Nghiên cứu sự phát triển phôi sau sinh thiết để chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN PHÔI SAU SINH THIẾT
ĐỂ CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN TRƢỚC CHUYỂN PHÔI
Nguyễn Thanh Tùng*; Nguyễn Ngọc Diệp*; Dương Đình Hiếu*
Nguyễn Đình Tảo*; Quản Hoàng Lâm*
TÓM TẮT
Mục tiêu: khảo sát sự phát triển phôi sau sinh thiết. Đ i tượng: 50 phôi ngày 3 và 20 phôi túi
đƣợc sinh thiết. Phương pháp: nghiên cứu tiến cứu mô tả. Kết quả: 32/50 phôi ngày 3 sau sinh
thiết phát triển thành phôi túi (64%). Tỷ lệ sống sau rã đông của 20 phôi túi sinh thiết đƣợc đông
lạnh bằng phƣơng pháp thuỷ tinh hoá đạt 95%. Kết luận: sinh thiết một phôi bào của phôi giai
đoạn phân chia ngày 3 không ảnh hƣởng đến sự phát triển phôi tại ngày 4 và 5. Phôi túi sinh
thiết đƣợc đông lạnh bằng phƣơng pháp thuỷ tinh hoá có tỷ lệ sống cao sau rã đông.
* Từ khóa: Phôi túi; Phôi ngày 3; Sinh thiết; Tỷ lệ sống sau rã đông; Chuyển phôi; Chẩn đoán
di truyền.

Study on Embryo Development after Biopsy for Genetic Diagnosis
prior Embryo Transfer
Summary
Objective: To investigate the invitro development of embryos after biopsy. Subjects: 50 embryos
on day 3 and 20 blastocysts were biopsied. Research method: Description progressive
research. Result: At day 5, 32 of 50 embryos after biopsy reached the blastocyst stage (64%).
The survival rate of post-thawing 20 biopsied blastocysts was 95%. Conclusion: The one-cell
biopsy from cleavage embryo at day 3 did not affect the embryo development on day 4 and day
5. By vitrification, the post - thawing survival rate of the biopsied blastocyst was high.
* Key words: Blastocyst; Day 3 embryo; Biopsy; Post-thawing survival rate; Embryo transfer;
Genetic diagnosis.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm
đóng một vai trò quan trọng trong lĩnh vực

hỗ trợ sinh sản và ngày càng đƣợc phát
triển rộng khắp trên thế giới. Tuy nhiên, tỷ
lệ thành công trong hỗ trợ sinh sản mới
chỉ đạt khoảng 30 - 40%, lĩnh vực này còn

nhiều vấn đề cần đƣợc tiếp tục nghiên cứu.
Hiện nay, hầu nhƣ việc lựa chọn phôi
đều dựa trên những tiêu chuẩn về hình
thái của phôi. Tuy nhiên, việc đánh giá về
hình thái chƣa phản ánh đầy đủ chất
lƣợng thực của phôi, nếu chỉ dựa vào
các thông số về hình thái thì kết quả thụ
tinh ống nghiệm vẫn còn những hạn chế.

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thanh Tùng ()
Ngày nhận bài: 06/05/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/06/2015
Ngày bài báo được đăng: 08/07/2015

45


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015

Để nâng cao tỷ lệ thành công và trẻ sinh
sống khoẻ mạnh khi thụ tinh trong ống
nghiệm, việc chẩn đoán di truyền trƣớc
chuyển phôi (Preimplantation Genetic
Diagnosis - PGD) và sàng lọc di truyền
trƣớc chuyển phôi (Preimplantation Genetic

Screening - PGS) là một trong những yêu
cầu quan trọng, cấp thiết và thực tiễn. Để
thực hiện kỹ thuật này, trƣớc tiên cần
sinh thiết phôi, cung cấp vật liệu di truyền
cho chẩn đoán. Đây là kỹ thuật xâm lấn
phôi có thể ảnh hƣởng đến sự phát triển
của phôi sau sinh thiết. Do vậy, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu này nhằm: Khảo sát
sự phát tri n phôi sau sinh thiết.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
70 phôi ngƣời còn dƣ khi thụ tinh trong
ống nghiệm, chia thành 2 nhóm:
- Nhóm I: 50 phôi ngày 3.
- Nhóm II: 20 phôi ngày 5.
* Tiêu chuẩn lựa chọn phôi đ sinh thiết:
- Phôi ngày 3 có ít nhất 6 phôi bào, tỷ lệ
mảnh vỡ bào tƣơng < 10%.
- Phôi ngày 5 đạt tiêu chuẩn 3AA, 3AB [1].
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
Nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang.
* K thuật sinh thiết phôi:
- Chuẩn bị:
+ Kính hiển vi soi ngƣợc trang bị bộ vi
thao tác có gắn hệ thống laser.

trong 30 phút. Các phôi sinh thiết sẽ để
trong giọt sinh thiết trong 10 phút trƣớc
khi sinh thiểt.

- Quy trình sinh thiết phôi ngày 3:
+ Lựa chọn phôi bào nhỏ, nhìn rõ nhân
để sinh thiết.
+ Xoay phôi để đƣa phôi bào sinh thiết
về vị trí 3 giờ và giữ cố định phôi bằng
kim giữ tại vị trí 9 giờ.
+ Dùng laser tạo lỗ thủng trên màng
trong suốt của phôi tại vị trí 3 giờ, kích
thƣớc lỗ khoảng một nửa kính thƣớc phôi
bào có hình chữ V hoặc hình chêm.
+ Đƣa kim sinh thiết đƣờng kính 30
µm qua lỗ thủng, vừa hút vừa kéo phôi
bào sinh thiết (tránh làm vỡ phôi bào).
+ Röa phôi bào sinh thiết bằng môi
trƣờng PBS, chuyển vào tuýp eppendorf
cùng với thể tích PBS 2 - 3 µm.
- Quy trình sinh thiết phôi ngày 5:
+ Phôi ngày 5 đƣợc tạo lỗ thủng 10 µm
trên màng trong suốt khi phôi đƣợc 3 ngày.
+ Khi phôi túi hình thành, chờ khi có 6
- 10 tế bào lá nuôi chui qua lỗ thủng màng
trong suốt tiến hành sinh thiết.
+ Xoay phôi túi để đƣa các tế bào lá
nuôi chui qua lỗ thủng ở vị trí 3 giờ.
+ Cố định phôi bằng kim giữ tại vị trí
9 giờ.
+ Dùng kim sinh thiết đƣờng kính 20 µm
vừa hút vừa kéo tế bào lá nuôi, khi không
đứt thì dùng laser cắt rời khỏi phôi túi.

+ Kim sinh thiết có đƣờng kính trong
30 µm và 20 µm.

+ Rửa các tế bào lá nuôi sinh thiết
bằng môi trƣờng PBS, chuyển vào tuýp
eppendorf cùng với thể tích PBS 2 - 3 µm.

+ Đĩa sinh thiết phôi tạo giọt môi trƣờng
sinh thiết, mỗi giọt có thể tích 5 µl, phủ
dầu khoáng và ổn định trong tủ ấm 37oC,

* Đông lạnh phôi ngày 5 sau sinh thiết
bằng phương pháp thuỷ tinh hoá, s dụng
môi trường đông và rã đông c a Kitazato:

46


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015

* Nuôi cấy phôi ngày 3 sau sinh thiết:

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Sau sinh thiết, rửa phôi ngày 3 bằng
môi trƣờng G-IVF và tiếp tục nuôi cấy
trong giọt môi trƣờng 20 µl G2 plus đƣợc
phủ dầu khoáng Ovoil trong hộp cấy
Nunc, nuôi trong tủ Cook 37oC sử dụng
khí trộn CO2 6%, O2 5%.

Bảng 3: Sự phát triển của phôi ngày 3
sau sinh thiết.
THỜI ĐIỂM ĐÁNH GIÁ PHÔI
Ngày 3

Phôi không
Phôi phát triển:
phát triển:
45 (90%)
5 (10%)

* Thời đi m đánh giá chất lượng phôi
sau sinh thiết:
Phôi ngày 3 sau sinh thiết: đánh giá
hình thái phôi vào ngày 4 và ngày 5 theo
đồng thuận Alpha của ESHRE (2011) về
chất lƣợng noãn và phôi [1].
Bảng 1: Phân loại phôi nuôi cấy ngày 4.
PHÂN LOẠI

MÔ TẢ

Tốt

Hiện tƣợng nén đã diễn ra ở toàn bộ
thể tích phôi

Trung bình

Hiện tƣợng nén đã diễn ra ở phần
lớn của phôi

Xấu

Hiện tƣợng nén xảy ra ít hơn 1/2 thể
tích phôi, với sự hiện diện của 2 - 3
phôi bào còn rõ màng tế bào, hoặc
hiện tƣợng nén xảy ra ở phôi trƣớc
khi phôi đạt đến 8 phôi bào

Bảng 2: Phân loại phôi nuôi cấy ngày 5.
PHÂN LOẠI

MÔ TẢ

Tốt

Phôi có mức độ giãn rộng ≥ 3, phân
loại nụ phôi và tế bào lá nuôi: AA,
AB, BA

Trung bình

Phôi có mức độ giãn rộng ≥ 3, phân
loại nụ phôi và tế bào lá nuôi: BB,
BC

Xấu

Phôi có mức độ giãn rộng < 3 hoặc
≥ 3, phân loại nụ phôi và tế bào lá
nuôi: AC, CB, CC

Ngày 4

50 phôi

45 phôi đang
giai đoạn kết
dính

Ngày 5
Hình thành phôi
túi: 32 (64%)
- 6 phôi túi giai
đoạn sớm

Số phôi bào
- 22 phôi túi
không thay
đang nở rộng
đổi
- 4 phôi túi đã
nở rộng

Tiếp tục nuôi cấy phôi ngày 3 sau sinh
thiết, kết quả cho thấy phôi nuôi cấy ngày
4 có 45 phôi (90%) phát triển, các phôi
này đang ở giai đoạn kết dính và 5 phôi

(10%) không phát triển với số phôi bào
trong phôi giống nhƣ ngày 3 sau sinh
thiết. Trong số các phôi nuôi cấy đến
ngày 5, 32 phôi (64%) phát triển thành
phôi túi. Phôi túi đang ở giai đoạn phát
triển khác nhau: 6 phôi túi giai đoạn sớm,
22 phôi túi đang nở rộng và 4 phôi túi
nở rộng.
* Phân loại chất lượng phôi ngày 4:
Tốt: 30 (66,7%); trung bình: 10 (22,2%);
xấu: 5 (11,1%).
* Phân loại chất lượng phôi ngày 5:
6 phôi túi giai đoạn sớm nên không thể
đánh giá chất lƣợng, chỉ có 26 phôi giai

Phôi ngày 5 sau rã đông: đánh giá hình
thái sau 2 giờ.

đoạn đang nở rộng và đã nở rộng nên có

* Phân tích và x lý s liệu: dựa trên
chƣơng trình SPSS 13.0.

loại tốt 16 (61,5%), phôi túi loại trung bình

thể đánh giá chất lƣợng trong đó phôi túi
6 (23,1%) và phôi loại xấu 4 (15,4%).

47

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015

Bảng 4: Tình trạng phôi ngày 5 sinh thiết
sau rã đông.
THỜI GIAN

PHÔI TÚI

PHÔI TÚI

SINH THIẾT
SAU RÃ ĐÔNG

SỐNG SAU
RÃ ĐÔNG

PHÔI TÚI
THOÁI
HÓA

n = 20

19 (95%)

1 (5%)

PHÔI TÖI TRỞ
VỀ HÌNH THÁI
BAN ĐẦU (giờ)

1,96 ± 0,15

Phôi túi sinh thiết sau rã đông có tỷ lệ
phôi sống 19/20 (95%), chỉ có 1 phôi thoái
hoá (5%). Thời gian phôi túi còn sống trở
về trạng thái ban đầu trƣớc sinh thiết là
1,96 ± 0,15 giờ.

Hình 1: Sinh thiết phôi ngày 3.

Hình 2: Sinh thiết phôi ngày 5.
48

BÀN LUẬN
Trong thập niên 1990 và đầu thập niên
2000, sinh thiết phôi ngày 3 đƣợc sử
dụng tại đa số các trung tâm hỗ trợ sinh
sản. Tiềm năng của tế bào trong phôi giai
đoạn phân chia là cân bằng. Do vậy, sinh
thiết 1 - 2 tế bào của phôi ngày 3 có số
lƣợng 6 - 8 tế bào hầu nhƣ không ảnh
hƣởng đến sự phát triển phôi sau đó.
Sinh thiết phôi giai đoạn phân chia sẽ kịp
thời gian để PGD/PGS và có thể chuyển
phôi tƣơi vào ngày 4 hoặc 5 [3, 5]. Geber
và Sampaio (1999) sinh thiết 66 phôi
ngày 3, tiếp tục theo dõi thấy có 33 phôi
phát triển đến giai đoạn phôi túi đạt tỷ lệ
50% [2]. Nghiên cứu của chúng tôi có kết

quả đáng khả quan với 32/50 (64%) đạt
đến phôi túi sau khi sinh thiết phôi ngày 3.
Gần đây, nhiều trung tâm đã bỏ sinh
thiết phôi giai đoạn phân chia do vấn đề
thể khảm dao động 40 - 60%, nên kết quả
chẩn đoán sẽ không chính xác. Sinh thiết
6 - 10 tế bào lá nuôi từ phôi túi có số
lƣợng xấp xỉ 100 tế bào không ảnh
hƣởng đến sự phát triển phôi và thai mà
còn hạn chế vấn đề thể khảm, cho kết
quả chính xác hơn [4]. Tuy nhiên, do phôi
túi phát triển không cùng thời gian, nên
việc sinh thiết không thể thực hiện cùng
một thời điểm. Cần cân nhắc tạo lỗ thủng
trên màng trong suôt để sinh thiết phôi túi
tại thời điểm phôi ngày 3 hoặc sáng ngày
5. Việc sử dụng laser để tạo lỗ thủng trên
màng trong suốt của phôi ngày 3 ảnh
hƣởng ít đến phôi bào và tạo thuận lợi
sinh thiết tế bào lá nuôi [3]. Tuy nhiên, vị
trí lỗ thủng của màng trong suốt cũng có
thể trùng với vị trí khôi tế bào trong phôi
túi, do vậy quá trình sinh thiết có thể ảnh
hƣởng đến phôi túi.


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015

Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp thuỷ
tinh hoá để đông lạnh phôi túi ngay sau

sinh thiết. Sau sinh thiết, phôi túi sẽ làm
cho phôi túi xẹp xuống do dịch trong
xoang phôi túi thoát ra ngoài. Do vậy, sẽ
làm cho phôi túi sau rã đông có tỷ lệ phôi
túi sống tƣơng đối cao (95%), kết quả này
cũng tƣơng tự nghiên cứu của Zhang
(2009) với tỷ lệ phôi túi sinh thiết sống
sau rã đông 95,6% [6].

assessment proceedings of an expert meeting.
Human Reproduction. 2011, 26 (6), pp.1270-1283.

KẾT LUẬN

4. Harton GL, Magli MC, Lundin K, Montag
M, Lemmen J, Harper JC. ESHRE PGD
Consortium/Embryology Special Interest Group best practice guidelines for polar body and
embryo biopsy for preimplantation gennetic
diagnosis/screening (PGD/PGS). Human
Reproduction. 2011, 26 (1), pp.41-46.

Qua nghiên cứu cho thấy phát triển
của 50 phôi ngày 3 sau sinh thiết một
phôi bào không ảnh hƣởng đến phát triển
phôi tại các ngày 4 và 5. 20 phôi túi sau
sinh thiết đƣợc đông lạnh bằng phƣơng
pháp thuỷ tinh hoá có tỷ lệ sống cao sau
rã đông.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Alpha Scientists in Reproductive Medicine

and ESHRE Special Interest Group of Embryo.
The Istabul consensus workshop on embryo

2. Geber S, Sampaio M. Blastomere
development after embryo biopsy: a new
model to predict embryo development and to
select for transfer. Human Reproduction. 1999,
14 (2), pp.782-786.
3. Gardner D, Veissman A, Howles C.M,
Shoham Z. Textbook of Assisted Reproductive
Technologies: laboratory and clinical perspectives.
Third edition on the United Kingdom. 2004.

5. Kahraman S, Candan ZN. Outcomes
of vitrified - warmed day-4 embryos after-3
cleavage-stage biopsy. Reprod Biomed Online.
2010, 21, pp.636-641.
6. Zhang X, Trokoudes KM, Pavlides.
Vitrification of biopsied embryos at cleavage,
morula and blastocyst stage. Reprod Biomed
online. 2009, 19, pp.526-531.

49