Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

 

VŨ ANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT
TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:  
1.

PGS.TS. TẠ THỊ THẢO

2.

TS. HÀ TRẦN HƯNG

HÀ NỘI ­ 2015
LỜI CẢM ƠN


Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm  ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ  Thị  Thảo và  TS. Hà Trần 
Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề 
tài và viết luận văn.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân viên Trung tâm  
Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên 
cứu.
Tôi xin bày tỏ  lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các  
thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập  
và thực hiện đề tài này. 
Tôi cũng xin gửi lời cảm  ơn các anh chị, bạn bè của tập thể  lớp cao học hoá K24, đặc  
biệt là những người bạn trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong  
suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này. 
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm  ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ  mọi  
khó khăn cùng tôi.
Hà Nội, ngày 01 tháng 10  năm 2015
Học viên

Vũ Anh Phương


MỤC LỤC


DANH SACH BANG BIÊU
́
̉
̉


DANH SACH HINH
́
̀

Chương 1.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
% RSD
% RSDR
ACN
AS
ATP
BN
DAD
DQ
EPQ
GC ­ MS
HP
HPLC
LC ­ MS
LOD
LOQ
MeOH
ppm
PQ
R
ROC
RP­HPLC
SD
SIPP
TCA
tR
UV­VIS

Tên tiếng anh
% Relative standard deviation
% Reproducibility standard deviation
Acetonitrile
Asymmetry factor
Adenosin Triphophate
Patient
diode­array detector
Diquat
Ethylparaquat
Gas chromatography ­ Mass 
spectroscopy
Hemoperfusion
High performance liquid 
Chromatography
Liquid Chromatography ­ Mass 
Spectroscopy
Limit of Detection
Limit of Quantification
Methanol
Parts per million
Paraquat
Relative  coefficient
Receiver operating characteristics
Reverse phase­HPLC
Standard deviation
Severity Index of Paraquat Poisoning
Trichloroacetic acid
Retention time

Ultraviolet­Visible

Tên Tiếng việt
% Độ lệch chuẩn tương đối
%   Độ   lệch   chuẩn   tái   lặp 
tương đối
Acetonitril
Hệ số đối xứng pic
Adenosin Triphophat
Bệnh nhân
detector mảng diode
Diquat
Ethylparaquat
Sắc ký khí khối phổ
Lọc máu hấp phụ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng khối phổ
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Methanol
Phần triệu
Paraquat
Hệ số tương quan
Đường cong ROC
Sắc ký lỏng pha đảo
Độ lệch chuẩn
Chỉ số độ nặng của ngộ độc 
Paraquat
Acid Tricloacetic 
Thời gian lưu

Tử ngoại và khả kiến


ĐẶT VẤN ĐỀ
Paraquat (viêt tăt cua 
́ ́ ̉ paraquaternary bipyridyl) la môt thuôc diêt co
̀ ̣
́
̣
̉  gia thành re,
́
̉  hiệu quả 
diêt co dai nhanh chong
̣
̉ ̣
́ , ít ảnh hưởng tới môi trường do đó hiện đang được sử dụng rộng rãi ở 
Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau. Tuy nhiên, paraquat (PQ) lại la môt chât hoa hoc
̀ ̣
́ ́ ̣  
vô cung đôc v
̀
̣ ới ngươi. Li
̀ ều tử vong của PQ  ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20%. Tai nhi
̣
ều 
nước phát triển, PQ đa bi câm s
̃ ̣ ́ ử dung nh
̣
ưng ở Viêt Nam viêc thi
̣

̣
ếu các chính sách và biện pháp quan̉  
ly s
́ ử dung hoa chât nay nên trong nh
̣
́
́ ̀
ững năm vừa qua co rât nhiêu tr
́ ́
̀ ương h
̀ ợp ngô đôc 
̣ ̣ PQ đên c
́ ấp 
cứu [1]. Trên thế giới, nhiêu ca t
̀
ử vong do ngộ đôc PQ đa đ
̣
̃ ược bao cao [10][19][27]. T
́ ́
ại Trung tâm  
Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không 
ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca trong năm 2013  
và năm 2014 lên tới 391 ca. Ti lê t
̉ ̣ ử vong do ngô đôc PQ rât cao, th
̣ ̣
́
ường khoảng 70­80% theo nhiêù  
nghiên cứu cua cac tac gia n
̉
́ ́

̉ ươc ngoai [29][32]. Tai Trung tâm ch
́
̀
̣
ống độc (TTCĐ) bênh viên Bach
̣
̣
̣  
Mai, ti lê t
̉ ̣ ử vong năm 2007 la 72,5% [
̀
4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu tai bênh viên Ch
̣ ̣
̣
ợ Râỹ  
thành phố Hồ Chí Minh la 85%. 
̀
Trong chẩn đoán và điều trị  ngộ  độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng   PQ  trong huyết 
tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ  nặng của ngộ  độc, tiên lượng 
bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ. 
Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao  vì thiếu các biện pháp điều trị hiệu quả. Gần đây, các  
nghiên cứu của nhiều tác giả  nước ngoài và một số tác giả  Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc  
máu mới, nhất là lọc máu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải 
PQ cho kết quả khả quan, cứu sống một số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ. Xét nghiệm  
định lượng nồng độ PQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánh giá hiệu quả của các  
biện pháp điều trị tăng thải trừ này. 
Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ  dừng  ở mức độ  định tính 
trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc PQ mà chưa có cơ sở 
xét nghiệm nào có thể  thực hiện việc định lượng nồng độ  PQ máu với kết quả  đáng tin cậy. 
Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn đoán, tiên lượng cũng như  đánh giá hiệu 

quả  của các biện pháp lọc máu làm cho việc điều trị  ngộ  độc  PQ tại Trung tâm Chống độc và 
các khoa hồi sức cấp cứu trên cả nước gặp rất nhiều khó khăn. 
Để  định lượng PQ trong huyết tương trên thế  giới đã áp dụng các phương pháp sắc ký 
khí khối phổ (GC­MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC­MS)... Tại Trung tâm 
chống độc bệnh viện Bạch Mai  hiện  đang sử  dụng máy  sắc ký lỏng hiệu năng cao  để  xét 


nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình chuẩn định lượng  PQ  huyết tương. Vì vậy, 
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề  tài  “Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết 
tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu: 
1.

Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và phân  
tích bằng HPLC để định lượng paraquat.

2.

Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết  
tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà  
Nội.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tông quan vê paraquat 
̉
̀
1.1.1. Công thức paraquat 
Paraquat là từ  viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'­dimethyl­4,4' 
bipyridilium là thuốc diệt cỏ  phổ  biến nh ất hi ện nay do đặc tính diệt cỏ  nhanh và triệt để. 
PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium,  đượ c tổng hợp  đầu tiên vào năm  

1882, ứng dụng trong nông nghiệp làm thuốc trừ cỏ từ những năm 1950 [42]. 
PQ có khối lượng phân tử tương đối 186,2 có công thức hóa học như hình 1.1: 

Hình 1.: Công thức hóa học của paraquat
1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat 
PQ thường có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ  trọng  ở  20oC là 1,240 ­ 1,260, điểm 
chảy 175 ­ 180oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ trong nước 6,5 ­ 7,5.
PQ   thường   ở   dạng  dimethylsulphate   hoặc   dichloride.  Dạng  dichloride   tinh  thể   trắng,  
dạng dimethylsulphate chảy rữa. PQ  ổn định trong dung dịch môi trường acid hoặc trung tính và  
không ổn định trong môi trường kiềm. 
PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20oC), ít tan trong cồn và hầu như không tan trong 
các dung môi hữu cơ khác. 
PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề mặt anionic 
và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với  đất. PQ không bay hơi. Dung dịch PQ đặc  
ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [43].
PQ  được sản xuất bởi nhiều công ty khác nhau vơi cac tên th
́ ́
ương mai và hàm l
̣
ượng 
khác nhau, nói chung thường đều  ở  dạng dung dịch màu xanh. Một số  tên gọi thường gặp của  
PQ như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone, Owen... [42].
Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các nước phát triển đều đã cấm sử dụng PQ 
như  là một loại hóa chất bảo vệ  thực vật (Mỹ và các nước Châu Âu). Một số  nước như  Nhật  
Bản chỉ  cho phép lưu hành  PQ  dạng dung dịch với hàm lượng thấp 4,5% sẽ  giúp giảm thiểu  


nguy cơ nếu bị ngộ độc. Thực tế hiện nay trên thế giới vẫn có gần 130 nước cho phép sử dụng  
PQ trong đó có Việt Nam [42]. Hiện ở Việt Nam thuốc từ cỏ PQ được lưu hành dạng dung dịch  
20% do đó nguy cơ ngộ độc cấp tính rất lớn.

Một điều đáng nói là công ty sản xuất  PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là Syngenta hay 
còn gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc và Anh. Trên đất nước họ đã cấm hoàn toàn  PQ, 
hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nước thứ ba [39].
1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat 
 Cơ chế gấy độc của PQ được mô tả theo sơ đồ sau [37]:

Hình 1.. Cơ chế gây độc của paraquat [15]
Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ2+ cùng với NADPH trải qua một phản  ứng  
tạo ra ion paraquat bị khử (PQ+) và NADP+. PQ+ phản ứng hầu như ngay lập tức với oxy tái tạo 
lại PQ2+ và gốc superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu trình oxy hoá ­ khử  của PQ xảy ra liên 
tục,  với  việc NADPH  liên tục  bị  mất  đi  và không ngừng tạo ra gốc superoxid. Gốc tự  do  
superoxid sau đó phản ứng với bản thân nó để tạo ra peroxid hydro (H 2O2), và với H2O2 cùng Fe 
để tạo thành gốc tự  do hydroxyl [18] [31]. Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy  
hoá ­ khử tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thương tế  bào: phản ứng 
với lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho tế bào sống 
sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [12] [39] [40].
Hậu quả lên tế bào do việc hình thành các gốc tự do (superoxid và các gốc tự do khác) là  
đối tượng của rất nhiều nghiên cứu. Các thử nghiệm điều trị nhằm vào việc thay đổi các gốc tự 
do bằng các chất như desferioxamin, superoxid dismutase, α­tocopherol và vitamin C cùng với bài 


niệu cưỡng bức. Tuy nhiên, cho đến hiện nay không có chất nào trong số này được khuyến cáo  
dùng.
Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các gốc tự do do PQ sinh ra vẫn chưa được 
biết nhưng những gì người ta đã biết về cơ sở để ngộ độc là sự tương tác giữa PQ, NADPH và  
oxy. Sau đó,  ở  mức độ  tế  bào, oxy là yếu tố  tối cần thiết cho việc hình thành bệnh lý do PQ.  
Đây là cơ sở cho việc hạn chế cung cấp oxy trong việc điều trị ban đầu bệnh nhân ngộ độc PQ.
PQ có tính ăn mòn và gây tổn thương giống như  kiềm khi tiếp xúc với da, mắt và các 
niêm mạc. Các cơ  quan đích chủ  yếu trong ngộ  độc toàn thân PQ là đường tiêu hoá, thận và  
phổi. Dạ dày, ruột bị tổn thương nặng nề do tác dụng ăn mòn trực tiếp khi bệnh nhân uống PQ  

có chủ ý với nồng độ cao. Thận là cơ quan đào thải PQ và DQ và có nồng độ bipyridyl cao hơn  
so với các cơ quan khác. Riêng ở phổi, PQ vào các phế bào týp I và II không phụ thuộc bậc thang 
nồng độ mà theo cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP.
Do vậy PQ gây tổn thương hầu hết tất cả các cơ  quan trong cơ thể  vì đều có liên quan  
đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ hoặc liên quan đến  
thải trừ PQ thì tổn thương đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong  
như tổn thương phổi gây suy hô hấp, suy thận, viêm gan, loét niêm mạc đường tiêu hóa và biến  
chứng nhiễm trùng [6][13][37]. Viêc tiêp xuc v
̣
́ ́ ơi l
́ ượng PQ it h
́ ơn se lam châm nguy c
̃ ̀
̣
ơ tử  vong  
do xơ phôi tiên triên va suy thân [33]. Môt sô nghiên c
̉
́
̉
̀
̣
̣ ́
ứu gân đây còn cho thây ph
̀
́ ơi nhiêm PQ co
̃
́ 
liên quan với hôi ch
̣ ưng Parkinson [21][23].
́

Trong ngô đôc câp PQ, co thê tiên l
̣ ̣
́
́ ̉
ượng bênh d
̣
ựa trên nông đô PQ trong huyêt t
̀
̣
́ ương. Môṭ  
sô bao cao cho thây nông đô PQ huyêt t
́ ́ ́
́ ̀
̣
́ ương vượt qua 2 µg/ml thi hâu hêt t
̀ ̀ ́ ử vong, tuy nhiên môṭ  
vai tr
̀ ương h
̀ ợp bênh nhân vân hôi phuc khi nông đô trong mau cao h
̣
̃ ̀
̣
̀
̣
́
ơn 2 µg/ml [7][10][22].
1.1.4. Dược động học paraquat
1.1.4.1. Hấp thu
Ở đường tiêu hoá PQ được hấp thu rất nhanh nhưng ít (5­10%). Hấp thu chủ yếu ở ruột 
non. Khi dạ  dày ruột bị  tổn thương lan rộng, số lượng chất độc được hấp thu sẽ  tăng lên. PQ  

không gắn với protein huyết tương. Nồng độ  đỉnh của PQ trong huyết tương đạt được trong  
vòng 2 giờ sau uống [6] [37]. Tiếp xúc qua da, hấp thu vào cơ thể nói chung chỉ xảy ra khi tiếp  
xúc kéo dài hoặc da bị tổn thương. Tiếp xúc với PQ qua đường hô hấp không làm cho lượng PQ  
được hấp thu đến mức đủ  để  gây nhiễm độc. Bởi vì kích thước các hạt chứa PQ lớn (hầu hết 
trên 100  m) làm cho PQ không đi sâu được xuống đường hô hấp để hấp thu [11]. Mắt tiếp xúc  
với PQ sẽ bị tổn thương, nhưng không đủ để gây nhiễm độc toàn thân.


1.1.4.2. Phân bố
Sau khi uông, PQ phân b
́
ố nhanh chóng nhất tới tât ca cac c
́ ̉ ́ ơ quan chinh nh
́
ư phổi, thận,  
gan và cơ, đăc biêt la phôi, PQ se bi kh
̣
̣ ̀ ̉
̃ ̣ ử thanh dang gôc t
̀
̣
́ ự do hoat tinh cao [8][22]. Th
̣ ́
ể tích phân 
bố của PQ là 1,2 ­ 1,6 l/kg. 
PQ đạt được nồng độ  cao và tồn tại lâu hơn trong phổi, nồng độ  trong phổi có thể  cao  
hơn so với nồng độ huyết tương gấp 50 lần. Sau uống 5­7 giờ, nồng độ  PQ trong tổ chức phổi  
đạt cao nhất. Tuy nhiên, lượng PQ huyết tương cũng cần đạt đến một ngưỡng tới hạn để  cho  
quá trình hấp thu ở phổi diễn ra [11]. 
PQ qua được nhau thai. Trong một nghiên cứu, nồng độ  PQ trong dịch ối và máu dây rốn, 

bào thai cao hơn nồng độ  trong máu mẹ  4­6 lần [11]. Không có bào thai nào sống sót. Tuy nhiên 
nếu mẹ ngộ độc PQ còn sống thì đến lần có thai sau không nguy hiểm đến bào thai.
1.1.4.3. Chuyển hoá, thải trừ
PQ được đào thải hầu như hoàn toàn qua thận nhờ cả quá trình lọc của cầu thận và quá  
trình bài tiết tích cực của ống thận. Trong vòng 12­24 giờ sau uống, trên 90%  PQ được đào thải 
dưới dạng không đổi qua thận, nếu chức năng thận bình thường [11].Tuy nhiên có thể  xét  
nghiệm thấy PQ trong nước tiểu vài ngày sau do có sự tái phân bố PQ từ các cơ quan. Thời gian  
bán thải của PQ có thể kéo dài 12­120 giờ hoặc lâu hơn khi có suy thận. Ngoai ra PQ con đao thai
̀
̀ ̀
̉ 
qua phân dươi dang không đôi [8][22].
́ ̣
̉
1.1.5. Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương.
Tiên lượng bệnh nhân uống PQ có thể  dựa vào nồng độ  PQ huyết tương theo thời gian. 
Nồng độ  PQ phải đo trước khi điều trị  vì các biện pháp điều trị  có thể  làm giảm nồng độ  PQ  
(dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…). Proudfoot và cộng sự  [29] lần đầu tiên trình bày biểu đồ 
tiên lượng khả năng sống từ  kết quả định lượng nồng độ  PQ huyết tương tại nhiều thời điểm  
khác nhau trên 79 bệnh nhân. Những BN sống có nồng độ  dưới 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/ l 
tương  ứng  ở  4, 6, 10, 16, và 24 giờ  sau uống PQ . Schermann và cộng sự [35] mở  rộng đường 
cong tiên lượng BN này lên đến ngày thứ  7 sau nhiễm độc, và nghiên cứu này cho thấy những  
BN nồng độ PQ huyết tương trên 10 mg/l (định lượng trong vòng 8 giờ), thường chết vì sốc tim 
trong 24h, trong khi những BN có nồng độ thấp hơn (nhưng vẫn trên đường tiên lượng), chết vì 
xơ phổi và suy hô hấp muộn hơn 24 giờ sau uống. Suzuki và cộng sự (1991) [36] đã kết hợp dữ 
liệu của Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann (1987), Sawada (1988) và thêm một nhóm 
78 BN, kết luận rằng đồ  thị  tiên lượng chính xác 101 trong 102 trường hợp tử vong và 61 trong  
63 BN sống được đánh giá trong vòng 24 h sau uống PQ. Mặc dù đồ  thị khá chính xác, giúp xác  
định mức độ nặng và tiên lượng tử vong nếu định lượng được PQ ngay lập tức, đồ thị này cũng  

đôi khi tiên đoán sai. Nguyên nhân do ước tính thời gian từ khi uống PQ dễ sai, đặc biệt trong vài 
giờ đầu tiên nồng độ PQ huyết tương giảm nhanh sai số về thời gian thậm chí 0,5 đến 1h có thể 
thay đổi hoàn toàn mối quan hệ nồng độ và tiên lượng. Ngoài ra, nồng độ PQ trong huyết tương  
có thể không hoàn toàn chính xác vì được phân tích bằng một số phương pháp khác nhau và các 
nghiên cứu thường không trình bày rõ nồng độ của ion hay là muối PQ, và thực tế có thể có khác 
biệt  giữa các bệnh nhân về mức độ nhạy cảm với tác dụng độc của PQ, tuy khác biệt này chưa 
được nghiên cứu.

Hình 1.: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tương (µg/ml), thời gian sau 
uống, và khả năng sống.
Năm 1988 Sawada và cộng sự [34] báo cáo chỉ  số tiên lượng ngộ độc PQ dựa trên nghiên 
cứu nồng độ  PQ huyết thanh ở 30 bệnh nhân, 20 tử  vong và 10 BN sống. Chỉ  số  độ  nặng của 
ngộ độc PQ (SIPP: severity index of PQ poisoning) tính bằng thời gian từ khi uống (giờ) cho đến 
khi bắt đầu điều trị nhân với nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml) khi vào viện.
SIPP = [nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)] × [thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)]
Khi điểm SIPP ít hơn 10, bệnh nhân có thể sống sót; điểm 50 phân biệt tử vong muộn do 
suy hô hấp (10 <  SIPP <50) với tử  vong  sớm do suy tuần hoàn  (SIPP  > 50). Mặc dù đây là 
nghiên cứu quan trọng, Sawada xét nghiệm định lượ ng dùng huyết thanh không phải huyết 
tươ ng. Suzuki và cộng sự (1991) đã so sánh SIPP với đồ thị tiên lượ ng sống trên 167 BN nhập 
viện trong vòng 24 h sau uống PQ. Các kết cục của BN dự đoán theo đồ  thị  của Proudfoot đã  
sai  ở  1 trường hợp tử  vong và 2 BN sống; trong khi đó, SIPP sai  ở  1 BN sống và 10 trườ ng  
hợp tử  vong. Những khác biệt này có ý nghĩa thống kê, và tác giả  kết luận rằng   dựa trên 


nồng độ  PQ  trong  24  h đầu  sau uống,  đồ  thị  của Proudfoot tiên lượ ng chính xác hơn  SIPP 
[36].
1.2. Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương
1.2.1. Phương pháp quang phô ̉
Rai M.K và cộng sự  [30] định lượng  PQ  sử  dụng  NaBH4  để  khử  PQ  trong môi trường 

kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 600nm trong khi  Kato K. và cộng  
sự [20] lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester (TBPE) phản ứng với PQ để tạo ra dung  
dịch hữu cơ PQ­TBPE màu xanh da trời, có thể chiết được bằng dichloromethane. Chang­bin Li 
và cộng sự  [24] đã định lượng PQ trong huyết tương dựa bằng đo quang phổ  của dẫn xuất khi 
phản ứng với Na2S2O4 10% và NaOH 5M.
Ưu điểm của phương pháp khử PQ bằng NaBH4 là độ  nhạy cao, với các điều kiện khử 
PQ là nhiệt độ  35­40°C, pH 10­11 thì màu có độ   ổn định lên đến 12h và không cần đệm để  ổn 
định màu, khoảng nồng độ 0,05 ­ 0,5 µg/ml tuân theo định luật Lambert – Beer, trong khi giới hạn 
phát hiện là 0,03 µg/ml. Trong khi đó, phương pháp sử dụng TBPE thì mẫu được phép để  tối đa 
trong 20 phút. Cả 2 phương pháp này đều đề cập đến DQ, trong khi Rai M.K [30] loại bỏ DQ thì 
Kato K. [20] lại định lượng đồng thời cả PQ và DQ. 
Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã loại được sự ảnh hưởng của các thuốc trừ 
sâu thông thường và các ion kim loại khác. DQ, có cấu trúc gần giống PQ, sẽ gây ảnh hưởng khi 
định lượng PQ. Tuy nhiên DQ, nếu có, sẽ  bị loại khi thêm NaOH 0,2 N, trong khi PQ không bị 
mất đi. Các ion kim loại như Fe3+ và Al3+, có thể ảnh hưởng do làm kết tủa hydroxide, sẽ bị loại  
đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5% trước khi thêm dung dịch NaOH [30]. Còn theo  Kato K [20], DQ 
cũng có thể chiết được với TBPE trong dichloromethane cũng giống như PQ nhưng PQ­TBPE có 
quang phổ hấp thụ hơi khác với DQ­TBPE. Đo độ hấp phụ của PQ ở bước sóng 603 nm & DQ ở 
bước sóng 608 nm với dãy nồng độ (4,5 ­ 45,0)×10­7 M. Giới hạn phát hiện 4,77.10­7 M. 
Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH 4  đã được  ứng dụng để  định lượng  PQ  trong 
mẫu bệnh phẩm bệnh nhân như  máu, nước tiểu, sữa mẹ  cũng như  các mẫu thực phẩm và các  
mẫu trong môi trường.
Với phương pháp đo quang phổ  thông thường, không phát hiện được PQ tại bước sóng  
257 nm. Nên Chang­bin Li và cộng sự [24] đã định lượng nồng độ PQ trong huyết tương dựa trên 
việc đo quang phổ  dẫn xuất thứ  2 (tuân theo định luật Lambert Beer với  r = 0,996). Dung dịch 
nước chuẩn PQ 10 μg/ml được quét bước sóng từ 200 đến 300 nm, với mẫu trắng là nước cất.  
Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10  μg/ml được thêm TCA 20% 
(tỉ lệ 6:1, v/v). Lắc xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch trong phần trên đi đo quét  

bước sóng từ  200 đến 300 nm. Sau khi xử  lý mẫu như  trên, dịch trong phần trên được chuyển 
vào ống Eppendorf mới, bảo quản tránh ánh sáng. Trước khi đo, 400  μl mẫu được lắc trộn nhẹ 
nhàng và hoàn toàn với 100 μl hỗn hợp đồng thể tích Na2S2O4 10% và NaOH 5M. Làm tương tự 
với mẫu huyết tương trắng đối chiếu và đo độ  hấp thụ  quang trong khoảng bước sóng từ  300 
đến 500 nm (khoảng bước sóng Δλ  = 0,5 nm). Từ đó dẫn xuất thứ 2 này có thể được tính toán 
theo công thức Δ2Abs/(Δλ)2 (khoảng bước sóng dẫn xuất Δλ=4 nm) [24].
1.2.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Phương pháp GC­MS là phương pháp đơn giản có độ  nhạy và độ  tin cậy cao, từ  lâu đã 
được sử  dụng để  định lượng PQ trong dịch sinh học. L. Gao [16] và Almeida R. M. [5] cùng sử 
dụng phương pháp GC­MS để định lượng PQ. Trong cả hai nghiên cứu, các tác giả  đã sử  dụng  
hệ  thống chọn lọc ion (selected ion monitoring – SIM) để  nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm 
EPQ làm chất nội chuẩn, khí He được dùng như là khí mang để đưa chất phân tích vào cột. Dung  
dịch mẫu phân tích đều được khử  bằng NaBH4 trước khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí. Tuy 
nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau.
Tác giả L. Gao và cộng sự [16] lại sử dụng cột mao quản (10 m  0,18 mm, độ  dày màng 
0,25 µm). Nhiệt độ  của bơm tiêm, interface và nguồn ion lần lượt là 280, 280, 200 oC. Khí mang 
được bơm đẳng dòng với tốc độ là 1,01 ml/phút. Mẫu được đưa vào bằng chế độ tiêm chia dòng 
(10:1) và nhiệt độ  giải hấp phụ  lúc đầu là 70 oC trong 1 phút và tăng đến 295oC với tốc độ 
25oC/phút. Nhiệt độ  295oC được duy trì trong 10 phút. Trong đó các mảnh ion 196 và 224 được  
dùng để  định lượng PQ & EPQ. Độ  thu hồi của mẫu máu và nước tiểu lần lượt là 94,00 ­  
99,85% và 95,00 ­ 100,34%, khoảng tuyến tính 0,1 ­ 50 µg/m l. Giới hạn phát hiện (S/N = 3) là 
0,01 µg/ml  đối với cả  máu và nước tiểu. Phương pháp này đã được áp dụng để  phân tích các 
mẫu sinh học thu được từ các nạn nhân chết do uống PQ.
Trong khi đó, Almeida R. M.  và  cộng sự  [5] sử  dụng trên hệ  máy sắc ký GC­MS (Gas 
chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972) với cột mao quản fused­
silica HP­5MS (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,1 µm) và chế độ đẳng dòng với tốc độ 0,6  
ml/phút. Nhiệt độ của bơm và interface (bộ phận ghép nối giữa GC và MS) là 270 oC. Bơm hoạt 
động ở chế độ chia dòng. Nhiệt độ cột duy trì 80oC trong 1 phút, tăng nhiệt 10oC/phút đến 200oC 
và 20oC/phút đến 270oC và duy trì 270oC trong 4 phút. Số khối của các mảnh ion được chọn cho 
các hợp chất là: m/z 108, 135,  190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220 (EPQ), trong 

đó các mảnh ion 192 và 162 được dùng để định lượng PQ & EPQ.


1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
Hai tác giả  ZhaohongWang và Proenca P. đều định lượng PQ trong mẫu sinh học bằng 
sắc ký lỏng ­ ion hóa tia điện ­ khối phổ [28] [41].
ZhaohongWang sử  dụng hệ  thống Waters UPLC với. Tiêm mẫu 5 μl với cột ACQUITY 
BEH HILIC (50 mm × 2,1 mm × 1.7 μm)  ở  30oC. Còn Proenca P. sử  dùng hệ  thống sắc ký LC 
Water 2695 Alliance System và cột silica HILIC (150 × 2,1 mm × 5 µm). Nhiệt độ  cột duy trì  
35oC. Bơm mẫu 10 µl. Detector mảng photodiode Water 996 hoạt động từ bước sóng 210­400 nm  
với độ phân giải 1,2 nm. Độ hấp thụ UV được đo ở 258 nm.
Cả  hai tác giả  đều sử  dụng pha động là ammonium formate và acetonitrile. Trong khi 
ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (điều chỉnh đến pH 3,7 bằng acid formic) và 
acetonitrile. Và chạy pha động theo chế  độ  gradient với tốc độ  dòng 0,3 ml/phút. Ngay sau khi  
tiêm mẫu, % acetonitrile giảm từ 60% đến 20% trong 0,5 phút, sau đó tăng tới 60% ở 1,5 phút và  
duy trì 60% ở 1,5 phút tiếp. Tổng thời gian chạy là 3 phút. Thì tác giả Proenca P.  dùng pha động 
gồm acetonitrile và đệm ammonium formate (200 mM) pH 3,6 với chế độ đẳng dòng (30:70, v/v)  
và tốc độ 300 µl/phút. 
Các tác giả trên đều sử dụng nguồn ion hóa tia điện dương để  ion hóa PQ và chuẩn nội 
nhưng có khác nhau về điều kiện khối phổ.
Tác giả  ZhaohongWang  sử  dụng bộ  phân tích phổ  khối ACQUITY BSM_SM_Quattro  
Premier XE MS. Tối  ưu hóa điều kiện MS­MS bằng cách tiêm dòng PQ và ethyl viologen trong  
acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250 mM (40:60, v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc  
độ  dòng khí làm khô là 651 l/h  ở  350 oC. Điện áp mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V,  
điện áp extractor là 4,0 V và điện áp thấu kính RzFl à 0,5 V. Định lượng bằng kỹ thuật quét ion  
(multi­reaction monitoring, MRM), bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sản phẩm có  
m/z 155 và 171 đối với PQ; mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sản phẩm có m/z 158 và 185 
đối với chuẩn nội ethyl viologen [41].
Còn với tác giả Proenca P [28] phát hiện phổ (MS) được thực hiện trên máy khối phổ tư ́
cực Water ZQ 2000. Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120 oC; nhiệt độ làm khô 400oC; tốc độ 

dòng khí cone (N2) 0 l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N2) 600 l/h. Điện thế capillary 3,5 kV; điện 
thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lượng ion 0,5 V; Quét phổ từ m/z 130­500, thời gian quét 0,5 s 
và thời gian trễ  (interscan) 0,1s. Đường chuẩn độ  PQ  trong máu tuyến tính từ  0,010­2,0 µg/ml 
trong máu (y=0,0142x+0,1497 với r2=0,9994) và tuyến tính từ 0,025­10,0 µg/ml trong nước tiểu (y 
= 0,0141x + 1,347 với r2 = 0,9994). Giới hạn phát hiện của PQ trong máu và nước tiểu lần lượt là 
0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml (LOD,  S/N  = 3) và giới hạn định lượng ( LOD,  S/N  = 10) là 0,0012 


µg/ml trong máu và 0,024 µg/ml trong nước tiểu. Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng 
không có pic nào trùng thời gian lưu với PQ và chất chuẩn nội 
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ trong dịch sinh học 
[7][17][26]. 
Arys K.  và cộng sự   [7] sử  dụng hệ  thống HPLC. Gồm b ơm model 126 và tiêm mẫu 
type 210A với vòng tiêm mẫu 50 µl. Bước sóng hoạt động là 230 nm. Cột phân tích Aluspher  
100 RP­select B (125 mm × 4,0 mm, kích thướ c hạt 5 µm) với cột bảo vệ 100 RP­select B (4  
mm × 4,0 mm, kích thướ c hạt 5 µm). Pha động là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125 M trong  
nướ c (dung dịch A) và dung dịch NaOH 0,0125 M trong methanol (dung d ịch B), t ốc độ  dòng  
1 ml/phút. Chạy pha động chế  độ  gradient, dung dịch A từ  90% đến 10% trong thời gian 15 
phút. Sau khi chạy xong, chạy l ại điều kiện ban đầu trong 5 phút trướ c khi chuyển sang chạy  
mẫu mới. Giới hạn phát hiện PQ của phương pháp trong máu và nướ c tiểu lần lượ t là 63 và 
32 µg/l.
Paixão  P.  [26]  định lượng PQ trong huyết thanh   và  huyết tương người được làm đơn 
giản và nhanh bằng phương pháp HPLC sử  dụng  1,19­diethyl­4,49­  bipyridyldiylium (diethyl 
paraquat)  làm nội chuẩn.  Hệ  thống  HPLC  gồm bơm mẫu model 1100,  ổn định nhiệt, detector 
UV­VIS.  Vòng bơm mẫu 50 µl, cột NovaPar C18  (150×4,6 mm, 5µm). Tiền cột C18  (100×4,6 
mm, 10µm). PQ và chất nội chuẩn được rửa giải  ở  25 oC với tốc độ  dòng 0,8 ml/phút và bước 
sóng hấp thụ  258 nm. Pha động gồm acid 1 ­ octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1  
M trong 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine. Acetonitrile nồng độ 
10% (v/v). Kết quả: Thời gian lưu của PQ và chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút. Giới hạn phát hiện  

(LOD) 0,1 µg/ml, giới hạn định lượng (LOQ) 0,4 µg/ml trong huyết tương và huyết thanh. Độ 
đúng trong ngày không vượt quá 3,5%; 3,2% đối với huyết tương, huyết thanh. Độ  đúng trong 
khác ngày không vượt quá 4,7%; 3,1% đối với huyết tương, huyết thanh. Độ thu hồi trong huyết  
tương và huyết thanh lần lượt là 98,9% và 98,7%.
Shuuji Hara [17] định lượng đồng thời PQ và DQ trong huyết tương bằng phương pháp 
HPLC. Hệ sử dụng bơm L­7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơm mẫu (20 µl)  Rheodyne 7125. 
PQ, DQ, IS được tách trên cột pha đảo Capcell PaK C18 UG120 (150­4,6 mm, cỡ hạt 5µm, của 
Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dung dịch rửa giải của methanol và  200 mM axit phosphoric 
với diethyl amine 0,1M và sodium 1­heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). Tốc độ  dòng của pha 


động 0,5 ml/phút và nhiệt độ cột trong khoảng từ 15­20oC. Dịch rửa từ cột HPLC được trộn với 
dung dịch kiềm của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn. Tốc độ  dòng 0,4 ml/phút. Hỗn hợp 
được dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và được làm  ấm trong bể  nước SB­9 (EYELA, Tokyo,  
Nhật) ở nhiệt độ 20oC và đo ở bước sóng 391 nm bằng detector UV Hitachi L­ 7405. Độ cao của 
pic được dùng để định lượng bằng máy C­R6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật). Giới hạn  
phát hiện của PQ và DQ là 50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết tương.
Định lượng PQ trong huyết tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo cặp ion đã  
được Brunetto M.R. thực hiện trên hệ  thống sắc ký được sử  dụng có 2 bơm, 1 bơm 2 nòng để 
chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model 64 để chuyển pha động vào cột chiết.  
Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100 hoặc 200 µl để  đưa mẫu vào cột chiết. Sử dụng 
các cột 25 ­ 4 mm được lấp đầy các hạt LiChrospher RP­18 ADS (kích thước hạt 25 µm) và cột 
VARIAN ODS C­18 (25 cm × 4,6 mm, hạt 5 µm) lần lượt là cột chiết và cột phân tích. Cột chiết  
và cột phân tích được gắn với van xoay 6 cửa Rheodyne được điều khiển bằng bơm 2 nòng. Sử 
dụng detector UV­DAD Perkin­Elmer LC 235  ở  bước sóng 258 nm với flowcell 12 µm để  phát 
hiện các tín hiệu.

Các pha động:
­

Pha động để  chiết (Pha động 1): chứa natri octane sulfonate (SOS) 10mM và acid 
orthophosphoric 0,05 M được pha bằng nước cất 2 lần, và lọc màng 0,45 µm. Điều  
chỉnh pH đến 2,8 bằng TEA và thêm 2­propanol nồng độ 3% (v/v).

­

Pha   động   để   phân   tích   (Pha   động   2):   methanol   40   %   và   SOS   10   mM   trong   acid  
orthophosphoric 0,05 M. Điều chỉnh đến pH 2,8 bằng TEA.

Các dung dịch và pha động được lọc màng 0,45 µm và loại khí trong bể siêu âm trước khi 
sử  dụng. Giới hạn phát hiện, tỉ  lệ  tín hiệu (Signal) / Nhiễu đường nền (Noise) với S/N > 3, là  
0,005 µg/ml PQ với thể tích tiêm mẫu 200 µg [9].
Chen Lu và cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định 
PQ trong huyết thanh người. Trong thí nghiệm này, các mẫu huyết thanh đã được kết tủa protein  
lần lượt 30% acid perchloric, acetonitrile và dichlormethane, thu được 50 ml dung dịch. Pha động 
acetonitrile­đệm (10:90), dung dịch đệm chứa natri heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 
0,26 M, điều chỉnh pH đến 2,0 bằng triethylamine. Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước sóng phát hiện  
256 nm, nhiệt độ cột 40oC. Đường chuẩn tuyến tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1 ­ 40 mg/l 
(r = 0,9999). Giới hạn phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3). Độ lêch chuân (RSD) c
̣
̉
ủa các mẫu chưng
́  


nồng độ thấp, trung bình và cao là trong vòng 3,061% ­ 6,149%, độ lêch chuân gi
̣
̉
ữa các lô 0,705%  
­ 2,796%, và đô thu hôi cua ph

̣
̀ ̉
ương phap x
́ ử  ly mâu 96,79 % ­ 100,07%, và đô thu h
́ ̃
̣
ồi phương  
pháp là 91,66% ­ 108,49%. Phương pháp này là đơn giản, nhạy cảm, chính xác, nhanh chóng và 
cũng chỉ ra rằng có thể được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng. 
* Ngoai ra, môt vai ph
̀
̣
̀ ương phap khac cung đa đ
́
́ ̃
̃ ược nghiên cứu đê đinh l
̉ ̣
ượng PQ trong  
mau nh
́ ư: miên dich phong xa [14], điên di mao quan [38]…
̃ ̣
́
̣
̣
̉
1.3. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat
Một trong những yếu tố  quyết định đến hiệu quả  của phương pháp định lượng đó là 
phương pháp xử lý mẫu.
Có rất nhiều nghiên cứu sử  dụng kỹ  thuật chiết pha rắn để  xử  lý mẫu sinh học trong 
phân tích PQ [5][16][20][28][41]. Một số tác giả dùng đệm phosphate để thêm vào mẫu thử trước  

khi cho qua cột chiết pha rắn [5][16][41]. 
Cột chiết pha rắn C18 thường được dùng để  chiết PQ & DQ trong mẫu thử [20]. Dung 
dịch mẫu đã loại protein được chỉnh pH đến 11 bằng  NaOH. Cột được hoạt hóa bằng 5 ml nước, 
5 ml methanol và 20 ml nước trước khi bơm mẫu vào cột. 3 ml nước cất được bơm qua cột để 
loại bỏ hoàn toàn các hợp chất khác trong máu. Sau đó, 3 ml acid hydrochloric 0,2 M và 1 ml × 3 
nước khử  khoáng được cho qua cột để  rửa giải PQ & DQ. Với dịch thu được thêm 3 m l dung 
dịch NaOH 0.2 M. Mẫu này được mang đi đo quang [20].
Chang­bin Li [5] cũng dùng cột C18 để chiết PQ, cột được rửa với 2 m l methanol và 2 ml 
đệm phosphate (pH 8,0). Dung dịch mẫu được đưa qua cột rồi rửa với 2 m l nước khử  khoáng. 
Cuối cùng, rửa giải với 2 ml methanol và dịch rửa giải được bay hơi ở nhiệt độ phòng dưới dòng 
khí nitrogen. Hòa tan cắn trong 100 µl methanol và bơm 1 µl vào hệ thống GC­MS.
Zhaohong Wang  [41]  xử  lý  1,0 ml  máu, thêm 3 ml  đệm phosphate 0,1M (pH 7) và dung 
dịch chuẩn nội 100 ng/ml. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút. Các cột Waters Oasis WCX 3 m l 
được cho chạy qua lần lượt 3 ml methanol, 3 ml nước khử khoáng và 1 ml đệm phosphate 0,1 M 
(pH 7). Sau khi cho mẫu chạy qua cột, rửa cột với 3 m l đệm phosphate 0,1 M (pH 7), 3 ml nước 
khử  khoáng và 3 ml methanol. Sấy khô chân không cột trong 10 phút. Chất phân tích được rửa 
giải bằng 2 ml dung dịch acid formic 2% trong acetonitrile 80%. Bay hơi dịch rửa giải bằng dòng 
khí nitrogen  ở  45oC. Hòa tan cắn bằng 50  μl  pha động (dung dịch acetonitrile và ammonium 
formate 250 mM tỉ lệ 1:1).
Proenca P [28] xử ly mâu băng cach lây 1 m
́ ̃ ̀
́
́
l máu hoặc 1 ml nước tiểu thêm 50 µl chuẩn 
nội (10 µg/ml) và 2 ml acetonitrile. Lắc, ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút. Cột chiết pha rắn 
(Oasis, 3 cc) được rửa với lần lượt 1 m l methanol và 1 ml nước khử khoáng. Đưa mẫu qua cột  


chiết pha rắn. Rửa cột với 1 ml đệm phosphate pH 7,1 ml nước khử  khoáng và 1 ml methanol. 
Sau khi làm khô 10 phút trong chân không, rửa giải cột với 1,5 m l acetonitrile/water/TFA (84:14:2, 

v/v/v). Dịch rửa giải được bay hơi đến cắn dưới dòng khí nitrogen  ở  40 oC. Cắn được hòa tan 
trong 100 µl methanol và bơm 10 µl vào hệ thống LC­ESI­MS.
Kyoko KATO, P. Paixão đều dùng acid perchloric để loại protein [20][26]. Tuy nhiên, một 
số công trình khác sử dụng acid trichloracetic để  kết tủa protein trong mẫu huyết tương [7][17]
[24][30] rất đơn giản và cho hiệu quả  cao vì vậy có thể  áp dụng rộng rãi  ở  các đơn vị  xét  
nghiệm. 
Phương pháp này được Rai M.K. và cộng sự áp dụng để định lượng PQ trong máu, nước 
tiểu và sữa mẹ. Thêm 1 ml dung dịch EDTA 5% và 1ml acid trichloracetic 1% vào để loại sự ảnh 
hưởng của các ion kim loại và loại protein. Ly tâm 1850 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch 
trong ở trên đem đo quang [30].
Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10   μg/ml  được thêm 
TCA 20% (tỉ lệ 6:1). Lắc xoáy, li tâm 13000  vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch trong phần trên đi  
đo quét bước sóng từ 200 đến 300 nm [24].
Arys K [7] xử  ly mâu băng cach lây 1 m
́ ̃ ̀
́
́
l (hoặc 1 g) mẫu, thêm 50 µl chuẩn nội và thêm 
nước vừa đủ 4 ml. Tủa protein bằng acid trichloroacetic là bước làm sạch đầu tiên của các mẫu  
máu, gan, thận. Thêm 1,5 ml dung dịch acid trichloroacetic 25%, lắc 10 phút, ly tâm 400  vòng/phút 
trong 5 phút. Sau khi chuyển dịch trong ở trên sang  ống nhựa sạch, phần tủa protein phía dướ i 
đượ c hòa tan lại bằng 2,5 ml  dung dịch   acid trichloroacetic 5%, l ắc 10 phút, ly tâm 1100 
vòng/phút trong 5 phút, gộp phần dịch trong l ại, chuy ển sang  ống silan hóa. Tuy nhiên ở  một  
số trườ ng hợp đã đượ c chứng minh cần thêm bướ c ly tâm nữa (2200  vòng/phút trong 10 phút) 
để  thu đượ c phần dịch sạch hoàn toàn. Đối với nướ c tiểu và dịch dạ  dày, bướ c loại protein  
có thể  bỏ  qua và làm ngay bước tiếp theo là khử  PQ bằng natri borohydride. Điều chỉnh pH 
của dung dịch đến pH lớn hơn 10 bằng 1 m l NaOH 1M (đối với nước tiểu và dịch dạ  dày) 
hoặc 1 ml NaOH 5M (đối với các mẫu khác). Sau đó, thêm 250 mg bột NaBH 4 và lắc  ở  60 oC 
trong 25 phút. Sau khi làm mát  ở  nhiệt độ  phòng, chiết dung dịch v ới 8 m l diethyl ether bằng 
máy trong 15 phút. Sau khi ly tâm (1100 vòng/phút trong 10 phút), chuyển lớp hữu cơ phía trên 

sang  ống silan hóa hình nón. Bay hơi dịch chiết đến khô bằng dòng khí nitrogen. Cắn đượ c  
hòa tan trong 60 µl pha động (dung dịch A : dung d ịch B là 50:50, v/v) và tiêm 50 µ l vào hệ 
thống HPLC.


Theo nghiên cứu của Shuuji Hara và cộng sự [17] chỉ cần lấy 200 µl huyết thanh trộn với 
20 µl dung dịch nội chuẩn (10 µg/ml) và 120 µl TCA 10% và lắc xoáy trong 20 giây, ly tâm 1000 
vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, lấy 20 µl dịch nổi ở trên bơm vào máy.
Tóm lại, tổng quan tài liệu tham khảo cho thấy việc định lượng PQ trong mẫu huyết  
tương chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp HPLC. Trong đó mẫu huyết tương được loại 
bỏ  protein bằng cách kết tủa với TCA và định lượng trên hệ  HPLC cột tách C8 dung môi pha 
động theo thể  tích (5:95) gồm ACN – Đệm photphat pH=2,5 gồm (natri heptanesulfonate; KCl; 
PEG ; triethylamine; MeOH).


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Để  xây dựng và  xác định giá trị  sử  dụng của   phương pháp phân tích PQ  trong huyết 
tương người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng sau:
­

Mẫu trắng: là huyết tương người của viện Huyết học và truyền máu trung ương.

­

Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm lượng xác định PQ tạo thành mâu.
̃

­

Mẫu thử: là huyết tương bệnh nhân ngộ  độc PQ thu được từ  mẫu máu, ly tâm lấy 
phần huyết tương.

2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị
2.2.1 Chất chuẩn
Chất chuẩn Paraquat dichloride.x­hydrate của hãng Sigma ­ Aldrich độ  tinh khiết 99,5%; 
Exp date: 14.Dec.2016.
2.2.2 Hoá chất
­ Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN ....) của hãng Merck.
­ KCl tinh thể, độ tinh khiết: 99,5% của hãng Merck.
­ Acid trichloroacetic tinh khiết 98,5% của hãng Merck.
­ Acid phosphoric (H3PO4) đặc (d=1,685 g/cm3) của hãng Merck.
­ Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu của hãng Merck và đạt tiêu chuẩn tinh khiết 
phân tích (P.A.)
­ Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá.
­ Dung   dịch   đệm   pha   động   pH   =   2,5   được   chuẩn   bị   bằng   cách   sau:   gồm   1,1   g   natri 
heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 200 ml MeOH; 0,5 ml triethylamine thêm 
nước xâp xi 1000 ml. Đi
́ ̉
ều chỉnh pH của pha động bằng H3PO4 đến các giá trị pH mong muốn. 
Định mức vưa đu 1000 ml băng n
̀ ̉
̀ ước deion. 
­ Pha   dung   dịch   chuẩn   gốc   PQ:   Hòa   tan   100   mg   chất   chuẩn   paraquat   dichloride 
(C12H14Cl2N2.xH2O), hòa tan trong 100 ml nước để được dung dịch gốc. Từ đó pha thành các dung 
dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,1 ­ 20 µg/ml trong nước. Trộn các nồng độ dung dịch chuẩn thứ 
cấp với huyết tương trắng để có nồng độ  PQ 0,02 ­ 10 µg/ml để khảo sát và xác định giá trị sử 
dụng của phương pháp. 
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ
Thiết bị

­ Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, gồm bơm trộn dung môi gradient áp  
suất cao, bộ  đuổi khí trực tuyến bằng chân không, buồng  ổn nhiệt, thiết bị tiêm mẫu tự  động,  
detector mảng Diode (DAD), thư viện phổ độc chất sử dụng detector mảng Diode, máy tính, máy 
in.
­ Cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 
5 μm).
­ Cân phân tích Precisa XT 220A, độ đọc của cân 0,0001 g. 
­ Bể siêu âm. Model: S30/H. Hãng ELMA, Đức.
­ Máy đo pH Meter 744, giá trị đọc ± 0,01, khoảng đo pH = 0,00 – 14,00
­ Máy ly tâm Universal 320 hãng Hettich, Đức, tốc độ tối đa 4000 vòng/phút.
­ Máy lắc xoáy model: 3005 của hãng GFL, Đức.
­ Tủ sấy model: 500 của hãng Memmert, Đức.
­ Máy cất nước hai lần. Model: A4000D/Aquatron hãng Stuart ­ Barloworld Scientific, 4 
l/h, Anh.
­ Bộ lọc nước siêu sạch. Model: WaterPro PS/HPLC/UF  hybrid ­ Labconco, 115V, 60Hz, 
Mỹ.
Dụng cụ
­ Bình định mức dung tích: 5, 10, 25, 50, 100 ml.
­ Pipetman các loại từ 0 ­ 1000 µl.
­ Bộ lọc dung môi của hãng Agilent, Mỹ.
­ Ống nghiệm lấy máu chứa EDTA và ống nghiệm có nút xoáy.
Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sau đó tráng 
bằng MeOH và để khô, tráng n­hexan 3 lần sau đó sấy ở 105oC trong vòng 1 giờ, lấy ra để nguội 
trước khi sử dụng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat.
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn
Theo như  tính chất đã biết của  paraquat  dichloride là tan tốt trong nước và  it tan trong

́
 
dung môi hữu cơ  như  EtOH, MeOH… Tham khảo các tài liệu và so sánh về  độ  phân cực của 
nước và các dung môi, chúng tôi lựa chọn nước để hòa tan PQ vì nước không độc hại, thân thiện 
với môi trường hơn EtOH,  MeOH. 


2.3.1.2. Phương pháp tách PQ từ huyết tương
Dựa theo tính chất lý hóa của PQ, theo các tài liệu đã công bố  va trang thiêt bi phong thi
̀
́ ̣
̀
́ 
nghiêm, chúng tôi ti
̣
ến hành khảo sát các điều kiện để tách PQ từ huyết tương như sau:
Với 1 ml mẫu huyết tương, thêm dung dich TCA đ
̣
ể loại protein, lắc xoáy và ly tâm với  
nồng độ  dung dich TCA thay đ
̣
ổi là: 2,0%; 4,0%; 5,0%; 6,0% và thời gian lắc xoáy: 30 giây, 1 
phút, 2 phút.
2.3.1.3. Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ trong huyết tương
Để  đánh giá khả  năng tách PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương, các mẫu chuẩn chiết PQ  
trong nền mẫu được chuẩn bị  bằng cách cho TCA, lắc xoáy, ly tâm, lọc rồi chạy sắc ký. Dựa  
trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù hợp của điều kiện đo.
* Cột sắc ký: Cột tách có vai trò quan trọng trong việc quyết định quá trình tách có độ 
phân giải tốt hay không [3]. Để chọn loại pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử  và  
độ phân cực của chất phân tích. Dựa trên khảo sát các tài liệu tham khảo và điều kiện cơ sở vật  

chất sẵn có tại Trung tâm Chống độc, chúng tôi sử dụng cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6  
mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm) trong nghiên cứu này.
* Bước sóng (λ): là cực đại hấp thụ của PQ trong mẫu thử, xác định cực đại hấp thụ của 
PQ dựa vào phổ  hấp thụ  UV trong khoảng 210 ­ 400 nm theo máy   sắc ký lỏng hiệu năng cao 
Agilent 1200, detector DAD.
* Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm mẫu từ 10 ­ 50 µl.
* Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các hệ  pha động có khả 
năng tách, thời gian lưu phù hợp và cho các pic cân đối thuận lợi cho phân tích định lượng gồm  
các hệ pha động sau:
­ Hệ  A: Kênh 1 là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125M trong nước và kênh 2 là dung dịch 
NaOH 0,0125M trong methanol. Tốc độ dòng 0,5 ml/phút. Tỷ lệ thể tích 2 kênh tương ứng là 90 : 
10.
­ Hệ  B: Gồm kênh 1 là ACN kênh 2 là dung dịch đệm pH = 3 (10:90, v/v). Thành phần 
đệm gồm acid 1 ­ octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 m l nước khử 
khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine.
­ Hệ C: ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) pH = 2,5 gồm 1,1 g  natri heptanesulfonate; 2 g 
KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 0,5 ml triethylamine; 200 ml MeOH thêm nước xâp xi 1000 m
́ ̉
l. 
Điều chỉnh pH bằng H3PO4 đặc. Định mức vưa đu 1000 m
̀ ̉
l băng n
̀ ươć  deion. 


* Sau khi chọn được hệ  dung môi pha động phù hợp chúng tôi tiên hanh kh
́ ̀
ảo sát thành  
phần của pha động. Giá trị pH pha động cũng được khảo sát trong khoảng từ 2,5 đến 4,5.
*   Khảo   sát   thành   phần   dung   dịch   đệm:   nồng   độ  natri   heptanesulfonate,   KCl   & 

polyethylenglycol.
* Tốc độ  dòng: thay đổi tốc độ  pha động từ  0,2 ­  0,8 ml/phút để  xác định được tốc độ 
phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu.
* Các kết quả  thu được  ứng với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về  thời gian lưu  
của các chất phân tích (tR), độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS). Phương pháp đánh giá 
này dựa trên lý thuyết Van Deemter sao cho 0,9 < A S < 1,2, tR của các chất phải không quá lớn 
nhưng đảm bảo phải tách xa nhau.
2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương
2.3.2.1. Tính chọn lọc
Chuẩn bị  mẫu huyết tương trắng không có PQ và mẫu huyết tương trắng có PQ. Tiến 
hành xử lý và phân tích mẫu, đánh giá hiệu quả tách PQ ra khỏi nền mẫu.
2.3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính
Chuẩn bị các mẫu huyết tương trắng, thêm PQ để  thu được các mẫu chuẩn có nồng độ 
PQ từ 0,02 ­ 10 µg/ml. Chúng tôi xây dựng đường chuẩn với 8 nồng độ PQ được them vào mẫu 
huyết tương trắng lần lượt là 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 và 10 µg/m l. Sau đó xử lý mẫu và 
tiến hành phân tích.
2.3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Tiến hành xử lý các mẫu huyết tương trắng và mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 0,01 ­ 0,1 
µg/ml và phân tích trên hệ thống HPLC, tính độ lệch chuẩn của phương trình hồi quy và xác định 
LOD theo quy tắc 3ϭ, LOQ theo quy tắc 10 ϭ.
2.3.2.4. Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại)
­ Độ  đúng: chuẩn bị  các mẫu PQ trong huyết tương trắng  ở   5 nồng độ  khác nhau, mỗi 
nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký rồi so sánh giá trị trung bình giữa các lần định  
lượng của mỗi nồng độ với giá trị chất thêm vào trong mẫu.
­ Độ lặp lại: 
+ Độ lặp lại trong ngày: chuẩn bị các mẫu PQ trong huyết tương trắng ở 3 nồng độ khác 
nhau, mỗi nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký như phần độ đúng, đánh giá độ lệch  
chuẩn tương đối của các mẫu theo từng nồng độ.
+ Độ lặp lại khác ngày : tiến hành tương tự như trên nhưng làm ở 5 ngày khác nhau.

2.3.2.5. Độ ổn định
Xác định độ   ổn định của chất phân tích trong dịch sinh học trong thời gian phân tích và  
thời gian bảo quản.  
­ Độ ổn định trong thời gian phân tích: chuẩn bị 3 mẫu PQ nồng độ  1 µg/ml trong huyết 
tương, xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký ngay và tiếp tục cứ  mỗi giờ 1 lần trong vòng 5 giờ, xác 
định RSDr.
­ Độ ổn định trong thời gian bảo quản: chuẩn bị 3 mẫu như trên, lấy 1 phần ra xử  lý và 
tiến hành sắc ký ngay, phần còn lại bảo quản  ở ­30 oC trong 21 ngày. Lấy các mẫu đang bảo 
quản ra để xử lý và tiến hành sắc ký ngay vào các ngày thứ 7, 14 và 21.
2.3.3. Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân ­ áp dụng thực tế  tiên lượng bệnh  
nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ
2.3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
31 bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai từ tháng 
3 đến tháng 5 năm 2015.
Chẩn đoán ngộ độc PQ dựa vào: bệnh nhân có 1 trong 2 tiêu chuẩn:
­ Bệnh nhân uống thuốc trừ cỏ PQ và có biểu hiện lâm sàng ngộ độc PQ.
­ Xét nghiệm định tính độc chất nước tiểu tìm thấy PQ.
2.3.3.2. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân
­  Bệnh nhân có tiền sử bệnh phổi, thận, gan.
­  Những bệnh nhân ngộ độc đồng thời các chất độc khác.
Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu loạt ca bệnh.
Tiến hành nghiên cứu:

* Thu thập các số liệu bệnh nhân khi nhập viện từ bệnh án (theo đánh giá của bác 
sĩ điều trị): 
­

Tên loại thuốc trừ cỏ có PQ, hàm lượng PQ trong thuốc trừ cỏ, lượng  PQ uống, 

thời gian đến viện, thời gian bắt đầu điều trị.
­

Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng.

­

Điều trị lọc máu hấp phụ được áp dụng.

­

Các điều trị khác: than hoạt, ức chế miễn dịch, liệu pháp lipid. 

Các số liệu này được dùng trong đánh giá hiệu quả điều trị và mức độ nhiễm độc

* Lấy mẫu định lượng PQ huyết tương khi vào viện, trước và sau các lần lọc máu 
hấp phụ: