Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Thử nghiệm tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của các chế phẩm cây trinh nữ hoàng cung

ĐẠI H
ỌC QU
ỐC GIA HÀ N
ỘI
ĐẠI
HỌC
QUỐC
GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG
ĐẠI
HỌC
KHOA HỌC
TỰỰNHIÊN
TRƯỜNG Đ
ẠI H
ỌC KHOA H
ỌC T
 NHIÊN
KHOA SƯ PHẠM
­­­­­­­­­­­­­­­­

­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­

KHOÁ LUẬ
N TỐT NGHIỆP 
Phạm Huy Cường
Đề tài:
THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO 
CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
Giáo viên hướng dẫn:     Sinh viên thực hiện:  Lớp: 

       
        
Hµ né i ­ 2009

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

1

Hà Nội ­ 2012


ĐẠI H
ỌC QU
ỐC GIA HÀ N
ỘI
ĐẠI
HỌC
QUỐC
GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG
ĐẠI
HỌC
KHOA HỌC
TỰỰNHIÊN
TRƯỜNG Đ
ẠI H
ỌC KHOA H
ỌC T
 NHIÊN
KHOA SƯ PHẠM

­­­­­­­­­­­­­­­­

­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­

Phạm Huy Cường
KHOÁ LUẬ
N TỐT NGHIỆP 

Đề tài:
THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO 
CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

Chuyên ngành
: Sinh học thực 
Giáo viên hướng dnghi
ẫn:     
ệmSinh viên thực hiện:  Lớp: 
Mã số

: 60 42 30            
                
     
Hµ né       
i ­ 2009
        

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
2

TS. NGUYỄN VĂN ĐÔ


Hà Nội ­ 2012

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ  lòng kính trọng và biết  ơn sâu sắc tới cán bộ  hướng dẫn  
khoa học TS. Nguyễn Văn Đô ­ Phó chủ nhiệm bộ môn Miễn dịch ­ Sinh lý bệnh,  
Trường Đại học Y Hà Nội người thầy đã tận tình chỉ  bảo dẫn dắt tôi trong  
nghiên cứu khoa học, cùng tôi giải quyết nhiều khó khăn, vướng mắc trong quá  
trình thực hiện luận văn, đóng góp những ý kiến quý báu cũng như tạo mọi điều  
kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ  lòng quý trọng và biết  ơn sâu sắc tới GS. TSKH. Phan Thị  
Phi Phi người thầy đã tận tình chỉ  bảo đóng góp những ý kiến quý báu và tạo  
điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị  
Ngọc Trâm – Giám đốc Công ty TNHH Thiên Dược, tỉnh Bình Dương đã tạo mọi  
điều kiện thuận lợi về  tình cảm cũng như  kinh phí để  tôi hoàn thành luận văn  
này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS. TS Phạm Đăng Khoa –  
Chủ nhiệm bộ môn, PGS. TS Nguyễn Thanh Thúy – Phó chủ nhiệm bộ môn, cùng  
toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh, Trường  Đại học Y  
Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ, nhân viên khoa Xạ 3  
Bệnh viện K Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.

3

Nhân dịp này, cho tôi được gửi lời cám ơn tới các thầy cô Khoa Sinh học,  
Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Các thầy cô đã  
cho tôi những kiến thức hết sức mới mẻ  và cần thiết để  tôi thấy thêm tự  tin,  
bước tiếp trên con đường nghiên cứu khoa học.
Và trên hết, tôi muốn gửi tới lời cảm  ơn chân thành nhất  đến những  
người thân trong gia đình và bạn bè luôn ở bên động viên, giúp đỡ  tôi trong suốt  
thời gian học tập và làm việc.
Chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 12 tháng 12 năm 2012
Học viên

                                                                          Phạm Huy Cường

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT 
ADN

: Acid Deoxyribonucleic

AIDS

: Acquired Immunodeficiency Syndrome

ARN

: Acid Ribonucleic

B2M

: Beta 2 microglobulin

CD

: Cluster of  Differenciation

cDNA

: Complementary Deoxyribonucleic

DDT

: D­dopacchrome tautomerase

dNTP

: Deoxyribonucleotid Triphotphat

EBV

: Epstein Barr Virus

ELISA

: Enzyme – Linker Immunosorbent Assay

HIV

: Human Immunodeficiency Virus

HLA

: Human Leucocyte Antigen

HPLC

: High Perfomance Liquid chromatography

IL­2

: Interleukin – 2

IL­2R

: Interleukin – 2 Receptor

4


KN

: Kháng nguyên

KT

: Kháng thể

LGL 

: Larger gramilar lymphocyte

MHC

: Major Histocompatibility Complex

NK

: Natural Killer

PCR

: Polymerase Chain Reaction

SCF

: Stem cell factor

SGMD

: Suy giảm miễn dịch

TNFα

: Tumor Necrosis Factor alpha

TNHC

: Trinh nữ hoàng cung

UTCTC

: Ung thư cổ tử cung

UTDD

: Ung thư dạ dày

UTVMH

: Ung thư vòm mũi họng

MỤC LỤC

 MỞ ĐẦU                                                                                                                            
 
...........................................................................................................................
   
 1
 Chương 1                                                                                                                            
 
...........................................................................................................................
   
 3
  TỔNG QUAN TÀI LIỆU                                                                                                  
 
.................................................................................................
   
 3
 1.1. Cây Trinh nữ hoàng cung                                                                                            
 
...........................................................................................
   

 3
 1.1.1. Phân biệt cây TNHC với các cây náng khác                                                    
 
...................................................
   
 4
 1.1.2. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L.                                         
 
.......................................
   
 7
 1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây TNHC ở Việt Nam                                               
 
.............................................
    
 10
 1.2. Vai trò của hệ thống đáp ứng miễn dịch trong ung thư                                         
 ........................................
 
    
 11
 1.2.1. Đại cương đáp ứng miễn dịch chống ung thư                                              
 
.............................................
    
 11
 1.2.2. Suy giảm miễn dịch                                                                                       
 
.....................................................................................
    

 12
 1.2.3. Ung thư vòm mũi họng                                                                                   
 
.................................................................................
    
 14
 1.2.4. Nguyên nhân ung thư vòm                                                                              
 
.............................................................................
    
 15
 1.3. Tình hình nghiên cứu về thuốc điều trị suy giảm miễn dịch                                  
 
.................................
    
 16
 1.3.1. Vai trò của các cytokin                                                                                   
 
..................................................................................
    
 17
 1.3.2. Một số cytokin liên quan đáp ứng miễn dịch chống ung thư                       
 
......................
    
 21
 1.3.3. Levamisole ­ thuốc điều trị suy giảm miễn dịch                                           
 
.........................................
    

 29
 1.3.4. Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư của TNHC                                                
 
...............................................
    
 29
 Chương 2                                                                                                                          
 
.........................................................................................................................
    
 32

5


 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU                                                    
 
...................................................
    
 32
 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu                                                                            
 
...........................................................................
    
 33
 2.2. Đối tượng nghiên cứu                                                                                               
 
..............................................................................................
    
 33

 2.2.1. Bệnh nhân                                                                                                       
 
......................................................................................................
    
 33
 2.2.2. Người bình thường                                                                                         
 
........................................................................................
    
 34
 2.2.3. Vật liệu nghiên cứu                                                                                        
 
.......................................................................................
    
 34
 2.3. Phương pháp nghiên cứu                                                                                           
 
..........................................................................................
    
 35
 2.3.1. Nuôi cấy tế bào lympho                                                                                 
 
................................................................................
    
 35
 2.3.2. Đếm số lượng bạch cầu và dòng bạch cầu lympho                                     
 
....................................
    
 36

 2.3.3. Chiết tách ARN từ tế bào nuôi cấy                                                               
 
..............................................................
    
 37
 2.3.4. Tổng hợp cADN                                                                                             
 
............................................................................................
    
 38
 2.3.5. Kỹ thuật RT­PCR                                                                                           
 
..........................................................................................
    
 39
 2.3.6. Sơ đồ nghiên cứu                                                                                            
 
...........................................................................................
    
 45
2.3.7. Kỹ thuật ELISA định lượng IL­2 và TNFα trong dịch nuôi cấy tế bào 
 lympho                                                                                                                       
 
......................................................................................................................
    
 45
 Chương 3                                                                                                                          
 
.........................................................................................................................
    

 48
 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN                                                                                             
 
............................................................................................
    
 48
 3.1. Kiểm tra chất lượng ARN chiết tách được                                                             
 
............................................................
    
 48
 3.2. Phản ứng RT­PCR đơn mồi của gen B2M, IL­2 và TNFα                                     
 
....................................
    
 49
 3.3. Phản ứng RT­PCR đa mồi của gen B2M với IL­2/TNFα                                       
 
......................................
    
 50
3.4. Sự biểu lộ IL­2 ở mức độ mARN của lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy in vitro 
 với thuốc thử                                                                                                           
...........................................................................................................
 
    
 52
 3.5. Sự biểu lộ mARN của TNFα ở lympho bào nuôi cấy in vitro với thuốc thử.       
   55
.....

    
3.6. So sánh biểu lộ protein của gen IL­2 ở dịch nuôi cấy lympho bào được xác định 
 bởi ELISA                                                                                                                 
 
................................................................................................................
    
 58
3.7. So sánh biểu lộ protein của gen TNFα ở dịch nuôi cấy có sử dụng các thuốc thử
                                                                                                                                    64
..................................................................................................................................
    
                    (A)                                              (B)                                                               
 
..............................................................
    
 66
  Sự biểu lộ TNFα ở mức độ mARN không có sự khác biệt giữa các nhóm chứng âm 
và dương. Sự biểu lộ này thấp hơn so với sự kích thích của Crilin T ở cả hai 
nồng độ 0,25mg và 0,5mg. Ở mức độ protein cũng cho kết quả tương tự (Hình 
3.18A và hình 3.18B). Như vậy, các kỹ thuật ELISA và RT­PCR đều cho kết quả 
 tốt đối với sự biểu lộ TNFα                                                                                   
...................................................................................
 
    
 66
3.8. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với nhóm chứng dương 
 Levamisol.                                                                                                                 
 
................................................................................................................
    

 66

6


 KẾT LUẬN                                                                                                                       
 
.....................................................................................................................
    
 68
 KIẾN NGHỊ                                                                                                                      
 
.....................................................................................................................
    
 69

7


DANH MỤC BẢNG

 Bảng 1.1. So sánh cây TNHC và cây Lan huệ                                                                       
 
......................................................................
   
 5
 Bảng 1.2. Các hỗn hợp alkaloid của cây TNHC [39]                                                            
 
...........................................................
   

 8
 
                    
 9
  
 Bảng 2.1. Thành phần dung dịch PBS                                                                                 
 
................................................................................
    
 35
 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi                                                                 
 
................................................................
    
 40
 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR đa mồi                                                                    
 
...................................................................
    
 42
Bảng 2.4. Tương quan giữa nộng độ gel agarose và kích thước đoạn ADN cần phân tách
                                                                                                                           43
.........................................................................................................................
    

8


DANH MỤC HÌNH

 Hình 1.1. Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)                                        
 
.......................................
   
 4
 Hình 1.2. Những cây khác cùng họ với Crinum                                                        
 
.......................................................
   
 4
 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số Alkaloid [39]                                              
 
.............................................
   
 8
Hình 3.1. RT­PCR đơn mồi xác định biểu lộ các gen B2M, IL­2 và TNFα ở các tế 
 bào dòng chuẩn                                                                                      
 
.....................................................................................
    
 50
Hình 3.2. Hình ảnh PCR đa mồi của cặp gen nội chuẩn. (A) Các băng được 
khuếch đại mARN của gen B2M và IL­2; (B) B2M và TNFα. Marker: 
0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker ­Fermentas).
                                                                                                                 52
...............................................................................................................
    
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RT­PCR của IL­2 ở lympho người bình 
thường nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range 
 DNA marker ­Fermentas).                                                                      

 
....................................................................
    
 53
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RT­PCR của IL­2 ở lympho nuôi cấy của 
bệnh nhân ung thư vòm mũi họng. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn 
 dải thấp (low range DNA marker ­Fermentas).                                     
 
...................................
    
 54
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm RT­PCR của TNFα ở lympho người bình 
thường nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range 
 DNA marker ­Fermentas).                                                                      
 
....................................................................
    
 56
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm RT­PCR của TNFα ở lympho bệnh nhân 
ung thư vòm mũi họng nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải 
 thấp (low range DNA marker ­Fermentas).                                           
 
.........................................
    
 57
Hình 3.7. So sánh sự biểu lộ IL­2 của Levamisol với chứng âm ở bệnh nhân 
 (p=0,045).                                                                                               
 
..............................................................................................
    

 58
Hình 3.8. So sánh nồng độ IL­2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở tế bào bệnh 
 nhân in vitro (p= 0,14)                                                                            
 
...........................................................................
    
 59
Hình 3.9. So sánh nồng độ IL­2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy 
 in vitro tế bào lympho từ bệnh nhân (p=0,39)                                       
 
......................................
    
 60
Hình 3.10. So sánh nồng độ IL­2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào 
 lympho in vitro (p=0,23)                                                                        
 
.......................................................................
    
 60
Hình 3.11. So sánh sự biểu lộ Il­2 của lympho được kích thích bởi Levamisol với 
 chứng âm ở người thường (p=0,18).                                                     
 
....................................................
    
 61
Hình 3.12. So sánh nồng độ IL­2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở dịch nuôi 
 cấy người thường in vitro (p=0,42)                                                      
 
.....................................................
    

 62
Hình 3.13. So sánh nồng độ IL­2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy 
 người thường in vitro (p=0,30)                                                              
 
.............................................................
    
 62
Hình 3.14. So sánh nồng độ IL­2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào 
 người bình thường in vitro (p = 0,34)                                                    
 
...................................................
    
 63

9


Hình 3.15. So sánh nồng độ IL­2 ở tế bào bệnh nhân ung thư vòm mũi họng và 
 người bình thường in vitro                                                                    
 
...................................................................
    
 64
Hình 3.16. So sánh nồng độ TNFα ở liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào 
 lympho in vitro (p=0,17)                                                                        
 
.......................................................................
    
 65
Hình 3.17. So sánh nồng độ TNFα với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào 

 người bình thường in vitro (p=0,42)                                                      
 
.....................................................
    
 65
Hình 3.18. So sánh sự biểu lộ TNFα ở hai mức độ mARN và Protein ở tế bào 
 lympho của cùng một người bình thường                                            
 
...........................................
    
 66
Hình 3.18. So sánh sự biểu lộ TNFα ở hai mức độ mARN và Protein ở tế bào 
lympho của cùng một người bình thường...........................................58

10


MỞ ĐẦU
Trinh nữ hoàng cung (THNC) là một loại cây thuốc được sử dụng là thuốc  
cổ truyền ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế  giới [12]. Hiện 
nay, người ta đã phát hiện đến 130 loài khác nhau, phân bố ở các nước nhiệt đới 
và   hơn   150   alkaloid   trong   loài   cây   này   đã   được   chiết   tách   [17],   [18].   TNHC  
(Crinium latifolium (L.) đã được dùng như loại thuốc y học cổ truyền để điều trị 
các bệnh Viêm khớp dạng thấp, ung thư, lao, viêm do vi khuẩn sinh mủ…Ở 
Trung quốc và Việt nam, thuốc sắc trong nước nóng của loài này vẫn dùng để 
điều trị  nhờ  hoạt tính chống virut và chống ung thư, đặc biệt là ung thư  tuyến  
tiền liệt cho đến ngày nay  [41]. Một số nghiên cứu đã và đang chiết xuất từ  lá 
cây TNHC, chính xác với tên mới là Trinh nữ Crila [16] và thử nghiệm in vitro và 
in vivo [8], [39], [40]. Trên các tế  bào đơn nhân máu ngoại vi được nuôi cấy và 
trên chuột thực nghiệm cho thấy các chất chiết hoạt hóa tế  bào lympho T nuôi 

cấy và cả  ở  chuột Balb/c. Nhiều hoạt chất có tác dụng chống phân bào, ức chế 
phát triển tế bào ung thư đồng thời phục hồi chức năng miễn dịch. 
Viên nang Crila biệt dược của Nguyễn Thị  Ngọc Trâm, chiết từ  lá cây 
Trinh nữ Crila được sản xuất từ các alkaloid có hoạt tính sinh học. Thuốc này đã  
được đăng ký sản xuất, sử dụng  rộng rãi ở Việt Nam và một số nước ngoài để 
điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung. Ngoài ra, viên Crila còn  
được nghiên cứu sử dụng để điều trị thực nghiệm các tế bào dòng ung thư vú, tử 
cung, dạ dày, phổi, tuyến tiền liệt và trên một số bệnh nhân ung thư  tự  nguyện  
[17], [30]. 
Các phân đoạn đã chứng minh là có tác dụng tăng cường miễn dịch và 
chống ung thư mạnh nhất (gồm các alkaloid và flavonoid) cũng đã được chiết và  
làm thành viên nén có tên là Crilin T. Các đặc tính hóa, lý và tác dụng độc tính 
cấp, bán cấp…của thuốc đã được đánh giá. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác  
dụng tăng cường miễn dịch  in vitro  trên mô hình bệnh nhân ung thư  đã có suy 
giảm miễn dịch, bằng cách nuôi cấy tế bào máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư 
vòm mũi họng giai đoạn muộn và thử  các nồng độ  thuốc khác nhau và theo dõi 
đáp ứng miễn dịch chống ung thư bởi các dấu ấn biểu lộ IL­2, TNFα ở mức độ 
ARN và protein bằng phương pháp RT­PCR và ELISA một cách tương ứng. Đề 
tài này nhằm mục đích: 

1


1. Xác định biểu lộ  của IL­2 và TNF­α  ở  mức độ  mARN và protein của tế  bào  

lympho nuôi cấy  in vitro  của  bệnh nhân ung thư  vòm mũi họng giai đoạn 
muộn và người bình thường về lâm sàng với hai liều thuốc khác nhau. 
2. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với Levamisol

2

Chương 1
 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây Trinh nữ hoàng cung
Cây Trinh nữ  hoàng cung (TNHC) còn được gọi là Náng lá rộng, Tỏi lá  
rộng, Tây nam văn châu lan, Thập bát học sĩ ­ Crinum latifolium L., thuộc họ Náng 
Amaryllidaceae [18], [50].
TNHC là một loài có thân như củ hành tây to, đường kính 10­15 mm, bẹ lá 
úp vào nhau thành một thân giả dài khoảng 10­15 cm, có chiều lá mỏng kéo dài từ 
80­100 cm, rộng 3­8 cm, hai bên mép lá lượn sóng. Gân lá song song mặt trên lá 
lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ  lá nơi sát  
đất có màu đỏ  tím. Hoa mọc thành tán gồm 6­18 hoa, trên một cán dài 30­60 cm.  
Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ [14], [41].
Cây TNHC có nhiều nước Đông Nam Á và Nhật bản, gồm Việt Nam,  Ấn  
Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào [25], [31], [50].  Ở 
Việt Nam cây mọc hoang ven suối trong rừng và cây thường phát triển mạnh  ở 
các vùng có khí hậu nóng khô từ Đà Nẵng đến tận mũi Cà Mau, đặc biệt là ở một  
số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai và Bà Rịa ­ Vũng Tàu [9], [14], [18]. 

3


Hình 1.1. Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)
1.1.1. Phân biệt cây TNHC với các cây náng khác
Trong tự nhiên, có nhiều cây giống nhau về hình thái, đặc điểm thực vật…
trong một họ  nhất định. Do đó, để  phân biệt cây TNHC có tác dụng sinh học,  
tránh nhầm lẫn với các cây náng khác giống với cây TNHC có  ở  Việt Nam, 
Nguyễn Thị  Ngọc Trâm không chỉ  dựa vào hình thái thực vật mà còn phân tích  
đặc tính di truyền (ADN) đặc trưng của cây TNHC có ở Việt Nam. Theo Nguyễn 

Thị  Ngọc Trâm, có 6 loại cây náng khác giống với cây TNHC (Hình 1.1) mà tác 
giả  đã chọn làm thuốc viên nang Crila và Crilin T. Cây này đã được gọi với tên 
chi riêng là “Trinh nữ Crila” và được trồng thành nhiều điền trang ở Bình Dương 
[16].
Về  hình dáng, TNHC có hình dáng bên ngoài rất giống với cây náng hoa 
trắng, cây huệ biển... Thậm chí, TNHC còn có hình dáng bên ngoài rất giống với 
một loại cây có tác dụng làm giảm khả năng sinh sản. Sự nhầm lẫn nhiều khi rất  
tai hại, nó không những không giúp cho điều trị mà có thể ảnh hưởng xấu đến sức  
khỏe. 

Hình 1.2. Những cây khác cùng họ với Crinum

4


Một đặc điểm của lá TNHC khác với các cây náng hoa trắng và náng hoa  
đỏ  là mép lá xoăn hình lượn sóng, trong khi 2 cây cùng họ  cao hơn, lá to và dài 
hơn. Hoa gồm 1 cán dài 40­60 cm, to cỡ ngón tay cái, hoa tựa như hoa loa kèn to, 
có màu trắng và màu hồng phấn từ  cuống hoa trở lên độ  ¼ hoa rất đẹp, nhưng 
nhiều khi cuống không mang nổi hoa mà bị đổ, nhất là trồng ở đất tốt, không đủ 
nắng. TNHC cũng như các cây thuộc họ thuỷ tiên có hoa thơm, náng hoa trắng có  
hoa thơm hơn.
Để có thể phân biệt cây TNHC với cây Lan huệ cùng chi Crinum, phải dựa 
trên sự  khác nhau về  hình thái thực vật. Sự  khác nhau về  hình thái giữa hai cây  
này trình bày trong bảng sau:
Bảng 1.1. So sánh cây TNHC và cây Lan huệ
TNHC
­ Hoa ít thơm

Lan huệ

­ Hoa rất thơm

­   Cánh   hoa   mảnh,   rộng,   màu   phớt  ­ Cánh hoa hẹp, màu trắng xanh.
hồng.

­ Nụ hoa lúc chưa nở thon dài hơn.

­ Nụ hoa chưa nở phồng to, ngắn.

­ Trên một tán hoa thường có 12 hoa

­ Số  hoa thường là 6 trên một tán hoa,  
có khi là 9, 10, 12.
­ Chỉ nhụy hoa màu trắng.

­ Chỉ nhụy hoa màu đỏ tía.
­   Cuống   hoa   dài   hơn   TNHC   (10­12 

­ Cuống hoa tròn, đế  tán hoa hơi cong,  cm), đế hoa và cuống hoa màu đỏ tía.
dài khoảng 7cm, đế  hoa và cuống hoa  
màu xanh.
­ Khi hoa nở hết, các cánh hoa vẫn xếp 
sát nhau giữ hình ống.
­ Lá có màu xanh nhạt hơi vàng

­ Khi hoa nở hết, các cánh hoa tách rời 
nhau ra, uốn cong xuống.
­ Lá có màu xanh đậm hơn, lá dầy hơn 

5

lá TNHC.
­ Thân thường ngắn, có màu đỏ tía.

­ Thân cao hơn, thường có màu xanh, 
đôi khi cũng có màu đỏ tía.

6


1.1.2. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L. 
Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần  
hóa học của cây náng có tên khoa học Crinum latifolium L. [25], [26], [32], [39], [51].
Thành phần alkaloid của cây Crinum latifolium L.
+  Crinum latifolium L.  Ấn Độ: 11­O­Acetylambelline, 11­O­Acetyl­1,2­ ­
epoxyambelline,   Ambeline,   Crinafolidine,   Crinafoline,   (­)   2­Epilycorine,   2­
Epipancrassidine,   1,2­ ­epoxyambelline,   Hippadine   (Pratorine,   Alkalois   N3), 
Latindine, Latisodine, Latisoline (Latisodine­O­ ­D­glucopyranosyl), (­) Lycorine, 
(­)  Lycorine­1­0­ ­glucoside, Pratorimine, Pratorinine, Pratosine, Pseudolycorine­
1­0­ ­D­glucpside [25], [27].
+  Crinum latifolium L.  Nhật Bản: 3­O­Acetylhamayne, (­) Acetyllycorine, 
Cherylline   (S),   (+)   Crinamine,   (­)   Crinine   (Vittatine,   Crinidine),   Hamayne 
(Bulbispermine,   Demethylcrinamine),   Hipeastrine,   Latifine   (S),   Powelline, 
Undulatine [31].

7


Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số Alkaloid [39]

+ Cây TNHC Việt Nam với tên mới là Trinh nữ Crila (Crinum latifolium L.): 
9­Octadecenamideb,

 

Dihydro­oxo­demethoxyhaemanthamine,

 

Augustamine, 

Oxoassoanine, Crinane­3­ ­ol, Buphannidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline, 6­
hydroxybuphannidrine,   1 ,2 ­epoxyambelline,   6­hydroxycrinamidine,   Epoxy­3,7­
dimethoxycrinane­11­one,   Lycorin   và   Pratorin   (Hippadin)   và   các   flavonoid:   4’7­
dihydroxy­3­vinyloxyflavan, 4’7­dihydroxyflavan, kaemperol­3­O­ ­glucopyranoside 
[9], [14],[17], [41].
Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L.
+  Crinum latifolium L. Nhật Bản có Glucan a và Glucan b.
+   Cây   TNHC   Việt   Nam   (Crinum   latifolium   L.)   có   32   chất   bay   hơi   và 
saponin,   acid   hữu   cơ,   amino   acid,   p­hydroxycinnamat   metyl,   3,4’­
dihydroxycinnamat ethyl, keampferol­3­4­di­O­ ­D­glucopyranosit.
Bảng 1.2. Các hỗn hợp alkaloid của cây TNHC [39]

8


9


1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây TNHC ở Việt Nam 

Viên nang Crila ra đời từ  cụm công trình nghiên cứu về  cây TNHC của  
Nguyễn Thị  Ngọc Trâm và cộng sự  trong và ngoài nước [30], [40].   Viên nang 
Crila được sản xuất từ các alkaloid có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ  lá  
cây TNHC, điều trị  u xơ  tử  cung và phì đại lành tính tuyến tiền liệt [40]. Viên 
nang Crila đã được Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung  ương nghiên cứu nâng cấp 
tiêu chuẩn kiểm nghiệm định lượng hàm lượng alkaloid bằng phương pháp sắc 
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [39]. “Nghiên cứu định tính, định lượng crinamidin  
trong dược liệu và viên nang TNHC bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng  
cao” [2],[14], [18], [41]. 
Viên thuốc Crila được sản xuất từ vùng trồng TNHC hay Trinh nữ Crila của  
Công ty Thiên Dược, Bình Dương, đạt tiêu chuẩn của GACP – WHO và nhà máy 
của Công ty TNHH Thiên Dược đã được Cục quản lý dược – Bộ  Y tế  cấp giấy 
chứng nhận đạt tiêu chuẩn GMP­WHO (Thực hành tốt nhà máy sản xuất thuốc), 
GLP (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc), GSP (Thực hành tốt bảo quản 
thuốc) [18].
Thuốc này đã được thử nghiệm lâm sàng tại các bệnh viện trung ương và 
đã được hội đồng khoa học công nghệ ­ Bộ Y tế đánh giá với hiệu quả  điều trị 
phì đại lành tính tuyến tiền liệt đạt 89,18%, đối với u xơ tử cung là 79,5% [15].  
Thuốc Crila được người bệnh tin dùng vì hiệu quả điều trị cao, giá thành hợp lý, 
phù hợp với thu nhập của đa số bệnh nhân đặc biệt bệnh nhân nghèo. Từ khi sản  
phẩm ra đời cho đến nay chưa thấy có ý kiến của người bệnh về tác dụng không 
mong muốn làm ảnh hưởng đến sức khỏe hoặc chất lượng cuộc sống. 
Ngoài sản phẩm thuốc Crila, cụm công trình nghiên cứu về cây TNHC còn  
có thêm  hai  sản  phẩm thực  phẩm chức   năng viên nang  Crilin  và   Trà   túi  lọc  
TNHC.

10


Sản phẩm Crila ra đời là kết quả nghiên cứu từ Nhiệm vụ hợp tác quốc tế 

về  khoa học và công nghệ  theo Nghị  định thư  giữa Việt Nam và Bungari được 
chiết từ  hoa và lá cây TNHC Việt Nam. Crila  đã được chứng minh tác dụng  
chống oxy hóa và tăng cường chống khối u gián tiếp hay có tác dụng gây độc tế 
bào ung thư trực tiếp trên các dòng ung thư phổi, ung thư vòm mũi họng, ung thư 
tuyến tiền liệt, gan, màng tim nghiên cứu in vitro và in vivo [19], [40].
Viên nén Crilin T (sản phẩm đang được nghiên cứu) được chọn từ  hai  
thành phần chủ yếu là các alkaloid và flavonoid (chưa công bố)
1.2. Vai trò của hệ thống đáp ứng miễn dịch trong ung thư 
1.2.1. Đại cương đáp ứng miễn dịch chống ung thư
Ung thư là bệnh ác tính được sinh ra từ các tế bào bình thường bị biến đổi.  
Các tế  bào ác tính phát triển vô hạn định và sẽ  giết chết cơ  thể  chủ. Có nhiều 
bằng chứng cho thấy sự đáp ứng miễn dịch chống ung thư như: một số ít ung thư 
tự  thoái triển, có rất nhiều lympho và đại thực bào thâm nhiễm khối u, thoái lui 
của di căn sau khi loại bỏ các khối u nguyên phát. Tỷ  lệ  mắc bệnh ung thư  cao 
hơn  sau  ức chế  miễn dịch,  suy giảm miễn dịch (AIDS, trẻ  sơ  sinh, người già, 
bệnh nhân ghép tạng). Hệ miễn dịch tham gia bảo vệ cơ thể bằng hai cơ chế [5],  
[7].
­

Cơ chế đề kháng tự nhiên của cơ thể (dịch thể hay tế bào) mà không cần 

mẫn cảm trước với kháng nguyên (KN) ung thư. Đây là rào chắn đầu tiên của sự 
bảo vệ, chúng có tầm quan trọng đặc biệt chống lại sự  xuất hiện của di căn  
thông qua vai trò của các tế bào đại thực bào, NK, bạch cầu ái toan…
­

Cơ  chế  cảm  ứng một đáp  ứng miễn dịch đặc hiệu với sự  có mặt của  

kháng nguyên ung thư  và sự  tham gia của các tế  bào miễn dịch như  lympho T 
(Th, Ts, Tc), lympho B. Đây là một quá trình phức tạp, chúng hoạt động và điều  

11


hòa thông qua các cytokine tạo nên một loạt các tín hiệu hoạt hóa cần thiết để 
nhận biết và tiêu diệt các tế bào ung thư.
1.2.2. Suy giảm miễn dịch 
Suy giảm miễn dịch (SGMD) hay thiếu hụt miễn dịch cũng như  mọi hệ 
thống, ngoài sự hoạt động bình thường thì trong những trường hợp nhất định do 
những nguyên nhân đã biết hay chưa biết do những tổn thương tiên phát hay thứ 
phát của một cấu thành nào đó mà dẫn đến những rối loạn. Cho nên, hệ  thống  
miễn dịch có thể  hoạt động một cách quá mức gây nên tình trạng quá mẫn, hay 
hoạt động yếu không đạt yêu cầu gọi là thiểu mẫn, thiểu năng miễn dịch hay suy 
giảm miễn dịch (SGMD). Như vậy SGMD là tình trạng của cơ thể sống trong đó 
hệ thống miễn dịch hoạt động yếu, không đáp ứng được yêu cầu của cuộc sống  
đời thường mà cụ thể là chống lại các vi sinh vật gây bệnh, dẫn tới hậu quả phổ 
biến nhất là cơ  thể  bị  nhiễm trùng nặng, đưa đến tử  vong. Dưới góc độ  miễn  
dịch sinh lý bệnh thì SGMD có thể phân chia ra 2 nhóm lớn [10].
­ SGMD bẩm sinh hay tiên phát mà nguyên nhân gây ra là do di truyền.
­ SGMD mắc phải hay thứ phát thường là hậu quả của một quá trình bệnh 
lý khác ảnh hưởng đến hoạt động của hệ thống miễn dịch.
* Suy giảm miễn dịch tiên phát có thể gặp:
­ SGMD nguy kịch do thiếu hụt cả dòng tế  bào lympho T và dòng tế  bào  
lympho B thường chết  ở  trẻ sơ sinh. SGMD do thiếu hụt lympho B (h ội chứng  
Bruton). Đây là bệnh di truyền ở nam giới, trẻ em bị bệnh thường phát hiện sau 6  
tháng (trẻ không tự tạo kháng thể). Trường hợp này điều trị  phải tiêm  globulin 
và   sống   trong   môi   trường   sạch.   SGMD   do   thiếu   hụt   lympho   T   (hội   chứng  
Digeorge). Đây là bệnh do rối loạn hình thành tuyến  ức, tế  bào lympho T giảm 
dẫn đến rối loạn quá trình miễn dịch qua trung gian tế bào và cả  miễn dịch dịch  

12


thể. Trường hợp này điều trị phải ghép tuyến ức. Ngoài ra, SGMD bẩm sinh còn  
có biểu hiện ở dòng tế bào thực bào và sản xuất bổ thể.
 * SGMD thứ phát (mắc phải):
Là một trạng thái bệnh lý rất hay gặp không chỉ   ở  các nước đang phát 
triển mà kể  cả  những nước đã phát triển. Nó là hiện tượng hay thấy, thứ  phát 
sau nhiều bệnh, nhất là các bệnh gây suy dinh dưỡng, sau nhiễm độc một số 
thuốc gây ức chế miễn dịch, nhiễm trùng kéo dài hay tia xạ để  điều trị  ung thư, 
do nhiễm HIV hay do chính tế  bào ung thư  tiết ra các chất có hoạt tính  ức chế 
miễn dịch.
­ SGMD thứ phát do suy dinh dưỡng: rất phổ biến ở các nước kinh tế thấp  
thuộc diện nghèo như  nước ta. Do đó nên thiếu protein dẫn đến thiếu nguyên  
liệu để  tổng hợp kháng thể, thiếu các yếu tố  vi lượng đặc biệt là kẽm vì kẽm  
rất cần cho phát triển tuyến ức.
­ SGMD thứ phát do nhiễm khuẩn:Trong tất cả các trường hợp nhiễm nếu 
kéo dài đều có thể gây ra tình trạng suy dinh dưỡng ở các mức độ khác nhau. Một  
số  loại virut như  sởi bám trên bề  mặt lympho T và B làm các tế  bào này không 
nhận diện được kháng nguyên gây ức chế miễn dịch. Một số vi khuẩn như tụ cầu  
vàng (staphylocoscus aureus) sinh ra một protein A có tác dụng gây ra hiện tượng 
ngưng tập các kháng thể  dẫn đến bị  các đại thực bào nuốt. Nhiễm khuẩn kinh  
diễn đặc biệt nhiễm nội tế bào như  trong bệnh lao, bệnh phong thì bao giờ  cũng  
gây SGMD tế bào.
Nhiễm virut HIV và bệnh AIDS đã và đang là con bệnh của thế kỷ. Virus  
HIV tấn công vào tế  bào lympho TCD4 và gây SGMD chung do vai trò kích thích 
miễn dịch của TCD4.
­ SGMD thứ  phát do các bệnh ác tính như  ung thư  phát triển chiếm dinh  
dưỡng trong cơ thể và cơ thể tiết rất nhiều��  lâm sàng, được sử  dụng làm chứng dương cho thực nghiệm nuôi 
cấy tế bào của công trình này. Chứng âm là các tế bào được nuôi cấy không cho  

thuốc thử  hoặc chất gì khác ngoài điều kiện nuôi cấy giống các giếng chứng 
dương và thuốc thử. Do một số  lý do như, số  lượng tế  bào thấp, thời gian và 
kinh   phí   nên   việc   thử   liều   chỉ   được   thực   hiện   ở   hai   nồng   độ   khác   nhau 
0.25mg/ml (liều thấp) (giống nồng độ Levamisol) và 0.5mg/ml (liều cao). Ở thời  
điểm 8 giờ  sau khi nuôi cấy sự  biểu lộ  mARN của IL­2 được thể  hiện trong  
Hình 3.3.

52


Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RT­PCR của IL­2 ở lympho người bình  
thường nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA  
marker ­Fermentas). 
Với vai trò của gen nội chuẩn B2M là không chỉ  dùng để  đánh giá chất 
lượng của cDNA/mARN chiết tách được mà còn có chức năng rất quan trọng là 
xác định lượng cDNA đưa vào phản  ứng PCR có tương đương nhau hay không. 
Dựa vào băng nội chuẩn  B2M ta có thể biết được mức độ biểu lộ xác định được 
là tăng hay giảm của các mẫu nghiên cứu. Đối với lympho bào của người bình  
thường (Hình 3.3) B2M có kết quả tương đương nhau, ngoại trừ mẫu Crilin T có  
hàm lượng 0,25mg/ml (hơi cao hơn một chút). Nếu so sánh mẫu chứng âm với 
chứng dương, ta thấy có sự khác biệt về biểu lộ IL­2, thể hiện bởi các băng nhạt  
(mẫu chứng âm) và băng đậm hơn (mẫu chứng dương). Trong khi đó, khi ta so  
sánh các mẫu thuốc thử  nồng độ  thấp và cao thì thấy  ở  nồng độ  thấp IL2 cho  
biểu hiện nhiều hơn so với nồng độ cao, mặc dù B2M hơi khác nhau đôi chút ở 
hai mẫu này. 

53


Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RT­PCR của IL­2 ở lympho nuôi cấy  

của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải  
thấp (low range DNA marker ­Fermentas). 
Sự  biểu lộ  IL­2  ở  lympho bào của bệnh nhân ung thư  vòm mũi họng bởi  
RT­PCR được thể hiện trong Hình 3.4. Các mẫu nghiên cứu của bệnh nhân được  
nuôi cấy cùng điều kiện và song song với các mẫu của người bình thường với 
thời gian thu hoạch như  nhau. Kiểu biểu lộ  của lympho bào  ở  bệnh nhân cũng 
giống như  người bình thường (Hình 3.3) có nghĩa là chứng dương và chứng âm 
giống nhau. Biểu lộ IL­2 của liều thấp Crilin T biểu hiện rõ nét so với liều cao,  
trong khi băng của gen nội chuẩn B2M tương đương nhau. 
Như  vậy, cả  bệnh nhân và người thường đều cho kết quả  như  nhau và  
điều đặc biệt là Crilin T cho kết quả  kích thích tăng tiết IL­2 cao hơn so với 
chứng dương và chứng âm. Để đánh giá sự tiết IL­2 của bệnh nhân so với người  
thường bằng RT­PCR (Hình 3.3 và Hình 3.4) có khác nhau hay không thì không  

54