Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất anthraquinon và stilben trong Đại hoàng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT
ANTHRAQUINON VÀ STILBEN TRONG ĐẠI HOÀNG
BẰNG SẮC Kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Văn Long*; Chử Văn Mến*
Nguyễn Thị Thanh Hương*; Phạm Thị Thanh Hương*
TÓM TẮT
Nghiên cứu đã tiến hành định lƣợng đƣợc một số hoạt chất anthraquinon và stilben trong
Đại hoàng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 5 hoạt chất đƣợc định lƣợng
gồm: 4 hoạt chất là dẫn xuất anthraquinon: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside và
sennoside A và 1 hoạt chất nhóm stilben là rhaponticin đƣợc định lƣợng trong nghiên cứu này.
Tiến hành phân tách trên cột pha đảo C18 với chƣơng trình gradient sử dụng dung môi A (dung
dịch 0,05 M axít phosphoric trong nƣớc) và dung môi B (acetonitrile), bƣớc sóng 280 nm, tốc độ
dòng 1,0 ml/phút. Chƣơng trình rửa giải gồm: 0 - 5 phút (20% B); 18 phút (28% B); 25 phút
(42% B); 30 phút (100% B) cho kết quả tách tốt. Thẩm định phƣơng pháp cho kết quả độ tuyến
tính cao (r > 0,9995) và độ thu hồi trong khoảng 98,0 - 102,6%. Giới hạn định lƣợng trong khoảng
0,05 - 0,28 μg/ml. Phƣơng pháp trên đƣợc áp dụng để phân tích 31 mẫu Đại hoàng gồm nhiều loài
khác nhau. Kết quả: hàm lƣợng hoạt chất biến động nhiều trong các mẫu, hàm lƣợng của
sennoside, rhaponticin, emodin- glucoside, emodin và chrysophanol tƣơng ứng là: 2,53 ± 4,26;
16,40 ± 29,50; 0,58 ± 0,48; 0,93 ± 0,83 và 3,72 ± 2,97 mg/g.
* Từ khóa: Đại hoàng; Sắc ký lỏng hiệu năng cao.

STUDY ON THE QUANTITATION OF SOME ANTHRAQUINONE
AND STILBENE COMPOUNDS IN RHEI RHIZOMA BY HPLC
summary
We quantitated some anthraquinone and stilben active compounds in Rhei Rhizoma using high
performance liquid chromatography. Five bioactive compounds were quantitated including 4
anthraquinone: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside and sennoside A and 1 stilbene compound:
rhaponticin. The chromatographic separation was performed on a C18 column by gradient elution
with 0.05 M phosphoric acid in water and acetonitrile, the wavelength was set at 280 nm, the

flow rate was set at 1 ml/min, gradient condition as followed: 0 - 5 min (20% B); 18 min (28% B);
25 min (42% B); 30 min (100% B) gave the satisfied separation. The methodological validation
gave acceptable linearities (r > 0.9995) and recoveries (ranging from 98.0 - 102.6%). The limits
of detection (LOD) of these compounds ranged from 0.05 to 0.28 μg/ml. The developed method
was applied to the quantitation of 31 samples of different Rhei Rhizoma species. The results
showed that the contents of bioactive compounds were fluctuated among samples, the contents
of sennoside, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin and chrysophanol: 2.53 ± 4.26, 16.40 ±
29.50; 0.58 ± 0.48, 0.93 ± 0.83 and 3.72 ± 2.79 mg/g, respectively.
* Key words: Rhei Rhizoma; HPLC.
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến ()
Ngày nhận bài: 20/03/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/04/2014
Ngày bài báo được đăng: 15/04/2014

7


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đại hoàng (Rhei Rhizoma) là một nhóm
loài trong chi, Rheum thuộc họ rau Răm
(Polygonaceae). Có 3 loài của chi Rheum
đƣợc chính thức công nhận trong Dƣợc
điển Việt Nam, Hàn Quốc và Trung Quốc là
R. tanguticum, R. palmatum và R. officinale
[1, 2, 3]. Theo Dƣợc điển Nhật Bản, ngoài
3 loài trên, ngƣời ta còn công nhận thêm
Rheum coreanum và những loài lai giữa
các loài trên là dƣợc liệu Đại hoàng [4].

Ngoài ra, các loài không chính thức nhƣ
Rheum undulatum, Rheum rhaponticum,
Rumex crispus, Rumex aquatica và
Reynoutria elliptica cũng thƣờng bị sử
dụng nhầm nhƣ là Đại hoàng. Trong một
số trƣờng hợp, việc xác định loài dựa trên
phân tích mô học giữa các loài của mẫu
Đại hoàng trên thị trƣờng cực kỳ khó
khăn. Các nhà nghiên cứu và thầy thuốc

đông y thƣờng bị nhầm lẫn bởi sự không
rõ ràng của nhiều loài trong sử dụng
dƣợc liệu Đại hoàng. Do vậy, đánh giá
chất lƣợng Đại hoàng dựa trên thành
phần hoạt chất đóng vai trò rất quan trọng
trong kiểm soát chất lƣợng của dƣợc liệu
Đại hoàng.
Dƣợc liệu Đại hoàng có nhiều hoạt chất
có tác dụng nhuận tràng, lợi mật, bảo vệ
gan, kháng virut, kháng viêm, chống ung
thƣ... [5, 6, 7]. Đó là các anthraquinone nhƣ:
chrysophanol, emodin [8], dianthrone
nhƣ sennoside A [9] hay stilbene nhƣ
rhaponticin [10]. Trong nghiên cứu này,
phƣơng pháp HPLC đƣợc phát triển và
thẩm định để phân tích 5 hoạt chất là
chrysophanol, emodin, emodin-glucoside,
rhaponticin và sennoside A (hình 1), làm
cơ sở để định lƣợng các hoạt chất sinh
học trong 31 mẫu Đại hoàng từ nhiều

nguồn gốc khác nhau.

Hình 1: Cấu trúc hóa học của các hoạt chất chính trong Đại hoàng: 1. Sennoside A,
2. Rhaponticin, 3. Emodin-glucoside, 4. Emodin, 5. Chrysophanol.
8


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Hóa chất và thiết bị.
- Hóa chất và nguyên liệu:
+ Hóa chất: chất chuẩn chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin và
sennoside A đƣợc GS. Bae Ki Hwan, Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Chung Nam, Hàn
Quốc cung cấp. Xác định độ tinh khiết bằng HPLC và khẳng định lại bằng sắc ký lỏng
khối phổ; chuẩn nội (eugenol), acetonitrile, methanol, nƣớc cất, axit phosphoric đạt tiêu
chuẩn cho HPLC, các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích.
+ Mẫu Đại hoàng đƣợc thu hái từ nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc và Hàn
Quốc (bảng 1), mẫu đƣợc GS. Jae Hyun Lee, Khoa Y học Cổ truyền, Đại học Dong
Guk thẩm định và lƣu trữ tại Khoa Dƣợc, Đại học Quốc gia Chung Nam, Hàn Quốc.
- Thiết bị: máy HPLC Shimadzu gồm bơm LC-20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ
thống tiêm mẫu tự động SIL-20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A (Shimadzu, Japan). Thực
hiện phân tích trên cột C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm, Optimapak, RStech Corp, Korea).
Bảng 1: Danh mục mẫu sử dụng trong nghiên cứu.
TÊN

KÝ HIỆU

TÊN

KHOA HỌC

MẪU

KHOA HỌC

09B1001

R. tanguticum

09B1012

R. officinale

09B1026

R. tanguticum

09B1002

R. palmatum

09B1013

R. palmatum

09B1027

R. tanguticum

09B1003

R. palmatum

09B1014

R. undulatum

09B1028

R. palmatum

09B1004

R. palmatum

09B1015

R. undulatum

09B1029

R. officinale

09B1005

R. palmatum

09B1016

R. undulatum

09B1030

R. undulatum

09B1006

R. tanguticum

09B1017

R. undulatum

09B2038

R. undulatum

09B1007

R. tanguticum

09B1021

R. palmatum

09B2039

R. undulatum

09B1008

R. tanguticum

09B1022

R. tanguticum

09B2041

R. undulatum

09B1009

R. officinale

09B1023

R. tanguticum

09B2042

R. undulatum

09B1010

R. officinale

09B1024

R. tanguticum

09B1011

R. officinale

09B1025

R. tanguticum

KÝ HIỆU MẪU

KÝ HIỆU MẪU

TÊN
KHOA HỌC

2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
- Điều kiện sắc ký:
Cột: cột phân tích pha đảo Optimapak C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) của Công ty
RS Tech (Hàn Quốc); bƣớc sóng phát hiện 280 nm; pha động: dung môi A: dung dịch
axít phosphoric 0,05 M trong nƣớc; dung môi B: acetonitrile; tốc độ dòng 1 ml/phút, thể
tích tiêm 10 μl.
9


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014

Với chƣơng trình rửa giải:
THỜI GIAN (phút)

%A

%B

05

80

20

5 18

80  72

20  28

18  25

72  58

28  42

25  30

58  0

42  100

30  35

0  80

100  20

35  40

80

20

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử:
+ Nội chuẩn (IS): dung dịch eugenol
nồng độ 1.000 µg/ml trong methanol.
+ Mẫu chuẩn: dãy các dung dịch
chuẩn nồng độ chính xác chrysophanol
(từ 2 - 200 µg/ml), emodin (1 - 100 µg/ml),
emodin-glucoside (0,5 - 50 µg/ml),
rhaponticin (2 - 200 µg/ml) và sennoside
A (0,5 - 50 µg/ml) trong dung dịch chuẩn
nội eugenol (200 µg/ml) trong methanol.
+ Mẫu thử: cân chính xác 100 mg bột
dƣợc liệu Đại hoàng, cho vào bình định
mức 10 ml. Thêm khoảng 9 ml ethanol
70% và 200 μl dung dịch chuẩn nội, bổ
sung ethanol 70% vừa đủ, cân, lắc siêu
âm 60 phút, cân lại, bổ sung khối lƣợng
mất bằng ethanol 70%, ly tâm, gạn lấy
lớp trên, lọc qua màng lọc 0,45 μm.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ

BÀN LUẬN
Với điều kiện sắc ký và phƣơng pháp
xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu
đƣợc cho các píc tách rõ ràng, nhiễu nền
thấp thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu thử
Đại hoàng và hỗn hợp chuẩn. Trên sắc

ký đồ, mẫu thử có thời gian lƣu trùng với
thời gian lƣu của píc sennoside A,
rhaponticin, emodin-glucoside, emodin,
chrysophanol trong sắc ký đồ của mẫu
chuẩn lần lƣợt là 12,25; 13,35; 17,56;
34,42; 36,06 phút (hình 2). Tại thời gian
lƣu píc sennoside A, rhaponticin,
emodin-glucoside, emodin, chrysophanol
trên các sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn,
so sánh phổ hấp thụ UV thu đƣợc của
píc, kết quả: phổ mẫu thử và mẫu chuẩn
trùng khít lên nhau với hệ số phù hợp lần
lƣợt 0,9997; 0,9996; 0,9998; 0,9992 và
0,9994. Chứng tỏ: píc thu đƣợc trên sắc
ký đồ của mẫu thử tinh khiết và các
thành phần khác có trong mẫu thử không
ảnh hƣởng đến quá trình phân tích 5
chất đối chiếu sennoside A, rhaponticin,
emodin-glucoside,emodin, chrysophanol.
Kết quả trên cho phép tiến hành định
tính, định lƣợng.
- Tính thích hợp của hệ thống sắc ký:
để đánh giá tính thích hợp của hệ thống

sắc ký, pha mẫu chuẩn theo chỉ dẫn ở
trên. Tiêm 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống
HPLC, tiến hành sắc ký với điều kiện đã
chọn.
10


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014

Bảng 2: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống.
RSD CỦA THỜI
GIAN LƢU

RSD CỦA
DIỆN TÍCH PÍC

SỐ ĐĨA LÝ THUYẾT
TRUNG BÌNH

HỆ SỐ BẤT ĐỐI
TRUNG BÌNH (T)

Sennoside A

0,12

0,11

12340

1,10

Rhaponticin

0,14

0,15

13260

1,07

Emodin-glucoside

0,16

0,17

14580

1,11

Emodin

0,18

0,20

14620

1,08

Chrysophanol

0,19

0,22

15146

1,06

HOẠT CHẤT

Các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng phù hợp và đảm bảo
ổn định cho phép phân tích định lƣợng sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside,
emodin, chrysophanol.

Hình 2: Sắc ký đồ và so sánh phổ của mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b, c): (1): sennoside
A; (2): rhaponticin; (3): emodin-glucoside (4): emodin; (5): chrysophanol.
- Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng:

11


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014

Tiêm 6 dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau (từ 0,5 - 200 μg/ml), tiến hành
sắc ký nhƣ điều kiện đã mô tả.
Bảng 3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng.

NỒNG ĐỘ (g/ml)

PHƢƠNG TRÌNH HỒI QUY

r

LOD (g/ml)

LOQ (g/ml)

Sennoside A

0,9 - 50

Y = 0,0023 X - 0,0066

1,0000

0,28

0,94

Rhaponticin

2,0 - 200

Y = 0,0066 X - 0,0039

0,9998

0,15

0,50

Emodin-glucoside

0,5 - 50

Y = 0,0211 X - 0,0045

0,9997

0,05

0,15

Emodin

1,0 - 100

Y = 0,0155 X - 0,0069

0,9997

0,06

0,20

Chrysophanol

2,0 - 200

Y = 0,0061 X - 0,0055

0,9996

0,16

0,50

CHẤT CHUẨN

Với khoảng nồng độ của sennoside A từ 0,9 - 50 μg/ml, rhaponticin từ 2,0 - 200
μg/ml, emodin-glucoside từ 0,5 - 50 μg/ml, emodin từ 1,0 - 100 μg/ml, chrysophanol từ
2,0 - 200 μg/ml, có sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích píc
chuẩn/chuẩn nội tƣơng ứng.
Từ phƣơng trình tuyến tính của sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin,
chrysophanol, cho phép xác định giới hạn phát hiện của các chất lần lƣợt 0,28; 0,15;
0,05, 0,06 và 0,16 µg/ml, giới hạn định lƣợng của từng chất tƣơng ứng với từng chất
lần lƣợt 0,94; 0,50; 0,15; 0,20 và 0,50 µg/ml.
- Kết quả phân tích định lƣợng các hoạt chất trong mẫu dƣợc liệu Đại hoàng:
Kết quả khảo sát hàm lƣợng sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin,
chrysophanol có trong 31 mẫu Đại hoàng (hình 3) cho thấy: hàm lƣợng cao nhất của
sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol là 16,31; 94,41; 1,81;
3,11 và 12,64 mg/g trong dƣợc liệu khô. Sennoside A chỉ phát hiện đƣợc trong các
mẫu Đại hoàng thật gồm 3 loài R. tanguticum, R. palamtum và R. officinale; rhaponticin
chỉ phát hiện đƣợc trong các mẫu R. undulatum. Hàm lƣợng hoạt chất chính trong các
mẫu Đại hoàng biến động nhiều trong tất cả các mẫu.

12

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014

Hình 3: Kết quả phân tích hàm lƣợng hoạt chất trong các mẫu Đại hoàng.
KẾT LUẬN
Phƣơng pháp HPLC đơn giản, hiệu
quả đã đƣợc phát triển và thẩm định cho
việc định lƣợng đồng thời 5 hoạt chất
trong dƣợc liệu Đại hoàng. Kết quả cho
thấy hàm lƣợng các hoạt chất biến động
nhiều trong mẫu, hàm lƣợng của sennoside,
rhaponticin, emodin-glucoside, emodin và
chrysophanol tƣơng ứng 2,53 ± 4,26;
16,40 ± 29,50; 0,58 ± 0,48; 0,93 ± 0,83 và
3,72 ± 2,79 mg/g.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dƣợc điển Việt Nam IV. 2010.

from Ventilago leiocarpa. The American
Journal of Chinese Medicine. 1996, 24,
pp.139-142.
7. Kang SC, Lee CM, Choung ES, Bak JP,
Bae JJ, Yoo HS, Kwak JH, Zee OP. Antiproliferative effects of estrogen receptor modulating
compounds isolated from Rheum palmatum.
Archives Pharmaceutical Researches. 2008, 31,
pp.722-726.
8. Kashiwada Y, Nonaka GI, Nishioka I.
Studies on Rhubarb (Rhei Rhizoma). XV.
Simultaneous determination of phenolic constituents

by high-performance liquid chromatography.
Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 1989, 37,
pp.999-1004.

4. The Japanese Pharmacopoeia. 2001.

9. Komatsu K, Nagayama Y, Tanaka K,
Ling Y, Cai SQ, Omote T, Meselhy MR.
Comparative study of chemical constituents of
rhubarb from different origins. Chemical &
Pharmaceutical Bulletin. 2006, 54, pp.1491-1499.

5. Li Z, Li LJ, Sun Y, Li J. Identification of
natural compounds with anti-hepatitis B virus
activity from Rheum palmatum L. ethanol extract.
Chemotherapy. 2007, 53, pp.320-326.

10. Hu C, Ye S, Zhao L, Wang J. Effects of five
stilbene compounds on NO mediated vasodilation
and their structure-activity relationship. Zhongguo
Yiyuan Yaoxue Zazhi. 2006, 26, pp.826-829.

2. Pharmacopoeia of the People's Republic
of China. 2005.
3. Korean Pharmacopoeia. 2007.

6. Chang CH, Lin CC, Yang JJ, Namba T,
Hattori M. Anti-inflammatory effects of emodin

13

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014

14