Nghiên cứu định lượng adenosine trong đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ADENOSINE TRONG
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps spp.)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC
Chử Văn Mến*; Vũ Tuấn Anh*; Nguyễn Văn Long*
Nguyễn Thị Lan Hương*; Bùi Thị Thu Hà*
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng adenosine trong Đông trùng
hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng: Đông trùng hạ thảo.
Phương pháp: xác định điều kiện sắc ký để định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo
bằng HPLC. Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH. Kết quả: xác định được điều kiện
sắc ký thích hợp định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo gồm: cột C18 Phenomenex
(4,6 mm × 250 mm, 5 µm) với hệ dung môi pha động là dung dịch đệm phosphate và acetonitril,
tỷ lệ 92/8, detector UV tại bước sóng 259 nm. Phương pháp được thẩm định đã đáp ứng yêu
cầu về tính tương thích hệ thống, chọn lọc đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng
(LOQ), giới hạn phát hiện (LOD), độ đúng, độ chính xác. Kết luận: đã xây dựng và thẩm định
được phương pháp định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC.
* Từ khóa: Đông trùng hạ thảo; HPLC; Adenosine.

Determination of Adenosine in Cordyceps spp. by HPLC
Summary
Objectives: Establishment and validation of adenosine quantification in Cordyceps spp. by high
performance liquid chromatography. Materials: Cordyceps spp. Methods: Determine chromatographic
conditions for quantitation of adenosine in Cordyceps spp. using HPLC. The validation was carried
out in accordance with ICH guideline and USP-34. Results: The suitable chromatographic
conditions for quantitation of adenosine in Cordyceps spp., including: C18 Phenomenex columns
(4.6 mm x 250 mm, 5 µm) with mobile phase of phosphate buffer and acetonitrile, at the ratio
of 92/8, the detection wave length of 259 nm. The quantitative method was validated on system
compatibility, selectivity, linear range, limit of detection (LOD), limit of quantitation (LOQ), precision
and accuracy. Conclusion: The HPLC method for adenosine quantitation has been developed

and fully validated in accordance with ICH guideline.
* Key words: Cordyceps spp.; HPLC; Adenosine.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đông trùng hạ thảo, một thuốc cổ truyền
nổi tiếng của Trung Quốc, có tên khoa học
là Cordyceps sinensis hoặc Cordyceps

militaris, ký sinh trên ấu trùng một số loài
côn trùng và sâu chết. Đông trùng hạ
thảo phân bố chủ yếu ở một số tỉnh của
Trung Quốc như Tibet, Qinghai, Sichuan,
Yunnan và Gansu. Đây là vị thuốc có nhiều

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến ()
Ngày nhận bài: 24/06/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/11/2015
Ngày bài báo được đăng: 01/12/2015

18


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

tác dụng quý và giá thành cao. Đông trùng
hạ thảo dùng trong đông y có tác dụng bổ
thận, bổ khí điều trị các trường hợp mệt
mỏi, mồ hôi về đêm, giảm năng lực tình
dục, tăng đường huyết, tăng mỡ máu, vô
lực sau khi ốm nặng, bệnh phổi, bệnh

thận, suy thận, loạn nhịp tim và bện gan
[1, 2]. Nghiên cứu dược lý học hiệu đại
cho thấy: Đông trùng hạ thảo có tác dụng
cải thiện nhiều hệ thống cơ quan của cơ
thể như tuần hoàn, miễn dịch, cơ quan
tạo máu, tim mạch, phổi và các tuyến nội
tiết trong cơ thể [3, 4]. Cho tới nay, hoạt
chất chính trong Đông trùng hạ thảo được
xác nhận là nucleoside và adenosine là
một chỉ tiêu để đánh giá tiêu chuẩn chất
lượng của Đông trùng hạ thảo [3, 5].
Adenosine có tác dụng dập tắt trạng thái
kích thích của tế bào thần kinh trung
ương và ức chế giải phóng nhiều chất
dẫn truyền thần kinh tiền sinap [6, 7].
Để đảm bảo hiệu quả chữa bệnh của
Đông trùng hạ thảo, việc đánh giá chất
lượng của Đông trùng hạ thảo rất quan
trọng. Nghiên cứu này tiến hành: Định lượng
adenosine trong Đông trùng hạ thảo
nhằm đánh giá chất lượng của loại dược
liệu này.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị.
- Dược liệu: Đông trùng hạ thảo do
Phòng Dược và các Hợp chất tự nhiên,
Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân
sự - Học viện Quân y cung cấp. Mẫu được
lưu tại Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học

Quân sự, Học viện Quân y.

- Hóa chất:
+ Chất chuẩn adenosine (Shanghai Tauto
Biotech Co., Ltd. Trung Quốc).
+ Ethanol 96, methanol... đạt tiêu chuẩn
tinh khiết phân tích.
+ Acetonitril, đệm phosphate, nước cất
2 lần: đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC - Merck.
- Thiết bị, dụng cụ:
+ Bình chiết siêu âm Soniclean, bộ chiết
hồi lưu dung môi.
+ Máy HPLC Alliance Water 2695D;
detector PDA.
+ Cân phân tích Sartorius có độ chính
xác 0,1 mg.
+ Bộ lọc hút chân không Alltech (Mỹ).
+ Màng lọc nylon Sartorius Minisart
kích thước lỗ lọc 0,45 µm.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
- Xây dựng phương pháp định lượng
adenosine trong Đông trùng hạ thảo dựa
trên đánh giá các thông số: tính tương
thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng
tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn
phát hiện và giới hạn định lượng dưới.
- Qua tham khảo tài liệu [3, 5] và thực
nghiệm, chúng tôi xây dựng các điều kiện
phân tích HPLC như sau:
+ Hệ thống HPLC.

+ Detector PDA, tại bước sóng 259 nm.
+ Chương trình rửa giải isocratic với
hệ pha động acetonitrile/dung dịch đệm
phosphate pH 6,5 (tỷ lệ 8/92).
+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
+ Thể tích tiêm: 10 µl.
19


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

- Dung dịch thử: cân chính xác 2 g bột
dược liệu (được nghiền tới kích thước
thích hợp) cho vào bình hồi lưu, thêm
chính xác 50 ml methanol 90%, cân bình,
ghi chính xác khối lượng. Tiến hành chiết
bằng phương pháp hồi lưu trong 60 phút.
Để nguội, cân lại bình, bổ sung methanol
90% đến khối lượng ban đầu. Lắc đều,

lọc qua màng 0,45 μm, sau đó, đem phân
tích sắc ký.
- Dung dịch chuẩn: cân chính xác 10,0 mg
chất chuẩn adenosine và hòa tan vào
bình định mức 10 ml với methanol để được
dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng
1,0 mg/ml (dung dịch A).

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Tính tƣơng thích hệ thống.

Đánh giá bằng cách tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký với
điều kiện nêu trên. Kết quả trình bày ở bảng 1 và sắc ký đồ của dung dịch chuẩn
adenosine, dịch chiết từ Đông trùng hạ thảo được ghi ở hình 1, 2.
Adenosine

Hình 1: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn adenosine.

Adenosine

Hình 2: Sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu.
20


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

Bảng 1: Kết quả khảo sát tính thích
hợp của hệ thống sắc ký.
Nội dung

Kết quả

Diện tích píc

Stb = 3978562
RSD = 0,18%

Thời gian lưu

tR,tb = 8,58 phút
RSD = 0,12%

Hệ số bất đối xứng

1,26

Số đĩa lý thuyết

3.600

Kết quả cho thấy hệ thống sắc ký tương
thích với mẫu phân tích với RSD của diện
tích pic và thời gian lưu đều < 1%.
2. Tính đặc hiệu.
Sử dụng detector PDA để đánh giá tính
đặc hiệu của phương pháp tại thời gian
lưu píc trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và
mẫu thử, xác định phổ UV-VIS. Kết quả
cho thấy: phổ của hai píc giống nhau về
hình dạng và số đỉnh hấp thụ cực đại,
chứng tỏ phương pháp có tính đặc hiệu cao.
3. Khoảng tuyến tính.
Để khảo sát khoảng tuyến tính của
phương pháp, chúng tôi tiến hành pha
một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ
2,40; 6,0; 12,0; 30,0; 60,0; 100,0 µg/ml.
Sau đó xác định tương quan diện tích píc
và nồng độ các dung dịch chuẩn.
Bảng 2: Sự phụ thuộc của diện tích píc
vào nồng độ adenosine chuẩn.

Hình 3: Đồ thị tương quan giữa diện tích
píc và nồng độ adenosine.
Kết quả cho thấy: trong khoảng nồng
độ khảo sát, diện tích píc và nồng độ
adenosine có tương quan tuyến tính chặt
chẽ, R2 = 0,9999.
4. Độ lặp lại.
Tiến hành xác định độ lặp lại của phương
pháp bằng cách định lượng adenosine
với 6 thí nghiệm riêng biệt theo phương
pháp đã chọn.
Bảng 3: Kết quả đánh giá độ lặp lại của
phương pháp.
Lƣợng
Lƣợng
Thứ
Đông trùng adenosine
tự
hạ thảo (g)
(mg)

Hàm
lƣợng
(%)

1

2,0001

11,70

0,585

Nồng độ (µg/ml)

Diện tích (mAUx min)

2

2,9992

17,13

0,571

100,00

6674247

3

2,0024

11,53

0,576

60,00

3978562

4

2,0015

11,65

0,582

30,00

1989281

5

2,0016

11,69

0,584

12,00

796987

6,00

398494

6

2,0023

11,57

0,578

2,40

160345
2

y = 66682 x - 5338 với R = 0,9999

Thống kê

Xtb = 0,579%
RSD = 0,92%

Kết quả cho thấy: phương pháp định
lượng có độ lặp lại tốt với RSD = 0,92%.
21


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015

- Độ đúng.
Xác định độ đúng của phương pháp
bằng phương pháp thêm chuẩn.
+ Dung dịch chuẩn gốc: hút chính xác

1 ml dung dịch chuẩn (dung dịch A), hòa
loãng vào bình định mức 50 ml bằng
methanol, lắc kỹ (dung dịch B).
+ Dung dịch thử gốc: tiến hành chuẩn
bị như phần dung dịch thử.
+ Dung dịch hỗn hợp: hút chính xác
5 ml dung dịch thử gốc cho vào bình định
mức 10 ml, thêm dung dịch chuẩn gốc
(dung dịch B) vừa đủ tới vạch, lắc đều.
Lọc dung dịch được qua màng 0,45 µm,
sau đó, dung dịch được phân tích sắc ký.
Tiến hành đo HPLC với điều kiện đã
nêu trên, lặp lại thực nghiệm với 5 dung
dịch thử khác nhau.
Bảng 4: Kết quả khảo sát độ đúng.
Thứ
tự

Lƣợng thêm
vào (µg)

Lƣợng thu hồi
(µg)

Tỷ lệ (%)
thu hồi

1

60,00

58,91

98,18

2

60,00

59,23

98,72

3

60,00

59,52

99,20

4

60,00

60,64

101,07

5

60,00

59,43

99,05

Thống kê

Tỷ lệ (%) thu hồi tb = 99,24%;
RSD = 1,10%

Phương pháp định lượng có độ đúng
cao với tỷ lệ (%) thu hồi từ 98,18 - 101,07%;
RSD = 1,10%.
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng dưới:
22

+ Nồng độ mẫu thử khoảng 0,8 µg/ml
là giới hạn phát hiện. Tại nồng độ này,
đáp ứng píc mẫu thử có diện tích gấp
hơn 3 lần diện tích đáp ứng của mẫu trắng.
+ Nồng độ mẫu thử khoảng 2,4 µg/ml
là giới hạn định lượng dưới. Tại nồng độ
này, đáp ứng píc mẫu thử có diện tích
gấp hơn 10 lần diện tích đáp ứng của
mẫu trắng với độ đúng và độ lặp lại ở
mức có thể chấp nhận khi tiến hành phân
tích ở nồng độ này.

KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã xây dựng được phương
pháp định lượng adenosine trong Đông
trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC với
điều kiện sắc ký: cột Phenomenex Genimi
RP-C18; pha động: acetonitrile: đệm
phosphate pH6,5 (8:92); detector: UV tại
bước sóng 259 nm. Phương pháp định
lượng này có sự tương quan tuyến tính
chặt chẽ giữa diện tích píc và nồng độ
adenosine trong khoảng nồng độ khảo sát
với R2 = 0,9999; độ lặp lại (RSD = 0,92%)
và độ đúng (98,18 - 101,07%). Thời gian
phân tích một mẫu bằng HPLC là phù hợp
(khoảng 15 phút).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Zhu JS, Halpern GM, Johns K. The
scientific rediscovery of an ancient Chinese
herbal medicine: Cordyceps sinensis: Part I;
J Alt Comp Med. 1998, 4, pp.289-303.
2. Zhu JS, Halpern GM, Johns K. The
scientific rediscovery of an ancient Chinese
herbal medicine: Cordyceps sinensis: Part II;
J Alt Comp Med. 1998, 4, pp.429-457.


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015
3. SP Li, FQ. Yang, Karl WK. Tsim. Quality
control of Cordyceps sinensis, a valued traditional
Chinese medicine, Journal of Pharmaceutical

and Biomedical Analysis. 2006, 41, pp.15711584.
4. Ashok Kumar Panda, Kailash Chandra
Swain. Traditional uses and medicinal
potential of Cordyceps sinensis of Sikkim,
J Ayurveda Integr Med. 2011, Jan-Mar, 2 (1),
pp.9-13.
5. The Pharmacopoeia Commission of
PRC (Eds.). Pharmacopoeia of the People’s

Republic of China, Chemical Industry Publishing
House, Beijing. 2005.
6. Corradetti R, Lo Conte G, Moroni F,
Passani MB, Pepeu G. Adenosine decreases
aspartate and glutamate release from rat
hippocampal slices. Eur J Pharmacol. 1984,
Sep 3, 104 (1-2), pp.190-126.
7. C Schmidt, M C Bellingham, D W Richter.
Adenosinergic modulation of respiratory
neurones and hypoxic responses in the
anaesthetized cat. J Physiol. 1995, Mar 15,
483 (Pt 3), pp.769-778.

23