Xác định đột biến gen Kras trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện Bạch mai bằng kỹ thuật Stripassay

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN KRAS TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ
ĐẠI TRỰC TRÀNG TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI
BẰNG KỸ THUẬT STRIPASSAY
Mai Trọng Khoa*; Phạm Cẩm Phương*; Nguyễn Tiến Lung*
TÓM TẮT
Mục tiêu: xác định tình trạng đột biến gen KRAS trên bệnh nhân (BN) ung thư đại trực tràng
(UTĐTT) tại Trung tâm Y học Hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai. Phương pháp: 92
mẫu bệnh phẩm (mẫu mô sau phẫu thuật hoặc sinh thiết), chẩn đoán xác định bằng giải phẫu
bệnh là UTĐTT được xác định đột biến gen KRAS bằng kít KRAS 12/13/61 StripAssay®
(ViennaLab). Kết quả: tỷ lệ đột biến gen KRAS là 37,0% (34/92 bệnh phẩm), tập trung chủ yếu
ở codon 12 (chiếm 65,7% tổng số đột biến). Kết luận: kết quả phân tích đột biến gen KRAS trên
BN UTĐTT tại Bệnh viện Bạch Mai tương tự nhiều nghiên cứu khác tại Việt Nam và trên thế giới.
* Từ khóa: Ung thư đại trực tràng; Đột biến gen KRAS; KRAS 12/13/61 StripAssay®.

The Results of KRAS Mutation Testing in Colorectal Cancer at
Bachmai Hospital
Summary
Objectives: To determine the KRAS mutation status in colorectal cancer at Nuclear Medicine
and Oncology Center, Bachmai Hospital Hospital. Methods: 92 formalin-fixed, paraffinembedded specimens (needle biopsy and surgical specimens) of colorectal cancer patients
were tested for KRAS mutations using KRAS 12/13/61 StripAssay® (ViennaLab). Results: 34 of
92 specimens had KRAS mutations (37.0%), mutations in codon 12 were most common
(65.7%). Conclusion: The results of KRAS mutations determination in colorectal cancer in
Bachmai Hospital were similar to other studies in Vietnam and over the world.
* Key words: Colorectal cancer; KRAS mutation; KRAS 12/13/61 StripAssay®.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư đại trực tràng là một trong
những loại ung thư có tỷ lệ mắc và tử
vong cao nhất. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc

chuẩn theo tuổi là 10,1/100.000 dân,
đứng thứ sáu trong các bệnh ung thư
(theo GLOBOCAN 2012). Các phương
pháp điều trị UTĐTT bao gồm phẫu thuật,
xạ trị, hóa trị và điều trị đích, trong đó có
các kháng thể đơn dòng kháng thụ thể

yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal
growth factor receptor - EGFR). Các nghiên
cứu đã chứng minh kháng thể đơn dòng
kháng EGFR (cetuximab, panitumumab…)
có hiệu quả hơn ở BN UTĐTT không có
đột biến KRAS so với BN mang đột biến
KRAS. Vì vậy, xét nghiệm đột biến gen
KRAS có vai trò quan trọng trong chỉ định
kháng thể đơn dòng như cetuximab,
panitumumab… cho BN UTĐTT [1, 3].

* Bệnh viện Bạch Mai
Người phản hồi (Corresponding): Phạm Cẩm Phương ()
Ngày nhận bài: 04/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/09/2016
Ngày bài báo được đăng: 19/09/2016

80


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
Hiện nay có nhiều phương pháp phát

biến gen KRAS tại Đơn vị Gen Trị liệu,

hiện đột biến gen KRAS được sử dụng

Trung tâm Y học Hạt nhân và Ung bướu,

như giải trình tự gen, real-time PCR, PCR

Bệnh viện Bạch Mai.

đặc hiệu alen…. Các phương pháp này
khác nhau về độ nhạy, độ đặc hiệu, số
lượng đột biến có thể phát hiện… [3]. Từ
tháng 11 - 2014, Đơn vị Gen Trị liệu,
Trung tâm Y học Hạt nhân và Ung bướu,
Bệnh viện Bạch Mai đã áp dụng xét
nghiệm đột biến gen KRAS bằng kỹ thuật
PCR đặc hiệu alen kết hợp lai đầu dò
phân

tử

theo

kít

KRAS

12/13/61

StripAssay® (ViennaLab, Áo). Bộ kít này

có khả năng phát hiện hơn 98% các loại
đột biến của gen KRAS, bao gồm 13 đột
biến phổ biến trên các codon 12, 13 và 61
với độ nhạy cao (có khả năng xét nghiệm
chính xác khi tỷ lệ tế bào đột biến trong
mẫu xét nghiệm dưới 1%) [3]. Nghiên cứu
này thực hiện nhằm: Đánh giá tỷ lệ đột
biến gen KRAS trên BN UTĐTT tại Bệnh

2. Phương pháp nghiên cứu.
Nghiên cứu mô tả tiến cứu
- Thu thập thông tin về đặc điểm lâm
sàng, cận lâm sàng, giai đoạn bệnh của
BN theo một mẫu thu thập thông tin thống
nhất.
- Quy trình xét nghiệm: gồm 4 giai
đoạn chính
+ Tách ADN từ mô cố định formalin vùi paraffin.
+ Khuếch đại đoạn gen quan tâm bằng
phản ứng PCR.
+ Lai sản phẩm khuếch đại với đầu dò
đặc hiệu phân bố trên Teststrip.
+ Phân tích kết quả.
* Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm
SPSS 16.0.

viện Bạch Mai, giúp bác sỹ lâm sàng có
thể đưa ra phác đồ điều trị phù hợp với
từng trường hợp cụ thể.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu.
92 BN UTĐTT được chẩn đoán và
điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai từ tháng
11 - 2014 đến 5 - 2016. Các mẫu bệnh
phẩm (mẫu mô sau phẫu thuật hoặc sinh
thiết) được chẩn đoán xác định bằng giải
phẫu bệnh tại Trung tâm Giải phẫu bệnh
và Tế bào học, sau đó xét nghiệm đột

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
* Tỷ lệ phát hiện đột biến gen KRAS:
34/92 BN (37,0%) UTĐTT phát hiện có
đột biến gen KRAS, không phát hiện đột
biến 58 BN (63%). Đặc biệt, 1 BN mang
2 đột biến gen KRAS (codon 12 và
codon 13).
* Vị trí đột biến gen KRAS:
Trong tổng số các đột biến được phát
hiện ở 34 BN, đột biến trên codon 12
chiếm ưu thế với 23 BN (65,7%); codon
13: 10 BN (28,6%), chỉ có 2 BN (5,7%)
mang đột biến trên codon 61.
81


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016

Hình 1: Phân tích kết quả trên Teststrip.
Trên mỗi Teststrip có sẵn vạch control cho phản ứng lai, PCR negative control

(vạch 14 - 15) và PCR positive control (vạch 16) làm đối chứng. Các vạch 1 - 13 tương
ứng với 13 đột biến phát hiện được ở codon 12, 13 và 61. (A) Mẫu không phát hiện đột
biến. (B) Mẫu mang đột biến 12Val (p.G12V, c.35G>T). (C) Mẫu mang đồng thời 2 đột
biến: 12Asp (p.G12D, c.35G>A) và 13Asp (p.G13D, c.38G>A). (D) Mẫu mang đột biến
61Arg (p.Q61R, c.182A>G).
Bảng 1: Tương quan giữa tỷ lệ đột biến gen KRAS và độ tuổi.
Tuổi

Số lượng mẫu

Số mẫu đột biến

Tỷ lệ

> 50

74

30

40,5%

≤ 50

18

4

22,2%

Chung các nhóm

92

34

37,0%

Tỷ lệ đột biến ở nhóm tuổi < 50 (22,2%) thấp hơn so với nhóm tuổi > 50 (40,5%),
tuy nhiên khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Bảng 2: Tương quan giữa tỷ lệ đột biến gen KRAS và giới tính.
Giới tính

Số lượng mẫu

Số mẫu đột biến

Tỷ lệ

Nam

53

18

34,0%

Nữ

39

16

41,0%

Chung cả 2 giới

92

34

37,0%

Tỷ lệ nữ đột biến nhiều hơn nam (41,0% so với 34,0%), tuy nhiên sự khác biệt này
không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
82


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
Bảng 3: Tương quan giữa tỷ lệ đột biến gen KRAS và vị trí u.
Vị trí

Số lượng mẫu

Số mẫu đột biến

Tỷ lệ

Đại tràng

60

23

38,3%

Trực tràng

32

11

34,4%

Chung các nhóm

93

34

37,0%

Không có sự khác biệt về tỷ lệ đột biến gen KRAS ở đại tràng, trực tràng và tỷ lệ đột
biến chung, 23/60 (38,3%) mẫu bệnh phẩm đại tràng và 11/32 (34,4%) mẫu bệnh
phẩm trực tràng mang đột biến gen KRAS (sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê
với p > 0,05).
Bảng 4: Tương quan giữa tỷ lệ đột biến gen KRAS và loại bệnh phẩm.
Loại bệnh phẩm

Số lượng mẫu

Số mẫu đột biến

Tỷ lệ

Phẫu thuật

76

29

38,2%

Sinh thiết

16

5

31,3%

Chung các nhóm

92

34

37,0%

Tỷ lệ phát hiện đột biến KRAS trên bệnh phẩm phẫu thuật (38,2%) cao hơn so với

trên bệnh phẩm sinh thiết (31,3%), tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống
kê (p > 0,05).
BÀN LUẬN
Ở tế bào UTĐTT, các con đường tín
hiệu phụ thuộc EGFR thường được kích
hoạt. Theo con đường này, yếu tố tăng
trưởng biểu mô liên kết với EGFR, từ đó
hoạt hóa protein RAS và truyền tín hiệu
qua những con đường khác nhau: qua
RAF, MAPK để kiểm soát tăng sinh và
biệt hóa; qua PI3K, AKT, mTOR giúp tế
bào duy trì khả năng sống sót, không đi
vào chết theo chương trình… Vì vậy, một
trong những hướng điều trị UTĐTT hiệu
quả là ngăn chặn sự kết hợp giữa yếu tố
tăng trưởng và thụ thể của nó, đó chính là
cơ chế hoạt động của các kháng thể đơn
dòng như cetuximab, panitumumab….
Tuy nhiên, nếu gen KRAS bị đột biến,
protein KRAS có khả năng tự hoạt hóa,
kích thích con đường tín hiệu nội bào mà

không phụ thuộc tín hiệu từ EGFR, do đó
các thuốc kháng EGFR nếu được dùng
sẽ không có hiệu quả [3].
Nghiên cứu trên 92 BN UTĐTT, chúng
tôi thấy tỷ lệ đột biến gen KRAS là 37,0%,
tương tự với các nghiên cứu trên thế giới
và tại Việt Nam. Theo công bố năm 2011
của Ciardiello và CS, tần số đột biến

KRAS ở châu Á, châu Âu, châu Mỹ Latinh
tương ứng là 24%, 36% và 40% [6]. Các
nghiên cứu khác thống kê tỷ lệ này nhìn
chung khoảng 30 - 45% (trong đó cơ sở
dữ liệu COSMIC ghi nhận tỷ lệ 37%) [1, 2,
3, 6].
Tỷ lệ các loại đột biến cũng có sự
chênh lệch khá lớn. Theo kết quả xét
nghiệm tại Bệnh viện Bạch Mai, đột biến
tại codon 12 chiếm ưu thế (65,7%), tiếp
theo là tại codon 13 (28,6%), đột biến tại
83


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
codon 61 khá hiếm gặp (chỉ 2/92 mẫu).
Kết quả này có sự khác biệt với nghiên
cứu của Bệnh viện K, khi đột biến tại
codon 13 chiếm ưu thế (66,7%), nhưng
tương tự với hầu hết các nghiên cứu
khác trên thế giới (tỷ lệ đột biến tại codon
12 khoảng 65 - 80%, Tổ chức Nghiên cứu
Hệ gen Ung thư Mỹ công bố tỷ lệ này là
67,9%) [2, 3, 8].
Thực tế hiện nay có hơn 5.000 đột
biến điểm trên gen KRAS đã được báo
cáo, trong đó xảy ra nhất là thay thế
nucleotid codon 12 và 13 ở exon 2, các
dạng này chiếm > 95% tổng số đột biến
và có liên quan đến đáp ứng với thuốc ức

chế EGFR [3]. Các nghiên cứu gần đây
đã chứng minh vai trò của xét nghiệm
KRAS trên lâm sàng: những BN có khối u
mang đột biến gen KRAS có khả năng
đáp ứng với thuốc kháng EGFR (như
cetuximab, panitumumab) kém hơn BN
không mang đột biến KRAS [2, 3]. Ngoài
ra, một số nghiên cứu cho thấy đột biến
tại codon 61 (exon 3) và 146 (exon 4)
mặc dù chiếm tỷ lệ nhỏ nhưng cũng làm
tế bào không đáp ứng với thuốc ức chế
EGFR [5]. Vì vậy, xét nghiệm đột biến gen
KRAS thực sự cần thiết để bác sỹ lâm
sàng quyết định lựa chọn thuốc cho BN.
Về mối tương quan giữa tỷ lệ đột biến
gen KRAS và các chỉ số sinh học, nhiều
báo cáo đã chỉ ra mối liên hệ nhất định
giữa tỷ lệ đột biến với tuổi (thường gặp ở
tuổi trên 50) và giới tính (ở nữ cao hơn
nam) [8]. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ đột
biến gen KRAS ở BN > 50 tuổi cao hơn
gần 2 lần so với độ tuổi < 50, gặp nhiều ở
nữ, tỷ lệ này không khác biệt theo vị trí u,
không có ý nghĩa thống kê. So với các
báo cáo khác tại Việt Nam, kết quả này
khá tương đồng [7].
84

Về kỹ thuật phát hiện, chúng tôi sử
dụng kít KRAS 12/13/61 StripAssay®

(ViennaLab) để phân tích đột biến gen
KRAS. Đây là kít được thiết kế theo
nguyên tắc PCR đặc hiệu alen kết hợp lai
đầu dò phân tử: giai đoạn PCR sử dụng
mồi đặc hiệu (có gắn biotin) giúp khuếch
đại chính xác với các trình tự gen quan
tâm. Ở giai đoạn lai, những đoạn ADN
được khuếch đại kết hợp chính xác với
đầu dò tương ứng trên Teststrip, phân tử
biotin trên những đoạn này được hoạt
hoá bởi streptavidin thành dạng phát
màu. Nhờ đó, dễ dàng phát hiện kết quả
bằng cách so màu trên Teststrip, đối
chiếu với thang chuẩn bằng mắt thường
hoặc phần mềm StripAssay® Evaluator.
Bộ kít có khả năng phát hiện 13 đột biến
chiếm tỷ lệ cao nhất (phát hiện > 98%
tổng tỷ lệ các loại đột biến), có khả năng
phát hiện khi số lượng tế bào mang đột
biến < 1%, đồng thời đã được cấp chứng
chỉ tiêu chuẩn xét nghiệm châu Âu áp
dụng cho chẩn đoán bệnh (European
Conformity - In Vitro Diagnostics, CE-IVD).
Hiện nay, có nhiều phương pháp khác
nhau để xét nghiệm đột biến gen KRAS
như giải trình tự gen (giải trình tự Sanger
hoặc pyrosequencing), real time PCR
(tiêu biểu là kít Therascreen - Qiagen), lai
đầu dò (tiêu biểu là kít StripAssay ViennaLab)… Phương pháp sử dụng kít
StripAssay tại Đơn vị Gen Trị liệu, Bệnh

viện Bạch Mai có một số ưu điểm hơn
các phương pháp khác: độ đặc hiệu và
độ nhạy cao, thời gian thực hiện xét
nghiệm ngắn, không đòi hỏi các thiết bị
chuyên dụng như hệ thống giải trình tự
hay real time PCR, đã được cấp chứng
chỉ CE-IVD [5, 8]. Hiện nay, chúng tôi đã
chuyển sang sử dụng kít KRAS XL


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
StripAssay® được cải tiến từ kít KRAS
12/13/61 StripAssay®, trong đó số lượng
đột biến được phát hiện cao hơn (29 đột
biến trên các codon 12, 13, 59, 60, 61,
117 và 146 của gen KRAS) để nâng cao
hơn chất lượng xét nghiệm.
KẾT LUẬN
Kết quả phân tích đột biến gen KRAS
trên 61 BN UTĐTT tại Bệnh viện Bạch
Mai theo kít KRAS 12/13/61 StripAssay®
cho thấy tỷ lệ đột biến gen KRAS là
37,0%, trong đó đột biến ở codon 12
chiếm tỷ lệ cao nhất (65,7% tổng số đột
biến), đột biến ở codon 61 tương đối ít
gặp (5,7%). Kết quả này bổ sung thêm dữ
liệu về phân tích trạng thái đột biến gen
KRAS trên BN UTĐTT tại Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO

4. Sarasqueta AF, Moerland E et al.
SNaPshot and StripAssay as valuable
alternatives to direct sequencing for KRAS
mutation detection in colon cancer routine
diagnostics. The Journal of Molecular Diagnostics.
2011, 13 (2), pp.199-205.
5. Loupakis F, Ruzzo A et al. KRAS codon
61, 146 and BRAF mutations predict resistance
to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon
12 and 13 wild-type metastatic colorectal
cancer. British Journal of Cancer. 2009, 101,
pp.715-721.
6. Parsons BL, Myers MB. Personalized
cancer treatment and the myth of KRAS wildtype colon tumors. Discovery Medicine. 2013,
15 (83), pp.259-267.
7. Ciardiello F, Tejpar S, Normanno N,
Mercadante D, Teague T, Wohlschlegel B,
van Cutsem E. Uptake of KRAS mutation
testing in patients with metastatic colorectal
cancer in Europe, Latin America and Asia.
Targeted Oncology. 2011, 6, pp.133-145.

1. Nguyễn Kiến Dụ, Trần Vân Khánh và
CS. Phát hiện đột biến gen KRAS và bước
đầu đánh giá hiệu quả điều trị đích ở BN
UTĐTT. Tạp chí Y học Việt Nam. 2013, 405
(2), tr.37-41.

8. Rosty C, Young JP et al. Colorectal
carcinomas with KRAS mutation are associated

with distinctive morphological and molecular
features. Modern Pathology. 2013, 26 (6),
pp.825-834.

2. Vương Diệu Linh, Nguyễn Ngọc Quang,
Nguyễn Phi Hùng. Phân tích đột biến gen Kras trên BN UTĐTT bằng kỹ thuật giải trình tự
tự động. Tạp chí Ung thư học. 2014, 4, tr.138-143.

9. Jancik S, Drabek J et al. A comparison
of direct sequencing, pyrosequencing, high
resolution melting analysis, TheraScreen DxS,
and the K-ras StripAssay for detecting KRAS
mutations in non small cell lung carcinomas.
Journal of Experimental & Clinical Cancer
Research. 2012, 31, pp.79-91.

3. Tan C and Du X. KRAS mutation testing
in metastatic colorectal cancer. World Journal
of Gastroenterology. 2012, 18 (37), pp.5171-5180.

85