Ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP xác định các LOCI HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học Thành phố Hồ Chí Minh

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-SSP XÁC ĐỊNH CÁC LOCI HLA-A, -B, -C, DRB1, -DRB3/4/5 VÀ –DQB1 TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Hoàng Thị Tuệ Ngọc*, Phan Nguyễn Thanh Vân*, Huỳnh Thị Thu Hương*, Phạm Thị Kim Ngân*,
Lê Thanh Trúc*, Nguyễn Tấn Bỉnh**

TÓM TẮT
Mục tiêu: Xác định kháng nguyên HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1 ở người cho và người
nhận tế bào gốc tại Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh.
Phương pháp: Định type HLA ở 203 đối tượng nhờ kỹ thuật polymerase chain reaction-sequence specific
primers (PCR-SSP)
Kết quả: Tổng cộng có 14 họ allele HLA-A, 25 HLA-B, 12 HLA-C, 13 HLA-DRB1, 3 HLA-DRB3, 1 HLADRB1, 2 HLA-DRB5 và 6 HLA-DQB1 được tìm thấy. Các họ alen HLA-A*11, A*02, A*24, B*15, B*46, B*07,
Cw*07, Cw*08, Cw*01, DRB1*12, DRB1*09, DRB3*03, DRB3*02, DRB4*01, DRB5*01, DQB1*03 và
DQB1*05 chiếm ưu thế trong nghiên cứu.
Kết luận: Kết quả của nghiên cứu cho thấy việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP để định danh HLA đã đáp
ứng được nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu tại BVTMHH.
Từ khóa: PCR-SSP, hệ thống kháng nguyên bạch cầu người (HLA).

ABSTRACT
APPLICATION OF THE PCR-SSP FOR IDENTIFYING THE HLA-A, -B -C, -DRB1, -DRB3/4/5 AND –
DQB1 LOCI AT THE BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL - HO CHI MINH CITY
Hoang Thi Tue Ngoc, Phan Nguyen Thanh Van, Huynh Thi Thu Huong, Pham Thi Kim Ngan,
Le Thanh Truc, Nguyen Tan Binh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 488 - 492
Objective: To determine the HLA –A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 and –DQB1 in the donors-recipients in
the Blood Transfusion Hematology Hospital - Ho Chi Minh City.
Methods: The HLA typing in 203 subjects was studied using the polymerase chain reaction-sequence
specific primers (PCR-SSP).
Results: A total of 14 HLA-A, 25 HLA-B, 12 HLA-C, 13 HLA-DRB1, 3 HLA-DRB3, 1 HLA-DRB1, 2

HLA-DRB5 and 6 HLA-DQB1 alleles were found. HLA-A*11, A*02, A*24, B*15, B*46, B*07, Cw*07, Cw*08,
Cw*01, DRB1*12, DRB1*09, DRB3*03, DRB3*02, DRB4*01, DRB5*01, DQB1*03 and DQB1*05 were
predominant in this study.
Conclusion:Our study showed the application of the PCR-SSP for identifying of the HLA alleles was
responded to the hematopoietic stem cell transplatation at the Blood Transfusion Hematology Hospital - Ho Chi
Minh City.
Keywords: polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP), human leukocyte antigen
system (HLA).
* Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh
** Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch
Tác giả liên lạc: ThS.BS. Phan Nguyễn Thanh Vân
ĐT: 091.691.770

488

Email:

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hệ thống kháng nguyên bạch cầu (HLA human leukocyte antigen system) là tên gọi của
phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (major
histocompatibility complex - MHC) ở người. Hệ
miễn dịch dùng các kháng nguyên HLA là yếu
tố chính để xác định kháng nguyên phù hợp với
cơ thể. Vì vậy hệ thống HLA là hàng rào chính
của sự thải ghép, chỉ sau hệ kháng nguyên
ABO(1,2). Các kháng nguyên HLA có vai trò quan

trọng trong ghép cơ quan và được nhiều nghiên
cứu quan tâm là các kháng nguyên HLA-A,
HLA-B, HLA-C (HLA lớp I) và các kháng
nguyên HLA-DR, HLA-DQ (HLA lớp II).
HLA là một trong những hệ thống có kiểu
gen phức tạp và đa dạng nhất. Kết quả của sự
đa hình này là hai cá thể không có quan hệ
huyết thống với nhau có tỷ lệ tương đồng trên
tất cả các locus quy định HLA là rất thấp(1). Như
vậy, việc xác định kiểu gen HLA là rất có ý
nghĩa nhằm tìm ra người hiến tạng có tương
đồng về HLA với người nhận, góp phần quan
trọng vào sự thành công của các trường hợp
ghép tạng. Do kháng nguyên HLA là những
kháng nguyên đồng trội nên ở mỗi cá thể có sự
biểu lộ cả 2 kháng nguyên tại mỗi locus (A, B,
DR, …). Các kháng nguyên này có thể được
định danh bằng các phương pháp định type và
sự hiện diện của kháng nguyên này không ảnh
hưởng gì đến việc định danh các kháng nguyên
khác(2,6).
Có rất nhiều phương pháp định danh HLA.
Trước đây các tính đặc thù của HLA được xác
định bằng huyết thanh học nhưng từ khi
phương pháp PCR ra đời, các kỹ thuật định
danh HLA đã có những tiến bộ đáng kể. Ngày
nay, có rất nhiều kỹ thuật dựa trên PCR được
phát triển cho mục đích định danh HLA, ví dụ
như: PCR-SSO (polymerase chain reaction sequence specific oligonucleotides), PCR-SBT
(polymerase chain reaction - sequence-based

typing), PCR-SSP (polymerase chain reactionsequence specific primers)… Các phương pháp
này có độ chính xác cao cũng như có tính khả

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học

Nghiên cứu Y học

thi và dễ dàng chuẩn hóa quy trình hơn là
phương pháp định type cổ điển bằng huyết
thanh học nên ngày càng được ưu tiên lựa
chọn(7).
Để phục vụ cho công tác ghép tế bào gốc tạo
máu tại Thành Phố Hồ Chí Minh, Bệnh Viện
Truyền Máu Huyết Học (BVTMHH) đã triển
khai kỹ thuật PCR-SSP trong việc định danh
HLA-A, -B, - DR từ năm 2004 và sau đó mở rộng
thêm với việc định danh HLA-C, -DQB1 kể từ
giữa năm 2010. Trong nghiên cứu này, chúng tôi
trình bày kết quả của việc ứng dụng kỹ thuật
PCR-SSP để xác định các loci HLA-A, -B, -C, DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1 tại BVTMHH trong
khoảng thời gian từ tháng 06/2010 đến tháng
07/2011.

ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu mô tả tiến cứu được thực hiện
từ tháng 06/2010 đến tháng 07/2011 tại
BVTMHH trên mẫu máu ngoại vi của 203
người, bao gồm các bệnh nhân có chỉ định
ghép tế bào gốc tạo máu và thân nhân là
người cho tế bào gốc dự kiến.

Mẫu máu ngoại vi của các đối tượng nghiên
cứu được thu thập trong ống chống đông bằng
EDTA, sau đó được chuyển ngay đến bộ phận
HLA, Khoa Miễn Dịch, BVTMHH để ly trích
DNA trong ngày. DNA toàn phần được ly trích
từ 200 L máu bằng QIAamp Blood Mini Kit của
công ty Qiagen theo quy trình do công ty cung
cấp. DNA sau khi ly trích có độ tinh sạch từ 1,6 1,9 OD, có thể được dùng để thực hiện PCR
ngay hoặc được trữ ở -20oC cho đến khi sử
dụng.
Xác định HLA được thực hiện bằng kỹ thuật
PCR-SSP với bộ xét nghiệm Micro SSPTM của
công ty One Lamda. Tất cả các trường hợp đều
bắt đầu bằng 3 xét nghiệm loại tổng quát
(Generic) là (1) Micro SSP TM HLA Class I and II
ABDR DNA Typing Tray; (2) Micro SSP TM HLA
Class I C Locus Specific và (3) Micro SSP TM HLA
Class II Typing Tray DQB1 only. Dựa vào kết
quả phân tích các loci HLA-A, -B, -C, -DRB1, DRB3/4/5, -DQB1 từ các 3 xét nghiệm loại tổng

489


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

quát (Generic) trên, tùy từng trường hợp mà sử
dụng thêm các xét nghiệm loại đặc hiệu cho
từng gen (Allele Specific) phù hợp để xác định

chính xác họ allele của đối tượng. Các bộ xét
nghiệm gồm hai thành phần chính là các khay
có sẵn primer đặc hiệu và D-mix với các thành
phần có sẵn cho phản ứng PCR (Ngoại trừ Taq
polymerase). Taq polymerase sử dụng trong phản
ứng PCR là iTaq DNA polymerase của công ty
BioRad. Dựa theo quy trình của nhà sản xuất, tất
cả các phản ứng được thực hiện với thể tích tổng
cộng 10 L. Phản ứng được cài đặt theo chu
trình luân nhiệt như sau: 96oC trong 130 giây,
tiếp theo là 63oC trong 60 giây, tiếp đó là 9 chu
kỳ với bước 1 ở 96oC trong 10 giây và bước 2 là
63oC trong 60 giây, sau đó là 20 chu kỳ với bước
1 ở 96oC trong 10 giây, bước 2 là 59oC trong 50
giây và bước 3 là 72oC trong 30 giây.
Sản phẩm PCR được điện di trên thạch
agarose 2% trong dung dịch đệm 0,5xTBE rồi
được chụp hình. Kết quả được phân tích nhờ
phần mềm HLA Fusion 2.0. Tần xuất các allele
HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1
được ước tính bằng tính toán trực tiếp.

KẾT QUẢ
Do kháng nguyên HLA là những kháng
nguyên đồng trội nên ở mỗi cá thể có sự biểu lộ
cả 2 kháng nguyên tại mỗi locus. Trong nghiên
cứu này, chúng tôi xác định kiểu gen HLA của
203 người, nghĩa là tại mỗi locus có tổng cộng
406 trường hợp phân tích.

Phân bố các allele của HLA lớp I
Sự phân bố các họ allele của HLA lớp I
(HLA-A, -B và -C) trong nghiên cứu được
trình bày ở Bảng 1. Nghiên cứu đã tìm thấy 14
họ allele tại locus HLA-A. Trong dân số
nghiên cứu, HLA-A*11 là họ allele HLA-A
phổ biến nhất (chiếm 23,4%), theo sau là A*02
(chiếm 22,6%) và A*24 (chiếm 19,7%). Ngoài
ra, có 19 trường hợp không phân định được
giữa A*02 với A*24, có 3 trường hợp không
phân định được giữa A*02 với A*92. Các
trường hợp này được xếp riêng vào nhóm
HLA-A*02/24 và HLA-A*02/92, có tỉ lệ lần

490

lượt là 4,7% và 0,7%. Như vậy trên thực tế, tỉ
lệ A*02 và A*24 có thể còn cao hơn con số
22,6% và 19,7%.
Tại locus HLA-B, nghiên cứu đã tìm thấy 25
họ allele, trong đó phổ biến nhất là HLA-B*15
(chiếm 19,2%), theo sau là B*46 (chiếm 12,8%) và
B*07 (chiếm 12,5%). Có 31 trường hợp (trong
tổng số 406) không phân định được chính xác
họ allele, các trường hợp này chiếm 7,3% trong
số HLA-B của nghiên cứu.
Có 12 họ allele HLA-C được xác định qua
nghiên cứu. Cw*07 là họ allele thường gặp nhất
trong dân số nghiên cứu này, chiếm tỉ lệ 21,6%.
Tiếp đó, các họ allele chiếm tỉ lệ cao là Cw*08

(chiếm 17,5%) và Cw*01 (chiếm 16,7%). Ngoài
ra, có 8 trường hợp không phân biệt được giữa
Cw*08 với Cw*05 và 5 trường hợp không phân
định được giữa Cw*01 với HLA-C khác. Như
vậy, tỉ lệ Cw*08 và Cw*01 trên thực tế có thể còn
cao hơn.
Bảng 1: Phân bố tần xuất các allele HLA lớp I của
203 người
HLA-A
HLA-B
HLA-C
Họ allele Tỉ lệ% Họ allele Tỉ lệ%
Họ allele Tỉ lệ%
A*01
3,2
B*07
12,5
Cw*01
16,7
A*02
22,6
B*08
1,2
Cw*02
0,2
A*03
1,9
B*13
6,6
Cw*03

13,3
A*11
23,4
B*15
19,2
Cw*04
8,6
A*24
19,7
B*18
3,2
Cw*05
3.4
A*26
2,9
B*27
2,2
Cw*06
3,9
A*29
5,9
B*35
3,9
Cw*07
21,6
A*30
2,9
B*38
3,7
Cw*08

17,5
A*31
0,2
B*39
1,5
Cw*12
2,5
A*33
8,6
B*40
4,4
Cw*14
0,7
A*34
0,2
B*44
1,5
Cw*15
7,4
A*68
2,9
B*45
0,2
Cw*16
0,2
A*74
0,2
B*46
12,8
Cw*01/12

0,2
A*02/24
4,7
B*48
1,2
Cw*01/14
0,7
A*02/92
0,7
B*51
3,9 Cw*01/03/04 0,2
B*52
1,2
Cw*03/05
0,7
B*53
0,2
Cw*06/12
0,5
B*54
3,7
Cw*08/05
1,5
B*55
1,2
Cw*12/14
0,2
B*56
0,5
B*57

2,5
B*58
4,9
B*95
0,5

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011
HLA-A
HLA-B
Họ allele Tỉ lệ% Họ allele Tỉ lệ%
B*13/44
0,2
B*15/45
4,7
B*15/46
0,2
B*27/47
0,2
B*38/39
0,5
B*38/44
0,2
B*39/67
0,2
B*40/45
0,2
B*44/51

0,2
B*46/95
0,5
B*54/55
0,2

HLA-C
Họ allele Tỉ lệ%

Phân bố các allele của HLA lớp II
Sự phân bố các allele HLA lớp II (HLADRB1, -DRB3/4/5 và -DQB1) được trình bày
trong Bảng 2. Trong số 13 họ allele HLA-DRB1
được xác định, allele DRB1*12 chiếm tỉ lệ vượt
trội trong nghiên cứu, với 29,8% các trường hợp.
Họ allele có tần xuất cao tiếp theo là DRB1*09
(chiếm 19,4%). Tiếp theo là hai họ allele
DRB1*15 và DRB1*10, với tỉ lệ lần lượt là 9,8%
và 9,3%. Tất cả các trường hợp xác định HLADRB1 trong nghiên cứu đều được định rõ họ
allele.
Bảng 2: Phân bố tần xuất các allele HLA lớp II của
203 người
HLA-DRB1
HLA-DRB3/4/5
HLA-DQB1
Tỉ
Họ allele
Tỉ
Họ allele
Họ allele
Tỉ lệ%

lệ%
lệ%
DRB1*01 0,7
DRB3*01
4,2
DQB1*01 0,2
DRB1*03 3,2
DRB3*02
19,5 DQB1*02 4,9
DRB1*04 5,4
DRB3*03
26,4 DQB1*03 40,3
DRB1*07 5,9 DRB3*02/03
0,5
DQB1*04 3,7
DRB1*08 3,6 DRB3*01/02
0,2
DQB1*05 28,3
DRB1*09 19,4 DRB3*01/02/03 1,9
DQB1*06 11,8
DRB1*10 9,3
DRB4*01
32,3 DQB1*01/06 0,2
DRB1*11 2,9
DRB5*01
14,5 DQB1*03/04 10,1
DRB1*12 29,8 DRB5*01/02
0,5 DQB1*03/06 0,5
DRB1*13 4,2
DRB1*14 4,6

DRB1*15 9,8
DRB1*16 1,2

Trong dân số nghiên cứu, có 52,7% các
trường hợp biểu hiện DRB3; 32,3% các trường
hợp biểu hiện DRB4 và 15% các trường hợp biểu
hiện DRB5. Trong các trường hợp biểu hiện
DRB3, có 3 họ allele được tìm thấy trong nghiên

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học

Nghiên cứu Y học

cứu là HLA-DRB3*01, DRB3*02 và DRB3*03,
trong đó họ allele DRB3*03 thường gặp nhất
(chiếm 26,4% trong tổng số 406 trường hợp). Tất
cả các trường hợp biểu hiện DRB4 đều là
DRB4*01 (chiếm 32,3%).
Trong số 6 họ allele HLA-DQB1 tìm thấy
trong nghiên cứu, các họ allele HLA-DQB1*03
và DQB1*05 là phổ biến nhất (chiếm tỉ lệ lần
lượt là 40,3% và 28,3%).

BÀN LUẬN
Nghiên cứu này dựa trên phân tích các
kháng nguyên HLA của bệnh nhân có chỉ định
ghép tế bào gốc tạo máu tại BVTMHH và người
cho tế bào gốc dự kiến là anh chị em ruột, bà con
có liên hệ huyết thống của bệnh nhân nên tần
suất các allele không thể đại diện cho dân số

chung. Tuy nhiên, kết quả của nghiên cứu cũng
có thể đưa ra một số ước tính về các allele
thường gặp ở người Việt Nam.
Trong nghiên cứu này, phân tích sự phân
bố các allele tại locus HLA-A cho thấy có sự
tương đồng với các nghiên cứu ở các nước
châu Á, trong đó các họ allele chiếm ưu thế là
A*11, A*02 và A*24(3,5,7). Ở hầu hết các nghiên
cứu trong dân số châu Á đều ghi nhận nhóm
allele A*02 chiếm tỉ lệ cao nhất, trong khi
nghiên cứu này cho thấy tỉ lệ A*11 cao hơn
A*02 (23,4% so với 22,6%). Tuy nhiên, có 21
trường hợp (5,4%) trong nghiên cứu không
phân định được A*02 với A*24 và A*92 nên có
thể thực tế tỉ lệ A*02 sẽ cao hơn A*11.
Khi so sánh sự phân bố của các kháng
nguyên HLA-B trong nghiên cứu này với
nghiên cứu của Hoa B.K. và cộng sự trên 170
người Việt Nam dân tộc Kinh, chúng tôi nhận
thấy có điểm chung là các allele HLA-B*15, B*46
và B*07 chiếm ưu thế(3). Tuy nhiên, kết quả này
có khác biệt so với các nghiên cứu khác trong
quần thể dân châu Á như nghiên cứu của
Chunmei Shen và cộng sự trên 516 người Trung
Quốc khỏe mạnh tìm thấy các allele hay gặp
nhất là HLA-B*13, B*15 và B*51 với tỉ lệ lần lượt
là 11%; 9,3% và 8,5%(5). Họ allele B*40 không
chiếm ưu thế trong nghiên cứu này (4,4%)

491

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

nhưng theo một số nghiên cứu khác thì rất
thường gặp ở châu Á(4).
Khi so sánh sự phân bố các allele HLA-C, DRB1, -DQB1 của nghiên cứu này với nghiên
cứu của Hoa B.K. trên 170 người Việt Nam
dân tộc Kinh, chúng tôi nhận thấy có một số
tính chất chung là các allele Cw*01, Cw*07,
Cw*08, DRB1*12, DQB1*03, và DQB1*05
thường gặp nhất(3). Như vậy, cho dù dân số
của nghiên cứu này là những người cho và
người nhận có quan hệ huyết thống nhưng
kết quả vẫn thể hiện hình ảnh đặc trưng cho
dân số chung là người Việt Nam.
Về mặt kỹ thuật định danh HLA dùng trong
nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy có một số
trường hợp không phân định được rõ họ allele
(5,4% các trường hợp HLA-A; 7.3% HLA-B; 3,6%
HLA-C; 3,1% HLA-DRB3/4/5 và 10,8% HLADQB1). Vấn đề này là do trong giai đoạn đầu
của nghiên cứu không có nhiều thông tin về các
allele thường gặp, các mẫu được thực hiện với
các xét nghiệm loại tổng quát (Generic) nên có
nhiều trường hợp không phân định được. Dần
dần, trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi triển
khai thêm các xét nghiệm loại đặc hiệu cho từng
gen (Allele Specific) nên các trường hợp về sau

đều phân định được rõ họ allele. Về mặt dịch tễ,
đây là một điểm hạn chế của nghiên cứu nhưng
xét về mặt thực tế lâm sàng thì vẫn chấp nhận
được vì các trường hợp ghép ở BVTMHH là

492

giữa các anh chị em ruột nên có thể dựa thêm
vào sự tương hợp của các locus khác để tìm
người cho phù hợp.

KẾT LUẬN
Kết quả của nghiên cứu cho thấy việc ứng
dụng kỹ thuật PCR-SSP để xác định các loci
HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1 đã
đáp ứng được nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu
tại BVTMHH. Đây còn là cơ sở cho việc định
danh HLA cho các mẫu máu cuống rốn nhằm
phục vụ việc phát triển ngân hàng máu cuống
rốn tại bệnh viện.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.
3.

4.

5.

6.

7.

Choo SY. (2007). The HLA system: genetics, immunology,
clinical testing, and clinical implications. Yonsei Medical Journal,
48: 11-23.
Ferrer A. et al. (2005). Overview on HLA and DNA typing
methods. Biotechnologia Aplicada, 22: 91-101.
Hoa BK. (2008). HLA-A, -B, -C, -DRB1 and -DQB1 alleles and
haplotypes in the Kinh population in Vietnam. Tissue Antigens,
71(2): 127-134.
Shankarkumar U. (2010) Complexities and similarities of HLA
antigen distribution in Asian subcontinent. Indian J Hum Genet,
16(3): 108-110.
Shen C. (2008). Genetic polymorphisms at HLA-A, -B, and –
DRB1 loci in Han population of Xi’an city in China. Croat Med J.,
49: 476-482.
Sullivan KA. KIPPS TJ. (2010). Human leukocyte and platelet
antigens. In: Williams Hematology, 8ed. MacGraw-Hill, Inc.
International edition, New York.
Zhu B. et al. (2010). Distribution of HLA-A and –B alleles and
haplotypes in the Yi ethnic minority of Yunnan, China:
relationship to other populations. Journal of Zhejiang
University-Science, 11(2): 127-135.

Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học