Xây dựng quy trình multiplex PCR định týp gen VacA và CagA trên mẫu mô sinh thiết ung thư dạ dày

XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX PCR ĐỊNH TÝP GEN
vacA VÀ cagA TRÊN MẪU MÔ SINH THIẾT UNG THƯ DẠ DÀY
Lê Thị Thanh Bình*, Trần Thiện Trung**
TÓM TẮT
Đặt vấn ñề: ung thư dạ dày là căn bệnh gây tử vong ñứng hàng thứ II trên thế
giới chỉ sau ung thư phổi. Helicobacter pylori (H. pylori) ñược Viện Nghiên Cứu Ung
Thư Quốc Tế xếp loại là tác nhân loại I gây UTDD vào năm 1994 dựa trên hai
protein gây ñộc chính là VacA và CagA .
Mục tiêu: xây dựng quy trình Multiplex PCR nhằm xác ñịnh nhanh ñồng thời các
týp gen vacA và cagA của Helicobacter pylori từ mẫu mô sinh thiết ung thư dạ dày.
Phương pháp: ñun mô sinh thiết trong dung dịch ñệm PBS, tối ưu chương trình
nhiệt và các thành phản ứng cho quy trình Multiplex PCR, ñiện di, giải trình tự, ño ñộ
nhạy của quy trình, so sánh kết quả quy trình với hai tiêu chuẩn vàng CLOtest và
Chẩn ñoán mô bệnh học (Giải phẫu bệnh).
Kết quả: xây dựng thành công quy trình có ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu hoàn toàn phù
hợp với kết quả CLOtest, chẩn ñoán mô bệnh, kết quả giải trình tự và các kết quả
nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước.
Kết luận: quy trình có thể ñưa vào ứng dụng ñể xác ñịnh các kiểu gen vacA và
cagA của Helicobacter pylori trên bệnh nhân ung thư dạ dày và những bệnh nhân bị
viêm loét dạ dày tá tràng ñể phân loại nhóm nguy cơ cao và nguy cơ thấp. Từ ñó ñưa
ra chiến lược tầm soát và ñiều trị H. pylori triệt ñể góp phần dự phòng UTDD.
Từ khóa: Helicobacter pylori, ung thư dạ dày, quy trình Multiplex PCR.
ABSTRACT
ESTABLISHING A MULTIPLEX PCR FOR GENOTYPING OF vagA AND
cagA GENES OF HELICOBACTER PYLORI FROM GASTRIC CANCER
BIOPSY SAMPLES
Le Thi Thanh Binh, Tran Thien Trung
Background: gastric cancer (stomach cancer) is the second most common cause
of death worldwide behind cancer of the lung. Helicobacter pylori has been as a
class I carcinogen by the International Agency for Research on Cancer 1994 through
VacA and CagA proteins.

Objective: establishing a multiplex PCR for identification of the vagA and the
cagA genes of Helicobacter pylori from gastric cancer biopsies.
Methods: from 88 biopsy samples of 44 pattients with gastric cancer, boiling of
biopsy samples in sterile PBS buffer, optimization of multiplex PCR cycling
conditions and of Multiplex reaction components, centrifugation followed by PCR
assay, sequencing PCR products, and comparing results of PCR with two gold standard CLOtest and histology.
* Bệnh viện Từ Dũ. Liên hệ: Bs Lê Thị Thanh Bình- ĐT: 0909519398
Email:
** Đại học Y Dược TPHCM

1


Results: process gains specificity and the sensittivity suiting the results of
CLOtest, histology, sequencing, studying of authors in country and in the world.
Conclution: This Multiplex PCR assay could apply to determine vacA and cagA
of H. pylori from biopsy specimens of gastric cancer, gastritis or peptic ulcer patients
to class high risk and low risk groups. From the results, clinicals could establish a
strategy for screening and eradicating absolutely H. pylori to prevent gastric cancer.
Keywords: Helicobacter pylori, Gastric cancer, multiplex PCR.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư dạ dày (UTDD) là dạng ung thư phổ biến gây tử vong ñứng hàng thứ II
trên thế giới chỉ sau ung thư phổi. Ung thư dạ dày phát triển chậm qua nhiều năm, tỷ
lệ sống sót thấp nguyên nhân là do phần lớn bệnh thường ñược chẩn ñoán muộn nên
khả năng ñiều trị triệt ñể thấp vì giai ñoạn sớm có ít hoặc không có triệu chứng ñặc
hiệu.
Theo thống kê dịch tễ học và kết quả của các công trình nghiên cứu cho ñến nay,
nhiễm Helicobacter pylori (H. pylori) ñược xem là nguyên nhân quan trọng dẫn ñến
UTDD dựa trên hai protein gây ñộc chính của H. pylori là CagA và VacA. Hai vùng
gen mã hóa cho hai protein này là hai vùng gen ña hình tạo nên các chủng của H.

pylori có ñộc lực khác nhau. Theo Xiang và cs (1995), H. pylori ñược chia thành 2
týp: týp 1 bao gồm các chủng H. pylori có ñộc lực mang kiểu gen s1m1cagA+,
s1m2cagA+ ; týp 2 gồm các chủng H. pylori không có ñộc lực mang kiểu gen
s2m2cagA- [17]. Từ những tính ñộc lực khác nhau này sẽ dẫn ñến các mức ñộ bệnh
khác nhau của dạ dày - tá tràng như viêm dạ dày, loét dạ dày tá tràng và ung thư dạ
dày. Như vậy có thể thấy việc tầm soát và ñiều trị triệt ñể H. pylori là biện pháp dự
phòng cho ung thư dạ dày. Phương pháp sinh học phân tử là phương pháp duy nhất có
thể giúp xác ñịnh chính xác kiểu gen của H. pylori thuộc nhóm nguy cơ cao hay nguy
cơ thấp gây UTDD.
Chúng tôi xây dựng quy trình Multiplex PCR với mục tiêu xác ñịnh nhanh ñồng
thời các týp gene vacA và cagA của H. pylori trong cùng một phản ứng từ mẫu sinh
thiết của bệnh nhân bị ung thư dạ dày sao cho chính xác và hiệu quả kinh tế.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chọn mẫu bệnh phẩm : là các mẫu mô sinh thiết dạ dày ñược lấy bằng kỹ thuật
nội soi từ 44 bệnh nhân bị ung thư dạ dày ở 2 vị trí mô lành và mô bệnh tại hang vị
của dạ dày và ñược làm cùng một lúc 3 xét nghiệm chẩn ñoán H. pylori : CLO test
(test urease), Chẩn ñoán mô học (giải phẫu bệnh) và chẩn ñoán bằng PCR. Nguồn thu
mẫu : bệnh viện Đại học Y Dược TPHCM. Trữ mô ở nhiệt ñộ – 200C.
Mồi: sử dụng 3 cặp mồi ñặc hiệu của H. pylori là CAGA, Va1 và VAG từ công
trình nghiên cứu của Yamaoka và cs (1999), Cover và cs (1994) và Atherton và cs
(1995); 1 cặp mồi chứng nội hGSTP từ công trình của Menegon và cs (1998). Kiểm
tra tính không bắt cặp bổ sung và ñộ ñặc hiệu của các cặp mồi trên các phần mềm
chuyên dụng. Các cặp mồi này ñược tổng hợp từ công ty IDT (Hoa Kỳ) [1,5,10,18].
Chứng nội tại dương tính sẽ chứng minh ñược khâu tách chiết và khuếch ñại ñộ nhạy
không bị ức chế [16].
DNA của mẫu mô : ñược thu nhận từ mẫu mô ñun trong dung dịch ñệm PBS vô
trùng. Các vật liệu và hóa chất khác: thang 100 bp Marker (Bio - Rad), Taq DNA
polymerase (Bio - Rad) kèm theo dNTPs, PCR buffer, MgCl2, và H2O khử ion của
hãng; PBS vô trùng; hóa chất dùng cho ñiện di do công ty Khoa Thương cung cấp.

2


Quy trình Multiplex PCR : khuếch ñại ñồng thời nhiều cặp mồi trong cùng một
phản ứng.
Nguyên tắc khi chuẩn hóa quy trình: (1) ñầu tiên chọn ra chu trình nhiệt cho
PCR mồi ñơn nhưng phù hợp với các cặp mồi ñể làm cơ sở cho việc chuẩn hóa quy
trình PCR mồi ña. Chu trình ñược áp dụng trên cùng một loại máy luân nhiệt; (2) sử
dụng các cặp mồi cùng một nồng ñộ ở bước ñầu tiên, sau ñó dựa vào kết quả phản
ứng sẽ cho biết bước tiếp theo cần phải ñiều chỉnh nồng ñộ mồi và các tham số khác
như thế nào; (3) khi tối ưu một thành phần nào ñó trong phản ứng thì những thành
phần còn lại sẽ ñược giữ cố ñịnh.
Thành phần mix PCR mồi ñơn ban ñầu: Taq DNA polymerase (1U/25µl); 1 cặp
mồi (0,2 µM); MgCl2 (1,5 mM); dNTPs (200 µM/mỗi loại); dung dịch ñệm (1X);
dH20; DNA khuôn (5µl).
Chương trình nhiệt PCR mồi ñơn ban ñầu: (1) Nhiệt ñộ : nhiệt ñộ biến tính là
95 C, nhiệt ñộ lai là 520C và nhiệt ñộ kéo dài là 720C; (2) Chu kỳ nhiệt: 1 chu kỳ ñầu
tiên là 950C trong 3phút 30 giây; 35 chu kỳ tiếp theo, mỗi chu kỳ gồm : 940C trong 20
giây, 620C trong 40 giây, 720C trong 40 giây; (3) 1 chu kỳ cuối là 720C trong 6 phút.
0

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 3% với 3µl thang DNA 100bp, 5µl dd
nạp mẫu 1X, 9µl sản phẩm PCR, 8 µl ethidium bromide (10mg/ml), hiệu ñiện thế U=
100Volt trong 35 - 40 phút.
Đánh giá ñộ nhạy của quy trình: dựa trên mẫu sinh thiết ñã biết chắc chắn
dương tính, ño nồng ñộ DNA trong dung dịch, pha loãng theo log cơ số 10 với các
nồng ñộ 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 và sau ñó xác ñịnh nồng ñộ DNA tối thiểu
trong phản ứng PCR có thể phát hiện ñược H. pylori.
Đánh giá ñộ ñặc hiệu của sản phẩm PCR [16]: gửi giải trình tự 3 sản phẩm PCR
của 3 bệnh nhân ở CTY Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả ñược giải theo lần lượt từng

cặp mồi xuôi và ngược. Đọc kết quả trình tự bằng công cụ Blast trên NCBI.
So sánh hiệu quả chẩn ñoán của quy trình với kết quả của hai tiêu chuẩn vàng
CLO test và Chẩn ñoán mô bệnh học. [13]
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát vị trí mô
Kết quả khảo sát sơ bộ sự hiện diện của H. pylori trong 32 mẫu bệnh phẩm từ 8
bệnh nhân có kết quả CLOtest dương tính cho thấy tỷ lệ H. pylori dương tính ở mô
lành cao hơn mô bệnh (mô lành là 87,5 % và mô bệnh là 75,0 %). Kết quả trên cũng
phù hợp với nguyên lý của Mobley và cs (2001) [15] về tính bám dính và xâm thực của
H. pylori cũng như sự nhận ñịnh của El - Zimaity (2000) [6], Tang YL và cs (2005) [14],
Chey WD, Wong BCY. (2007) [4] và Nguyễn Ngọc Huyền (2009) [12] về cách chẩn
ñoán sự hiện diện của H. pylori trên mẫu mô sinh thiết. Vì vậy chúng tôi quyết ñịnh
chọn mẫu ở vị trí mô lành ñể tiếp tục cho quy trình nghiên cứu tiếp theo.
Hình 1: Kết quả khảo sát sự hiện diện của H.pylori ở các vị trí mô lành và mô
bệnh có kết quả CLO test dương tính. Sử dụng cặp mồi CAGA ñể khảo sát.
Ký hiệu mẫu: 1,2: mô bệnh; 3,4 : mô lành; .

3


cagA
349 bp

Khảo sát nồng ñộ mồi và chương trình nhiệt (mẩu DNA ñược dùng tối ưu là
những mẫu ñã ñược giải trình tự có kết quả hoàn toàn ñặc hiệu với H. pylori)
Tiêu chí ñể chúng tôi khảo sát nhiệt ñộ lai là nhiệt ñộ này phải phù hợp với các
cặp mồi của H. pylori và cặp mồi chứng nội hGSTP sao cho các cặp mồi này ñạt hiệu
quả khuếch ñại cao nhất trong cùng một phản ứng PCR. Đầu tiên chúng tôi khảo sát
chương trình nhiệt PCR một cặp mồi trước, sau ñó lấy kết quả vừa khảo sát làm cơ sở
ñể chuẩn hóa chương trình nhiệt cho quy trình Multiplex PCR 4 cặp mồi. Chúng tôi

ñưa ra nhiều chương trình (khác nhau về nhiệt ñộ lai, số chu kỳ luân nhiệt, thời gian
biến tính, thời gian lai và thời gian kéo dài). Chúng tôi ñiều chỉnh nhiệt nồng ñộ mồi
theo nhiệt ñộ lai. Cuối cùng chúng tôi ñã tìm ñược một chương trình nhiệt chuẩn cho
quy trình Multiplex PCR ((hình 2,3) với nhiệt ñộ lai là 620C, nồng ñộ 4 cặp mồi lần
lượt là : VAG 0,2 µM; CAGA 0,2 µM; VA1 0,5 µM; hGSTP 0,4 µM.

Hình 2 : Kết quả khảo sát nồng ñộ mồi cùng với các
nhiệt ñộ lai 610C, 620C, 630C, 650C cho 4 cặp mồi
VAG, VA1, CAGA và hGSTP trên 3 bệnh nhân
trong hệ thống Multiplex PCR 4 cặp mồi.; Nồng ñộ
hai cặp mồi VAG và CAGA là 0,2 µM/ 1 cặp mồi;
Nồng ñộ hai cặp mồi VA1(s1/s2) và hGSTP là 0,4
µM / 1 cặp mồi; Mũi tên : là những vạch band không
ñặc hiệu.

Hình 3 : Kết quả khảo sát nồng ñộ
mồi cùng với các nhiệt ñộ lai 610C,
620C cho 4 cặp mồi VAG, VA1,
CAGA và hGSTP trên 3 bệnh nhân
trong hệ thống Multiplex PCR. Nồng
ñộ hai cặp mồi VAG và CAGA là
0,2 µM/ 1 cặp mồi; Nồng ñộ cặp mồi
VA1 là 0,5 µM và hGSTP là 0,4 µM.

Tối ưu các thành phần phản ứng
Khảo sát nồng ñộ Taq DNA polymerase
Hình 4 : Khảo sát nồng ñộ Taq DNA polymerase trên 3 bệnh nhân với các nồng ñộ 1U,
2U, 2,5U và 3U

Kết quả cho thấy Taq DNA

polymerase với nồng ñộ 2U cho
phản ứng tối ưu phù hợp với nồng

4


ñộ Taq DNA polymerase trong thành phần mix multi PCR của chúng tôi ñưa ra và
phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước ñây [2,8,9]. Như vậy, nồng ñộ Taq DNA
polymerase chuẩn là 2U.
Khảo sát chỉ số MgCl2 /dNTPs
Đây là chỉ số quan trọng nhất của quy trình, quyết ñịnh hoạt tính của Taq DNA
polymerase. Ion Mg2+ là cofactor của Taq DNA polymerase. Mg2+ tự do gắn vào Taq
DNA polymerase giúp Taq pol. có thể gắn vào DNA khuôn, vào mồi, vừa gắn vào
dNTPs ñể thực hiện sự tổng hợp. Điều này giải thích tại sao tăng nồng ñộ dNTP lên
cao, sẽ ức chế nhanh phản ứng PCR trong khi tăng nồng ñộ MgCl2 lên cao thường tạo
ra hiệu quả dương tính. Tuy nhiên nếu nồng ñộ MgCl2 quá cao sẽ ức chế hoạt tính của
Taq polymerase, làm giảm số lượng sản phẩm mong muốn.
Giữ nguyên nồng ñộ của các thành phần khác trong mix PCR, chúng tôi lần lượt
thay ñổi nồng ñộ MgCl2 và dNTPs. Kết quả (hình 5 và 6) cho thấy, MgCl2 ở nồng ñộ
3,5 mM và dNTPs ở nồng ñộ 400 µM cho kết quả sản phẩm PCR ñặc hiệu, rõ, ñẹp và
ổn ñịnh hơn so với các nồng ñộ khác. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu
của các tác giả Newton CR và cs (1997), và Grunenwald H (2003) [7,11]; Henegariu O
(1997) [9]; Zangenberg G và cs (1999) [19].

Hình 5 : Kết quả khảo sát nồng ñộ MgCl2 với các Hình 6 : Kết quả khảo sát nồng
nồng ñộ 1,5mM, 2mM, 2,5mM, 3mM, 3,5mM, ñộ dNTPs với các nồng ñộ 200
10,8mM, 20mM
µM, 400 µM và 800 µM; Mũi tên
ñen: các băng không ñặc hiệu.

Khảo sát nồng ñộ dung dịch ñệm và chất hỗ trợ phản ứng DMSO 5%
Nồng ñộ dung dịch ñệm chuẩn cho một phản ứng
PCR mồi ñơn phụ thuộc vào loại enzyme DNA
polymerase sử dụng. Đối với Taq polymerase, nồng
ñộ ñệm thường là 1X (50 mM KCl; 10 mM Tris - HCl
pH 8,3 và 50 mM KCl; 0,001% gelatin) (Cetus buffer).
Trong hệ thống multiplex PCR, nồng ñộ ñệm có
thể ñược tăng lên 1,6X (Chamberlain và cs, 1988)
hoặc lên ñến 2X (Henegarin và cs, 1997) ñể làm tăng
hiệu quả hoạt ñộng của Taq polymerase.
Hình 7 : Kết quả khảo sát nồng ñộ dung dịch ñệm với các giá trị
1X; 1,6X; 2X và DMSO 5%

5


Nồng ñộ ñệm sẽ hiệu quả hơn rất nhiều khi sử dụng các chất hỗ trợ phản ứng như
DMSO, glycerol, BSA,…[3,8].
Kết quả (hình 7) cho thấy, ở nồng ñộ 1X cho kết quả tốt nhất trong quy trình của
chúng tôi. Điều này cho thấy nồng ñộ muối trong dung dịch ñệm ñã ñủ cho phản ứng
khuếch ñại hiệu quả. Vai trò DMSO trong khảo sát không làm thay ñổi kết quả phản
ứng.
Khảo sát ñộ nhạy
Theo kết quả (hình 8): (1) Ngưỡng DNA khuôn cho chứng nội
và H. pylori thấp nhất mà quy trình có thể phát hiện là 10-3 tương
ñương lượng DNA khuôn là 3,21 ng. Đây là một ñộ nhạy rất cao.
Theo Grunenwald (2003), DNA khuôn cần cho phản ứng Multiplex
PCR là từ 2 - 2500 ng [7]. Theo Zangenberg G và cs (1999) lượng
DNA bộ gen người làm khuôn cần cho một phản ứng Multiplex
PCR tối ưu là từ 10 - 100 ng [19].

Hình 8: Khảo sát ñộ nhạy của phản ứng với các nồng ñộ pha loãng 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5, 10-6.

Khảo sát ñộ ñặc hiệu của sản phẩm PCR
Kết quả giải trình tự, sau khi phân tích bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng dữ
liệu gen quốc gia Mỹ NCBI cho thấy sản phẩm hoàn toàn ñặc hiệu với vi khuẩn
Helicobacter pylori.
Áp dụng quy trình trên 44 bệnh nhân - Hiệu quả chẩn ñoán của quy trình:

Tình trạng
H. pylori

Ung thư (n = 44)
CLO test

CĐMBH

PCR

+

33

18

28

-

11

26

16

Sự hợp lý khi kết hợp ñộ nhạy cao của CLO test và ñộ ñặc hiệu cao của Chẩn
ñoán mô học ñược thể hiện ở kết quả phương pháp PCR của chúng tôi như sau: kết
quả PCR dương tính tất cả các mẫu ñó ñều có kết quả CLO test dương tính; PCR âm
tính tất cả các mẫu ñó ñều có kết quả chẩn ñoán mô bệnh học âm tính; khi mẫu có kết
quả CLO test âm tính thì mẫu ñó cũng có kết quả PCR và Chẩn ñoán mô học âm tính.
Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi thiết nghĩ có thể dùng kết quả chẩn ñoán
mô bệnh học ñể kiểm tra âm tính giả của PCR, và ñộ nhạy của CLO test ñể kiểm tra
kết quả dương tính giả của PCR.
CLO test và Chẩn ñoán mô học vẫn là "tiêu chuẩn vàng" ñể kiểm tra tính hiệu
quả của một phương pháp chẩn ñoán mới.

KẾT LUẬN
Chúng tôi ñã xây dựng thành công quy trình Multiplex PCR 4 cặp mồi bao gồm:
(1) CAGA F/R nhân bản phân ñoạn gen cagA (349bp) ; (2) VA1 F/R nhân bản phân
ñoạn gen vacA s1 (259 bp), vacA s2 (286 bp); (3) VAG F/R nhân bản phân ñoạn gen

6


vacA m1 (567 bp), vacA m2 (642 bp); 1 cặp mồi chứng nội hGSTP nhân bản phân
ñoạn gen hGSTP (192 bp) từ mẫu mô sinh thiết ở vị trí mô lành ñược xử lý ñun mô
trong PBS. Đây là quy trình ñược nghiên cứu ñầu tiên ở Việt Nam trên mẫu mô sinh
thiết ñể phát hiện trực tiếp kiểu gen vacA và cagA của Helicobacter pylori với ñộ
nhạy của quy trình là 10-3 tương ứng với 3,21ng DNA khuôn. Chưong trình nhiệt của
quy trình : (1) Nhiệt ñộ : nhiệt ñộ biến tính là 950C, nhiệt ñộ lai là 620C và nhiệt ñộ

kéo dài là 720C; (2) Chu kỳ nhiệt: 1 chu kỳ ñầu tiên là 950C trong 3phút 30 giây; 35
chu kỳ tiếp theo, mỗi chu kỳ gồm : 940C trong 20 giây, 620C trong 40 giây, 720C
trong 40 giây; 1 chu kỳ cuối là 720C trong 6 phút. Thành phần mix PCR: Taq DNA
polymerase (2U/25µl); VA1 F/R là 0,5 µM; VAG F/R : 0,2 µM; CAGA F/R : 0,2 µM;
hGSTP : 0,4 µM; MgCl2 : 3,5 mM; dNTPs : 400 µM/mỗi loại; dung dịch ñệm : 1X;
dH20; DNA khuôn : 5µl.
Quy trình không sử dụng các hóa chất làm tan mô và tách chiết DNA ñã giảm chi
phí và thời gian xử lý mẫu rất nhiều so với phương pháp tách chiết truyền thống. Có
thể ứng dụng quy trình này vào việc tầm soát các kiểu gen nguy cơ cao của
Helicobacter pylori gây UTDD, giúp phát hiện sớm UTDD, làm giảm tỷ lệ tử vong
cho bệnh này gây ra cho người bệnh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Atherton JC, Cao P, Peek RM, et al. (1995). Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of
Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic
ulceration. J. Biol. Chem. 270: 17771 - 17777.

2.

Chamberlain J. S, Chamberlain J. R. 1994. The Polymerase Chain Reaction (Mullis K, Ferré F,
Gibbs R. A, Eds.). Chapter 3 Optimization of Mutiplex PCR. Birkhauser, Boston.

3.

Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyên PN, Caskey CT. 1988. Deletion screening of the
Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Ac Res. 16 :
11141 - 11156.

4.

Chey WD, Wong BCY. (2007). American College of Gastroenterology Guideline on the
Management of Helicobacter pylori Infection. Am. J Gastroenterol. 102:1808-1825.

5.

Cover TL, Tummuru MKR, Cao P, Tompson SA, and Blaser MJ. (1994). Divergence of genetic
sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains. J. Biol. Chem.
269:10566-10573.

6.

El-Zimaity HM. (2000). Accurate diagnosis of Helicobacter pylori with biopsy. Gastroenterol
Clin N Am. 29: 863-869.

7.

Grunenwald H. (2003). Chapter 20 Optimization of Polymerase Chain Reactions. Methods in
Molecular Biology, PCR Protocol, Second Edition (Bartlett JMS, Stirling D). Vol. 226 : 89 99. Humana Press, USA.

8.

Henegariu O, Heerema NA, Dlouhy SR, Vance GH, Vogt PH. (1997). Multiplex PCR : Critical
Parameters and Step - by - step Protocol. BioTechniques. 23 : 504 - 511.

9.

Henegariu O. (1997). PCR and Multiplex PCR guide. Yale University, USA.

10. Menegon A, Board PG, Blackburn AC., et al. (1998). Parkinson's disease, pesticides, and

glutathione transferasep polymorphisms. Lancet. 352 (9137): 1344-1346.
11. Newton CR, Graham A. (1997). PCR. Second edition. BIOS Scientific. UK.
12. Nguyễn Ngọc Huyền (2009). Tình hình nhiễm Helicobacter pylori trên bệnh nhân ung thư dạ dày.
Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Tuổi Trẻ Các Trường Đại Học Y Dược Việt Nam lần thứ
XIII.
13. Ogata SK, Kawakami E, Reis FPS. 2002. Evaluation of invasive methods to diagnosis
Helicobacter pylori infection in children and adolescents with dyspepsia invasive methods to
diagnosis Helicobacter pylori infection. Medicina, Ribeirao Petro. 35: 24 - 29.

7


14. Tang YL, Gan RL, Dong BH, Jiang RC, Tang RJ. (2005). Detection and locaiton of Helicobacter
pylori in human gastric carcinomas. World J Gastrenterol. 11(9): 1387 - 1391.
15. Testerman TL, McGee DJ, and Mobley HLT. (2001). Chapter 34 Adherence and Colonization.
Part VI Bacterial Virulence and Pathogenic Mechanisms. Helicobacter pylori : Physiology
and Genetics (Harry L.T. Mobley, George L. Mendz, and Stuart L. Hazell).
16. The World Organisation for Animal Health (OIE) Terrestrial Manual 2008.
17. Xiang Z, Censini S, Bayeli PF, et al. (1995). Analysis of expression of CagA and VacA virulence
factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two
major types and that CagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin. Infect.
Immun. 63: 94 - 98.
18. Yamaoka Y, Kodama T, et al. (1999). Relationship between Helicobacter pylori iceA, cagA, and
vacA status and clinical outcome: studies in Four different countries. J Clin Microbiol. 37:
2274 - 2279.
19. Zangenberg G., Saiki R. K., Reynolds R. (1999). Chapter 6 Multiplex PCR : Optimization
guidelines. PCR applications : protocols for functional genomics (Innis M. A., Sninsky J. J.,
Gelfand D. H.). Academic Press, USA.

8