Kết quả bước đầu phát hiện vi khuẩn lao bằng LAMP

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017

KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU PHÁT HIỆN
VI KHUẨN LAO BẰNG LAMP
Triệu Tiến Sang*; Trần Văn Khoa*; Nguyễn Duy Bắc*
TÓM TẮT
Sự phát triển của kỹ thuật làm tăng độ nhạy phát hiện vi khuẩn lao, là một trong những ưu
tiên hàng đầu của nghiên cứu phát hiện mầm bệnh lao trong nhiều năm qua vì bệnh lao vẫn là
một mối đe dọa lớn tới sức khỏe. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt đoạn vòng lặp kiểu k p
tóc (LAMP - loop-mediated isothermal amplification) là phương pháp mới phát hiện axít nucleic,
có thể sử dụng được ở những nơi không có trang thiết bị đắt tiền. Mục tiêu: hoàn thiện kỹ thuật
LAMP-PCR phát hiện gen đích của Mycobacterium tuberculosis. Phương pháp: 15 mẫu bệnh
phẩm đờm của bệnh nhân (BN) lao được xác định, thiết kế mồi trên cơ sở trình tự chèn lặp lại
IS6110 như một gen đích cho phản ứng LAMP. Kiểm tra kết quả bằng realtime-PCR, điện di
trên gel agarose. Kết quả: đã hoàn thiện được quy trình LAMP-PCR để phát hiện vi khuẩn lao.
* Từ khoá: Vi khuẩn lao; Kỹ thuật LAMP.

Initial Results of using Lamp in Mycobacterium Tuberculosis
Detection
Summary
Developing techniques to improve sensitivity in Mycobacterium tuberculosis detection is one
of the international research priorities recently, because TB remains globally a major health
threat. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a new nucleic acid detection method
that can be used in laboratories without expensive equipments. Objectives: To develop the
LAMP-PCR technique for detecting target genes of Mycobacterium tuberculosis. Subjects and
methods: 15 specimens of sputum specimens of TB patients were identified, primer design
based on repeat sequence IS6110 as target gene for LAMP-PCR. Examine the results using
realtime-PCR and electrophoresis on agarose gel. Results: We have completed the LAMP-PCR
process for Mycobacterium tuberculosis detection.
* Keywords: Mycobacterium tuberculosis; LAMP technique.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, bệnh lao vẫn là nguyên nhân
thứ hai gây tử vong do một tác nhân
nhiễm trùng đơn lẻ. Chẩn đoán nhanh và
hiệu quả bệnh lao là một trong những vấn

đề quan trọng trong việc phòng chống bệnh
này trên toàn cầu [4 . Do tính đơn giản và
chi phí thấp nên phương pháp soi dịch đờm
vẫn là kỹ thuật chẩn đoán thường quy
cho bệnh lao ở các nước đang phát triển.

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Duy Bắc ()
Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017
Ngày bài báo được đăng: 04/09/2017

330


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
Tuy nhiên, kỹ thuật này có độ nhạy thấp.
Xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn cho độ
nhạy cao hơn là tiêu chuẩn vàng, song
nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp tốn
thời gian, đòi hỏi kỹ thuật chuyên môn và
chỉ thực hiện được tại các cơ sở chuyên
ngành. Mặt khác, hình ảnh chụp X quang
trong nhiều trường hợp không rõ ràng [5 .
Các kỹ thuật dựa trên PCR là một trong

những phương pháp mới hứa h n và hấp
dẫn nhất so với các phương pháp thông
thường. Tuy nhiên, không phải nơi nào
cũng có điều kiện thực hiện do hạn chế
về trang thiết bị, kỹ thuật.
Gần đây, một kỹ thuật khuếch đại axít
nucleic mới được mô tả, có tên là LAMP
(Loop-Mediated Isothermal Amplification)
[6 . LAMP có nhiều ưu điểm hơn so với
phương pháp PCR thông thường. Thứ
nhất, phản ứng LAMP thực hiện ở nhiệt
độ cố định (60 - 650C), điều này giúp tiết
kiệm thời gian và thuận tiện hơn vì không
cần phải mua thiết bị đắt tiền. Thứ hai,
LAMP là một phản ứng đặc hiệu, vì nó sử
dụng 4 hoặc 6 mồi khác nhau nhận biết
nhiều vùng khác biệt trên trình tự đích.
Thứ ba, kỹ thuật LAMP cho kết quả với
hiệu suất cao trong tổng hợp sản phẩm
khuếch đại, ít nhất là 50 lần so với phản
ứng PCR thông thường ở cùng một thể
tích. Cùng với phản ứng khuyếch đại, một

’

’

lượng lớn muối kết tủa của magiê
pyrophosphat được tạo ra như một sản
phẩm phụ làm tăng độ đục của hỗn hợp

phản ứng, cho phép phát hiện bằng mắt
thường hoặc đo độ đục. Do đó, không
cần thiết bị đòi hỏi tốn nhiều thời gian cho
bước phát hiện sau khuếch đại.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợngnghiên cứu.
15 mẫu đờm lâm sàng được lấy từ BN
đã xác nhận mắc lao (TB), do Trung tâm
Phòng chống Lao Hà Nội cung cấp. Tách
ADN từ mẫu bằng kít Qiagen, 10 ul ADN
tách chiết được sử dụng cho mỗi phản
ứng LAMP dưới điều kiện tối ưu. Để kiểm
soát nhiễm chéo, sử dụng 1 đối chứng
âm cho mỗi 3 phản ứng lâm sàng của mẫu.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* LAMP primer:
Để phát triển một kỹ thuật LAMP thành
công, thiết kế mồi là bước quan trọng
nhất. Chúng tôi đã tham khảo và sử dụng
6 trình tự mồi khác nhau để nhân một gen
đích làm tăng độ đặc hiệu.
Đặc điểm của các primers ADN
oligonucleotide sử dụng cho IS6110-LAMP
phát hiện Mycobacterium tuberculosis
như dưới đây:

Primer

Tr nh tự (5 -3 )

Chiều dài

Vị trí đích

IS-FOP

AGACCTCACCTATGTGTCGA

20-mer

812-831

IS-BOP

TCGCTGAACCGGATCGA

17-mer

1029-1045

IS-FIP
(F1c+F2)

ATGGAGGTGGCCATCGTGGAAG

41-mer

904-925, 847-865

CCTACGTGGCCTTTGTCAC

Sản phẩm
(bp)

169

331


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017
IS-BIP
(B1c+B2)

AAGCCATCTGGACCCGCCAA
CCCCTATCCGTATGGTGGAT

40-mer

946-965, 996-1015

IS-FLP

AGGATCCTGCGAGCGTAG

18-mer

872-889

IS-BLP

AAGAAGGCGTACTCGACCTG

20-mer

967-986

Hình 1: Sơ đồ và vị trí gắn mồi trên đoạn gen IS6110 của M. Tuberculosis.
((A) Sơ đồ trình tự của IS6110 đầy đủ như trên mũi tên đen đậm được đánh dấu vị
trí: phần trên cùng (A) cho thấy vùng khuếch đại đích bởi PCR và các mồi nested PCR;
phần dưới (A) cho thấy 8 vùng khác nhau được nhận diện bởi primer của LAMP Mồi
xuôi bên ngoài (FOP) và mồi ngược bên ngoài (BOP) lần lượt tương ứng với các trình
tự của các vùng F3 và B3 của đích Mồi xuôi bên trong (FIP) chứa trình tự có nghĩa của
vùng F2 ở đầu 3’ được kết nối trực tiếp với trình tự F1c (trình tự bổ sung tới trình tự F1)
ở đầu 5’, và mồi ngược bên trong (BIP) chứa trình tự có nghĩa của vùng B2 tại đầu 3’
trực tiếp liên kết với B1c (bổ sung trình tự đến vùng B1) ở đầu 5’ Mồi xuôi vòng (FLP)
và mồi ngược vòng (BLP), lần lượt chứa trình tự bổ sung cho một phần của trình tự
giữa F1 và F2 và giữa các vùng B1 và B2 (B) Vị trí gắn mồi và vị trí khuếch đại của
mồi LAMP trên đích 234bp được chọn của IS6110 Dấu (*) cho biết các biến thể dựa
trên chuỗi IS6110 của các chủng lao khác nhau)
332


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
* Phản ứng LAMP-PCR:
Kỹ thuật LAMP được tối ưu hóa ở thể
tích tổng cộng 25 ul, sử dụng 15 ul
Isothermal Master mix cho LAMP
(OptiGene, Anh), 0,1% uM mỗi IS-FIP và
IS-BIP, 0,2 uM mỗi IS-FOP và IS-BOP,

0,8 uM mỗi IS-FLP và IS-BLP, 2 mM
dNTPs, 6 mM MgSO4, 8U Bst ADN
polymerase và 5 ul ADN khuôn từ mẫu
tách chiết. Phản ứng thực hiện ở nhiệt độ
tối ưu là 650C trong 90 phút, kết thúc
bằng bất hoạt enzym ở 900C trong 2 phút.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Để kiểm tra, đánh giá kết quả phản
ứng LAMP, thông thường chỉ cần một
trong các cách thức là:

- Quan sát bằng mắt thường thông
qua biến đổi độ đục của dung dịch phản
ứng: mẫu dương tính sẽ cho màu trắng
đục, mẫu âm tính có màu trong suốt.
- Quan sát sau khi nhuộm bằng thuốc
nhuộm huỳnh quang (thường dùng là
SYBR green I) bổ sung trực tiếp vào ống
PCR: mẫu dương tính sẽ cho màu xanh,
mẫu âm tính có màu vàng cam.
- Điện di agarose thường: mẫu dương
tính cho kết quả băng điện di có dạng
nhiều băng vạch giống như thang chuẩn,
mẫu âm tính có dạng dải smear của ADN
khuôn và các dimer.
Trong nghiên cứu này, do chúng tôi sử
dụng master mix đã có sẵn SYBR green I,
có thể kiểm tra trên máy realtime-PCR và
diện di trên gel agarose (khi áp dụng trong
thực tế, không cần thiết bị realtime-PCR).

1. Kết quả đánh giá qua điện di trên agarose.

Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP-PCR trên 15 mẫu nghiên cứu.
(M: thang ADN, 100 bp; (-) và (+): mẫu chứng âm và mẫu chứng dương;
1-15: 15 mẫu dương tính)
2. Kết quả đánh giá qua tín hiệu huỳnh quang trên hệ thống realtime.
Độ nhạy cao của kỹ thuật IS6110-LAMP phụ thuộc vào thời gian của phản ứng
khuếch đại. Để khảo sát thời gian theo thời gian thực, chúng tôi khảo sát trên máy
333


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017
realtime-PCR. LAMP có đặc điểm diễn ra liên tục trong điều kiện đẳng nhiệt. Vì vậy,
chúng tôi xác định thời gian theo chu kỳ giả định, mỗi chu kỳ phản ứng tương đương
với 1 phút.

Hình 3: Hình ảnh LAMP-PCR trên hệ thống realtime.
(Ký hiệu trên trái (-) và dưới cùng bên phải (+): mẫu chứng dương và mẫu chứng âm;
còn lại: các mẫu bệnh phẩm lâm sàng)
Hình ảnh cho thấy, hầu hết các mẫu có tăng tín hiệu chỉ sau 20 phút, 1 mẫu số 12
tăng tín hiệu sau 50 phút. Trong khi đó, mẫu chứng âm sau 85 phút không thấy tăng
tín hiệu huỳnh quang.
BÀN LUẬN
Các kỹ thuật dựa trên LAMP với đích
gyrB và rrs gần đây đã được mô tả nhằm
phát hiện ra vi khuẩn lao [1, 3 . Trong
nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ
thuật LAMP để phát hiện vi khuẩn lao
dựa trên khuếch đại trình tự chèn 6110

(IS6110). IS6110, đặc trưng cho chủng M.
tuberculosis. Hơn nữa, hầu hết các thành
viên của vi khuẩn lao chứa nhiều bản sao
của IS6110, do đó sử dụng gen mục tiêu
này sẽ làm tăng độ nhạy [7 .
Qua kết quả nhân gen và kiểm tra
bằng điện di trên gel agarose (hình 2) cho
thấy các mẫu có dạng nhiều băng vạch,
cấu trúc hình thang ADN đặc trưng của
334

sản phẩm được khuếch đại LAMP do kết
quả nhân lên kiểu vòng lặp. Kích thước
sản phẩm các đoạn lặp trong phản ứng
LAMP vào khoảng 169 bp (băng vị trí
thấp nhất trên bản gel) trên gel agarose,
cho thấy khuếch đại đặc hiệu của trình tự
đích như thiết kế.
Kết quả thể hiện qua phản ứng LAMP
trên thiết bị realtime cũng cho thấy sự
trùng lặp (hình 3).
Bên cạnh việc tăng độ nhạy, một lợi
thế lớn khác của kỹ thuật LAMP so với
PCR và nested-PCR là thời gian tiến
hành kỹ thuật, chỉ cần khoảng 1,5 giờ để
thực hiện kỹ thuật LAMP-PCR so với 2,5
giờ đối với kỹ thuật PCR thường và


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017

khoảng 5 giờ đối với kỹ thuật nestedPCR. Ngoài ra, đối với lượng ADN lớn
được sử dụng trong kỹ thuật LAMP, kết
quả dương tính có thể thu được trong
vòng 20 phút (hình 3). Do đó, có thể xem
xét cải tiến kỹ thuật LAMP bằng cách kết
hợp nó với một thiết bị đo độ đục trong
thời gian thực. Điều này sẽ cho phép thu
được kết quả xét nghiệm nhanh hơn khi
các mẫu có lượng trực khuẩn cao.

tuberculosis: modern molecular epidemiology
and perspectives. In: Tibayrenc M, editor.
Encyclopedia of infectious diseases: modern
methodologies. Wiley-Liss, New Jersey. 2007,
pp.1-29.

KẾT LUẬN

4. Keeler E, Perkins MD, Small P, Hanson
C, Reed S, Cunningham J et al. Reducing the
global burden of tuberculosis: the contribution
of improved diagnostics. Nature. 2006, 444
(1), pp.49-57.

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy
LAMP-PCR là kỹ thuật rẻ tiền và phát
hiện nhanh vi khuẩn laotrong điều kiện
Việt Nam.Hiện tại, chúng tôi đang thực
hiện kỹ thuật MTB-LAMP trên một số
lượng lớn mẫu bệnh phẩm lâm sàng để

đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ
thuật.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Boehme CC, Nabeta P, Henostroza G,
Raqib R, Rahim Z, Gerhardt M et al.
Operational feasibility of using loop-mediated
isothermal amplification for diagnosis of
pulmonary tuberculosis in microscopy centers
of developing countries. J Clin Microbiol.
2007, 45 (6), pp.1936-1940.
2. Godreuil S, Tazi L, Ban˜uls AL
Pulmonary tuberculosis and Mycobacterium

3. Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K. Loopmediated isothermal amplification for direct
detection of Mycobacterium tuberculosis
complex, M. avium and M. intracellulare in
sputum samples. J Clin Microbiol. 2003, 41
(6), pp.2616-2622.

5. Koppaka R, Bock N. How reliable is
chest radiography? In: Frieden T, editor.
Toman’s
tuberculosis
case
detection,
treatment and monitoring: questions and
answers. World Health Organization, Geneva.
2004, pp.51-60.
6. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H,
Yonekawa T, Watanabe K, Amino N et

al.Loop-mediated isothermal amplification of
DNA. Nucleic acids Res. 2000, 28 (12), p.63.
7. Thierry D, Brisson-Noel A, Vincent-LevyFrebault V, Nguyen S, Guesdon JL, Gicquel
B. Characterization of a Mycobactenum
tuberculosis insertion sequence, IS6110 and
its application in diagnosis. J Clin Microbiol.
1990, 28 (12), pp.2668-2273.

335