Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của V. cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ ĐẤU
MSHV: 62031005

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ TÍNH
KHÁNG THUỐC CỦA VIBRIO CHOLERAE
PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07

CẦN THƠ, 2015


Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Cần Thơ

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường tại Đại
học Cần Thơ
Vào……giờ…….., ngày……tháng……..năm……….

Có thể tìm luận án tại: Thư viện Quốc gia
Trung tâm học liệu trường Đại học Cần Thơ


Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm, tác nhân của bệnh dịch tả trên
người, gây tiêu chảy cấp tính và mất nước, dịch bệnh xảy ra với các hình
thức dịch địa phương và đại dịch. Thế giới đã trải qua 7 đại dịch dịch tả, từ
năm 1816 đến năm 1923 đã có 6 vụ đại dịch xảy ra, những đại dịch này đều
bắt đầu từ Ấn Ðộ và đều do V. cholerae O1 type sinh học cổ điển gây ra. Đại
dịch thứ 7 khác với 6 đại dịch trước, đại dịch này do V. cholerae type sinh
học El Tor gây ra và có nguồn gốc từ đảo Celebes của Indonesia năm 1961.
Đại dịch này kéo dài nhất và có phạm vi rộng hơn 6 đại dịch trước đó, đến nay
còn nhiều nước thông báo những đợt bùng phát dịch tả cũng do nguyên nhân
này gây ra (Hayes, 2005).
Đồng bằng sông Cửu Long, tính đến 19/8/2010 đã có 4 địa phương
gồm: Bến Tre, Tiền Giang, thành phố Cần Thơ và An Giang xuất hiện
bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy do vi khuẩn V. cholerae (Nguyễn Hoàng
Vũ, 2011). Tỉnh Trà Vinh có vị trí địa lý với nhiều nguy cơ tiềm ẩn bệnh
dịch tả vì có bờ biển kéo dài khoảng 65 km và trên địa bàn Trà Vinh có hệ
thống sông chính với tổng chiều dài 578 km, trong đó có các sông lớn
là sông Hậu, sông Cổ Chiên và sông Măng Thít, vì thế rất dễ cho việc lưu
hành vi khuẩn tả từ sông Cổ Chiên giáp với tỉnh Bến Tre, nơi đã từng xảy
ra dịch bệnh vào năm 2010.
Có nhiều loại kháng sinh sử dụng điều trị bệnh tả đang đề kháng với vi
khuẩn này, trong đó có V. cholerae, đây là vấn đề phức tạp trong điều trị
bệnh và là mối quan tâm đối với sức khỏe cộng đồng. Nhiễm sắc thể được
chứng minh là yếu tố di truyền về gene kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Việc thu nhận và lây truyền của các gene kháng kháng sinh là do các yếu
tố di truyền như plasmid, integrons và transposons (Ghosh et al., 2011).
Một trong những yếu tố di truyền được tích hợp và sao chép trên nhiễm
sắc thể và được truyền gene kháng kháng sinh giữa các vi khuẩn cùng loài
trong môi trường (Burrus et al., 2004).
Xuất phát từ những vấn đề trên, nghiên cứu được thực hiện với nội
dung: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của V. cholerae

phân lập tại tỉnh Trà Vinh”, từ đó giúp cơ sở y tế có chiến lược sử dụng
kháng sinh đúng nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm chi phí trong điều trị
bệnh, phù hợp với điều kiện kinh tế trong khu vực.
1.2 Mục tiêu: Xác định tỉ lệ nhiễm và type huyết thanh học của các
chủng V. cholerae trên những mẫu phân lập được; xác định đặc tính kháng
1


kháng sinh của các chủng V. cholerae và các kiểu đột biến gene gây kháng
thuốc; đánh giá quan hệ di truyền giữa các chủng phân lập với các chủng
đã công bố và tính đáp ứng miễn dịch với V. cholerae ở thỏ đã được chủng
vaccine đang lưu hành trên thị trường.
1.3 Ý nghĩa của luận án: Xác định các kháng sinh còn nhạy cảm với
Vibrio cholerae nhằm giúp cơ sở y tế chọn những loại kháng sinh điều trị
bệnh tả có hiệu quả trên người.
Kết quả của luận án là cơ sở khoa học cho việc lựa chọn chủng vi
khuẩn có đột biến để sản xuất vaccine phòng bệnh tả trên người; cung cấp
thông tin giúp cảnh báo về khả năng gây bệnh trên người của các chủng
Vibrio spp. trong các nguồn nước, nguồn thực phẩm có nguồn gốc thủy hải
sản tại tỉnh Trà Vinh.
1.4 Những điểm mới của luận án
Là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Đồng bằng sông Cửu Long phân
lập được 6 chủng V. cholerae trên các loại mẫu thức ăn từ hải sản và mẫu
từ môi trường nước sông và nước ao nuôi tôm; xác định được type huyết
thanh học của V. cholerae là Ogawa và Inaba; xác định được sự tương
đồng về trình tự nucleotide của các chủng V. cholerae phân lập được với
trình tự nucleotide của những chủng V. cholerae ở các nước thuộc vùng
Đông Nam Á; xác định được gene kháng tetracycline của V. cholerae phân
lập được.
Bố cục của luận án

Luận án gồm 108 trang (không kể phần phụ lục), chia thành các phần
như sau: Chương 1: Giới thiệu (4 trang); Chương 2: Tổng quan tài liệu (42
trang); Chương 3: Nội dung, phương tiện và phương pháp nghiên cứu (18
trang); Chương 4: Kết quả và thảo luận (43 trang); Chương 5: Kết luận và
đề nghị (1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang). Luận án có 35 bảng, 40
hình. Tổng tài liệu tham khảo là 180, gồm 09 tài liệu tiếng Việt, 171 tài liệu
tiếng Anh và 11 tài liệu tham khảo từ trang Web.
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả
Năm 1816 bệnh xuất hiện tại Châu Âu và Mỹ, đến đầu thế kỷ 20 đã
có 6 đại dịch tả lan khắp thế giới. Tiếp đó, đến những năm 60 phạm vi gây
bệnh của vi khuẩn tả đã được khoanh vùng và cho đến những năm gần đây
bệnh chủ yếu xuất hiện ở Đông Nam Á. Năm 1961 type sinh học El Tor
gây dịch tại Philippines và tạo làn sóng thứ bảy. Từ đó trở đi type vi khuẩn
2


này tiếp tục gây những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và
một phần Châu Âu (Colwell, 2004).
Từ năm 1991, tỉ lệ mắc bệnh tả do vi khuẩn V. cholerae O1 đã xảy ra ở
Châu Mỹ La tinh (Levine, 1991; Ries et al., 1992), đến năm 1992 bệnh lại
xuất hiện và lây lan nhanh chóng bởi V. cholerae O139 trong khu vực Đông
Nam Châu Á (Shimada et al., 1993) và gần đây bệnh lại bùng phát ở châu
Phi, do type huyết thanh non-O1, non-O139, đây cũng là nguyên nhân quan
trọng gây tiêu chảy (Sharma et al., 1998). Các nghiên cứu về sự tiến hóa phân
tử chủng V. cholerae O1 ở Peru từ năm 1991-1995, Ấn Độ, và ở Thái Lan
cho thấy rằng V. cholerae O1 đã trải qua những thay đổi về di truyền ở mức
tương đối cao. Những thay đổi này rất quan trọng trong việc tìm hiểu về dịch
tễ học và sự tiến hóa của V. cholerae (Dalsgaard et al., 1999). Tháng 12 năm
1992 một vụ dịch lớn lại xảy ra ở các nước, vi khuẩn gây bệnh được xác

định là V. cholerae O139 Bengal. Về mặt di truyền, O139 Bengal hình
thành từ type sinh học El Tor nhưng cấu trúc kháng nguyên của chúng
cũng biến đổi. Tất cả ở mọi lứa tuổi trên người (kể cả trong vùng đã có
dịch) đều có thể bị nhiễm, vi khuẩn V. cholerae O139 đã gây bệnh ít nhất
11 nước ở Đông Nam Á đến năm 2005 (Garg et al., 2003).
Ở Việt Nam bệnh tả là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra
tiêu chảy từ những năm 1850. Năm 1885, một đợt bùng phát dịch tả lại xảy ra
và đến năm 1910-1930 bệnh tả đã được báo cáo hàng năm (Nguyen, 1962).
Đến năm 1964 V. cholerae O1 type sinh học El Tor lại gây bệnh ở miền Nam
Việt Nam. Trong lịch sử, phần lớn các đợt dịch bệnh tả đều xuất hiện ở các
khu vực ven biển miền Trung và Nam Việt Nam. V. cholerae O1 type sinh
học El Tor hiếm khi xuất hiện ở Bắc Việt Nam. Đến năm 1976, bệnh có xảy
ra tại thành phố Hải Phòng và tỉnh Quảng Ninh (Dalsgaard et al., 1999). Từ
năm 2007 đến năm 2008 và năm 2010, một chủng vi khuẩn V. cholerae
O139 được phân lập từ 7 mẫu nước và được đặt tên là V. cholerae O139.
Tuy có sự lây lan nhanh chóng của O139 trong khu vực Đông Nam Á
nhưng ở Việt Nam, có rất ít thông tin về bệnh tả do O139 gây ra (Dong Tu
Nguyen, 2012).
2.2 Phân loại – Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae
2.2.1 Phân loại vi khuẩn V. cholerae
V. cholerae là vi khuẩn Gram âm gây bệnh tả ở người, thuộc chi Vibrio
lớp Gammaproteobacteria. V. cholerae có hai type sinh học chính, đó là
type sinh học cổ điển và type sinh học El Tor, và một số nhóm type huyết
thanh khác. V. cholerae được phân loại căn cứ trên kháng nguyên O ở
3


phần thân và các nhóm huyết thanh, đến nay người ta đã biết có ít nhất 200
nhóm huyết thanh (Kaper et al., 1995). Trước năm 1992, nhóm O1 là
nhóm huyết thanh duy nhất gây ra dịch, từ năm 1992 về sau một nhóm

huyết thanh khác là O139 gây ra các đại dịch bùng phát tại Ấn Độ và
Bangladesh. Hiện nay, 2 nhóm huyết thanh này là nguyên nhân gây bệnh
tả lưu hành và phát thành dịch; những nhóm huyết thanh V. cholerae khác
không gây thành dịch được gom chung lại thành nhóm V. cholerae non-O1
và non-O139.
V. cholerae O1 còn được phân ra 3 type huyết thanh, Ogawa, Inaba và
Hikojima; type thứ 3 này ít gặp, các type huyết thanh này được chia thành
3 loại kháng nguyên (KN): A, B và C.
2.2.2 Đặc điểm hình dạng của Vibrio cholerae
Vi khuẩn V. cholerae còn gọi là vi khuẩn tả hay phẩy khuẩn tả, có
chiều dài từ 1μm đến 3 μm và chiều ngang từ 0,5 μm đến 0,8 μm (1mm =
1.000 μm). Chúng có 1 sợi chiên mao (flagellum) ở một đầu giúp chúng di
chuyển rất nhanh theo hình xoắn ốc loạng choạng. Vi khuẩn tả có 2 loại
kháng nguyên chính: kháng nguyên H (flagellar) và kháng nguyên O từ
thân vi khuẩn (somatic O antigen).

Hình 2.1: Cấu tạo vi khuẩn V. cholerae. (Korinfo, 2000)
2.2.3 Đặc tính di truyền về độc lực của Vibrio cholerae
Sự xuất hiện của TCP và độc tố vi khuẩn tả được điều khiển bởi các
yếu tố di truyền bao gồm toxR, tcpH, tcpP, và toxT. Tất cả những yếu tố di
truyền này hợp lại thành đặc tính có độc lực của V. cholerae, đặc tính này
có liên quan đến tính di động, khả năng định vị trong ruột, và sự sản xuất
độc tố. Khi V. cholerae được tìm thấy trong phân của bệnh nhân, điều đó
cho thấy có sự sao chép di truyền của V. cholerae rất độc và rất dễ lây lan.
Quá trình tiến hóa của V. cholerae gây bệnh lý có 2 giai đoạn quan trọng:
trước hết, các chủng V. cholerae tiếp nhận phage TCP và biến thành V.
cholerae TCP +. Sau khi trở thành TCP+, tức là vi khuẩn có tua, tua sẽ
4

đóng vai trò thụ thể cho phage CTXΦ để cho phage chui vào vi khuẩn, và
gắn DNA của nó vào nhiễm sắc thể của V. cholerae theo cơ chế phage
tiềm tan (lysogenic).
Bản chất của các gene CTX và TCP đều là bacteriophage từ bên ngoài
được gắn vào trong nhiễm sắc thể của V. cholerae. V. cholerae vốn là vi
khuẩn “hiền” nhưng khi bị các bacteriophage gây nhiễm chúng mới trở
thành chủng sinh độc tố và gây bệnh lý. V. cholerae trở thành chủng sinh
độc tố (toxicogenic V. cholerae) và gây bệnh khi chúng có tiêm mao giúp
vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột non.

Hình 2.2: Sự hình thành chủng V.cholerae có độc tố (Blake, 1994)

2.2.4 Các yếu tố về độc lực
V. cholerae sử dụng hai yếu tố độc lực, độc lực từ tiêm mao/roi (TCP)
và độc tố tả CTX. TCP, mã hóa cho các yếu tố gây bệnh, là một loại
protein từ tiêm mao (Kirn et al, 2000), TCP cũng rất cần thiết cho sự hình
thành khuẩn lạc của V. cholerae định vị trong ruột non của chuột sơ sinh
(Taylor et al., 1987) và con người (Herrington et al., 1988). Khi sự hình
thành khuẩn lạc trong ruột non thành công, V. cholerae sẽ tiết ra độc tố gây
bệnh tả. Các độc tố kích thích các tế bào biểu mô ruột non tiết ra dịch lỏng
trong lòng ruột non, từ đó có hiện tượng tiêu chảy mất nước. Do đó, sự đột
biến ở roi của một số chủng V. cholerae sẽ ảnh hưởng đến yếu tố độc lực
TCP, Hình sau biểu hiện sự biến đổi về roi.

5


a. Roi dài

b. Không có roi

c. Roi ngắn

a. Chủng vi khuẩn hoang dại; b. Vi khuẩn đột biến gene; c. Vi khuẩn đột biến gene
Hình 2.3: Vi khuẩn đột biến roi (Ewen, 2008)

Nếu vi khuẩn mang gene đột biến sẽ dẫn đến khiếm khuyết trong việc
lắp ráp roi (flagellum). Qua Hình trên, đối với loài hoang dại (Hình 2.3a)
không mang gene đột biến nên chiều dài roi dễ dàng nhìn thấy qua hiển vi
điện tử; Hình (2.3b) vi khuẩn mang gene flgT đột biến nên không hình
thành roi; Hình (2.3c) vi khuẩn có roi ngắn hơn cũng do hiện diện gene đột
biến roi fliA.
Chương 3: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1 Nội dung nghiên cứu
Phân lập, định danh, tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. trên các loại mẫu
tại tỉnh Trà Vinh; định type huyết thanh học vi khuẩn V. cholerae phân lập
được; giải trình tự nucleotide vi khuẩn V. cholerae dựa trên gene 16S
rDNA; xác định gene kháng kháng sinh vi khuẩn V. cholerae được tuyển
chọn; thử nghiệm chủng V. cholerae phân lập được trên thỏ nhằm đánh sự
đột biến của V. cholerae và khả năng đáp ứng miễn dịch đối với vaccine
hiện hành.
Thời gian nghiên cứu từ tháng 10/2012 – 4/2014 tại Khoa Nông nghiệp
và Sinh học Ứng dụng Đại học Cần Thơ; Bệnh viện đa khoa Trung ương
Cần Thơ; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Đại học Cần
Thơ; Khoa Nông nghiệp – Thuỷ sản trường Đại học Trà Vinh; mẫu gửi
giải trình tự tại công ty Macgrogen Hàn Quốc.

6

3.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1.1 Hoá chất, môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Nước cất, nước muối sinh lý (NaCl 0,9%), thuốc thử Kowacs, cồn 96o,
cồn 70o, muối tinh khiết, alkaline saline peptone water (ASPW) với các
nồng độ từ 0-10%. Môi trường chuyên chở mẫu bệnh phẩm: Cary- Blair
(India); môi trường nuôi cấy: TCBS: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muốiSacaroza (Merck); SNA: Saline Nutrient Agar (Merck); môi trường làm
kháng sinh đồ: MHA (Muller Hinton Agar), đĩa giấy tẩm kháng sinh (Nam
Khoa, Tp. HCM).
Môi trường và hóa chất dùng phân lập vi khuẩn: đĩa giấy oxidase, đĩa
giấy ONPG, TSI agar (Saline triple sugar iron agar), ADH (Arginine
Dihydrolase), Tryptophan saline (Bộ định danh vi khuẩn Gram âm: IDS
14GNR, Nam Khoa, Tp.HCM). 8 loại đĩa kháng sinh sử dụng:
streptomycin (10μg), norfloxacin (10μg), ampicillin (10μg), tetracycline
(30μg), azithromycin (30μg), amoxicillin-clavulanic axit (30μg),
trimethoprim-sulfamethoxazole (25μg) và vancomycin (30μg); bộ thuốc
nhuộm Gram: dung dịch crystal violet; lugol; cồn - aceton; safranin
(Germany); kháng huyết thanh định type V. cholerae: Inaba, Ogawa và
O139; (Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh).
3.2.1.2 Hoá chất, sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR
Xác định vi khuẩn dựa trên đoạn gene 16S rDNA
Bảng 3.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR dựa
trên gene 16S rDNA.
Mồi

Trình tự nucleotide của mồi (5'3')

27F

AGAGTTTGATCCTGGCTC’

1492R

TACGGTTACCTTGTTACGACT

ctxA-F
ctxA-R

Độ dài (bp)

Mồi xuôi // Mồi ngược

CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG
TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG

O139rfb-F

AGCCTCTTTATTACGGGTGG

O139rfb-R

GTCAAACCCGATCGTAAAGG

1500
302

449

(1) Weisburg et al., (1991); (2)-(3): Alam et al., (2006)

Xác định gene kháng kháng sinh
7


Hoá chất ly trích DNA: Tris-HCl, EDTA, H20; hoá chất PCR: Buffer,
MgCl2, dNTPS, DMSO, Taq polymerase và các cặp mồi xác định gene
kháng kháng sinh.
Bảng 3.2: Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR xác
định gene kháng kháng sinh.
Nhóm
kháng sinh
β-Lactam

Aminoglycosid

Gene
được
kiểm tra
blaSHV
aac(3)IV

Tetracycline

tetA

Trimethoprim

dhfrI

Trình tự nucleotide của mồi

(5'3')
Mồi xuôi // Mồi ngược
TCGCCTGTGTATTATCTCCC
CGCAGATAAATCACCACAATG
GTGTGCTGCTGGTCCACAGC
AGTTGACCCAGGGCTGTCGC
GTGAAACCC AACATACCCC
GAAGGCAAGCAGGATGTAG
AAGAATGGAGTTATCGGGAATG
GGGTAAAAACTGGCCTAAAATTG

Độ dài
(bp)
768
286
888
931

(Maynard et al., 2005)
3.2.1.3 Vật liệu nghiên cứu
- 160 mẫu nghêu thu từ huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang; 100 mẫu
huyết heo thu từ các cơ sở giết mổ heo tại Thành phố Trà Vinh, huyện
Châu Thành, huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang và huyện Càng Long;
40 mẫu phân lấy từ bệnh nhân tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa tỉnh Trà
Vinh; 150 mẫu nước thu từ sông, nước biển và các địa điểm nuôi tôm; 50
mẫu tôm thu từ huyện Duyên Hải. Tất cả các mẫu được bảo quản trong
thùng trữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm để nuôi cấy, phân lập.
- Vaccine tả uống (mORCVAX) điều chế từ các chủng vi khuẩn tả
gồm type sinh học Cổ điển và type sinh học El Tor và chủng vi khuẩn tả
O139 (Công ty TNHH MTV Vaccine và Sinh phẩm số 1, Hà Nội); 24 thỏ

trắng giống New Zealand, trọng lượng 2-2,5kg/con.
3.2.1.4 Thiết bị - Dụng cụ
Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, autoclave, máy lắc, buồng cấy vô trùng và kính
hiển vi, cân điện tử, ống nghiệm, đĩa petri, chai, ống đong, ống hút, lam,
kẹp, kéo, tăm bông vô trùng, găng tay, đèn cồn, túi nilon.
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1 Phương pháp phân lập, định danh vi khuẩn
* Phương pháp lấy mẫu
8


Mẫu nghêu: nghêu được thu mua tại các chợ huyện Duyên Hải và Cầu
Ngang, nghêu còn tươi (25gram/con), rửa sạch chất bẩn bên ngoài, lấy
phần thịt cắt nhuyễn (1gram) tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW.
Mẫu huyết heo: được thu từ các cơ sở giết mổ thuộc Thành phố Trà
Vinh và các huyện: Châu Thành, Duyên Hải, Cầu Ngang và Càng Long, ở
mỗi cơ sở đều lấy 25 ml mẫu/lần có pha nước muối với tỉ lệ 0,5%, mẫu
được chuyển về phòng thí nghiệm, sau đó hút l ml mẫu đem tăng sinh
trong 9 ml môi trường ASPW .
Mẫu nước: được thu trên bề mặt nước tại các ao nuôi tôm, nước sông,
nước biển (mỗi loại 25 ml mẫu), sau đó lấy 1ml nước tăng sinh trong 9ml
môi trường ASPW.
Mẫu tôm: được thu từ huyện Duyên Hải, tôm còn tươi (150gram/con)
tôm được rửa sạch lấy phần đầu, cắt nhuyễn 1gram mẫu, lọc lấy dịch trong
và tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW.
Mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy: dùng tăm bông vô trùng lấy phân
của bệnh nhân tiêu chảy, bảo quản ở môi trường vận chuyển Carry-Blair,
và chuyển về phòng thí nghiệm để nuôi cấy, phân lập.
* Phương pháp nuôi cấy
Các loại mẫu đều được nuôi tích lũy 2 lần trong môi trường ASPW. 1

ml mẫu được tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW ủ lần 1 ở 370C từ 6-8
giờ. Sau đó lấy 1 ml từ môi trường trên cho vào 9 ml môi trường ASPW ủ
lần 2 ở 41,50C từ 16-18 giờ; sau đo phân lập trên môi trường chuyên biệt
TCBS ở 370C/ 24 giờ: khuẩn lạc có thể có màu vàng/xanh.
Chọn khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trường thạch dinh
dưỡng có muối (SNA), trên SNA khuẩn lạc Vibrio spp. tròn, trơn, láng,
màu trắng sữa.
a. Xác định V. cholerae bằng phản ứng sinh hóa (quy trình ISO/TS
21872-1:2007)
Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng để phát hiện hay phân biệt các
loài Vibrio được thực hiện theo quy trình ISO/TS 21872-1:2007 (E).
Chọn khuẩn lạc trên SNA để thử nghiệm các phản ứng với oxidase;
kiểm tra tính lên men đường glucose/lactose; khả năng sinh hơi và sinh
H2S; thử phản ứng sinh Indole và sự di động. Thử tính ưa mặn của Vibrio
spp. ở các nồng độ NaCl khác nhau (0%, 2%, 6%, 8% và 10%).

9


* Nhuộm Gram: Vi khuẩn Vibrio spp. thuộc nhóm Gram âm nên sau
khi nhuộm Gram vi khuẩn bắt màu hồng nhạt và có hình que ngắn, sau đó
xem dưới kính hiển vi điện tử.
b. Xác định chủng V. cholerae bằng máy định danh tự động (Vitex
2 compact- Biomerieux - BVĐK Trung ương Cần Thơ).
Nguyên lý định danh vi sinh vật là dùng phương pháp đo màu để nhận
biết các tính chất sinh hoá của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của
các giếng môi trường có sẵn trong thẻ (card). Các thẻ định danh được phủ
hoá chất tối đa 64 giếng, các giếng có hoá chất đặc biệt phù hợp với tính
chất sinh hoá của vi sinh vật khác nhau.
c. Phương pháp định type huyết thanh học

Việc định type huyết thanh của V. cholerae được thực hiện bằng phản
ứng ngưng kết với 4 loại kháng huyết thanh Inaba, Ogawa, O139 và kháng
huyết thanh đa giá Inaba + Ogawa + O139 (Trần Linh Thước, 2009)
d. Xác định vi khuẩn Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR
Các gốc vi khuẩn thuần được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR, dựa trên
gene 16S rRNA. Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1,5%
trong dung dịch đệm TBE 1X ở điện thế 100V trong 90 phút và chụp bằng
máy chụp hình gel Biorad UV 2000, thang chuẩn 100 bp (công ty
Fermentas).
3.2.2.2 Phân tích trình tự gene 16S RNAvà thiết lập cây di truyền.
Sản phẩm PCR (DNA) ký hiệu 6 trình tự của 6 chủng thuộc Vibrios: V.
cholerae-Ng3, V. cholerae-O3.2, V. cholerae-O1.2, V. cholerae-81V1, V.
cholerae-N8 và V. cholerae-85V1, được giải trình tự tại công ty Macrogen
Inc (Hàn Quốc). Các trình tự được phân tích và đọc bằng phần mềm
Bio.Edit, sau đó so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên
Genbank và thiết lập cây di truyền.
3.2.2.3 Xác định sự kháng kháng sinh của vi khuẩn V. cholerae
a. Xác định sự kháng kháng sinh bằng PP Kirby Bauer
* Chọn 08 loại kháng sinh thường được sử dụng để điều trị bệnh ở
đường ruột, đặc biệt là bệnh tả.
Sau khi ủ 18 đến 24 giờ, đo đường kính vùng ức chế, kể cả đường kính
khoanh giấy kháng sinh và đọc kết quả dựa vào bảng tiêu chuẩn đánh giá sự
nhạy cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn đường ruột (CLSI, 2010).
b. Xác định sự kháng kháng sinh của V. cholerae bằng kỹ thuật
PCR (Polymerase Chain Reaction)
10


Sau khi ly trích DNA, tiếp tục xác định gene kháng kháng sinh
bằng kỹ thuật PCR với các trình tự cặp mồi tương ứng với gene kháng

kháng sinh gồm blaSHV, aac(3)-IV, tetA và dhfrI. Sản phẩm PCR được phân
tích trên gel agarose 1.5% trong dung dịch đệm TBE 1X ở 100V trong 90
phút và chụp bằng máy chụp hình gel Biorad UV 2000, thang chuẩn 100
bp (công ty Fermentas).
3.2.2.4 Phân tích trình tự gene kháng kháng sinh và thiết lập cây di
truyền.
Sản phẩm PCR (DNA) xác định gene kháng kháng sinh sau đó được
giải trình tự tại công ty Macrogen Inc (Hàn Quốc). Các trình tự được phân
tích, đọc bằng phần mềm Bio.Edit, so sánh với các trình tự nucleotide
tương đồng trên Genbank và thiết lập cây di truyền.
3.2.2.5 Thử nghiệm chủng V. cholerae phân lập và đáp ứng miễn
dịch trên thỏ đối với vaccine tả.
Phương pháp thí nghiệm
* Thử nghiệm độc lực và đáp ứng miễn dịch:
12 thỏ thí nghiệm cho uống vaccine tả với liều 1,5 ml/con, lặp lại lần 2
vào ngày thứ 14. Sau 28 ngày uống vaccine, thực hiện mổ khám; 12 thỏ
không cho uống vaccine nhưng chế độ nuôi dưỡng như nhau.
Tiêm các chủng vi khuẩn đã phân lập (N8, O3.2, O1.2, Ng3, 85V1 và
81V1) vào ruột thỏ không uống vaccine và thỏ đã uống vaccine như nhau,
sau đó mổ khám xác định tính đáp ứng miễn dịch của các lô thí nghiệm
trên. Thỏ được gây mê để phẫu thuật, ruột non được cột thành 4 đoạn, mỗi
đoạn 10 cm, cách nhau 2 cm. Dùng kim tiêm 1 ml vi khuẩn (có chứa 1 x
105 - 5 x 107 CFU) vào trong lòng từng đoạn ruột, đóng xoang phúc mạc,
kiểm tra chất lỏng ở các thời điểm 3, 6, 9, và 16 giờ sau khi tiêm.
Các chỉ tiêu theo dõi:
(i) Xác định ti lệ dịch lỏng (FA: Fluid accumulation): Tỉ lệ dịch lỏng
tích tụ trong các đoạn ruột được xác định bằng số lượng dịch lỏng
(ml)/chiều dài đoạn ruột của thỏ (cm).
(ii) Sự bám dính vi khuẩn vào bề mặt đường ruột: Cắt từng đoạn
ruột, cạo niêm mạc ruột hoặc dịch lỏng trong lòng ruột, sau đó pha loãng

chất lỏng theo dãy thập phân (log 10). Kết quả được tính theo công thức:
Mi (CFU/ml) = Ai x D1/v (Mi: số lượng vi khuẩn trong dung dịch ban
đầu; Ai: số khuẩn lạc trung bình/đĩa; D1: độ pha loãng; v: dung tích huyền
dịch /đĩa). Chuẩn bị các chuỗi pha loãng:
11


(iii) Tỉ lệ vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột non thỏ
Phần trăm (%) bám dính = 100 x số vi khuẩn bề mặt ruột/ số vi khuẩn
bề mặt ruột + CFU dịch lỏng (Richardson, 1991).
Xử lý số liệu: Phần mềm Excel: tính các giá trị trung bình về tỉ lệ
nhiễm V.cholerae và tỉ lệ kháng kháng sinh; phần mềm BioEdit: phân tích
kết quả giải trình tự nucleotide; phần mềm MEGA (Treeview): vẽ cây giản
đồ phả hệ; Minitab version 16.0: phân tích các giá trị FA và CFU.
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập và định danh Vibrio spp.
4.1.1 Kết quả phân lập Vibrio spp.
Vi khuẩn Vibrio spp. có thể phát triển trong môi trường thạch
muối-sucrose thiosulfate citrate-mật (TCBS): khuẩn lạc màu vàng
hoặc màu xanh tuỳ loài. Nhìn chung khuẩn lạc thuộc các loài V.cholerae,
V. vulnificus; V. fluvialis và V. alginolyticus đều có màu vàng, riêng khuẩn
lạc V. paraheamolyticus có màu xanh; kích thước khuẩn lạc của từng loài
cũng khác nhau (Trần Linh Thước, 2009).
4.1.2 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng phản ứng sinh hóa
Quan sát đặc tính sinh hóa để phân biệt giữa các loài thuộc
Vibrio spp. Hầu hết đều tạo sản phẩm oxidase và catalase, lên men
đường và không sinh hơi; V. cholerae, V. paraheamolyticus, V.
fluvialis và V. alginolyticus đều không lên men đường lactose, riêng V.
cholerae và V. alginolyticus có khả năng oxy hóa tryptophan của vi
khuẩn thành những sản phẩm biến dưỡng có gốc indole gồm indole,

sketole tạo nên một phức chất có màu đỏ (Trần Linh Thước, 2009).
Tất cả các loài như V. cholerae, V. vulnificus, V. fluvialis và V.
alginolyticus đều âm tính với urê, riêng V. parahaemolyticus có phản
ứng dương tính với urê. Vibrio spp. phát triển ở nồng độ muối thích
hợp: 0-2%, 2-6%, 2-8% và từ 2-10%.

12


Bảng 4.1: Kết quả thử sinh hoá các loài thuộc Vibrio spp.
Test SH
K. lạc
Oxidase

V.cholerae
Vàng
(+)

Vibrio spp.
V.paraheamolyticus
V.vulnificus
Xanh
Vàng
(+)

(+)

V.fluvialis
Xanh
(+)

TSI

V.alginolyticus
Vàng
(+)
(+)

Glucose

(+)

(+)

(+)

Lactose

(-)

(-)

(+)

(-)

(-)

Sucrose

+

(-)

(-)

(+)

(+)

LDC

(+)

(+)

(+)

(-)

(+)

Di động

(+)

(+)

(+)

(+)

(+)

ONPG

(+)

(+)

(+)

(+)

Indole

(+)

(-)

(-)

(-)

(+)

Urease

(-)

(+)

(-)

(-)

(-)

PAD

(-)

(-)

(-)

(-)

Citrate

(-)

(-)

(-)

(-)

(+)

Hình dạng vi khuẩn V. cholerae dưới kính hiển điện tử với độ phóng
đại 5.000 và 10.000:

Hình 4.1: Vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử, độ phóng đại 5.000 và
10.000 lần
Hình ảnh vi khuẩn V. cholerae chủng O3.2 qua kính hiển vi điện tử có
hình hơi cong, có chiều dài từ 1 µm – 3 µm, có roi ngắn. V. cholerae sử
dụng hai yếu tố độc lực từ tiêm mao/pili (TCP) và độc tố dịch tả CTX.
13


TCP cũng rất cần thiết cho sự hình thành khuẩn lạc của V. cholerae định vị
trong ruột non của chuột sơ sinh (Taylor et al., 1987) và con người
(Herrington et al., 1988).
Vi khuẩn trong nghiên cứu này có roi ngắn, điều đó có thể do sự khiếm
khuyết trong việc lắp ráp roi và có hiện diện của gene đột biến nên chiều
dài roi không nhìn thấy qua kính hiển vi điện tử.
4.1.3 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR

Hình 4.2: Sản phẩm khuếch đại đoạn gene 16S-27F và 1492Rbp
Kết quả điện di hình trên cho thấy các sản phẩm PCR dài 1500 bp
tương đương với đoạn gene 16S rRNA ở tất cả các chủng thuộc Vibrio
spp. dài 1.500 bp (William et al., 1991) bao gồm các khu vực bảo tồn cao
và có mặt ở hầu hết các vi khuẩn có phân nhánh nhưng có mối quan hệ
gần. Đối chiếu các kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa với các sản phẩm từ
PCR, nghiên cứu ghi nhận những loài thuộc Vibrio lần lượt: V. cholerae
vạch từ 1-6; V. fluvialis từ 7-11; V. paraheamolyticus từ 12-19; V.
vulnificus từ 20-23; V. alginolyticus từ 24-25. Cũng qua nghiên cứu này,
chưa phát hiện được chủng nào thuộc Vibrios mang gene O139rfb và
chủng mang gene mã hoá độc tố CTXA trên những mẫu từ môi trường

nước và thức ăn có nguồn gốc thủy sản.
Như vậy, qua kết quả PCR chưa phát hiện chủng nào thuộc Vibrio
mang gene O139rfb và mang gene mã hoá độc tố tả CTX trên những mẫu
từ môi trường nước và thức ăn có nguồn gốc thủy sản. Điều đó chứng tỏ
Vibrio O139 chưa xuất hiện phổ biến tại tỉnh Trà Vinh.

14


4.1.5 Tỉ lệ hát hiện Vibrio spp. trên các loại mẫu phân lập
Trên mẫu nghêu, có sự hiện diện rất đa dạng các loài thuộc Vibrio
spp., vì đây là loài sinh vật sống ở vùng nước mặn, rất phù hợp cho vi
khuẩn Vibrio spp. ký sinh, trong đó loài V. cholerae là 1,9 %. Trong
huyết heo do có sử dụng nguồn nước từ sông để sử dụng trong quá
trình giết mổ như rửa thịt, pha vào huyết (lúc chọc tiết), tỉ lệ dương
tính 2% với V. cholerae tương ứng với tỉ lệ V. cholerae được phân lập
từ nguồn nước sông (Bảng 4.2). Kết quả này cũng tương đương với
kết quả phân lập tại thành phố Hồ Chí Minh với tỉ lệ 1,1% trên mẫu
nước và 2,2% trong mẫu thực phẩm; tại Bến Tre trong mẫu nước là
5,7% (Nguyễn Hoàng Vũ, 2013), do Bến Tre là tỉnh có bệnh dịch tả xảy
ra vào năm 2010.
Bảng 4.2: Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên các loại mẫu
Loại mẫu

Loài Vibrios

(n = 500)
Nghêu (n = 160)

Huyết heo (n = 100)

Số mẫu kiểm
tra

Dương tính
Số mẫu Tỉ lệ (%)

V. cholerae

160

03

1,9

V. paraheamolyticus

160

03

1,9

V. vulniticus

160

04

2,5

V. fluvialis

160

05

3,1

V. alginolyticus

160

01

0,63

V. cholerae

100

02

2,0

V. paraheamolyticus

100

02

2,0

Nước (n = 150)
+ Nước sông

V. cholerae

50

01

2,0

+ Nước biển

V. alginolyticus

50

01

2,0

+ Nước ao nuôi tôm

V. paraheamolyticus

50

02

4,0

Tôm (n = 50)

V. paraheamolyticus

50

01

2,0

40

0

0,0

Phân (n = 40)
Tổng cộng

25

Trong 25 chủng phân lập được bao gồm 6 chủng thuộc loài V.
cholerae (24%); 8 chủng thuộc loài V. paraheamolyticus (32%); 4
chủng thuộc loài V. vulnificus (16%); 5 chủng thuộc loài V. fluvialis
(20%) và 2 chủng thuộc loài V. alginolyticus (8%).
Kết quả từ Bảng trên cho thấy tỉ lệ phân lập V. paraheamolyticus

là cao nhất (32%), chúng xuất hiện trên nghêu, trong nước sông, đặc
15


biệt ở nước ao nuôi tôm có độ mặn từ 6 - 8% và trên tôm, phù hợp với
môi trường sống của chúng. Nghêu cũng là ký chủ thường xuyên của
V. vulniticus; V. fluvialis và V. alginolyticus.
4.2 Kết quả định type huyết thanh
Kết quả định type huyết thanh học các chủng Vibrio cholerae phân lập
được bằng phản ứng ngưng kết cho thấy 100% (6/6) chủng dương tính với
kháng huyết thanh đa giá (Ogawa, Inaba, O139), trong đó 50% (3/6) chủng
thuộc Ogawa và 50% (3/6) chủng thuộc Inaba.
4.3 Kết quả tính tương đồng giữa các loài thuộc Vibrio trên
Genbank bằng công cụ BLAST
Trong nghiên cứu này, những chủng đại diện thuộc loài Vibrio spp.
phân lập được gồm chủng Ng3, O3.2, O1.2, N8 và O9.1 có tỉ lệ tương
đồng về trình tự nucleotide đoạn gene 16S-27F và 1492R của các chủng
phân tích với các chủng khác thuộc loài V. cholerae là rất cao.

Hình 4.3: Cây biễu diễn mối quan hệ di truyền dựa trên 16srDNA của các
Vibrio spp. phân lập và một số chủng tham khảo

Hình trên cho thấy những chủng vi khuẩn phân lập có những đặc điểm
tương tự như những chủng có nguồn gốc từ môi trường, chứng tỏ những
16


chủng thuộc Vibrio spp. luôn có nguy cơ tiềm ẩn và sẽ dễ dàng gây thành
dịch bệnh do tiếp nhận các gene từ các chủng có độc lực CTX.
4.4 Sự kháng kháng sinh của V. cholerae

4.4.1 Kết quả khảo sát sự kháng KS của V. cholerae bằng phương
pháp Kirby Bauer (CLSI, 2010)
Bảng 4.3: Sự nhạy cảm và đề kháng kháng sinh của V. cholerae
Kháng sinh
Streptomycin
Norlfoxacin
Ampicillin
Tetracyclin
Azithromycin
Amoxicillinclavulanic acid
Trimethoprimsulfamethoxazole
Vancomycin

Ký
hiệu
Sm
Nr
Am
Te
Az
Ac
SXT/Bt
Van

Nhạy cảm
Số mẫu
%

Số mẫu
kiểm tra

Kháng
Số mẫu

%

6
6
6
6
6
6

3
6
5
4
4
5

50
10 0
83
67
67
83

3
0
1

2
2
1

50
0
17
33
33
17

6

4

67

2

33

6

2

33

4

67

Các kết quả trên cho thấy, các chủng V. cholerae trong nghiên cứu này
còn nhạy cảm cao với nhiều loại kháng sinh như norfloxacin (100%),
ampicillin (83%) và amoxicillin-clavulanic acid (83%). Ngoài ra, V.
cholerae kháng với vancomycin (67%), streptomycin 50%, tetracycline
33%....Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Xuân
Trang và Nguyễn Ngọc Tuân (2012); Huu Dat Tran (2012).
4.4. Sự hiện diện một số gene kháng kháng sinh ở các vi khuẩn
phân lập bằng kỹ thuật PCR
M

1 2

tetA (880bp)

900bp

M: thang chuẩn 100bp, 1: V.cholerae (T1), 2: V.cholerae (T3)
Hình 4.4: Sản phẩm khuếch đại đoạn gen tetAF và testAR

17


Kết quả điện di hình trên, cho thấy các sản phẩm PCR dài khoảng
880bp tương ứng với đoạn gene tetA được phát hiện ở 2 chủng V.
cholerae. Gene tetA có trình tự bảo tồn đặc trưng cho V. cholerae nên các
sản phẩm PCR quan sát được đều thuộc chủng V. cholerae T1 và T2. Qua
nghiên cứu, chưa phát hiện chủng V. cholerae mang gene kháng kháng
sinh blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI. Chủng V. cholerae (T1) và chủng V.
cholerae (T3) đều phân lập từ môi trường nước và chúng đều mang gene

kháng tetracycline, thuộc nhóm Aminoglycosid. Như vậy một số chủng
trong nghiên cứu không chứa gene kháng tetracycline (tetA), nhưng chúng
có khả năng kháng với tetracycline, có thể là do sự hiện diện của các gene
khác mã hóa kháng với tetracycline như blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI. Kết
quả này cũng tương tự như kết quả của Dang et al,. (2006).
4.4.5 Kết quả so sánh trình tự nucleotide của chủng V. cholerae T1,
T3 với chủng V. cholerae hoang dại N16961 tìm các dạng đột biến
Các vị trí nucleotide được chèn vào và mất đi sẽ tương ứng với các vị
trí acid amin sẽ thay đổi trong chuỗi trình tự của các chủng V. cholerae, từ
đó suy luận về kiểu đột biến của chủng V. cholerae phân lập.
Bảng 4.4: So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang dại
N16961 với chủng V. cholerae T1
Codon
14
51
52
69
71
74
105
106
121
142
160
161
164
165
166

Thay đổi

Nucleotide
AGT→CTG
CCT→TGA
TGG→TCA
CGT→TAG
GTT→TAA
A-T→TCA
CA - →CG - TG→-TG GCT→TAG
GGT→TGA
AAA→TGA
GTA→TGA
CTT→TGA
GAA→TGA
TCA→TGA

Thay đổi
acid amin
Ser→Leu
Pro →End
Trp→Ser
Arg→End
Val→End
→ Ser
→
→
Ala→End
Gly →End
Gly →End
Val →End
Leu →End

Glu→End
Ser→End

18

Số nucleotide
T1 mất
1
1

Thêm đoạn
1
2

Kiểu đột biến
Sai nghĩa
Dịch khung
Sai nghĩa
Dịch khung
Dịch khung
Vô nghĩa
Vô nghĩa
Vô nghĩa
Dịch khung
Dịch khung
Dịch khung
Dịch khung
Dịch khung
Dịch khung
Dịch khung

Khi so sánh các vị trí nucleotide chủng V. cholerae hoang dại N16961
với các vị trí nucleotide chủng V. cholerae T1 phân lập được, nhận thấy
chủng V. cholerae T1 có hiện tượng đột biến là thêm hoặc mất từ 1- 3
nucleotide ở nhiều codon, dẫn đến hiện tượng thay đổi vị trí các acid amin
và thay đổi cấu trúc protein. Chủng V. cholerae T1 có codon kết thúc ở 10
vị trí, tương ứng với 10 vị trí acid amin, đây là một đột biến dịch khung do
thêm vào hoặc bớt đi một đến hai nucleotide, dẫn tới 1 stop codon (end)
điều đó sẽ làm ngừng tổng hợp chuỗi polypeptid và các enzyme này sẽ bị
ngừng hoạt tính (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007).
Bảng 4.5: So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang dại
N16961 với chủng V. cholerae T3
Codon

6
14
17
19
23
24
32
48
52
53
54
55
63
71
74

95
100
106
124
161

Thay đổi
Nucleotide
TAA→TGA
AGT→CTG
TGA→ATC
ACA→CCC
GAT→CTC
TCA→TAC
AAC→ATC
ACA→CGC
TGG→CTA
GAT→GCG
CTA→GCG
AAA→TAT
GGA→GAA
GTT→GAG
A-T→G- AAA →TGA
ATT→TGA
GAA → TAA
GCA→TAA
GTA→TAA

Thay đổi
acid amin

Số
nucleotide
T3 mất

Kiểu đột
biến

End →End
Ser→Leu
End→Ile
Thr→Pro
Asp→Leu
Ser→Tyr
Asn→Met
Thr→Ala
Trp→Leu
Asp→Gly
Leu→Gly
Lys→Tyr
Gly→Glu
Val→Glu
→
Lys →End
Ile→End
Glu→End
Ala→End
Val→End

Thêm đoạn

1
1
1
3
3
1
1
1
3
3
2
1
2
2

Dịch khung
Sai nghĩa
Vô nghĩa
Sai nghĩa
Sai nghĩa
Sai nghĩa
Sai nghĩa
Sai nghĩa
Sai nghĩa
Sai nghĩa
Sai nghĩa
Sai nghĩa
Sai nghĩa
Sai nghĩa
Vô nghĩa

Dịch khung
Dịch khung
Dịch khung
Dịch khung
Dịch khung

Tương tự với T1, khi so sánh các vị trí nucleotide chủng V. cholerae
hoang dại N16961 với các vị trí nucleotide chủng V. cholerae T3 phân lập
được, nhận thấy chủng V. cholerae T3 cũng có hiện tượng đột biến là thêm
19


hoặc mất từ 1- 3 nucleotide ở mỗi codon, dẫn đến hiện tượng thay đổi vị trí
các acid amin và thay đổi cấu trúc protein. Chủng V. cholerae T3 có codon
kết thúc ở 6 vị trí, tương ứng với 6 vị trí acid amin, đây là một đột biến
dịch khung do thêm vào hoặc bớt đi một đến hai nucleotide, dẫn tới 1 stop
codon (end) điều đó sẽ làm ngừng tổng hợp chuỗi polypeptid và các
enzyme này sẽ bị ngừng hoạt tính (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)
4.4.6 Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene kháng
kháng sinh tetA
Trong nghiên cứu này, 2 chủng V. cholerae phân lập tại Trà Vinh có
mang gene mã hoá gene kháng kháng sinh tetracycline phân lập trên mẫu
nước và mẫu nghêu có tỉ lệ tương đồng về trình tự nucleotide với các
chủng khác ở Thái Lan, Nhật Bản, Trung quốc, Indonesia, Brazil và Ấn
Độ, tương đồng 97% với 10 chủng; tương đồng 96% với 01 chủng và
tương đồng 94% với 04 chủng khác.

Hình 4.5: Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene kháng kháng
sinh tetA

Kết quả cây phát sinh loài cũng chỉ ra rằng 2 chủng V. cholerae T1 và
T3 phân lập từ nước sông tại Trà Vinh mang gene kháng kháng sinh có mối
liên hệ gần về trình tự nucleotide (97%) với nhiều chủng V. cholerae khác
phân lập tại Indonesia năm 2008; Brazil năm 2012; Haiti năm 2010; Trung
Quốc năm 2008; Bangladesh năm 2009; Thái Lan năm 2014 và V.
cholerae non-O1 vcmD phân lập tại Nhật Bản năm 2005.

20


Như vậy, cho thấy 2 chủng trong nghiên cứu này có cơ chế kháng
kháng sinh tương tự với các chủng so sánh và nguy cơ về sự di truyền gene
kháng kháng sinh là rất cao trong những chùng thuộc loài V. cholerae
4.5 Thử nghiệm độc lực chủng V. cholerae và đánh giá đáp ứng
miễn dịch trên thỏ.
4.5.1 Kết quả đánh giá chủng V. cholerae đối với thỏ không uống
vaccine phòng bệnh tả.
4.5.1.1 Lượng dịch lỏng FA (Fluid accumulation): Sau khi đưa huyền
dịch vi khuẩn vào ruột non thỏ với liều 105 – 107, lượng dịch lỏng tiết ra sẽ
được thu hồi qua biểu đồ sau:
Dịch lỏng (ml)

Thời gian (giờ)

Hình 4.6: Biểu đồ tỉ lệ dịch lỏng sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ
Qua kết quả trên, nhận thấy chủng V. cholerae hoang dại N16961 bắt
đầu tích luỹ dịch lỏng trong thời gian 9 giờ và 16 giờ sau khi tiêm vi khuẩn
là 1.45 ml – 2.3 ml/cm cao hơn so với 2 chủng V. cholerae T1 và V.
cholerae T3 trong nghiên cứu này là có mang gene kháng tetracycline khi
tiêm vào ruột non thỏ không kích thích niêm mạc ruột non thỏ tiết ra dịch

lỏng, chỉ tiết ra từ 0.8 – 0.9 ml/cm tại thời điểm 6 giờ, sau đó giảm dần chỉ
còn 0.15 - 0.2 ml/cm ở thời điểm 16 giờ. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống
kê (p<0,05) vì chủng V.cholerae hoang dại N16961 có roi, di động mạnh,
dễ dàng bám dính vào nhung mao ruột và kích thích niêm mạc ruột sản
xuất một lượng độc tố CT, gây ra hiện tượng tiêu chảy (Sameer et al.,
2014; Taylor et al., 1987).
4.5.1.2 Số lượng V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non đối
với thỏ không uống vaccine phòng bệnh tả.
Số lượng vi khuẩn đếm được tại các thời điểm: 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và
16 giờ được tổng hợp qua biểu đồ sau:
21


CFU V.cholerae

Thời gian (giờ)

Hình 4.7: Biểu đồ V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ
Qua Biểu đồ trên, số vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột non cao
nhất tại thời điểm 6 giờ và sau đó giảm dần tại các thời điểm 9 giờ và 16
giờ ở tất cả các chủng vi khuẩn. Riêng 2 chủng T1, T3 số lượng vi khuẩn
chỉ bám dính tạm thời ở thời điểm 6 giờ từ 5,105 đến 65,104, sau đó cũng
giảm xuống đáng kể ở thời điểm 9 giờ chỉ còn 4,105 đến 35,104 và đến thời
điểm 16 giờ không còn V. cholerae bám dính.
Tóm lại, thí nghiệm trên thỏ đã chứng minh vi khuẩn có hiện tượng đột
biến chỉ bám dính tạm thời tại thời điểm 6 giờ, sau đó giảm dần và mất hẳn
ở thời điểm 16 giờ.
4.5.2 Kết quả đánh giá tính đáp ứng miễn dịch trên thỏ đã uống
vaccine phòng bệnh tả
4.5.2.1 Lượng dịch lỏng FA (Fluid accumulation): Sau khi đưa huyền

dịch vi khuẩn vào ruột non thỏ với liều 105 – 107, lượng dịch lỏng tiết ra sẽ
được thu hồi qua biểu đồ:.
Dịch lỏng (ml/cm)

Thời gian (giờ)

Hình 4.8: Biểu đồ dịch lỏng sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ
22


Qua kết quả trên, nhận thấy tất cả các chủng V. cholerae T1, T3, O1.2
Ng3, 85V1, và 81V1 khi tiêm vào ruột non đối với thỏ đã uống vaccine
(mORCVAX) có tích luỹ dịch lỏng tại thời điểm 3 giờ nhưng sau đó giảm
dần đến thời điểm 6 giờ, 9 giờ và đến 16 giờ số lượng dịch lỏng không
đáng kể, do niêm mạc ruột có tiết kháng thể đã gắn với thụ thể trên bề mặt
vi khuẩn, cản trở vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột của vật chủ, từ đó niêm
mạc ruột không thể tiết ra độc tố và tế bào biểu mô ruột non không thể tiết
ra chất lỏng (Taylor et al., 1987). Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống
kê (p>0,05). Như vậy, đối với tất cả thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả đã
có kháng thể nên dịch lỏng không tiết ra ở ruột non.
4.5.2.2 Số lượng V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non đối
với thỏ đã uống vaccine phòng bệnh tả
Số lượng vi khuẩn thu được: 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 16 giờ :
CFU V.cholerae

Hình 4.9: Biểu đồ V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non
Qua Biểu đồ nhận thấy số đơn vị vi khuẩn bám dính trên niêm mạc
ruột non cao nhất tại thời điểm 6 giờ và sau đó giảm dần tại các thời điểm
9 giờ và 16 giờ ở tất cả các chủng vi khuẩn, riêng 2 chủng T1, T3 số lượng
vi khuẩn chỉ bám dính tạm thời ở thời điểm 6 giờ từ 8,104 đến 105, sau đó

cũng giảm xuống đáng kể ở thời điểm 9 giờ chỉ còn 12,103 đến 20,103, đến
thời điểm 16 giờ hầu như tất cả các chủng đều không còn bám dính vào
niêm mạc ruột non, chứng tỏ V. cholerae bị ức chế bởi các kháng thể được
tiết ra từ niêm mạc ruột non.
Vậy, đối với tất cả thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả đã có kháng thể
nên hàm lượng vi khuẩn chỉ bám dính tạm thời ở thời điểm 6 giờ, sau đó
không còn bám dính vào niêm mạc ruột non ở thời điểm 16 giờ, đặc biệt 2
chủng T1và T3 có hàm lượng vi khuẩn ít nhất so với các chủng khác.
23