồi qui dựa vào phương pháp bình
phương tối thiểu, phương trình ŷ= ax.

0,1% trong MeOH và acid formic 0,1% trong

Chuyên Đề Dược

15


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

Yêu cầu: có sự tương quan tuyến tính giữa
diện tích pic (hoặc tỷ số diện tích pic chuẩn
hóa) với nồng độ chất đối chiếu ở khoảng
nồng độ khảo sát, hệ số R2 ≥ 0,995.

Độ lặp lại
Thực hiện định lượng trên 6 dịch chiết
mẫu thử khác nhau. Độ lặp lại được đánh giá

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định
lượng (LOQ)
Hai giới hạn này được tính trên tỷ lệ tín
hiệu (S) với tín hiệu nhiễu đường nền (N).
LOD và LOQ được tính toán theo tỷ lệ
S/N=3/1 và 10/1 theo thứ tự dựa theo kết
quả thực nghiệm.
Áp dụng quy trình định lượng

dựa vào RSD của hàm lượng các chất phân

Sau khi xây dựng quy trình định lượng,

tích có trong bột lá Nữ lang. Mỗi mẫu định

quy trình được áp dụng để định lượng các

lượng 2 lần, lấy kết quả trung bình .

thành phần có trong thân và rễ của Nữ lang

Độ đúng

(V. hardwickii) và trong rễ và lá của V.

(7)

Độ đúng là tỷ lệ phục hồi giữa nồng độ

officinalis.

chất đối chiếu tìm thấy so với lượng chất đối

KẾTQUẢ

chiếu thêm vào. Thêm vào mẫu thử dược liệu
một lượng chất đối chiếu 10%, 20%, 30% so với
hàm lượng chất phân tích có trong mẫu thử,
tiến hành định lượng 3 nồng độ, mỗi nồng độ

Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu

Khảo sát dung môi chiết
Dung môi chiết đuợc khảo sát với phần

trăm MeOH khác nhau. Kết quả cho thấy

thực hiện trên 3 mẫu.
Yêu cầu: tỷ lệ phục hồi trong khoảng 90 –

MeOH 40% cho hiệu suất chiết cao nhất, vì
vậy dung môi MeOH 40% dùng để chiết các

107%(11).

thành phần định lượng từ lá Nữ lang.
Bảng 1: Diện tích đỉnh các polyphenol và dung môi chiết trong khảo sát quy trình định lượng
Hợp chất
Acid clorogenic
Rhoifoolin
Neobudofficid
Linarin

MeOH 10%
3061530
210245
16917
454553

MeOH 20%
2721360
194555
18646
341823

Khảo sát số lần chiết

MeOH 40%
3401700
209199
18590
363642

MeOH 60%
3571785
173635
15244
338187

MeOH 80%
3061530
215475
16359
316369

MeOH 100%
3231615
171899
18962
356369

Khảo sát thời gian chiết

Kết quả khảo sát số lần chiết cho thấy chiết

Thời gian chiết 30 phút được chọn để

2 lần được chọn để chiết các hợp chất cần định

chiết vì cho diện tích đỉnh cao hơn so với

lượng trong lá Nữ lang.

chiết 15 phút và cũng gần tương đương với

Bảng 2: Diện tích đỉnh các polyphenol và số lần
chiết trong khảo sát qui trình định lượng

chiết 45 phút.

Hợp chất

Lần 1

Tỷ lệ % Tỷ lệ %
Lần 2 Lần 3 chiết
chiết
lần 2
lần 3

Acid
3402031 187110
clorogenic
Rhoifoolin 2092002 125520
Neobudofficid 18605 1302

Linarin
364110 14564

16

34020

5,16

0,94

29288
205
10923

5,59
6,48
3,74

1,30
1,02
2,80

Bảng 3: Diện tích đỉnh các polyphenol và thời gian
chiết trong khảo sát quy trình định lượng
Hợp chất
Acid
clorogenic
Rhoifoolin
Neobudofficid

Linarin

15 phút
3401120

30 phút
3571176

45 phút
3407922

2092110
18701
365210

2133952
18906
373244

2194202
18988
376166

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
Khảo sát nhiệt độ chiết
Nhiệt độ chiết đuợc khảo sát ở 30oC, 40oC
và 50oC. Kết quả cho thấy nhiệt độ 40oC cho

hiệu quả chiết cao hơn 30oC và cũng tương
đương với 50oC. Vậy, nhiệt độ 40oC thích hợp
cho quy trình chiết.
Bảng 4: Diện tích đỉnh các polyphenol và nhiệt độ
chiết trong khảo sát quy trình định lượng
Hợp chất
Acid clorogenic
Rhoifoolin
Neobudofficid
Linarin

o

30 C
3401800
2092528
18705
365283

o

40 C
3571890
2094621
19078.84
381355.5

o

50 C

3575292
2098806
19452.93
383181.9

Sau khi khảo sát dung môi chiết, số lần
chiết, thời gian chiết và nhiệt độ chiết. Quy
trình chiết được thiết lập như sau:
Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá Nữ
lang cho vào ống nghiệm thủy tinh có nắp,
thêm 10 ml MeOH 40%, siêu âm (mức năng
lượng 100%) ở nhiệt độ 40 oC trong vòng 30
phút, lọc, bã được chiết lần 2 với 10 ml MeOH
40%, gộp dịch lọc, cho dịch lọc thu được vào
bình định mức 25 ml, bổ sung dung môi cho
đủ thể tích, lọc qua màng lọc PTTE 0,22 µm
trước khi phân tích bằng UHPLC.
Khảo sát pha động và kỹ thuật rửa giải
Sau khi khảo sát các điều kiện sắc ký,
chương trình rửa giải được xây dựng như sau:

Nghiên cứu Y học

Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic
0,1% (A) – a. formic 0,1% trong acetonitril
(B). Chương trình rửa giải gradient thể hiện
ở Bảng 5.
Tốc độ dòng là 0,7 ml/phút và nhiệt độ
cột là 30oC và thể tích tiêm mẫu là 3 ml.
Bảng 5: Chương trình rửa giải của quy trình

định lượng
Thời gian
0-2 phút
2-3 phút
3-5 phút
5-7 phút
7-9 phút
9-14phút

Pha động
90% A
90% 78% A
78%  75% A
75% A
75%  5% A
5% A

Khảo sát điều kiện MS
Điều kiện phân tích khối phổ được thiết
lập với thông số capillary voltage ở 0,8 kV;
cone voltage là 15 eV, nhiệt độ của mao
quản được duy trì ở 350oC. Tốc độ khí khử
dung môi (desolvation gas) là 300 L/h. Phổ
khối của các chất phân tích được ghi nhận ở
chế độ ion dương (positive). Sắc kí đồ của
các chất phân tích được theo dõi ở cả hai chế
độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z
100-1000) và SIR (single ion recording). Chế
độ SIR của acid clorogenic ở m/z 355,31;
rhoifolin ở m/z 579,52; neobudofficid ở m/z

739,69; và linarin ở m/z 593,54.

Khảo sát tính tương thích hệ thống
Bảng 6: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng
Thành phần
Acid clorogenic
(30 mg/ml)
Rhoifolin
(18,75 mg/ml)
Neobudofficid
3,75 mg/ml)
Linarin
30 mg/ml)

Chuyên Đề Dược

tR (phút)
TB
RSD%
TB
RSD%
TB
RSD%
TB
RSD%

1,989
0,04
5,829
0,02

7,11
0,07
7,846
0,05

STB
(µV × s)
3787040
0,73
3182400
0,73
728291
0,89
7998000
1,57

N
(biểu kiến)
7817
106680
160595
84759

k’

α

Rs

3,3

11,7

1,13
1,04

2,86

14,5
16,1

As

1,12
1,10

1,04

2,63

1,13

17


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Hình 1: Sắc ký đồ ở chế độ SIR và các phổ khối của các hợp chất tương ứng

18

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

Tính đặc hiệu

Hình 2: Sắc ký đồ (SIR) trong khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng

Chuyên Đề Dược

19


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

Tính tuyến tính
Bảng 7: Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của các chất đối chiếu
Acid clorogenic
STB
C (µg/ml)
(µV×s)
120
14978010

60
7544520
30
3787048
15
1893524
7,5
1074029

Rhoifolin
C (µg/ml)
75
37,5
18.75
9,38
4,69

Neobudofficid
STB
C (µg/ml)
(µV×s)
15
2780080
7,5
1425682
3,75
728291
1,88
367899
0,938

182169

STB
(µV×s)
11991988
6295994
3182499
1610227
829839

Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến
tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh với
R2~0,999 và khoảng tuyến tính các chất phân
tích thể hiện ở Bảng 8.

Linarin
C (µg/ml)
120
60
30
15
7,5

STB
(µV×s)
31876180
15998040
7999020
4031245
1908647

Sau khi xét các hệ số hồi quy, phương
trình tuyến tính thể hiện ở Bảng 8.

Bảng 8: Phương trình tuyến tính
Hợp chất
Acid clorogenic
Rhoifolin
Neobudofficid
Linarin

Phương trình tuyến tính
ŷ = 124100x
ŷ = 158817x
ŷ = 184350x
ŷ = 265886x

Khoảng tuyến tính (mg/ml)
7,5 - 120
4,69 – 75
0,938 – 15
7,5 - 120

2

R
0,9999
0,9994
0,9998
0,9995

Độ lặp lại
Bảng 9: Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình định luợng (n=6)
Hợp chất

A. clorogenic

rhoifolin

neobudofficid

linarin

Hàm lượng (%)
(khối lượng/khối lượng)

1,76±0,03
(RSD = 1,61)

0,86±0,02
(RSD = 2,07)

0,19±0,005
(RSD = 2,42)

1,95±0,096
(RSD = 4,95)

Kết quả cho thấy có sự lặp lại trong phương
pháp phân tích bằng UHPLC-MS với RSD% < 5%.

Như vậy, phương pháp đạt độ lặp lại.

Khảo sát độ đúng
Tất cả các đỉnh cần định lượng đều có tỷ
lệ phục hồi trong giới hạn từ 97 – 105%.

Bảng 10: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy
trình định lượng (n=9)
Tên hợp chất
Acid clorogenic
Rhoifolin
Neobudofficid
Linarin

10%
101,1
101,5
101,3
103,4

Tỷ lệ phục hồi
20%
30%
99,9
104,5
99,3
103,2
102,5
98,2
102,6

97,5

RSD
2,3
1,9
2,0
3,2

Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới
hạn định lượng (LOQ)

Hình 3: Sắc ký đồ (SIR) trong khảo sát LOD của quy trình định lượng

20

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
Kết quả khảo sát LOD và LOQ được trình
bày ở Bảng 11. Trong các polyphenol định
lượng, neobudofficid có LOD thấp nhất với
nồng độ 0,0002 mg/ml.
Bảng 11: Kết quả khảo sát LOD và LOQ của quy
trình định lượng
A.
Rhoifolin Neobudofficid Linarin
clorogenic
(mg/ml)
(mg/ml)

(mg/ml)
(mg/ml)
LOD
0,029
0,0010
0,00020
0,015
LOQ
0,097
0,0033
0,00067
0,050

Hàm lượng các hợp chất phân tích

Nghiên cứu Y học

Bảng 12: Hàm lượng (%) các hợp chất trong lá V.
hardwickii
A. clorogenic rhoifolin neobudofficid
linarin
1,76±0,03
0,86±0,02 0,19±0,005
1,95±0,096

Ghi chú: Hàm lượng được tính bằng% (khối lượng/khối
lượng), n=6

Bảng 13: Hàm lượng (%) acid clorogenic trong V.
hardwickii và V. officinalis

Lá
Thân
Rễ
Lá
Rễ
V.
V.
V.
V.
V.
hardwickii hardwickii hardwickii officinalis officinalis
1,76±0,03 8,23±0,13 1,68±0,03 5,30±0,09 1,45±0,02

Ghi chú: Hàm lượng được tính bằng % (khối lượng/khối
lượng), n=6

Hình 4: Sắc ký đồ (SIR) của acid clorogenic trong V. hardwickii và V. officinalis

Chuyên Đề Dược

21


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019

Nghiên cứu Y học

2.

BÀNLUẬN

Phương pháp UHPLC với đầu dò MS
single quadrupole ACQUITY® QDa chưa được
áp dụng phổ biến. Một vài công trình công bố

3.

với đầu dò này bao gồm các phân tích acid
amin

(phenylalanin,

tyrosin,

tryptophan,

kynurenin) trong chuột , phân tích các
(15)

peptid

(bleomycin

sulfat,

4.
5.

tyrothricin,

vancomycin HCl, bacitracin)(17). Đầu dò này

cũng được dùng để theo dõi phản ứng, xác
định các tạp trong thuốc, xác định thuốc trừ
sâu, flavonoid trong nuớc ép trái cây, các cao

6.

7.
8.

chiết thấm qua da(24). Lần đầu tiên, phương
pháp này được áp dụng trong định lượng các

9.

thành phần trong Valeriana hardwickii và định
lượng acid clorogenic trong V. officinalis.

10.

Phương pháp được xây dựng với thời gian
phân tích ngằn (dưới 10 phút). Trong nghiên cứu

11.

này, hệ dung môi được thăm dò sao cho tách
được acid clorogenic ra khỏi đồng phân của nó,

12.

điều này thể hiện các pic đồng phân này trên sắc

ký đố (Hình 4), việc thăm dò này tốn nhiều thời

13.

gian và thừ với nhiều hệ dung môi.

KẾTLUẬN
Phương pháp UHPLC-MS đã được xây
dựng và đánh giá theo hướng dẫn ICH. Hàm
lượng các hợp chất trong V. hardwickii đã được
định lượng với acid clorogenic có trong lá là
1,76%, trong thân là 8,23% và trong rễ là
1,68%, hàm lượng các flavonoid trong lá bao
gồm rhoifolin là 0,86%, neobudofficid là 0,19%
và linarin là 1,95%. Acid clorogenic trong lá và
rễ của V. officinalis cũng đuợc định lượng với
hàm lượng lần lượt là 5,30% và 1,45%.

14.

15.

16.

TÀILIỆUTHAMKHẢO
1.

22

Bashir S, et al. (2011), "Antispasmodic and

Antidiarrheal Activities of Valeriana hardwickii Wall.
Rhizome Are Putatively Mediated through Calcium
Channel Blockade". Evid Based Complement Alternat
Med. 2011: pp. 304960.

17.

Bell CD (2007), "Phylogenetic placement and
biogeography of the North American species of
Valerianella (Valerianaceae: Dipsacales) based on
chloroplast and nuclear DNA". Molecular Phylogenetics
and Evolution. 44(3): pp. 929-941.
Bell CD, et al. (2005), "Phylogeny and biogeography of
Valerianaceae (Dipsacales) with special reference to the
South American Valerians". Organisms Diversity &
Evolution. 5(2): pp. 147-159.
Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV. NXB Y Học.
Chai SW, et al. (2015), "Chemical constituents from
whole plants of Valeriana hardwickii". Zhongguo Zhong
Yao Za Zhi. 40(20): pp. 4007-11.
Chandra SM, et al. (2007), "Epoxysesquithujene, a novel
sesquiterpenoid
from
Valeriana hardwickii
var.
hardwickii". Fitoterapia. 78(4): pp. 279-282.
Đặng Văn Hòa, et al. (2011), Kiểm nghiệm thuốc. Hà
Nội: NXB Giáo dục Việt Nam.
Đỗ Huy Bích, et al. (2004), Cây thuốc và động vật làm
thuốc ở Việt Nam. Hà Nội: NXB Khoa Học và Kỹ

Thuật.
Đỗ Ngọc Thanh, et al. (1989), "Sơ bộ nghiên cứu quá
trình tách, chiết valepotriat từ rễ cây Nữ lang". Tạp chí
Dược học. 2: pp. 19-20,26.
Houghton PJ (1997), Valerian: The Genus Valeriana.
Medicinal and Aromatic Plants - Industrial Profiles, ed.
Roland Hardman. Vol. 1. Amsterdam - The
Netherlands: Harwood Academic, pp.142.
Huber L, (2007) Regulations, Standards and Guidelines,
in Validation and Qualification in Analytical
Laboratories, Second Edition., CRC Press. p. 9-24.
Huynh L, et al. (2016), "Iridoids and flavonoids from
Valeriana hardwickii Wall". Journal of Pharmacognosy and
Phytochemistry. 5(3): pp. 245.
Huynh L, et al. (2013), "Comparative analysis of the
essential oils of Valeriana hardwickii Wall. from Vietnam
and Valeriana officinalis L. from Austria". Journal of
Essential Oil Research. 25(5): pp. 409-414.
Huỳnh Lời, et al. (2015), "Nghiên cứu về cây Nữ lang
Hardwicke III – Độc tính trên dòng tế bào thần kinh
của isovaleroxyvaltrat hydrin và linarin phân lập từ
Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall.
Valerianaceae) và tác dụng chống oxy hoá của Valeriana
hardwickii và Valeriana officinalis". Chuyên đề Dược, Y
Học TP. Hồ Chí Minh. Phụ bản 19(3): tr. 574-580.
Jaroslav G, et al. (2016), "Quantitative analysis of
phenylalanine, tyrosine, tryptophan and kynurenine in
rat model for tauopathies by ultra-high performance
liquid chromatography with fluorescence and mass
spectrometry detection". Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis. 117: pp. 85-90.
Jayashankar D, et al. (2011), "Volatile Constituents of
Valeriana hardwickii Wall. Root Oil from Arunachal
Pradesh, Eastern Himalaya". Records of Natural Products.
5(1): pp. 70-73.
Matthias DH, et al. (2016), "Implementation of a
single quad MS detector in routine QC analysis of
peptide drugs". Journal of Pharmaceutical Analysis.
6(1): pp. 24-31.

Chuyên Đề Dược


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
18. Meyer FG (1965), "New species of Valeriana from
Colombia, Ecuador, and Peru". Brittonia. 17: pp. 112120.
19. Meyer FG (1979), "A new species of Valeriana
(Valerianaceae) from Venezuela". Brittonia. 31(1): pp.
101-103.
20. Sati S, et al. (2005), "Essential oil composition of
Valeriana hardwickii var. arnottiana from the Himalayas".
Flavour and fragrance journal. 20: pp. 299-301.
21. Takhtajan A (2009), Flowering plants. Springer Science &
Business Media.
22. Võ Văn Chi (2002), Từ điển thực vật thông dụng. Hà Nội:
NXB Khoa Học - Kỹ Thuật.

Chuyên Đề Dược

Nghiên cứu Y học

23. Võ Văn Chi (2010), Tự điển cây thuốc Việt Nam. Hà
Nội: NXB Y Học.
24. Xiaodong B, et al. (2016), "The emergence of low-cost
compact
mass
spectrometry
detectors
for
chromatographic analysis". TrAC Trends in Analytical
Chemistry. 82: pp. 22-34.

Ngày nhận bài báo:

18/10/2018

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

01/11/2018

Ngày bài báo được đăng:

15/03/2019

23