Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào (Jatropha curcas L.) và ứng dụng trong vi nhân giống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

---------  ---------

ĐỖ ĐĂNG GIÁP

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ
NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ CÂY CỌC
RÀO (Jatropha curcas L.) VÀ ỨNG DỤNG TRONG
VI NHÂN GIỐNG
Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 62.62.01.11

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Tp. Hồ Chí Minh, 2016


Công trình được hoàn thành tại:
VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI
VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP MIỀN NAM

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. THÁI XUÂN DU
2. TS. NGUYỄN ĐÌNH LÂM

Phản biện 1: ..................................................................................

Phản biện 2: ..................................................................................

Phản biện 3: ..................................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại
Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam
V o hồi

giờ

ngày ..... tháng ..... năm ......

Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư viện Quốc gia
2. Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
3. Thư viện Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Đối với nước ta, việc sản xuất ethanol có thể có những hạn chế nhất
định, đó l diện6 tích đất nông nghiệp hạn hẹp nên khả năng mở rộng diện
tích trồng cây nguyên liệu có nhiều khó khăn, các cây nguyên liệu cho sản
xuất ethanol sinh học đều là những cây lương thực chủ yếu, cây làm thức
ăn chăn nuôi có liên quan đến an ninh lương thực cần phải xem xét cẩn
trọng Hơn nữa phát triển mạnh việc trồng cây sắn trên đất dốc sẽ gây ra
xói mòn đất (bồi lấp cửa sông, lòng hồ đập...).Cho nên việc định hướng
phát triển diesel sinh học sẽ có nhiều thuận lợi hơn Trong số những loài
cây có khả năng sản xuất diesel sinh học thì cây cọc r o được chú ý hơn

cả do dễ trồng, biên độ sinh thái rộng, khả năng chống chịu tốt và hàm
lượng dầu trong hạt khá cao.
Chương trình phát triển nhiên liệu sinh học nói chung, nói riêng nhất
là từ cây cọc r o đã nhận được sự ủng hộ mạnh mẽ của Nh nước. Ngày
20 tháng 11 năm 2007, Thủ Tướng Chính Phủ đã ra quyết định số
177/2007/QĐ ˗ TTg về việc phê duyệt “Đề án phát triển nhiên liệu sinh
học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025” Ng y 19 tháng 6 năm 2008,
Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ra quyết định số
1842/QĐ˗BNN˗LN về việc phê duyệt Đề án “Nghiên cứu, phát triển và
sử dụng sản phẩm cây cọc rào (Jatropha curcas L.) ở Việt Nam giai
đoạn 2008 ˗ 2015 và tầm nhìn đến 2025”
Hiện nay, cây giống cọc r o được dùng để phát triển vùng nguyên
liệu chủ yếu được gieo từ hạt và cành giâm.Mỗi phương thức sản xuất
giống đều có ưu v nhược điểm nhất định. Cây giống được gieo từ hạt
thì giá thành cây giống thấp nhưng bị phân ly do cọc rào là cây thụ phấn
chéo nên khó kiểm soát được năng suất. Cây giống được sản xuất từ
cành giâm của những cây gieo từ hạt thì cũng không đảm bảo tính đồng
nhất về mặt di truyền. Chính vì vậy, xu hướng gần đây các nh khoa học
nghiên cứu nhân giống theoquy trình kỹ thuật cơ bản như sau: (1) Nhân
giống in vitro một số cây đầu dòng tốt đã tuyển chọn được. Nguyên liệu
nuôi cấy ban đầu có thể l đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi nách; (2)


2
Trồng những cây cấy mô ra đồng ruộng; (3) Chọn lọc lại và nhân giống
bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi soma từ những cây nuôi cấy mô nói trên để
tăng hệ số nhân giống và làm hạ giá thành cây giống.
Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào là một phương pháp mới,
nghiên cứu về khả năng biệt hóa của tế bào. Hệ thống tế bào lớp mỏng
với đặc tính mỏng có nhiều ưu điểm quan trọng để tái thiết lập chương

trình cho việc tạo phôi soma. Sự thuận lợi của phương pháp nghiên cứu
lớp mỏng tế bào là: tần số phát sinh cơ quan cao, đồng thời chỉ trong
thời gian ngắn đã cho kết quả. Nếu chọn được môi trường dinh dưỡng và
nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp thì hầu như 100% mẫu cấy
có phản ứng Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế b o cũng l một phương
pháp mới, nghiên cứu về khả năng biệt hóa của tế bào.
Chỉ thị phân tử được phát triển và ứng dụng từ đầu thập niên 90 của
thế kỷ XX.Sự phát triển và ứng dụng của chỉ thị phân tử để xác định và
sử dụng những biến đổi của DNA là một bước phát triển quan trọng nhất
trong lĩnh vực di truyền chọn giống ở thực vật Cho đến n y đã có rất
nhiều loại chỉ thị phân tử được phát triển v đưa v o sử dụng. Mỗi loại
chỉ thị đều có nguyên lý, kỹ thuật, phạm vi ứng dụng khác nhau và phù
hợp cho từng mục đích nghiên cứu khác nhau. Không có một kỹ thuật
chỉ thị phân tử n o đáp ứng đầy đủ yêu cầu các nhà nghiên cứu.Trong số
các chỉ thị phân tử thì RAPD được xem l tương đối đơn giản và rẻ tiền
nhất để nghiên cứu về tính ổn định di truyền của cây giống nuôi cấy
mô.Trên thế giới, kỹ thuật RAPD được sử dụng rất nhiều trong nghiên
cứu tính ổn định di truyền và lai tạo giống bằng công nghệ nuôi cấy mô
tế bào thực vật. Trong phạm vi nghiên cứu của luận án này, vì tính chất
lịch sử trong đề cương nghiên cứu và giới hạn kinh phí nghiên cứu, thì
kỹ thuật RAPD đã được sử dụng để đánh giá kiểm tra tính ổn định di
truyền của cây con cọc rào từ quy trình vi nhân giống.
Từ những vấn đề đã nêu trên, việc thực hiện luận án: “Nghiên cứu
sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào
(Jatropha curcas L.) và ứng dụng trong vi nhân giống” nhằm đưa ra


3
một phương pháp mới để vi nhân giống hiệu quả số lượng lớn cây cọc
rào chất lượng cao, ổn định về mặt di truyền so với cây đầu dòng.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá
cây cọc rào; Xây dựng được quy trình vi nhân giống hiệu quả từ nuôi
cấy phôi soma; Đánh giá mức độ ổn định di truyền ở cây cọc rào vi nhân
giống tạo thành bởi phôi soma được cảm ứng từ mô sẹo nuôi cấy bằng
kỹ thuật lớp mỏng tế bào lá, từ đó l m cơ sở cho việc sản xuất cây giống
in vitro.
3. Tính mới của đề tài
Luận án đã xây dựng được quy trìnhvi nhân giống từ phôi soma cây
cọc rào thông qua kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá. Quy trình đảm
bảo các mục tiêu có hiệu suất nhân giống cao, ổn định di truyền, chất
lượng tốt Đây l quy trình được xây dựng đầu tiên ở Việt Nam và có
một v i điểm cải tiến so với những kết quả nghiên cứu trên thế giới.
Trong đề t i n y đã nghiên cứu thay thế các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật ngoại sinh bằng một số acid amine và polyamine trong một số
giai đoạn của quá trình phát sinh phôi soma trên cây cọc r o Đây có thể
là tính mới của luận án so với những kết quả nghiên cứu phát sinh phôi
soma trên cây cọc rào ở trong nước cũng như trên thế giới.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học: Đây l một hướng nghiên cứu mới trong nuôi cấy
in vitro tại Việt Nam trên đối tượng cây cọc rào; Đề t i đóng góp một số
kết quả nghiên cứu về phát sinh hình thái, di truyền chọn giống cũng
như vi nhân giống cây thân gỗ.
Ý nghĩa thực tiễn:Từ quy trình vi nhân giống của luận án có thể sản
xuất cây giống cọc rào ổn định về mặt di truyền, có năng suất và hàm
lượng dầu cao đáp ứng cho nhu cầu cao của xã hội; Các cá nhân, cơ
quan có nhu cầu nghiên cứu có thể sử dụng tham khảo quy trình công
nghệ vi nhân giống cây cọc rào từ kết quả của đề tài này; Một số cơ quan

4
nghiên cứu, doanh nghiệp cần được chuyển giao quy trình công nghệ vi
nhân giống cây cọc rào từ kết quả của đề tài này.
5. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu trên đối tượng cây cọc rào giống Ấn Độ. Giống
n y đã được nhập nội đã được khảo nghiệm từ đề tài: “Nghiên cứu tuyển
chọn giống và công nghệ trồng cây dầu mè Jatropha curcasL. để sản
xuất diesel sinh học góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường thành phố”
đã được thực hiện do Ban quản lý Khu Nông nghiệp Công nghệ cao
thành phố Hồ Chí Minh chủ trì từ năm 2007 - 2010. Lá của những cây
cọc r o trưởng th nh được thu nhận và sử dụng làm vật liệu nghiên cứu.
Phạm vi nghiên cứu: Sử dụng những phương pháp nuôi cấy mô tế
bào thực vật trong xây dựng quy trình vi nhân giống cây cọc rào từ phôi
soma; Sử dụng những công cụ hiện đại trong đánh giá mức độ ổn định di
truyền ở cây giống từ phôi soma; Sử dụng phương pháp giải phẫu mô tế
bào thực vật và quan sát hình thái trong nghiên cứu phát sinh hình thái.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 132 trang, được chia thành các phần: Mở đầu (04
trang); Chương 1 Tổng quan tài liệu (36 trang); Chương 2 Nội dung và
phương pháp (17 trang); Chương 3 Kết quả - thảo luận (54 trang); Kết
luận và kiến nghị (02 trang). Các công trình công bố liên quan đến luận
án (01 trang); Tài liệu tham khảo (18 trang) với 223 tài liệu tham khảo
trong đó có 17 tài liệu tiếng Việt và 206 tài liệu tiếng Anh. Luận án có
12 bảng số liệu, 26 hình.
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Cây cọc rào (Jatropha curcas L.) thuộc họ cây Thầu dầu
(Euphorbiaceae) có nguồn gốc từ châu Mỹ được biết đến với nhiều giá
trị trong sản xuất phân hữu cơ, thuốc trừ sâu, dược liệu, đặc biệt là ứng
dụng trong sản xuất dầu diesel sinh học (biodiesel) thân thiện với môi

trường với h m lượng dầu trong hạt cao 35 - 40%, 50 - 60% ở nhân hạt
(Sunder và cộng sự, 2006) Để sản xuất biodiesel hiệu quả từ cây cọc rào


5
điều quan trọng là cần có giống tốt và nhân những cây đầu dòng để phát
triển vùng nguyên liệu (Isabel và cộng sự, 1993; Leroy và cộng sự,
2000). Vi nhân giống cây J. curcas đã được nghiên cứu nhiều trên thế
giới, cây con được tái sinh từ nuôi cấy các bộ phận khác nhau như: chồi
nách, chồi đỉnh, đốt thân, lá,…(Isabel và cộng sự, 1993; Leela và cộng
sự, 2011; Leroy và cộng sự 2000). Quá trình phát sinh phôi soma ở cây
cọc rào trở thành một phương pháp lý tưởng để nhân giống tạo số lượng
lớn cây giống v phương pháp n y đã được áp dụng thành công trên cây
cọc rào (Bennici và cộng sự, 2004; Fourré và cộng sự, 1997; Ishii và
cộng sự, 1999; Nhut và cộng sự, 2013).
Tuy nhiên, tính không đồng nhất di truyền của tế bào soma và tác
động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy in vitro có thể góp phần
làm xuất hiện các biến dị soma, điều này dẫn đến sự chọn lọc mất ổn
định v l m tăng sự biến dị di truyền trong suốt giai đoạn đầu nuôi cấy.
Việc đánh giá tính ổn định di truyền của cây giống cấy mô cần được
quan tâm để định hướng trong quá trình sản xuất cây giống hàng loạt.
Trong luận án này, sử dụng phương pháp RAPD để đánh giá sự ổn
định di truyền ở cây cọc r o được tái sinh thông qua phôi soma dưới tác
động của các yếu tố theo thời gian nuôi cấy trong quá trình nuôi cấy in
vitro có thể góp phần làm xuất hiện các biến dị soma. Để bổ sung cho
tính chính xác cao của phương pháp RAPD, trong luận án có nghiên cứu
khả năng biến di kiểu hình và sử dụng phương pháp dòng chảy tế bào
trong đánh giá biến dị ở mức đa bội thể của cây nhân giống từ phôi soma.
Kết quả nghiên cứu này sẽ giúp định hướng thiết lập quy trình nhân
giống, giúp sản xuất cây cọc rào với số lượng lớn trong thời gian ngắn

bằng kỹ thuật vi nhân giống.
Chƣơng 2
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
Địa điểm thí nghiệm: Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc Gia về
Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới.


6
Thời gian thực hiện: Thời gian thực hiện từ tháng 01/2011 đến
tháng 03/2015.
Đối tƣợng nghiên cứu: Đối tượng được sử dụng là giống cọc rào
(Jatropha curcas L ) được nhập từ Ấn Độ trồng tại vườn ươm của Viện
Sinh học nhiệt đới.
Giống Ấn Độ nhập nội đã được khảo nghiệm từ đề t i “Nghiên cứu
tuyển chọn giống và công nghệ trồng cây dầu mè Jatropha curcas L để
sản xuất diesel sinh học góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường thành
phố” đã được thực hiện do Ban quản lý Khu Nông nghiệp Công nghệ
cao thành phố Hồ Chí Minh chủ trì từ năm 2007– 2010.
2.1. Nội dung nghiên cứu
2.1.1. Nội dung 1: Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan phôi soma
 Nội dung 1.1. Khảo sát tạo nguồn mô sẹo có khả năng sinh phôi
từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá
 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ auxin ngoại
sinh lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào lá
 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và
kinetin lên khả năng sinh phôi soma
 Nội dung 1.2. Khảo sát khả năng tăng sinh, sự biệt hóa và
trưởng thành của nguồn mô sẹo có khả năng sinh phôi: ảnh hưởng của
một số nồng độ acid amine và spermidine
 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ proline lên sự

hình thành phôi soma
 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glutamine lên sự
hình thành phôi soma
 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ adenine sulphate
lên sự hình thành phôi soma
 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ spermidine lên
sự hình thành phôi soma
 Nội dung 1.3. Khảo sát khả năng tái sinh, phát triển thành cây
con hoàn chỉnh của phôi soma


7
 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên
sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi soma
 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA, NAA lên
sự phát triển rễ của cây con tái sinh từ phôi soma
 Thí nghiệm 9: Khảo sát khả năng ươm cây từ phôi soma ở vườn
ươm, thử nghiệm một số loại giá thể
2.1.2. Nội dung 2: Đánh giá mức độ ổn định di truyền của cây giống
từ phôi soma
 Nội dung 2.1. Khảo sát mức độ biến dị kiểu hình ở cây phát
triển từ phôi soma
 Thí nghiệm 10: Khảo sát các biến dị kiểu hình ở cây phát triển từ
phôi soma
 Nội dung 2.2. Khảo sát mức độ bội thể của cây giống từ phôi
soma
+ Thí nghiệm 11: Sử dụng phương pháp dòng chảy tế b o đánh
giá mức độ bội thể của cây cọc rào nhân giống in vitro
 Nội dung 2.3. Khảo sát mức độ biến dị di truyền của cây giống
từ phôi soma

+ Thí nghiệm 12: Sử dụng kỹ thuật RAPD để so sánh về mặt di
truyền của cây giống từ phôi soma với cây đầu dòng
2.1.3. Nội dụng 3: Xây dựng quy trình vi nhân giống cây cọc rào từ
nuôi cấy phôi soma
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp giải phẫu quan sát hình thái của phôi soma, mô
sẹo có khả năng sinh phôi và mô sẹo không có khả năng sinh phôi
Hình thái của phôi, mô sẹo được theo dõi bằng phương pháp giải
phẫu, nhuộm hai màu (Nguyễn Tiến Bân và cộng sự, 1979).
2.2.2. Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào thực vật
Các lá sẽ được cắt nhỏ theo kỹ thuật lớp mỏng tế bào (Tran Thanh
Van, 1973) theo chiều ngang, mỗi mảnh nhỏ lá có kích thước 0,5 mm x
10 mm v được dùng làm vật liệu nuôi cấy cho từng thí nghiệm cụ thể.


8
2.2.3. Phân tích và xử lý số liệu
Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu thí nghiệm hoàn toàn
ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD) theo phương pháp
của Compton và Mize, 1999, sử dụng để nghiên cứu thực vật trong
phòng thí nghiệm và nhà kính [37]; Số liệu được ghi nhận và xử lý bằng
phần mềm Statgraphics Centurion XV I theo phương pháp LSD - Least
Significant Difference (Hayter, 1986) ở mức ý nghĩa 5% [82]
2.2.4. Điều kiện nuôi cấy
- Điều kiện nuôi cấy mô: Thời gian chiếu sáng l 10h/ng y, cường độ
chiếu sáng là 2500 lux. Nhiệt độ: 25  2C Độ ẩm trung bình: 60  5%.
- Điều kiện ngo i vườn ươm: Vườn ươm theo chuẩn được che sáng.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
3.1. Kết quả

3.1.1. Ảnh hƣởng của các auxin ngoại sinh lên sự phát sinh hình thái
của lớp mỏng tế bào lá
Ảnh hưởng của auxin NAA, IBA lên sự phát sinh hình thái của
lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào
Sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung IBA và NAA
riêng lẻ ở các nồng độ khác nhau cho thấy các mẫu cấy lớp mỏng lá của
cây cọc rào không có sự hình thành mô sẹo mà còn có dấu hiệu hóa nâu
và chết. Từ kết quả thu được chúng tôi có thể kết luận rằng IBA và NAA
là những loại auxin ngoại sinh không thích hợp để cảm ứng sự hình
thành mô sẹo của TCL lá cây cọc rào.
Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng
tế bào lá cây cọc rào
Kết quả cho thấy 2,4-D cảm ứng hiệu quả sự tạo mô sẹo từ nuôi cấy
lớp mỏng lá cây cọc rào. Nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D đạt kết
quả ở các chỉ tiêu khối lượng tươi 77,75 mg, khối lượng khô 4,11 mg, tỷ
lệ tạo mô sẹo 98,40%, tỷ lệ sống 90,30%.


9
Quan sát hình thái giải phẫu bằng phương pháp nhuộm kép
acetocarmine v Evan’s blue được sử dụng để nhuộm tế bào. Các tế bào
có khả năng phát sinh phôi có nhân lớn và tế bào chất đậm đặc nhuộm
m u đỏ sáng mạnh với acetocarmine. Kết quả cho thấy trên môi trường
có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D có hiệu quả để cảm ứng sự hình thành mô sẹo
có khả năng sinh phôi soma cây cọc rào.
Bảng 3.1.Ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D lên sự phát sinh hình thái sau 28 ngày nuôi cấy
Nghiệm
Nồng độ 2,4-D Khối lƣợng
Khối lƣợng
Tỷ lệ tạo

Tỷ lệ sống
thức
(mg/l)
tƣơi (mg)
khô (mg)
mô sẹo (%)
(%)
D0
0,0
0,80dx
0,16e
0,00c
20,36d
D1
0,1
8,01c
1,13d
10,52b
60,18c
D2
0,5
77,75b
4,11c
98,40a
90,30b
D3
1,0
80,44a
5,20a
97,95a

93,58a
D4
1,5
81,62a
4,71b
98,79a
92,22ab
y
ANOVA
*
*
*
*
77,24
68,58
77,47
41,16
CV%
x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD.
y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

3.1.2. Ảnh hƣởng của sự kết hợp 2,4-D và kinetin lên khả năng phát
sinh phôi soma
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo
Nghiệm
2,4-D
Kinetin
Khối lƣợng tƣơi Tỷ lệ hình thành phôi
thức
(mg/l)

(mg/l)
(mg)
(%)
A1
0,5
0,5
12,86dx
30,43f
A2
0,5
1,0
62,95a
77,33a
A3
0,5
1,5
50,52b
56,72b
A4
0,5
2,0
33,19c
49,52c
A5
0,5
14,52d
41,33e
A6
1,0
60,33a

79,29a
A7
1,5
27,14c
46,76d
A8
2,0
28,38c
44,67d
ANOVAy
*
*
52,08
30,89
CV%
x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD.
y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thí nghiệm cho thấy có sự hình thành
phôi từ mô sẹo cây cọc r o trên môi trường có bổ sung 2,4˗D v kinetin
ở các nồng độ khác nhau (Bảng 3.2) Môi trường khoáng cơ bản MS có
bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D v 1,0 mg/l KINđược ghi nhận có hiệu quả tốt
nhất để cảm ứng sự hình thành phôi từ mô sẹo có khả năng sinh phôi
soma cây cọc rào với khối lượng tươi (62,95 g) v tỷ lệ hình thành phôi
l (77,33%) đạt cao nhất so với các nghiệm thức cùng khảo sát. Mẫu cấy


10
trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l KIN đạt tỷ lệ cao về số mô sẹo phát
sinh phôi (79,29%) và phôi soma phát triển qua nhiều giai đoạn: dạng

cầu, dạng tim, dạng thủy lôi và dạng lá mầm.
3.1.3. Ảnh hƣởng của nồng độ proline lên sự hình thành phôi soma
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ proline lên sự hình thành phôi soma
Proline
Khối lƣợng tƣơi
Tỷ lệ hình thành phôi/mẫu
Số phôi/mẫu
(mg/l)
(mg)
(%)
0
11,66cx
13,00c
23,33d
250
45,07b
50,07b
50,00c
500
47,87b
52,83b
60,00bc
750
72,33a
81,37a
86,67a
1000
50,70b
56,80b
66,67b

ANOVAy
*
*
*
45,42
45,42
38,71
CV%
x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD.
y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thí nghiệm cho thấy có sự khác biệt
đáng kể về mặt thống kê giữa các nghiệm thức bổ sung proline và
nghiệm thức đối chứng. Khi tiếp tục gia tăng h m lượng proline lên, các
chỉ tiêu theo dõi cũng có sự gia tăng v đạt cao nhất ở nghiệm thức có
thành phần proline bổ sung là 750 mg/l với tỷ lệ hình thành phôi là
86,66%, số lượng phôi hình thành là 72,33 phôi/mẫu và khối lượng tươi
là 81,37 mg. Nhìn chung, kết quả thí nghiệm cho thấy proline có tác
động hiệu quả đối với sự hình thành phôi soma từ mẫu cấy mô sẹo có
khả năng phát sinh phôi của cây cọc rào. Không chỉ giúp gia tăng sự tạo
phôi, sự gia tăng khối lượng tươi của mẫu ở tất cả các nghiệm thức có bổ
sung proline cũng cho thấy proline có hiệu quả kích sinh sự tăng trưởng
ở đây l sự gia tăng sinh sinh khối mẫu cấy.
3.1.4. Ảnh hƣởng của nồng độ glutamine lên sự hình thành phôi
soma
Trong thí nghiệm này, mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được
cấy v o môi trường MS cảm ứng phát sinh phôi, có bổ sung glutamine ở
các nồng độ từ 50 đến 200 mg/l. Các mẫu được cấy trên môi trường có
bổ sung glutamine ở các nồng độ khác nhau (từ 50 ˗ 150 mg/l) đạt tỷ lệ
hình thanh phôi cao từ 53,33% đến 83,33%. Ở nghiệm thức có bổ sung

150 mg/l glutamine cho hiệu quả tạo phôi cao nhất với tỷ lệ hình thành


11
phôi là 83,33%, số lượng phôi hình thành là 67,6 phôi và khối lượng
tươi của mẫu cấy là 104 mg.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glutamine lên sự hình thành phôi soma
Glutamine
Khối lƣợng tƣơi
Tỷ lệ hình thành phôi/mẫu
Số phôi/mẫu
(mg/l)
(mg)
(%)
0
11,66cx
13,10c
23,33d
50
33,13c
38,10b
53,33c
100
46,40b
52,87b
70,00b
150
67,60a
104,30a
83,33a

200
48,23b
54,00b
63,33bc
y
ANOVA
*
*
*
46,72
68,39
36,93
CV%
x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD.
y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

3.1.5. Ảnh hƣởng của nồng độ adenine sulphate lên sự hình thành
phôi soma
Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thí nghiệm cho thấy có sự khác biệt
đáng kể về mặt thống kê giữa các nghiệm thức bổ sung adenine sulphate
và nghiệm thức đối chứng. Nghiệm thức bổ sung 150 mg/l adenine
sulphate cho kết quả tốt nhất ở các nghiệm thức khảo sát trong thí
nghiệm với số liệu cụ thể là 76,67% ở tỷ lệ hình thành phôi với số phôi
trung bình 52,43 phôi/mẫu và khối lượng tươi của mẫu là 59 mg, khác
biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ adenine sulphate lên sự hình thành phôi soma
Adenine
Khối lƣợng tƣơi
Tỷ lệ hình thành phôi/mẫu
sulphate

Số phôi/mẫu
(mg)
(%)
(mg/l)
x
0
11,66c
13,10c
23,33d
50
29,07c
33,50c
46,67c
100
41,40b
47,23b
63,33b
150
52,43a
59,23a
76,67a
200
39,27b
44,37b
53,33bc
ANOVAy
*
*
*
42,15

41,82
36,22
CV%
x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD.
y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

3.1.6. Ảnh hƣởng của nồng độ spermidine lên sự hình thành phôi
soma
Kết quả cho thấy có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê giữa các
nghiệm thức Trên môi trường có bổ sung spermidine, tỷ lệ hình thành
phôi của các mẫu cấy cao hơn so với môi trường không bổ sung
spermidine Trong đó, nghiệm thức bổ sung permidine ở nồng độ 0,03


12
mg/l cho hiệu quả cao nhất với tỷ lệ phát sinh phôi đạt 100%, số lượng
phôi hình thành là 102,70 phôi và khối lượng tươi trung bình l 1139 mg
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ spermidine lên sự hình thành phôi soma
Spermidine
Khối lƣợng tƣơi
Tỷ lệ hình thành phôi/mẫu
Số phôi/mẫu
(mg/l)
(mg)
(%)
0,00
11,67d
13,40d
23,33e
0,01

63,37c
71,73c
76,67c
0,03
102,70a
113,90a
100,00a
0,05
81,27b
91,20b
90,00b
0,07
61,13c
67,47c
70,00d
y
ANOVA
*
*
*
48,83
50,55
39,00
CV%
x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD.
y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

3.1.7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng khoáng lên sự hình thành rễ của
cây con tái sinh từ phôi soma
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi

soma
Tỷ lệ hình
MT
Số lƣợng
Chiều dài rễ
Khối lƣợng rễ
Chiều cao
thành rễ
khoáng
rễ
(cm)
(mg)
cây (cm)
(%)
1/2MS
1,00dx
0,54e
2,83e
1,29d
79,95d
MS
3,33b
1,57b
13,29b
2,13a
93,33b
B5
4,07a
2,02a
17,53a

2,38a
100,00a
WHITE
2,87c
1,28d
10,37d
2,11b
86,67c
WPM
3,07c
1,44c
11,70c
1,93c
93,33b
ANOVAy
*
*
*
*
*
36,93
36,52
44,73
19,34
8,12
CV%
x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD.
y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

Trong thí nghiệm này, các phôi hình thành lá mầm được nuôi cấy

trên các môi trường khoáng khác nhau. Tỷ lệ hình thành rễ của cây con
từ phôi soma đạt tương đối cao từ 80% đến 100% trên tất cả các môi
trường khảo sát. Trên môi trường B5, tỷ lệ hình th nh rễ cũng như các
chỉ tiêu khác đều cao hơn v khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các
nghiệm thức còn lại Cây con có sự hình thành rễ đạt 100% và phát triển
tốt hơn so với các môi trường khoáng khác với số lượng rễ trung bình
(4,07 rễ), chiều dài rễ (2,02 cm), khối lượng rễ (17,53 mg) và chiều cao
cây con (2,38 cm) đạt được cao nhất Môi trường MS v WPM cũng cho
thấy có hiệu quả trong việc thúc đẩy sự hình thành rễ và phát triển của
cây con, tuy nhiên rễ hình th nh trên các môi trường này ngắn và bị yếu
hơn so với rễ hình th nh trên môi trường B5.


13
3.1.8. Ảnh hƣởng của IBA, NAA lên sự phát triển rễ của cây con tái
sinh từ phôi soma
Kết quả tốt nhất của thí nghiệm được ghi nhận ở nghiệm thức bổ
sung 1,5 mg/l IBA với số lượng rễ (4,53 rễ), chiều dài rễ (3,02 cm), khối
lượng rễ (27,07 mg), chiều cao cây (3,23 cm) đạt cao nhất. Cả IBA và
NAA đều cho thấy hiệu quả kích thích hình thành rễ của cây tái sinh từ
phôi soma. Khi so sánh hiệu quả của IBA và NAA, ở cùng một nồng độ,
các nghiệm thức bổ sung IBA đều có ảnh hưởng tốt hơn các nghiệm
thức bổ sung NAA lên sự hình thành rễ cây cọc rào trong thí nghiệm này,
các rễ hình thành trên môi trường bổ sung IBA to khỏe, nhiều v d i hơn
các rễ hình th nh trên môi trường chứa NAA.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của IBA, NAA lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi soma
CĐHSTTV (mg/l)
IBA

Số

lƣợng
rễ

Chiều dài
rễ (cm)

0
0
0,5
1,0
1,5
2,0
0,5
1,0
1,5
ANOVAy
CV%

3,47dx
3,73cd
3,93bc
4,17b
4,10b
3,67cd
4,00bc
4,53a
*
8,51

1,62h

1,83g
2,13e
2,58b
2,37d
1,99f
2,32d
3,02a
*
18,02

NAA

Khối lƣợng
rễ (mg)

Chiều
cao cây
(cm)

Tỷ lệ tạo
rễ (%)

14,07g
15,97f
19,13d
22,97b
21,03c
17,03e
21,37c
27,07a

*
19,72

2,31f
2,36f
2,57d
3,03b
2,77c
2,45e
2,62d
3,23a
*
11,52

86,67c
93,33b
100a
100a
100a
93,33b
100a
100a
*
5,58

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD.
y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

3.1.9. Khảo sát khả năng ƣơm cây từ phôi soma ở vƣờn ƣơm, thử
nghiệm một số loại giá thể

Tỷ lệ sống của cây và khả năng phục hồi (phát triển rễ, ra lá mới và
tăng trưởng về chiều cao) là mối quan tâm đầu tiên khi đưa cây con in
vitro ra ngo i vườn ươm Trên các giá thể trồng khác nhau khả năng sinh
trưởng của bộ rễ cũng sẽ khác nhau, điều này ảnh hưởng đến tỷ lệ sống
và khả năng phục hồi sinh trưởng của cây trồng sau khi chuyển từ môi
trường in vitro ra môi trường ex vitro. Yêu cầu của giá thể là vừa đảm
bảo độ tơi xốp, có khả năng thoát nước tốt, có tính giữ ẩm cao đồng thời
phải hoàn toàn sạch các mầm bệnh. Trên giá thể mụn dừa tỷ lệ cây sống


14
và số rễ trung bình trên một cây của cây con ngo i vườn ươm đạt cao
nhất, tương ứng là 97,78% và 33,57 rễ.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng sinh trưởng và phát triển cây từ phôi soma khi ra
vườn ươm
Nghiệm thức

Tỷ lệ sống
(%)

Số rễ trung bình
(cái)

97,78ax
96,67a
97,78a
93,33ab
88,89b
86,67b
*

5,92

19,60b
14,07c
33,57a
15,43c
15,30c
7,23d
*
47,65

1 Đất sạch
2 Đất
3. Mụn dừa
4. Mụn dừa + đất sạch (1:1)
5. Mụn dừa + đất (1:1)
6. Mụn dừa + đất + cát (1:1:1)
ANOVAy
CV%

x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD.
y *: khác biệt có mức ý nghĩa ở p ≤ 0,05.

3.1.10. Khảo sát các biến dị kiểu hình ở cây phát triển từ phôi soma
Theo quan sát và phân loại các kiểu hình từ 300 cây cọc rào in vitro
thông qua tái sinh phôi soma đã thu được kết quả. Kết quả cho thấy số
cây không nhận thấy biến dị kiểu hình là 217 cây với tỷ lệ chiếm 72,30%.
Đặc điểm dễ nhận thấy ở những cây n y có thân vươn thẳng cao từ 0,5 ˗
1,0 cm, thân tròn, khỏe. Có lá hình ovan hoặc hình trái tim, mép lá thẳng
không bị xoắn lại; lá chia thùy và mọc theo kiểu xen kẻ, sắp xếp luân

phiên nhau dọc theo thân và tập trung ở phần ngọn.
Bảng 3.10.Kết quả phân loại kiểu hình
STT

Kí hiệu

Loại biến dị

Số lƣợng (cây)

Tỷ lệ
(%)

1
2
3
4

BT
BD1
BD2
BD3

Cây không biến dị
Cây biến dị ở lá
Cây biến dị ở thân
Cây biến dị cả thân và lá

217
24

6
53

72,30
8,00
2,00
17,70

3.1.11. Sử dụng phƣơng pháp dòng chảy tế bào đánh giá mức độ bội
thể của cây cọc rào nhân giống in vitro
Các nghiên cứu trước đây đã sử dụng phương pháp dòng chảy tế
bào (flow cytometry-CMF) để khảo sát mức độ bội thể của cây cọc rào
được nhân giống in vitro bằng các phương pháp khác nhau: nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng; nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá; nuôi cấy phôi soma. Kết
quả cho thấy 100% các cây cọc rào vi nhân giống bằng những phương


15
pháp nêu trên đều mang bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n), không có dạng
dị bội nào.
3.1.12. Sử dụng kỹ thuật RAPD để so sánh về mặt di truyền của cây
giống từ phôi soma với cây đầu dòng
Sử dụng 2 mẫu cây đầu dòng (BM1 và BM2) thực hiện phản ứng
RAPD với 19 mồi để sàng lọc các mồi hữu hiệu dùng cho khảo sát các
biến dị kiểu gen của 8 mẫu nghiên cứu. Sau khi sàng lọc mồi với mẫu
BM chọn được 8 mồi OPAL12, OPG02, OPAK14, OPC18, OPB01,
OPAW07, OPM11, OPB07 cho kết quả với tổng số băng đủ lớn, các
băng phân biệt rõ, riêng biệt để thực hiện đánh giá tính ổn định của các
mẫu cọc rào sau khi nhân giống phôi soma bằng phản ứng RAPD.
Phản ứng RAPD sử dụng 8 mồi thu được 47 băng, tổng số băng của

mỗi mồi khoảng 4 ˗ 8 v kích thước sản phẩm khuếch đại 370 ˗ 3000 bp
Bảng 4.12 cho thấy đa số các mồi cho kết quả đồng hình tuy nhiên có xuất
hiện các băng đa hình ở 2 mồi (OPM11, OPG02).
Khoảng cách di truyền giữa 8 mẫu con với cây dầu dòng được thể hiện.
Các mẫu được chia thành 3 nhóm lớn kiểu di truyền. Nhóm 1 bao gồm
BM1, BM2, L1 1 v L1 2 (97,44% tương đồng). Nhóm 2 gồm L3.1, L3.2
v L6 1 (98,37% tương đồng). Nhóm 3 là mẫu L6.2, L9.1, L9.2 (100%
tương đồng). Khoảng cách di truyền xa nhất với BM1, BM2 là L6.2, L9.1
v L9 2 (95,83% tương đồng), trong khi đó mẫu tương đồng gần nhất với
BM l L1 1 v L1 2 (tương đồng 100%) Điều này cho thấy các mẫu có độ
tương đồng cao (0,985) đảm bảo cây con từ phôi soma có tính ổn định di
truyền cao so với cây bố mẹ. Tuy nhiên khoảng cách di truyền tăng sau
các lần cấy truyền do nhiều yếu tố tác động trong quá trình nhân giống
như môi trường nuôi cấy, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng.
3.1.13. Quy trình nhân giống in vitro cây cọc rào từ nuôi cấy phôi
soma
Theo quy trình vi nhân giống cây cọc rào bằng nuôi cấy phôi soma,
sau 49 tuần thời gian (khoảng 1 năm) từ một mẫu lá non từ cây bố mẹ
thông qua chọn lọc chúng ta có thể tạo ra được trên 5 triệu cây giống
phôi soma. Cây giống n y đảm bảo các tính năng: ổn định di truyền so


16
với cây bố mẹ, sạch bệnh, có rễ cọc giống cây từ hạt Đồng thời với hệ
số nhân giống lớn như vậy quy trình này có thể đáp ứng được nhu cầu
cây giống rất lớn ở quy mô canh tác cây cọc rào sau này.
3.2. Thảo luận
3.2.1. Thảo luận nội dung 1
Hệ thống vi nhân giống cây cọc rào thông qua kỹ thuật nuôi cấy phôi
soma có thể giải quyết được 3 nhược điểm của những phương pháp nhân

giống cổ điển mắc phải trên đối cây này gồm:
- Khả năng chống chịu điều kiện ngoại cảnh kém của cây giâm
cành: cây cọc rào là loại cây có khả năng chịu hạn cao, được trồng ở
những vùng khô hạn. Do vậy, phương pháp nhân giống bằng giâm cành
đối với lo i cây n y có đời sống ngắn hơn v khả năng chống hạn và
bệnh tật kém hơn cây nhân giống bằng hạt. Bởi vì, cây con từ cành giâm
không tạo được rễ cọc thật sự nên khả năng kháng hạn kém, thay v o đó
chúng tạo ra các rễ cọc giả chỉ có thể cắm xuống đất khoảng 1/2 - 2/3 so
với rễ cọc được tạo ra từ cây con gieo hạt. Rễ của cây giâm cành phát
triển yếu, dễ bị gãy đổ. Phôi soma ở cây cọc r o đều có cấu trúc lưỡng
cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, m dưới những điều kiện thích
hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng ho n chỉnh gần
giống như hạt hữu tính (Dương Tấn Nhựt, 2007) Do đó những cây
giống từ phôi soma sẽ cũng có rễ cọc như cây từ hạt hữu tính và khả
năng chống chịu khô hạn và bệnh tật cũng như cây hữu tính.
- Khả năng biến dị di truyền do thụ phấn chéo của cây gieo hạt:
trồng cây cọc r o để khai thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống
bằng gieo hạt được sử dụng nhiều hơn Hạt trước khi đem gieo được lựa
chọn là những hạt to, chắc, mẩy. Hạt được ngâm nước qua đêm để làm
tăng tỷ lệ nảy mầm. Hôm sau, hạt được gieo vào trong các bầu đất. Hạt
sẽ nảy mầm sau khoảng 1 tuần và cây con có thể đem đi trồng sau 45
ngày. Rễ của cây con mọc từ hạt phát triển, thường có 1 rễ cái và 4 rễ
bên. Cây trồng ngoài thực địa sẽ ra hoa sau khoảng 3 - 4 năm Tuy nhiên
nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con
không đồng nhất bởi cây cọc rào là cây thụ phấn chéo nên giữa các hạt


17
có sự khác nhau về mặt di truyền Như xét tính trạng h m lượng dầu
trong hạt, các cây tạo ra bằng gieo hạt có h m lượng dầu trong hạt không

ổn định, giao động từ 4 đến 40 %. Vì vậy ở những cây cọc rào nhân
giống bằng phương pháp nuôi cấy phôi soma về nguyên tắc thì những
cây con được tái sinh bằng con đường n y thì đều có vật chất di truyền
giống hệt tế b o sinh dưỡng của cha mẹ, nếu tế b o n y được chuyển
gen thì cây tái sinh là cây chuyển gen Do đó những cây giống phôi
soma đều đồng nhất về mặt di truyền so với những cây đầu dòng đã qua
chọn lọc.
- Hạn chế của hệ số nhân giống không cao, không chủ động trong
nhân giống, cây con không ổn định di truyền so với cây bố mẹ đối với
nhân giống bằng hạt: phôi soma rất giống phôi hữu tính ở hình thái và
sinh lý nhưng không có quá trình tái tổ hợp di truyền do phôi soma
không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái.
Về nguyên tắc, tất cả những cây con được tái sinh bằng con đường này
đều có vật chất di truyền giống hệt các tế b o sinh dưỡng cha mẹ, nếu tế
b o n y được chuyển gen thì các cây tái sinh là cây chuyển gen. Nhân
giống vô tính thực vật qua con đường phát sinh phôi soma cho hệ số
nhân rất cao, ổn định về mặt di truyền so với cây bố mẹ được chọn lọc.
3.2.2. Thảo luận chung nội dung 2
Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính nói chung và kỹ thuật nhân giống
thông qua nuôi cấy phôi soma nói riêng được sử dụng nhằm mục đích
tạo ra quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương
pháp cũng tạo ra những quần thể biến dị tế bào soma. Những biến dị này
được nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng rất ít
những biến dị có lợi được báo cáo.
Đối với mức độ biến dị kiểu hình ở cây cọc rào nuôi cấy phôi soma:
cho thấy có nhiều kiểu biến dị khác nhau. Tổng số cây có biểu hiện biến
dị kiểu hình chiếm tỷ lệ 27,7%. Kết quả trên cho thấy tỷ lệ các cây có
biểu hiện biến dị kiểu hình là khá cao. Các biến dị kiểu hình này xuất
hiện có thể là do tác động của quá trình nuôi cấy mô, vì trong môi
trường nuôi cấy mô sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ

18
cao đã tác động vào quá trình biểu hiện gen. Một số ghi nhận ở những
đối tượng cây như cây bông vải, lúa nước (Oryza), lúa mì (Triticum)
cây ho n chỉnh phát sinh thông qua giai đoạn callus thì tần số cây bị
bạch tạng hoặc cây không phát triển bình thường chiếm khá cao (20 –
30 % hoặc cao hơn nữa). Tuy nhiên, các thay đổi kiểu hình có thể là tạm
thời và sẽ không di truyền cho thế hệ sau. Cây cọc rào in vitro từ nuôi
cấy phôi soma biến dị kiểu hình thường kém phát triển so với cây bình
thường, không sống được khi đưa ra ngo i vườn ươm Do đó, trong luận
án này, đối với cây cọc rào từ phôi soma có biến dị kiểu hình sẽ được
loại bỏ ngay v không đưa ra ngo i vườn ươm Quá trình n y nhằm cũng
phần n o đó đã l m giảm khả năng cây cọc rào nhân giống thông qua
nuôi cấy phôi soma triển khai ngo i vườn ươm có biến dị kiểu gen Như
vậy quy trình vi nhân giống cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma chỉ nhận
được kết quả với tỷ lệ khoảng 70% cây hình thành có khả năng ra ngo i
vườn ươm Tỷ lệ này là chấp nhận được với hai mục tiêu hệ số nhân rất
lớn từ nuôi cấy phôi soma và giảm khả năng biến dị khi cây triển khai
trồng ngo i đồng ruộng.
Đối với mức độ biến dị thể bội của cây cọc rào nuôi cấy phôi soma:
kết quả phân tích mẫu lá của các nhóm cây so sánh bằng phương pháp
dòng chảy tế bào cho thấycác cây con cọc rào từ phôi soma đều có mức
độ bội thể 2n. Kết quả n y có được có thể l do chúng ta đã loại bỏ
những cây có biến dị kiểu hình trước khi ra ngo i vườn ươm Những
hiện tượng tự đa bội hóa của tế bào trong quá trình nuôi cấy in vitro
cũng đã được ghi nhận. Lần đầu tiên Nitsch và cộng sự (1969) ứng dụng
để nhân được cây thuốc lá nhị bội từ mô sẹo đơn bội [131]. Woo và
Chen (1982) đã quan sát thấy mô sẹo và cây lúa tái sinh từ hạt phấn in
vitro tồn tại ở các mức bội thể rất khác nhau [201]. Kết quả nghiên cứu

trên cây lúa qua nhiều lần quan sát cho thấy mức bội thể ở mô sẹo mới
xuất hiện dưới 5 ng y như sau: đơn bội 78,38%; nhị bội 11,74%, số còn
lại là mô sẹo ở các mức đa bội khác từ 3n đến 5n. Cây lúa xuất hiện từ
mô sẹo cũng có mức đa bội thể khác nhau, trong số 168 cây nhận được


19
từ hạt phấn có 62% là cây nhị bội, 35% cây đơn bội, số còn lại là tam
bội.
Đối với mức độ biến dị di truyền của cây cọc rào nuôi cấy phôi
soma: ở đâychúng tôi muốn tìm hiểu số lần cấy chuyền (số lần cấy
chuyền càng cao thì tần số biến dị càng lớn) trong quá trình nhân phôi
soma có ảnh hưởng tới khả năng biến dị di truyền của cây cọc rào. Kết
quả cho thấy chỉ có biến dị ở mức nhỏ từ lần cấy chuyền thứ 6 trở
lên.Khoảng cách di truyền xa nhất với ở lần cấy truyền thứ 9 so với cây bố
mẹ l 95,83% tương đồng, trong khi đó mẫu tương đồng gần nhất với cây
bố mẹ là lần cấy chuyền thứ 1 tới thứ 3 (tương đồng 100%) Điều này cho
thấy các mẫu có độ tương đồng cao đảm bảo cây con từ phôi soma có tính
ổn định di truyền cao so với cây bố mẹ.
Như vậy, những cây giống từ vi nhân giống cây cọc rào thông qua kỹ
thuật nuôi cấy phôi soma nếu như đã loại bỏ những cây bị biến dị kiểu
hình thì hầu như không có biến dị kiểu gen ở mức đa bội thể, và ở mức
kiểu di truyền. Trong quy trình vi nhân giống cây cọc rào,cần phải loại
bỏ ở tỷ lệ biến dị kiểu hình cao gần 30%, nhưng hệ số nhân giống của
quy trình lại rất lớn sẽ bù đắp lại. Mặt khác sự loại bỏ những phôi soma
bị biến dị ở giai đoạn tăng sinh mạnh trong quy trình vi nhân giống nên
chi phí không đáng kể. Vì vậy qua quá trình sàng lọc trong quy trình vi
nhân giống cây cọc rào từ phôi soma vẫn đảm bảo hiệu quả: hệ số nhân
giống cao, ổn định về mặt di truyền so với cây đầu dòng, chất lượng cây
giống ổn định v đồng đều.

20
Chƣơng 4
KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
- Nghiên cứu sự phát sinh phôi:
+ Đã chứng minh được sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng
tế bào lá cây cọc rào.
- Nghiên cứu sự ổn định di truyền của cây nhân giống từ nuôi cấy
phôi soma:
+ Đối với mức độ biến dị kiểu hình ở cây cọc rào nuôi cấy phôi
soma: cho thấy có nhiều kiểu biến dị khác nhau. Tổng số cây có biểu
hiện biến dị kiểu hình chiếm tỷ lệ 27,7%. Trong quá trình nuôi cấy sẽ
loại bỏ những biến dị này.
+ Đối với mức độ biến dị thể bội của cây cọc rào nuôi cấy phôi
soma: kết quả phân tích mẫu lá của các nhóm cây so sánh bằng phương
pháp dòng chảy tế bào cho thấycác cây con cọc rào từ phôi soma đều có
mức độ bội thể 2n.
+ Đối với mức độ biến dị di truyền của cây cọc rào nuôi cấy phôi
soma: Kết quả cho thấy chỉ có biến dị ở mức nhỏ từ lần cấy truyền thứ 6
trở lên. Khoảng cách di truyền xa nhất với ở lần cấy truyền thứ 9 so với
cây bố mẹ l 95,83% tương đồng, trong khi đó mẫu tương đồng gần nhất
với cây bố mẹ là lần cấy truyền thứ 1 tới thứ 3 (tương đồng 100%) Điều
này cho thấy các mẫu có độ tương đồng cao đảm bảo cây con từ phôi
soma có tính ổn định di truyền cao so với cây đầu dòng.
- Quy trình nhân giống in vitro cây cọc rào từ nuôi cấy phôi soma
Đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro hiệu quả ở cây cọc
rào từ nuôi cấy phôi soma. Theo quy trình vi nhân giống cây cọc rào
bằng nuôi cấy phôi soma, sau 49 tuần thời gian (khoảng 1 năm) từ một

mẫu lá non từ cây bố mẹ thông qua chọn lọc chúng ta có thể tạo ra được
trên 5 triệu cây giống phôi soma. Cây giống n y đảm bảo các tính năng:
ổn định di truyền so với cây bố mẹ, sạch bệnh, có rễ cọc giống cây từ hạt.
Đồng thời với hệ số nhân giống lớn như vậy quy trình này có thể đáp


21
ứng được nhu cầu cây giống rất lớn ở quy mô canh tác cây cọc rào sau
này.

Hình1. Sơ đồ quy trình nhân giống cây cọc rào in vitro
4.2. Đề nghị
- Từ quy trình nhân giống này, tiếp tục nghiên cứu khảo nghiệm cây
giống cọc rào từ phôi soma ngo i đồng ruộng để đánh giá về khả năng


22
tăng trưởng v năng suất trước khi phục vụ cho triển khai sản xuất hoặc
tuyển chọn giống sau này.
- Kết hợp phân nhóm di truyền dựa vào thực hiện phản ứng RAPD
với việc phân nhóm di truyền dựa v o các phương pháp khác như: ISSR,
AFLP, SCAR để có thể có những nhận định chính xác v độ tin cậy cao
hơn trong tuyển chọn và lai tạo giống mới cây cọc rào từ nuôi cấy phôi
soma.

Hình2. Một số hình ảnh vi nhân giống cây cọc tào từ phôi soma


23
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

1. Bài báo 1: Đánh giá mức độ biến dị của cây cọc rào (Jatropha curcas L.) được
nhân giống in vitro thông qua tái sinh phôi. Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị Kim Loan,
Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Đình Lâm, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt. Tạp chí
Công nghệ Sinh học, 2015, 13(2A): 477-483.
2. Bài báo 2: Ảnh hưởng của một số acid amine và spemindin lên sự hình thành
phôi vô tính cây cọc rào (Jatropha curcas L.). Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị Kim
Loan, Trần Trọng Tuấn, Lê Thanh Tuấn, Huỳnh Lê Thiên Tứ, Thái Xuân Du,
Nguyễn Đình Lâm, Dương Tấn Nhựt. Tạp chí Sinh học, 2013, 35(3se):136-144.
3. Bài báo 3: Sử dụng phương pháp dòng chảy tế b o đánh giá mức độ bội thể của
cây cọc rào (Jatopha curcas L.) nhân giống in vitro. Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị
Kim Loan, Huỳnh Lê Thiên Tứ, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Đình Lâm, Thái Xuân
Du, Dương Tấn Nhựt. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2014, 52(4D): 42-50.