Kết quả bước đầu áp dụng quy trình chẩn đoán tiền làm tổ tại Học viện Quân y

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016

KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU ÁP DỤNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN
TIỀN LÀM TỔ TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y
Nguyễn Đình Tảo*; Quản Hoàng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng*
Trần Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*
TÓM TẮT
Mục tiêu: báo cáo kết quả bước đầu áp dụng quy trình chẩn đoán tiền làm tổ tại Học viện
Quân y. Đối tượng và phương pháp: 20 bệnh nhân (BN) có con bị mắc bệnh di truyền hoặc có
tiền sử bị đình chỉ thai vì bệnh di truyền, tiến hành thụ tinh ống nghiệm, sinh thiết phôi chẩn
đoán di truyền tiền làm tổ. Kết quả: 7 gia đình đã thành công sau khi chuyển phôi, trong đó
2 gia đình có con bị bệnh teo cơ tuỷ (SMA), 5 gia đình có con bị bệnh thalassemia. Kết luận:
đã thành công trong việc xây dựng quy trình chẩn đoán một số bệnh di truyền trước khi phôi
cấy truyền phôi với sự thành công của 7 gia đình.
* Từ khóa: Teo cơ tủy; Gen SMN; Thalassemia; Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ.

Primary Results of Applying Protocol of Preimplantation Genetic
Diagnosis in Military Medical University
Summary
Objectives: To report the primary results of applying protocol of preimplantation genetic
diagnosis in Military Medical University. Subjects and methods: 20 patients who had their
children with the genetic disease or history of suspended pregnancy for genetic diseases were
conducted in vitro fertilization and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis. Results:
7 families succeeded after embryo transfer, in which 2 families having children with SMA,
5 families having children with thalassemia. Conclusion: We have succeeded in building diagnostic
procedures of some genetic diseases before embryo transfer with the success of 7 families.
* Key words: Spinal muscular atrophy; SMN gene; Thalassemia; Preimplantation genetic diagnosis.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh teo cơ tủy (Spinal muscular
atrophy - SMA) là bệnh thần kinh cơ, di

truyền lặn do đột biến gen trên nhiễm sắc
thể thường. Bệnh SMA đặc trưng bởi thoái
hoá tuần tiến của tế bào sừng trước tuỷ
sống, dẫn đến yếu cơ đối xứng gốc chi,
trương lực cơ và phản xạ gân xương bị

giảm hoặc mất, biến dạng lồng ngực và
cứng khớp. Tỷ lệ bệnh SMA chung trên
toàn thế giới là 1/10.000 trẻ đẻ sống và tỷ lệ
người mang gen bệnh dao động từ 1/40 1/60. Theo cách phân loại quốc tế hiện
hành, SMA được chia thành ba thể lâm
sàng dựa vào tuổi khởi phát bệnh và mức
độ nặng của bệnh: thể nặng, thể vừa và thể
nhẹ tương đương với SMA týp I, II và III [8].

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đình Tảo ()
Ngày nhận bài: 20/05/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/07/2016
Ngày bài báo được đăng: 24/07/2016

13


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
Gen SMN bao gồm 9 exon mã hoá cho phân tử protein SMN dài 294 axít amin. Gen
SMN cả hai bản sao giống nhau là gen SMNt (SMN1) và gen SMNc (SMN2). Hai gen
này chỉ khác nhau ở 5 cặp base: một cặp ở intron 6, một cặp ở exon 7, hai cặp ở intron
7 và một cặp ở exon 8. Sự khác nhau ở exon 7 và exon 8 được sử dụng để phân biệt
giữa gen SMNt và SMNc trong chẩn đoán SMA.
Người bình thường có cả exon 7 của gen SMNc và gen SMNt, đối với người bị

SMA chỉ có exon 7 của gen SMNc, sự khác biệt ở vị trí nucleotid 214 trên exon 7 gen
SMNt là nucleotit C, còn exon 7 gen SMNc là nucleotit T.

Hình 1: Sự khác biệt giữa gen SMNt với SMNc.
Sự khác nhau ở 1 nucleotid thuộc
exon 7 giữa SMNt và SMNc, khiến cho
SMNt tổng hợp ra phân tử protein SMN
đủ chiều dài và có đủ chức năng, trong
khi protein do SMNc tổng hợp có chức
năng rất hạn chế.
Có ba dạng đột biến gen SMN gây
bệnh SMA gồm: dạng 1: đột biến mất
đồng hợp toàn bộ gen SMNt hoặc chỉ mất
đồng hợp một phần gen SMNt; dạng 2:
đột biến chuyển đổi gen SMNt thành
SMNc; dạng 3: đột biến điểm xảy ra ở
gen SMNt của một nhiễm sắc thể, gen
SMNt trên nhiễm sắc thể còn lại trong cặp
tương đồng số 5 bị đột biến dạng 1 hoặc 2.
Trong đó, khoảng 95% BN SMA có gen
SMNt bị đột biến thuộc dạng 1 hoặc 2, chỉ
5% BN SMA bị đột biến gen SMNt thuộc
dạng 3. Cả hai dạng 1 và dạng 2 đều
chẩn đoán được bằng cách phân tích sự
có mặt hay không exon 7 SMNt, đây là
14

cơ sở của phương pháp chẩn đoán gen
bệnh SMA.
Mỗi trẻ em mắc bệnh SMA ra đời là

gánh nặng cho gia đình về tâm lý và tài
chính, đồng thời cũng là gánh nặng cho
toàn xã hội. Do đó, việc chẩn đoán di
truyền trước chuyển phôi (Preimplantation
genetic diagnosis - PGD) với những gia
đình tiểu sử có người mắc bệnh SMA
nhằm chọn ra phôi lành để cấy chuyển
vào tử cung mẹ, từ đó sinh ra em bé khỏe
mạnh là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và
thực tiễn, nhân văn cao cả.
Thalassemia là một trong những bệnh
di truyền đơn gen phổ biến nhất trên thế
giới. Ở Việt Nam, ước tính có khoảng
5 triệu người mang gen và bị bệnh. Hàng
năm có khoảng 2.000 trẻ được sinh ra mắc
bệnh thalassemia. Điều trị cho những trẻ
này tạo ra một gánh nặng cả về kinh tế
cũng như tinh thần cho gia đình và toàn


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
xã hội. Chẩn đoán di truyền trước chuyển
phôi là phương pháp sàng lọc phôi bất
thường về mặt di truyền, được thực hiện
trước khi cấy phôi vào tử cung người mẹ,
đây là một phương pháp dự phòng hiệu
quả cho các bệnh di truyền, trong đó có
thalassemia. Để thực hiện được điều này,
cần một quy trình phát hiện đột biến gen
trên một tế bào. Đây cũng là một khó

khăn của kỹ thuật. PGD mang lại hy vọng
cho những cặp vợ chồng bị thất bại nhiều
lần trong thụ tinh ống nghiệm nhưng không
rõ nguyên nhân. Ngoài ra, PGD còn áp dụng
cho những bà mẹ lớn tuổi để hạn chế bất
thường về di truyền. Trên thế giới hiện nay
có khoảng 300 gen liên quan đến bệnh có
thể được phát hiện bằng PGD.
Trên cơ sở thực hiện nghiên cứu “Nghiên
cứu quy trình chẩn đoán một số bệnh di
truyền trước chuyển phôi để sàng lọc
phôi thụ tinh trong ống nghiệm”, chúng tôi
báo cáo: Kết quả bước đầu áp dụng quy
trình chẩn đoán tiền làm tổ tại Học viện
Quân y.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu.
20 gia đình, vợ < 35 tuổi, có con đang
điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương và
Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương,
được chẩn đoán bị bệnh SMA do mất
đồng hợp tử exon 7 gen SMNt hoặc bị bệnh
thalassemia.
2. Phương pháp nghiên cứu.
- Tách ADN từ tế bào máu ngoại vi của
bố, mẹ và con của tất cả gia đình có con
bị bệnh thalassemia và SMA.

- Chuẩn bị kích trứng cho người mẹ của

các gia đình đăng ký tham gia làm PGD.
- Sinh thiết phôi bào từ các phôi ngày
3 hoặc ngày 5.
- Khuếch đại bộ gen từ tế bào phôi sau
sinh thiết bằng bộ kít RepliG (Qiagen).
- Tiến hành phản ứng PCR nhân exon 7,
exon 8 gen SMN từ các mẫu phôi chẩn
đoán SMA.
- Tiến hành nhân gen chạy minisequencing
và TripAssay cho các mẫu phôi và bố mẹ,
con của các gia đình đã chẩn đoán
thalassemia.
- Chẩn đoán bệnh thalassemia và SMA
cho các phôi đã sinh thiết.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1. Kết quả chẩn đoán phôi của gia đình
mang gen SMA.
Khuếch đại exon 7, exon 8 của gen
SMN bằng kỹ thuật nested-PCR bằng hai
cặp mồi đặc hiệu exon 7, exon 8 gen
SMN qua hai vòng. Chu trình nhiệt PCR
được thực hiện trên máy khuếch đại gen
efpendorft trong điều kiện: 960C/5 phút;
[940C/1 phút; 550C/1 phút; 720C/1 phút]
x 25 chu kỳ; 720C/10 phút.
Lấy sản phẩm PCR của vòng 1 làm mẫu
cho phản ứng PCR vòng 2. Chu trình
nhiệt PCR thực hiện trên máy khuếch đại
gen efpendorft trong điều kiện: 960C/5 phút;

[950C/30 giây; 550C/30giây; 720C/45 giây] x
35 chu kỳ; 720C/5 phút.
Sản phẩm PCR ủ với enzym giới hạn
Dra I và DdeI trong thời gian từ 2 - 3 giờ.
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel
agarose 3%.
15


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
- Sản phẩm sau khi cắt enzym của exon
7 gen SMNt (188 bp) và exon 7 gen SMNc
(164 bp và 24 bp).
- Sản phẩm sau khi cắt enzym của exon
8 gen SMNt (190 bp) và exon 8 gen SMNc
(120 bp, 70 bp).

Hình 2: Kết quả điện di trên gel agarose
2% sản phẩm PCR của gia đình BN C3:
ladder 50 bp.
Sản phẩm PCR exon 7 khi chưa ủ với
enzym DraI (Ko DraI) và exon 8 khi chưa
ủ với enzym DdeI (Ko DdeI) của cả bố BN
C3 (B3), mẹ BN C3 (M3), BN C3 đều giống
nhau, cùng có băng 188 bp - sản phẩm nhân
của exon 7 và băng 190 bp - sản phẩm nhân
exon 8.
Nhưng khi ủ sản phẩm PCR với enzym
DraI thấy:
- B3 và M3 đều có hai băng tương ứng

là 188 bp và 164 bp, có nghĩa cả B3 và
C3 đều có exon 7 SMNt (không bị cắt 188 bp), exon 7 SMNc bị cắt thành hai
mảnh (164 bp và 24 bp).
- Trong khi đó con C3 chỉ có 1 băng
tương ứng 164 bp, nghĩa là con C3 bị mất
đồng hợp exon 7 SMNt, chỉ có exon 7
SMNc nên bị enzym giới hạn cắt thành
hai băng (164 bp, 24 bp), điều này phù hợp
với kết quả của Bệnh viện Nhi Trung ương.
16

Hình 3: Kết quả điện di trên gel agarose 3%
sản phẩm PCR sau khi ủ với enzym giới
hạn của gia đình BN C7: ladder 100 bp.
Cả bố (B7) và mẹ (M7) của BN C7 đều
có exon 7 gen SMNt nên khi ủ sản phẩm
PCR với enzym giới hạn DraI có hai băng
(188 bp của exon 7 SMNt và 164 bp của
exon 7 SMNc), tương tự đối với exon 8
của gen SMN. Như vậy, BN C7 cũng mất
đồng hợp exon 7 và exon 8 của gen
SMNt. BNC3 mất đồng hợp exon 7 và 8
gen SMNt.


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
Các phôi sinh thiết của 3 gia đình có con bị bệnh SMA cũng được chẩn đoán bằng
phương pháp này. Gia đình số 3 có 3 phôi sinh thiết ngày 3; gia đình số 7 thụ tinh
được 3 phôi, nhưng các phôi không phát triển đến ngày 3. Do vậy, không có phôi
sinh thiết; gia đình số 18 được 5 phôi sinh thiết ngày 3. Chúng tôi thu được một số kết

quả sau:
Bảng 1: Kết quả phát hiện đột biến gen SMNt trên máu toàn phần và trên phôi sinh
thiết của 3 gia đình có con mắc bệnh SMA.
TT

BN

1

Gen SMNt
Exon 7

Exon 8

SMAC3

-

-

P1_3

+

+

Bố BN

Gen SMNt
Exon 7

Exon 8

SMAB3

+

+

P2_3

+

+

Mẹ BN

Gen SMNt
Exon 7

Exon 8

SMAM3

+

+

P3_3

+

+

+

SMAM7

+

+

Kết quả: được 1 phôi bình thường
2

SMAC7

-

-

SMAB7

+

Không có phôi sinh thiết
3

SMAC18

-

-

SMAB18

+

+

SMAM18

+

+

P1_18

-

-

P2_18

-

-

P3_18

-

-

P4_18

+

+

P5_18

-

-

Kết quả: phôi số 4 được chuyển và thành công

Tất cả bố, mẹ của các BN trên đều có mặt exon 7, 8 SMNt và thực tế, các cặp bố
mẹ đều là người không có biểu hiện bệnh SMA. Nghĩa là, một nhiễm sắc thể trong cặp
tương đồng số 5 có gen SMNt bình thường (dạng dị hợp) cũng dịch mã đủ lượng
protein SMN (survival motor neurone) cho tế bào thần kinh vận động hoạt động bình
thường. Các phôi bình thường của những gia đình này được chuyển phôi, kết quả:
2 gia đình có con bị bệnh SMA đã có con khỏe mạnh. (Lê Thị H, Nguyễn Văn V, SMA,
chọc noãn 25/11/2014 chuyển phôi lần 1 không kết quả; chuyển phôi lần 2 ngày
30/3/2015, sinh con khỏe mạnh ngày 12/12/2015. Phạm Thị Việt H, Nguyễn Tuấn A,
SMA Nghệ An; chọc noãn 19/5/2015, sinh thiết 5 phôi; phôi 1 bị bệnh; phôi 2, 3, 4 bình
thường; phôi 5 chưa có thông tin di truyền; chuyển phôi ngày 18/6/2015; đã mang thai,
sinh con gái ngày 28/2/2016. Gia đình Phạm Thị H, Nguyễn Văn V, SMA; chọc noãn ngày
16/12/2014; sinh thiết được 3 phôi; phôi 1; phôi 2 bình thường; phôi 3 bị bệnh; chuyển

phôi 12/3/16, không kết quả).
17


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
2. Kết quả chẩn đoán thalassemia của gia đình và mẫu phôi sinh thiết của
17 gia đình tham gia nghiên cứu.

Hình 3: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THM16, THB16.
THM16 mang kiểu gen dị hợp tử Cd26, píc trên màu đen là nucleotid C (bình thường),
píc dưới màu đỏ là nucleotid T (đột biến).
THB16 mang kiểu gen dị hợp tử Cd17, píc trên xanh lá cây là nucleotid A (đột biến),
píc dưới đỏ là nucleotid T (bình thường).

Hình 4: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THC16.
Mẫu nghiên cứu THC16 mang kiểu gen dị hợp tử cả hai đột biến Cd26/Cd17.
18


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016

Hình 5: Hình ảnh TripAssay của mẫu nghiên cứu THB16, THC16, THM16.
Kết quả chẩn đoán xác định đột biến bằng kỹ thuật minisequencing được kiểm chứng
bằng bộ kít TripAssay cho kết quả phù hợp: vị trí đột biến trên mẫu của bố là Cd17 dị
hợp tử, mẹ là Cd26 dị hợp tử, con mang cả 2 đột biến Cd17 và Cd26.

Hình 6: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THB24, THM24.
THB24, THM24 mang kiểu gen dị hợp tử Cd17, píc trên xanh lá cây là nucleotid A
(đột biến), píc dưới đỏ là nucleotid T (bình thường).
19

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016

Hình 7: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THC24.
THC24 mang kiểu gen đồng hợp tử Cd17, chỉ xuất hiện 1 píc xanh lá cây A (đột biến).
Gia đình này có 6 phôi được sinh thiết ngày 5 để chẩn đoán xác định đột biến với
kết quả: 1 phôi bình thường không mang gen đột biến (phôi số 1), 2 phôi đồng hợp tử
Cd17 (phôi 2 và phôi 3) và 3 phôi mang gen dị hợp tử Cd17 (phôi số 4, 5, 6). Dưới đây là
kết quả nhân gen bằng kỹ thuật minsequencing và kiểm tra lại bằng bộ kít TripAssay:

Hình 8: Hình ảnh điện di minisequenicng 6 phôi của gia đình 24.
Từ hình ảnh trên cho thấy mẫu số 1 có xuất hiện píc huỳnh quang của nucleotid T,
đây là vị trí nucleotid bình thường. Do vậy, phôi số 1 này là một phôi không mang gen
gây bệnh, phôi bình thường. Phôi số 2 và phôi số 3 đều xuất hiện píc huỳnh quang của
nucleotid A. Vị trí nucleotid này là vị trí đột biến, do vậy phôi số 2 và phôi số 3 mang
gen đồng hợp tử Cd17, phôi bị bệnh. Các phôi số 4, 5, 6 xuất hiện cả 2 píc huỳnh
quang của nucleotid A và T, do đó các phôi này mang gen dị hợp tử Cd17, phôi chỉ
mang gen nhưng không phát hiện bệnh.
20


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016

Hình 9: Hình ảnh chẩn đoán 6 phôi sinh thiết bằng kít TripAssay.
Đây là hình ảnh chẩn đoán 6 phôi sinh thiết ngày 5 của gia đình số 24, trong 6 phôi
này, 2 phôi mang gen đồng hợp tử Cd17, là phôi số 2 và số 3. Các phôi này khi lai
TripAssay thấy xuất hiện vạch tại vị trí đột biến Cd17 và mất cả vạch tại vị trí bình
thường của Cd17. Phôi số 1 không xuất hiện vạch đột biến. Do vậy, phôi số 1 bình
thường. Phôi số 4, 5, 6 xuất hiện vạch đột biến, nhưng chưa mất vạch ở vị trí bình

thường nên các phôi này chỉ mang gen dị hợp tử Cd17, phôi không biểu hiện bệnh.
Tương tự như trên, kết quả của gia đình số 23 được 16 phôi ngày 3, trong đó 14 phôi tốt
6 - 10 tế bào, 2 phôi 4 - 6 tế bào, ngày 5 có 5 phôi phát triển bình thường được sinh thiết.
Đã chẩn đoán di truyền bệnh thalassemia cho tất cả các phôi. Một số gia đình tạo được
phôi, nhưng các phôi phát triển bất thường; Do vậy, không có phôi sinh thiết. Một số
gia đình có phôi được chẩn đoán và đang được chuyển phôi, một số gia đình khác
phôi đã chuyển lần 1, nhưng chưa đậu phôi, đang chờ chuyển lần 2. Trong số những
BN thalassemia, có 5 gia đình đậu phôi, trong đó 2 gia đình đã sinh con khỏe mạnh và
3 gia đình đang mang thai.
21


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
KẾT LUẬN
- Đã xây dựng quy trình chẩn đoán một
số bệnh di truyền trước chuyển phôi để
sàng lọc phôi thụ tinh trong ống nghiệm.

5. Taylor JE, Thomas NH, Lewis CM et al.
Correlation of SMNt and SMNc gene copy
number with age of onset and survival in
spinal muscular atrophy. Eur J Hum. Genet.
1998, 6, pp.467-474.

- Đã ứng dụng quy trình PGD thành
công trên BN thalassemia và SMA, tổng
số 7 gia đình, trong đó 2 gia đình SMA và
5 gia đình thalassemia.

6. Ng IS, Law HY. Challenges in screening

and prevention of thalassaemia in Singapore.
Asian-Oceanian Journal of Paediatrics and
Child Health. 2003, 2, pp.29-38.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dreesen JC, Bras M, Die - Smulders C
et al. Preimplantation genetic diagnosis of
spinal muscular atrophy. Mol Hum Reprod.
1998, 4 (9), pp.881-885.
2. Graeme Daniels, Rachel Pettigrew, Alan
Thornhill et al. Six unaffected livebirths
following preimplatation diagnosis for spinal
muscular atrophy. Mol Hum Reprod. 2001, 7
(10), pp.995-1000.

7. Wang W, Kham SK, Yeo GH, Quah TC,
Chong SS. Multiplex minisequencing screen
for common Southeast Asian and Indian betathalassaemia mutations. Clin Chem. 2003, 49,
pp.209-218.
8. Kuliev A, Rechitsky S, Verlinsky O,
Ivakhnenko V, Evsikov S, Wolf G et al.
Preimplantation diagnosis of thalassaemias.
J Assist Reprod Genet 1998, 15, pp.219-225.

3. Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S et al.
Identification and characterization of a spinal
muscular atrophy-determining gene. Cell.
1995, 80, pp.155-165.

9. Deng J, Peng WL, Li J, Fang C, Liang

XY, Zeng YH et al. Successful preimplantation
genetic diagnosis for alpha-and betathalassaemia in China. Prenat Diagn. 2006, 26,
pp.1021-1028.

4. Rodrigues NR, Owen N, Talbot K,
Ignatius J, Dubowitz V, Davies KE. Deletions
in the survival motor neurone gene on 5q13 in
autosomal recessive spinal muscular atrophy.
Hum Mol Genet. 1995, 4, pp.631-634.

10. De Rycke M, Van de Velde H, Sermon
K, Lissens W, De Vos A, Vandervorst M et al.
Preimplantation genetic diagnosis for sicklecell anemia and for beta-thalassaemia. Prenat
Diagn. 2001, 21, pp.214-222.

22