Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ β - Lactam trong các mẫu sinh học và dược phẩm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.2 MB, 97 trang )
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
ĐAI HOC QUÔC GIA HA NÔI
̣
̣
́
̀ ̣
TRƯƠNG ĐAI HOC KHOA HOC T
̀
̣
̣
̣
Ự NHIÊN
TRẦN THỊ DUNG
NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH THUỐC KHÁNG
SINH HỌ β – LACTAM TRONG CÁC MẪU SINH HỌC VÀ
DƯỢC PHẨM
LUÂN VĂN THAC SI KHOA HOC
̣
̣
̃
̣
Hà Nội 2011
Chuyên ngành Hoá Phân tích
1
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS –
TS. Nguyễn văn Ri đã giao đề tài và nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa phân
tích, TS. Dương Hồng Anh Trung tâm nghiên cứu công nghệ môi trường và
phát triển bền vững ĐH Khoa học Tự nhiên ĐHQGHN, Ths. Nguyễn Thị
Tuyết ĐH Y Dược Thái Nguyên đã luôn giúp đỡ và trao đổi những kinh
nghiệm trong thời gian qua.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị trong trung tâm môi
trường, các bạn học viên sinh viên bộ môn Hóa phân tích, gia đình đã động viên
và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.
Hà nội, ngày 29 tháng 11 năm 2011
H ọc viên
Tr ần Th ị Dung
Chuyên ngành Hoá Phân tích
2
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..........................................................................................1
Chương
1.
Tổng
quan.....................................................................2
1.1.
Giới
thiệu
chung
về
chất
kháng
sinh...............................................................2
1.1.1. Lịch sử ra đời...................................................................................................2
1.1.2. Phân loại...........................................................................................................2
1.1.3. Đánh giá tác dụng.............................................................................................2
1.2. Kháng sinh β – Lactam.....................................................................................3
1.2.1. Định nghĩa.........................................................................................................3
1.2.2.
Cấu
trúc
và
phân
loại........................................................................................3
1.2.3.
Tính
chất
vật
lý
và
hóa
học...............................................................................7
1.2.4.
Tác
dụng............................................................................................................7
1.2.5.
chế............................................................................................................8
Chuyên ngành Hoá Phân tích
3
Điều
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
1.2.6. Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện
nay...............................................................................................................................9
1.3.
Các
phương
pháp
định
lượng
β
–
Lactam.....................................................11
1.3.1.
Các
phương
pháp
quang
học...........................................................................11
1.3.2.
Các
phương
pháp
điện
hóa.............................................................................12
1.3.3.
Các
phương
pháp
điện
di
mao
quản................................................................12
1.3.4.
Sắc
kí
bản
mỏng..............................................................................................13
1.3.5.
Sắc
kí
lỏng
hiệu
năng
cao
(HPLC)..................................................................14
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên
cứu....................17
2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên
cứu.................................................17
2.1.1.
Đối
tượng
và
mục
tiêu
nghiên
cứu..................................................................17
2.1.2.
Nội
dung
nghiên
cứu.......................................................................................17
2.2. Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp RP
HPLC..................................18
2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp
HPLC..................................18
Chuyên ngành Hoá Phân tích
4
Luận văn Thạc sĩ
2.2.2.
Sắc
Trần Thị Dung
ký
hấp
phụ
pha
ngược
RP
HPLC.............................................................20
2.2.3. Detector huỳnh quang.....................................................................................22
2.2.4.
Một
số
đại
lượng
đặc
trưng
của
HPLC...........................................................23
2.2.5.
Phân
tích
định
lượng
bằng
HPLC...................................................................25
2.3. Kỹ thuật dẫn xuất hóa các β Lactam với thuốc thử NBD
F.......................26
2.4.
Dụng
cụ
và
hóa
chất.........................................................................................28
2.4.1.
Máy
móc
và
dụng
cụ.......................................................................................28
2.4.2. Hóa chất..........................................................................................................28
Chương
3:
Kết
quả
và
thảo
luận..................................................30
3.1. Khảo sát các điều kiện tạo dẫn xuất giữa β Lactam và thuốc thử
NBDF.....................................................................................................................30
3.1.1. Khảo sát nhiệt độ phản ứng dẫn xuất
hóa.......................................................30
3.1.2. Khảo sát thời gian phản ứng dẫn xuất
hóa......................................................33
3.2.
Khảo
sát
các
điều
kiện
chạy
sắc
ký.................................................................36
3.2.1.
Chọn
thể
tích
loop)...........................................................36
Chuyên ngành Hoá Phân tích
5
vòng
mẫu
(sample
Luận văn Thạc sĩ
3.2.2.
Trần Thị Dung
Chọn
bước
sóng
của
detector..........................................................................37
3.3.
Chọn
pha
tĩnh...................................................................................................37
3.4.
Chọn
pha
động.................................................................................................38
3.4.1.
pH
dung
dịch
đệm...........................................................................................38
3.4.2.
Tỉ
lệ
thành
phần
pha
động...............................................................................40
3.4.3.
Nồng
độ
đệm
acetat
của
pha
động..................................................................44
3.4.4.
Tốc
độ
pha
động.............................................................................................47
3.5.
Đánh
giá
phương
pháp
phân
tích...................................................................50
3.5.1.Khảo
sát
khoảng
tuyến
tính
và
lập
đường
chuẩn.............................................50
3.5.2.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
(LOQ)...............................54
3.5.3. Độ đung c
́ ủa phép đo...............................................................................55
3.5.4.
Độ
lặp
lại
của
phép
đo.....................................................................................57
3.6.
Phân
tích
mẫu
thực..........................................................................................58
3.6.1.
Phân
tích
phẩm...............................................................................58
Chuyên ngành Hoá Phân tích
6
mẫu
dược
Luận văn Thạc sĩ
3.6.2.
Trần Thị Dung
Phân
tích
mẫu
sinh
học...................................................................................63
3.7. Kết quả một số phương pháp khác xác định kháng sinh cùng
loại............68
3.8.
Hướng
phát
triển
của
đề
tài............................................................................70
KẾT
LUẬN.....................................................................................71
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................73
PHỤ LỤC.......................................................................................79
Chuyên ngành Hoá Phân tích
7
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
DANH MỤC BẢNG
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Tên bảng
Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số Penicillin
Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số Cephalosporin
Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của Spíc vào nhiệt độ phản ứng
Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của Spíc vào thời gian phản ứng
Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất vào pH
pha động
Bảng 3.4. Sự phụ thuộc k’ vào pH pha động
Bảng 3.5. Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa dung môi
hữu cơ và đệm
Bảng 3.6. Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa ACN và
MeOH
Bảng 3.7. Sự phụ thuộc của k’ vào tỉ lệ giữa ACN và MeOH
Bảng 3.8. Thời gian lưu của chất phụ thuộc vào nồng độ đệm
Bảng 3.9. Diện tích píc chất phân tích tại nồng độ đệm khác nhau
Bảng 3.10. Thời gian lưu của các chất phân tích phụ thuộc vào
tốc độ pha động
Bảng 3.11. Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc
độ pha động
Bảng 3.12. Sự phụ thuộc của Spic vào nồng độ chất phân tích
Bảng 3.13. Các giá trị Ftính, Fbảng và phương trình đường chuẩn
của các kháng sinh β Lactam
Chuyên ngành Hoá Phân tích
8
Trang
4
5
7
32
35
38
39
41
43
43
44
45
47
47
51
53
Luận văn Thạc sĩ
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
Trần Thị Dung
Bảng 3.14. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các
chất chuẩn kháng sinh β Lactam
Bảng 3.15. Độ đung c
́ ủa phép đo tại nồng độ các chất 0,15ppm
Bảng 3.16. Độ đung c
́ ủa phép đo tại nồng độ các chất 0,40ppm
Bảng 3.17. Độ đung c
́ ủa phép đo tại nồng độ các chất 0,80ppm
Bảng 3.18. Khảo sát độ lặp lại của phép đo theo diện tích pic
Bảng 3.19. Thông tin mẫu thuốc phân tích
Bảng 3.20. Kết quả độ thu hồi xác định βLactam theo phương
pháp thêm chuẩn trong mẫu thuốc
Bảng 3.21. Kết quả tính nồng độ Cx và sự sai khác hàm lượng so
với kết quả in trên nhãn thuốc
Bảng 3.22. Hiệu suất thu hồi của mẫu nước tiểu
Bảng 3.23. Hiệu suất thu hồi của mẫu máu
Chuyên ngành Hoá Phân tích
9
55
56
56
57
58
59
61
63
64
66
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
MỞ ĐẦU
Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con
người ngày càng được quan tâm, đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp
đến sức khỏe con người.
Trong y học hiện đại, các β Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan
trọng chữa bệnh con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường
vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Nhờ các
thuốc kháng sinh mà y học có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như
dịch hạch, tả, thương hàn, và điều trị hiệu quả nhiều bệnh gây ra bởi vi khuẩn.
Nhưng, nếu liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn
nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn. Ngoài ra, còn gây
lãng phí cho người bệnh vì có những bệnh do vi rút không chữa được bằng kháng
sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và
ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh. Đôi v
́ ơi nh
́ ưng ng
̃
ươi cao tuôi, l
̀
̉ ượng dư
khang sinh trong n
́
ươc tiêu nhiêu, con gây ra cac bênh vê thân.
́ ̉
̀
̀
́ ̣
̀ ̣ Đông th
̀
ơi, l
̀ ượng
dư nay thai ra môi tr
̀
̉
ương se gây lên nh
̀
̃
ững hâu qua vô cung nghiêm trong. Vì v
̣
̉
̀
̣
ậy,
kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần
thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng.
Có rất nhiều phương pháp tách khác nhau. Trong đó, phương pháp tách
sắc ký là phương pháp tách chọn lọc có độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít, thời
gian phân tích ngắn.
Tách và xác định đồng thời kháng sinh β Lactam bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector huỳnh quang trong mẫu sinh học
và dược phẩm là một hướng nghiên cứu mới, với những ưu điểm của nó ngày
càng được áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ.
Chuyên ngành Hoá Phân tích
10
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
Trên cơ sở đó, chúng tôi chọn đề tài là: “Nghiên cứu điều kiện phân tích
thuốc kháng sinh họ β Lactam trong các mẫu sinh học và dược phẩm ”.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Kháng sinh β Lactam
1.1.1. Định nghĩa
Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng βLactam. Gồm các nhóm:
penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng
phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin.
Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và
Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6amino penicillanic (6APA).
Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm
Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7amino cephalosporinic
(7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên [1].
1.1.2. Cấu trúc và phân loại
* Các penicillin
Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β
Lactam
R
CO
S
N
H
6
5
7
1
CH3
4
3
N
2
CH3
O
COOM
Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin
Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R
3,3dimethyl7oxo4thia1azabicyclo[3.2.0]heptane2carboxylic acid
Chuyên ngành Hoá Phân tích
11
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình
2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn
khác nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H.
Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác
nhau [1].
Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin
Nhóm penicillin
Tên kháng sinh
R
Gồm các Penicillin tự
PenicillinG
nhiên và dẫn chất.Phổ
CH2-
(PENG)
Benzyl
Benzathin
Nhóm penicillin kháng penicilliiase tự nhiên
Hoạt tính
hẹp: vi khuẩn gram(+).
Không kháng β
lactamase
CH3
C-
Oxacillin
(OXA)
N
O
6[(5methyl3phenyl1,2oxazole4 tổng hợp. Phổ hẹp như
carbonyl)amino]
Cl
O
N
Cloxacillin
(CLO)
Là các Penicillin bán
CCH3
nhóm I. Kháng
penicilliiase, không tác
động vào vòng β –
Lactam được.
6{[3(2chlorophenyl )5methyl
oxazole4carbonyl]amino}
Chuyên ngành Hoá Phân tích
12
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
NH2NH2
Nhóm penicillin phổ rộng
CH-
Ampicillin
Phổ rộng, tác dụng cả
(AMP)
6([(2R)2amino2
khuẩn gram (+) và ().
phenylacetyl]amino)
Không kháng β
NH2NH2
Amoxicill
lactamase và
CH-
(AMO)
penicilliiase
HO
6{[(2R)2amino2(4
hydroxyphenyl)acetyl]amino}
* Các cephalosporin
Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng βLactam 4 cạnh gắn
với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi
các gốc R
R2
S
R1
CO
N
H
7
6
8
N5
1
2
3
4
O
R3
COOM
Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin
Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8oxo
5thia1azabicyclo[4.2.0]oct2ene2carboxylic acid
Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được
các cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.
Chuyên ngành Hoá Phân tích
13
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các
cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng
trên gram âm yếu hơn thế hệ sau [1].
Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin
Kháng sinh
I: tác dụng
mạnh nhất
R1
Cephalexin
CH-
(CEP)
gram (+), yếu Cephapirin
gram
().
dễ bị β
CH3
SCH2-
H
CH2OCOCH3
hủy
II: tác dụng
yếu hơn trên
khuẩn
N
N
Cephazolin
N N
lactamase phá
H
trên
Không bền và
vi
R3
NH2
trên vi khuẩn
nhất
R2
N CH2-
Cefaclor
CH-
(CEF)
H
H
N
-CH2 S
CH3
Cl
NH2
gram (+),
mạnh hơn
trên gram () Cefprozil
so với thế hệ
HO
CH- H
NH2
CH=CHCH3
I. Bền với β
lactamase.
III: tác dụng Cefixim
yếu hơn trên
vi
khuẩn
Chuyên ngành Hoá Phân tích
H2N
N
S
N
HOOCCH2O
14
H
CH=CH2
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
gram (+) so
với thế hệ I,
tác
dụng
mạnh trên Ceftazidim
gram (). Bền
với
β
H2N
N
S
N
HOOCC(CH3)2O
H
-CH2 N
+
lactamase
IV: hoạt phổ
tác dụng như
thế hệ III
H2N
nhưng tốt Cefepim
N
S
N
CH3O
hơn và kháng
nhiều
+
H
-H2C N
CH3
β
lactamase hơn
1.1.3. Tính chất vật lý và hoá học
Các βlactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong
nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi
hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần
chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH2.
Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng
phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm
độ hấp thụ).
Các βlactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2,52,8 tùy vào cấu trúc
phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, βlactamase có tác dụng phân cắt khung
phân tử, mở vòng βlactam làm kháng sinh mất tác dụng.
Chuyên ngành Hoá Phân tích
15
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu [2]
Tên kháng
sinh
AMP
pKa1
Tên kháng sinh
pKa1
2,7
CEP
2,6
Tên kháng
sinh
CEF
pKa1
2,75
1.1.4. Tác dụng
Cơ chế:
Các penicillin có khả năng acyl hóa các D alanin tranpeptidase, làm cho quá
trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị
ngừng lại và ít tác dụng trên vi khuẩn gram (). Mặc khác, các penicillin còn hoạt
hóa enzim tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết
quả là vi khuẩn bị tiêu diệt.
Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ
yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh βlactam có
hoạt phổ rộng [13].
Kháng thuốc:
Vi khuẩn sinh ra các βlactamase, là enzim có tác dụng mở vòng βlactam,
theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các
cách kháng không sinh ra βlactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được
gọi là kháng methicillin) [13]
Độc tính:
Các kháng sinh βlactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị
ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là
sốc phản vệ [13].
Chuyên ngành Hoá Phân tích
16
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và bà mẹ trong thời kỳ cho con bú.
Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc.
Đánh giá tác dụng kháng sinh:
Theo đơn vị tác dụng: 1 IU là tác dụng của 0,6 g penicillin G natri tinh
khiết trên một chủng mẫu tụ cầu. Hoạt lục của 1mg chất này là 1667 IU.
1 IU sẽ ứng với 0,672 g penicillin G kali tinh khiết, với 1mg chất này
ứng với 1585 IU [13].
1.1.5. Điều chế
Sinh tổng hợp:
Là phương pháp chủ yếu nuôi cấy chủng nấm Penicillium nonatum hoặc
Penicillium chrysogennum trong môi trường và điều kiện thích hợp. Chiết xuất
dạng kết tinh và muối natri hoặc kali. Để cho hiệu suất cao thường gây đột biến
bằng mù tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muốn,
đồng thời thêm vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng
cho quá trình sinh tổng hợp. Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào là
acid phenylacetic. Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được quá
trình lên men. Trong môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid →
polypeptide. Penicillin tạo thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men.
Bán tổng hợp:
Các penicillin bán tổng hợp bằng cách chế tạo acid 6amino penicillanic
(A6AP).
Nuôi cấy nấm penicillium không thêm tiền chất, khi đó môi trường dồi
dào A6AP, chiết lấy trực tiếp.
Tách phần phenylacetyl (C 6H5CH2CO) khỏi phân tử penicillin G bằng
acylase thích hợp rồi chiết lấy A6AP. Acyl hoá A6AP với clorid acid trong môi
Chuyên ngành Hoá Phân tích
17
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
trường acetone, có mặt triethylamin để hấp thu HCl giải phóng ra trong phản ứng
được penicillin khác.
Tổng hợp hoá học:
Chưa được ứng dụng rộng rãi.
1.1.6. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
Ta biết rằng, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ
chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các
bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để
điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh
thích hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế
giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều,
cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách. Từ đó, làm cho
các vi khuân d
̉ ần dần kháng thuốc, việc chữa trị bệnh ngày càng khó khăn và sự ô
nhiễm môi trường do kháng sinh gây ra càng trầm trọng hơn [42].
Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275
triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R.
Gonzales [4,46], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp
trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không
cần và không điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến
enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng
vancomycin. Theo báo cáo của A.W. McCormick [15] năm 2003, tỉ lệ
pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm
2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc
tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.
Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với
phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế
giới trong vòng 24 giờ. Theo D.P. Raymond [26], mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu
người bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi
Chuyên ngành Hoá Phân tích
18
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5
đến 10 tỉ đôla.
Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [9],
năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh,
71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian dưới 5
ngày).
Theo [9], qua thống kê tại khoa Dị ứng Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện
Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có
không ít trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất,
dễ gây tử vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu,
thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó
giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua
kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều
loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh
tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%,
Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết
và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%.
Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng
kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các
nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý”
(Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm
chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát
triển.
Năm 2001, Tổ chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để
Kiểm Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y
tế của tất cả các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí
nghiệm phải tăng cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn
đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ
Chuyên ngành Hoá Phân tích
19
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
kháng sinh trong máu. Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn
ngừa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang
phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có
hoạt chất.
Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta
sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn
chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.
1.2. Các phương pháp phân tích định lượng β lactam
1.2.1. Phương pháp quang học
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang
học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các
phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi
xác định βlactam, đặc biệt trong dược phẩm.
Các βlactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp phụ, chúng
cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong
nhiều trường hợp, các βlactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để
phân tích.
Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các βlactam với độ
nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang
hóa của các βlactam.
A. FernándezGonzález và cộng sự [17] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức
với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện
thu được 4.107M (0,16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy
cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc
uống, huyết thanh…
Theo [30], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống
bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của
kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl 2, KCl 2M. Kết quả tạo ra
Chuyên ngành Hoá Phân tích
20
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8 40 mg/l
và giới hạn phát hiện của AMO là 0,73 mg/l, AMP 0,76 mg/l.
Wei Liu và cộng sự [49], sử dụng phản ứng quang hóa của βlactam với
hệ luminol K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân
tích một số βlactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP) trong sữa đat gi
̣ ơi han
́ ̣
phat hiên thâp: PEN là 0,5 mg/l, cefradine 0,04 mg/l, cefadroxil là 0,08 mg/l; 0,1
́
̣
́
mg/l CEP. Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV
VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0,1 mg/l.
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối
tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất
kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự
chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp
chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của
phương pháp này.
1.2.2. Phương pháp điện hóa
Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β
lactam nhưng không phổ biến nhiều. Theo [26], Daniela P. Santos và cộng sự sử
dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l)
trong môi trường đệm axetat 0,1M, pH= 5,2.
1.2.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis CE)
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về
hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã
được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh βlactam trong nhiều đối
tượng mẫu khác nhau.
L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [37] sử dụng phương pháp điện
di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm
điện di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8,5. Tiến hành phân tích tại thế
điện di 10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách
Chuyên ngành Hoá Phân tích
21
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân
tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0,14 đến
0,27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối cho thời gian lưu từ 0,25 đến 0,86%, diện
tích pic 1,3 đến 4,15%; độ thu hồi trên 96%.
Biyang Deng và cộng sự [19] đã sử dụng phương pháp điện di với detector
điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp
0,31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95,77%, độ
lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/
mẫu.
Attila Gaspar và cộng sự [16] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh
họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone
electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6,8.
Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện
14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon,
cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim,
ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 – 1,62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới
hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục
đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ
Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và 180C). Kết quả
cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau
khi pha loãng.
M.I.BailonPerez và cộng sự [38] sử dụng phương pháp CZE và detector
UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH =8 và 20% (v/v) ethanol,
dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng
thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền m ẫu n ước
(nước sông, nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0,8; 0,8; 0,25; 0,30;
0,30; 0,9; 0,08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối
thấp hơn 10%.
Chuyên ngành Hoá Phân tích
22
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
1.2.4. Sắc ký bản mỏng ( TLC)
Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để
kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích co tính
́
ưu việt, tiến hành nhiều mẫu
cùng một lúc song song rất tiện lợi. Khi TLC được trang bị phần phát hiện là
một máy đo quang có thể phân tích định tính và định lượng. Tuy nhiên phương
pháp này chỉ dùng để định tính.
1.2.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô
cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác
nhau, nhất là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá
học hợp chất thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích
lượng vết các chất.
Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh lactam bằng phương pháp
HPLC
Theo [50], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích
penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện
chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN –
(C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong
sữa 210 μg/kg, trong thịt 25100 μg/kg.
J.M. Cha và cộng sự [32] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β
lactam trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18
(2,1 mm×50 mm, 2,5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH),
C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút
A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0,25 ml/phút; nhiệt độ
cột 450C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO,
cephapirin có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề
mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý.
Chuyên ngành Hoá Phân tích
23
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang,
với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [19] C.Y.W Yang và cộng
sự dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa
bò (pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5,6 – 24/76; detector huỳnh quang:
346 nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5 μg/kg và 0,3 μg/kg. Tuy
vậy, do các βlactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên
phản ứng quang hóa [17, 25] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng
từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc
được.
Trong [33, 34], Boison J.O. và cộng sự sử dụng cột Spherisorb ODS2
(250mm*4,6mm, 5μm); pha động : ACN –Na2S2O3 15,7mM trong đệm photphat
0,1M pH 6,5; tốc độ pha động 1ml/phút, detector UV 325nm, phân tích đồng thời
AMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 25 g/kg.
Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ
dẫn… để phân tích các βlactam.
Trong [24], D.Hurtaud và cộng sự sử dụng etylaxetat để chiết tách CLO,
OXA, dicloxacillin từ thịt bò đạt hiệu suất thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91%.
Còn trong [46], WJ Blanchflower và cộng sự dung diclometan và hexan để tách
penicillin V, PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thận, thịt và sữa, hiệu suất
đạt 89117%.
Khi tách và làm giàu các β Lactam trong mẫu phân tích bằng kỹ thuật
SPE thì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là C18) và trao
đổi ion dựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu
cơ.
K. Takeba và cộng sự sử dụng cột chiết pha rắn pha đảo C 18 và dung môi
rửa giải là MeOH để tách PEN, AMP, CLO, dicloxacillin, nafcillin từ sữa đạt
hiệu suất thu hồi 8389%.
Chuyên ngành Hoá Phân tích
24
Luận văn Thạc sĩ
Trần Thị Dung
Còn trong [32] sử dụng cột Oasis HLB (60mg, 3ml) để tách và làm giàu
AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin trong mẫu nước môi trường đạt hiệu
suất thu hồi 77,1 95,9%.
Trong [28] sử dụng cột Osis MAX (500mg, 6ml, trao đổi anion) để tách
AMO, AMP, PEN, penicillin V, oxacillin CLO, nafcillin và dicloxacillintrong nước
thải cho hiệu suất thu hồi 76100%.
Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như
thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương
pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với
nền mẫu và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ. Do đó việc kết hợp phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao và kỹ thuật chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu
đạt độ tối ưu cao trong việc phân tích β – Lactam do có độ nhạy, độ chính xác và
độ lặp lại cao.
Chuyên ngành Hoá Phân tích
25
