Xây dựng qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CLONIDIN
TRONG HUYẾT TƯƠNG THỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
VỚI ĐẦU DÒ PDA
Trần Quốc Thanh*, Lê Quan Nghiệm*, Huỳnh Văn Hóa*, Lê Hậu*, Trương Quốc Kỳ*, Nguyễn Đức Tuấn*

TÓM TẮT
Đặt vấn đề - Mục tiêu nghiên cứu: Dạng thuốc dán hấp thu qua da với dược chất clonidin đã được phát
triển với tên thương mại là Catapres. Cho đến nay, chuyên luận thuốc dán clonidin chỉ có trong Dược điển Mỹ.
Trên thế giới chỉ có một vài công trình công bố qui trình định lượng clonidin được phóng thích từ thuốc dán
Catapres trong huyết tương thỏ bằng phương pháp LC-MS. Tại Việt Nam, thuốc dán thấm qua da clonidin 2,5 và
7,5 mg đã được Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh bào chế thành công. Bước tiếp theo của đề
tài là tiến hành xác định sinh khả dụng của thuốc. Vì vậy đề tài “Xây dựng qui trình định lượng clonidin trong
huyết tương thỏ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA” đã được thực hiện.
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Thăm dò điều kiện chiết clonidin từ huyết tương thêm clonidin
chuẩn bằng phương pháp tủa protein và chiết pha rắn. Thăm dò các điều kiện sắc ký về pha động: không có dung
dịch đệm, sử dụng dung dịch đệm, thêm vào một tác nhân tạo cặp ion.
Kết quả: Đã xác định được điều kiện thích hợp để chiết clonidin từ huyết tương thêm clonidin chuẩn với
hiệu suất chiết khoảng 70% và có độ lặp lại cao. Đã xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng
clonidin trong huyết tương thỏ. Qui trình định lượng đã được thẩm định đạt yêu cầu theo hướng dẫn của FDA
Hoa Kỳ. Cuối cùng, qui trình đã được ứng dụng để định lượng clonidin trong một số mẫu huyết tương thỏ sau
khi được dán thuốc thử nghiệm.
Kết luận: Đề tài đã xây dựng thành công qui trình HPLC-PDA định lượng clonidin trong huyết tương thỏ.
Qui trình có thể được tiếp tục ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc trên huyết tương thỏ.
Từ khóa: Clonidin, huyết tương thỏ, sắc ký lỏng hiệu năng cao.

ABSTRACT
QUANTITATIVE DETERMINATION OF CLONIDINE IN RABBIT PLASMA BY HIGH

PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH PHOTO DIODE ARRAY DETECTOR
Tran Quoc Thanh, Le Quan Nghiem, Huynh Van Hoa, Le Hau, Truong Quoc Ky, Nguyen Duc Tuan
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 14 - 20
Introduction - Aims: Transdermal patches containing clonidine have been launched into global market
under trade name Catapres–TTS (Transdermal Therapeutic System) for a long time. So far, there’s only TTS
monograph clonidine in USP. Liquid chromatography coupled with mass spectrometry has recently been applied
for measurement of clonidine in rabbit plasma. In Vietnam, transdermal therapeutic system of clonidine 2.5 mg
and 7.5 mg has been successfully prepared by Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy at Ho
Chi Minh City. Therefore, the aim of this study was to develop a simple HPLC-PDA method for quantitative
determination of clonidine in rabbit plasma.
Subjects and Methods: Protein precipitation and solid phase extraction were applied for clonidine
extraction from rabbit plasma. Several chromatographic conditions such as mobile phase including buffer, without
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS. Trần Quốc Thanh - ĐT: 0903 389 214 - Email:

14

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

buffer, or added to one ion pair agent, were investigated.
Results: The protein precipitation was successfully applied for clonidine extraction from rabbit plasma with
recovery of 70% and high repeatability. The appropriate chromatographic conditions were found out for
quantitative determination of clonidine from rabbit plasma. The liquid chromatographic method was validated and
satisfied all requirements under the guidance of US FDA. Finally, the validated method could be a reliable
statement concerning quantitative determination of clonidine in rabbit plasma.

Conclusion: A simple HPLC-PDA method was successfully developed for quantitative determination of
clonidine in rabbit plasma. The method can be further applied for clonidine quantitation in in vivo bioavailability
study of transdermal patches.
Key words: Clonidine, rabbit plasma, HPLC.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Dạng thuốc dán hấp thu qua da
(Transdermal Therapeutic System – TTS) ngày
càng được quan tâm phát triển rộng rãi do có rất
nhiều ưu điểm so với thuốc viên. Thuốc dán
điều trị tăng huyết áp đầu tiên ra đời là chế
phẩm Catapres – TTS chứa dược chất clonidin.
Cho đến nay, chuyên luận thuốc dán clonidin
chỉ có trong Dược điển Mỹ(3). Trên thế giới chỉ có
một công trình công bố qui trình định lượng
clonidin được phóng thích từ thuốc dán
Catapres trong huyết tương thỏ bằng phương
pháp LC-MS(2). Tại Việt Nam, thuốc dán thấm
qua da clonidin 2,5 và 7,5mg đã được Khoa
Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh
bào chế thành công. Bước tiếp theo của đề tài là
tiến hành xác định sinh khả dụng của thuốc. Vì
vậy đề tài “Xây dựng qui trình định lượng
clonidin trong huyết tương thỏ bằng kỹ thuật sắc
ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA” đã được
thực hiện.

Hóa chất, dung môi
Acid hydrocloric, acid phosphoric, natri 1heptansulfonat, acid percloric, kali hydroxyd đạt
tiêu chuẩn phân tích (Merck). Methanol đạt tiêu

chuẩn sắc ký lỏng (Merck).
Trang thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters
Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang 2996. Cân
phân tích Sartorius CP 224D. Máy đo pH
Metrohm 744. Bể siêu âm Elma.

Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát điều kiện sắc ký
Clonidin là một chất có tính base, phân cực
nên kỹ thuật sắc ký pha đảo được lựa chọn. Qua
tham khảo các tài liệu(3,2,1) định lượng clonidin
trong huyết tương, điều kiện sắc ký ban đầu
được đề nghị như sau:
Cột sắc ký: cột Phenomenex Luna C18 (150 x
4,6 mm; 5 µm).
Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU

Đầu dò PDA: bước sóng phát hiện 210 nm.

Đối tượng nghiên cứu

Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

Thuốc dán Clonidin 2,5 mg và 7,5 mg của
Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí
Minh.
Chất đối chiếu và thuốc đối chiếu

Clonidin hydroclorid chuẩn USP 32, hàm
lượng 99,38%, số lô QT170913, hạn dùng tháng
04/2014. Thuốc đối chiếu: Catapres-TTS® 7,5
mg/10,5 cm2, hạn dùng tháng 05/2013 của công ty
Boehringer Ingelhem, Đức.

Chuyên Đề Dược Học

Pha động A (không có dung dịch đệm):
methanol – nước (40:60) được điều chỉnh đến pH
3 bằng acid phosphoric.
Pha động B (có dung dịch đệm): 1000 ml
hỗn hợp methanol – nước (40:60), thêm 1 ml
acid phosphoric, điều chỉnh đến pH 3 bằng
KOH 30%.
Pha động C (có tác nhân tạo cặp ion): 1000 ml
hỗn hợp methanol – nước (40:60), thêm 1,21 g

15


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

natri 1-heptansulfonat và 1 ml acid phosphoric,
điều chỉnh đến pH 3 bằng KOH 30%.
Khảo sát 3 hệ pha động trên để chọn điều
kiện sắc ký thích hợp thoả mãn các yêu cầu
sau: pic clonidin phải tách hoàn toàn pic khác

(nếu có) và có hệ số đối xứng nằm trong
khoảng 0,8 – 1,5.

Khảo sát điều kiện xử lý mẫu huyết tương
Chuẩn bị mẫu chuẩn
Cân chính xác 11,8 mg clonidin HCl chuẩn,
cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan và bổ
sung bằng dung dịch KOH 0,0025% đến vạch,
lắc đều. Dung dịch sau khi pha được bảo quản
ở 0 – 4oC. Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với
nước để được các dung dịch chuẩn nồng độ từ
2 – 13 µg/ml.
Tủa protein trong huyết tương bằng dung môi hữu cơ
Trước tiên, chọn phương pháp tủa protein
để xử lý mẫu vì đây là phương pháp đơn giản,
không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, thời gian
xử lý nhanh. Do clonidin tan tốt trong methanol
nên dung môi này được lựa chọn để tủa protein.
Tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi/huyết tương
để tủa hoàn toàn protein.
Áp dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE)
Dựa theo tài liệu tham khảo(2), dùng cột SPE
đã được nhồi sẵn 500 mg silicagel C18, thể tích 5
ml. Hoạt hóa cột bằng 1 ml methanol, 1 ml nước.
Cho 0,04 ml dung dịch chuẩn clonidin vào 0,36
ml huyết tương trắng, lắc rung 1 phút. Cho qua
cột SPE, để yên 5 phút. Rửa cột với 1 ml nước và
1 ml methanol 5%. Rửa giải cột với 0,8 ml
methanol.
Tủa protein trong huyết tương bằng acid percloric

Cho 0,01 ml dung dịch chuẩn clonidin vào
0,49 ml huyết tương trắng, lắc rung 1 phút. Thêm
tiếp 0,05 ml dung dịch HCl 0,2%, lắc rung 1 phút.
Tiếp tục thêm 0,05 ml dung dịch acid percloric
70%, lắc rung 1 phút. Ly tâm 14000 vòng/phút
trong 10 phút.

16

Thẩm định phương pháp
Theo hướng dẫn của US FDA(4), bao gồm
khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc
hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng,
tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết), giới hạn định
lượng dưới (LLOQ), độ ổn định.
Ứng dụng qui trình định lượng clonidin trong
huyết tương thỏ
Thử nghiệm đối với thuốc dán chứa clonidin
7,5 mg/17,28 cm2 do Khoa Dược, ĐHYD Tp
HCM bào chế và thuốc dán đối chiếu Catapres –
TTS chứa clonidin 7,5 mg/10,5 cm2. Mỗi loại
thuốc dán trên sẽ được thử nghiệm trên 6 thỏ.
Lấy một miếng thuốc dán dán lên vùng thử
nghiệm trên da thỏ. Lấy 1 ml máu thỏ qua tĩnh
mạch vành tai thỏ vào các thời điểm 0, 6, 12, 24,
36, 48, 60, 72, 78 giờ. Mẫu máu được đem ly tâm,
xử lý và tiến hành định lượng.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát điều kiện sắc ký

Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký được thể
hiện qua hình 1.
Với pha động A, pic clonidin xuất hiện rất
sớm, có thời gian lưu khoảng 2,28 phút. Với pha
động B, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 4,58
phút nhưng bị kéo đuôi. Pha động C, pic
clonidin có thời gian lưu khoảng 11,4 – 12,8 phút,
pic clonidin tách hoàn toàn pic tạp và có hệ số
đối xứng nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Vì vậy pha
động C được lựa chọn.

Khảo sát điều kiện xử lý mẫu huyết tương
Phương pháp kết tủa protein trong huyết
tương bằng dung môi hữu cơ có ưu điểm là xử
lý mẫu nhanh, sau một tuần khảo sát, tỷ lệ
methanol/ huyết tương để tủa hoàn toàn
protein là 3:1. Tuy nhiên nồng độ clonidin bị
loãng đi, còn lẫn nhiều tạp chất khi tiến hành
sắc ký và pic clonidin không tách khỏi hoàn
toàn pic tạp (hình 2).

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

(a)

(b)

(c)

(d)

Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn: (a) với pha động A, (b) với pha động B, (c) với pha động C và mẫu huyết tương
trắng thêm dung dịch chuẩn: (d) với pha động C.
Phương pháp chiết pha rắn có thời gian xử lý
mẫu lâu hơn, sau khi tiến hành sắc ký thấy còn
khá nhiều tạp và pic clonidin còn lẫn với các pic
tạp khác (hình 3).
Phương pháp tủa protein với acid percloric
dù còn nhiều tạp nhưng pic clonidin tách hoàn
toàn khỏi pic tạp và phát hiện được với nồng độ
mẫu rất thấp (hình 1d).
Clonidin HCl

Hình 2: Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn được
xử lý bằng cách tủa protein với methanol
Clonidin HCl

Hình 3: Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn được
xử lý bằng phương pháp chiết pha rắn
Do đó phương pháp xử lý mẫu huyết tương
bằng acid percloric được lựa chọn.

Chuyên Đề Dược Học

Thẩm định phương pháp

Khảo sát tính phù hợp của hệ thống
Kết quả phân tích lặp lại 6 lần mẫu huyết
tương thêm chuẩn clonidin được trình bày ở
bảng 1.
Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên
mẫu huyết tương thêm chuẩn (n=6)
Diện tích Thời gian Hệ số
lưu
đối xứng
pic (µAu x
giây)
(As)
(phút)
TB
334818 12,014
1,2
RSD
1,03%
0,27%
0,87%

Số đĩa lý Độ phân
thuyết giải (Rs)
(N)
26891
4,25
1,92% 0,92%

Nhận xét: RSD của các thông số khảo sát gồm
diện tích pic, thời gian lưu, hệ số đối, số đĩa lý

thuyết, độ phân giải đều có RSD < 2%, chứng tỏ
qui trình có tính phù hợp hệ thống.

Tính đặc hiệu
Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu huyết
tương thêm chuẩn và mẫu huyết tương trắng
theo điều kiện sắc ký đã chọn. Kết quả cho thấy:
phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic clonidin
trong mẫu huyết tương thêm chuẩn và mẫu
chuẩn giống nhau (hình 4), thời gian lưu của pic
trong mẫu huyết tương thêm chuẩn (hình 1d)
tương đương với thời gian lưu của pic clonidin
trong mẫu chuẩn (hình 1c), mẫu huyết tương
trắng (hình 5) không có pic trùng với pic

17


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

clonidin, sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh
khiết của pic cho thấy pic clonidin trong mẫu
huyết tương thêm chuẩn tinh khiết (hình 6). Do
(a)

đó, có thể khẳng định qui trình phân tích có tính
đặc hiệu.

(b)

Hình 4: Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic clonidin trong mẫu chuẩn (a) và mẫu huyết tương thêm
chuẩn (b)

Hình 5: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng

Hình 6: Đồ thị minh họa độ tinh khiết của pic clonidin
HCl trong mẫu huyết tương thêm chuẩn

Khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ chính xác, độ đúng, hiệu suất chiết, độ ổn định
Bảng 2: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ chính xác, độ đúng, hiệu suất chiết và
độ ổn định
Chỉ tiêu thẩm định
Phương trình hồi qui
Khoảng tuyến tính (ng/ml)
Giới hạn định lượng dưới (ng/ml)
Hiệu suất chiết*
Độ chính xác trong ngày và khác ngày* (RSD, n= 18)
Độ đúng trong ngày và khác ngày* (tỷ lệ hồi phục, n=18)
Độ ổn định*

Clonidin HCl
2
Ŷ = 472,9X; R = 0,9999
45 – 800
45
73,1% - 77,0% ; RSD = 0,65% - 5,20%
2,42% - 18,25%
92,80% - 115,85%

Dung dịch chuẩn gốc vẫn ổn định sau 7 ngày bảo quản ở 0 –
o
4 C. Mẫu huyết tương chứa clonidin có thể bảo quản ở nhiệt
o
độ phòng trong 24 giờ, bảo quản ở -70 C trong khoảng 1
tháng, ổn định sau 3 chu kỳ đông, rã đông và sau khi xử lý mẫu
12 tiếng ở nhiệt độ phòng.

* Được thực hiện tại 3 nồng độ khác nhau 45 ng/ml, 400 ng/ml và 800 ng/ml.

Nhận xét: Bằng các kết quả thực nghiệm thu
được, phương pháp định lượng clonidin trong
huyết tương thỏ đạt yêu cầu thẩm định của quy
trình phân tích thuốc trong dịch sinh học về tính
phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, hiệu suất
chiết, giới hạn định lượng dưới, tính tuyến tính,
độ đúng và độ chính xác, độ ổn định theo hướng
dẫn của FDA Hoa Kỳ(4).

18

Tóm tắt qui trình định lượng clonidin
trong huyết tương thỏ
Chuẩn bị mẫu chuẩn
Cân chính xác 11,8 mg chuẩn clonidin HCl,
cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan và bổ
sung bằng dung dịch KOH 0,0025% (g/ml) đến
vạch, lắc đều. Pha loãng dung dịch thu được với
nước để thu được 3 dung dịch chuẩn ở 3 mức

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014
nồng độ sao cho nồng độ clonidin sau xử lý mẫu
huyết tương là 45 ng/ml, 400 ng/ml và 800 ng/ml.
Cho 0,01 ml dung dịch chuẩn clonidin vào 0,49
ml huyết tương trắng, lắc rung (vortex) 1 phút,
thêm 0,05 ml dung dịch HCl 0,2%, lắc rung 1
phút, tiếp tục thêm 0,05 ml dung dịch acid
percloric 70%, lắc rung 1 phút. Ly tâm 14000
vòng/phút trong 10 phút, lọc dịch trong qua
màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký.

Chuẩn bị mẫu thử
Lấy 0,5 ml huyết tương thỏ, thêm 0,05 ml
dung dịch HCl 0,2%, lắc rung 1 phút, thêm 0,05
ml dung dịch acid percloric 70%, lắc rung 1 phút.

Nghiên cứu Y học

Ly tâm 14000 vòng/phút trong 10 phút, lọc dịch
trong qua màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký.

Điều kiện sắc ký
Cột sắc ký: Phenomenex Luna C18 (150 x 4,6
mm; 5 µm).
Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng 260C.
Pha động: hòa tan 1,21 g natri heptansulfonat
trong 600 ml nước, thêm 400 ml methanol và 1

ml acid phosphoric, điều chỉnh đến pH = 3 bằng
dung dịch KOH 30%.
Tốc độ dòng: 1 ml/ phút.
Đầu dò PDA: bước sóng phát hiện 210 nm.
Thể tích tiêm mẫu: 100 µl.

Nồng ñộ clonidin (ng/ml)

Ứng dụng qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ

Thời gian (Giờ)

Hình 7: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ clonidin trong huyết tương thỏ theo thời gian sau khi dán thuốc dán
clonidin 7,5 mg và thuốc dán Catapres 7,5 mg
được ứng dụng cho các nghiên cứu về sinh khả
Nhận xét:
dụng trên thỏ.
Thuốc dán Catapres 7,5 mg và clonidin 7,5
mg đều có nồng độ nồng độ clonidin cực đại
trong huyết tương thỏ tương đương sau khi dán
thuốc 36 giờ. Không phát hiện clonidin sau khi
dán thuốc (0 giờ) và nồng độ clonidin trong
huyết tương thỏ nhỏ hơn giới hạn định lượng
dưới sau khi dán thuốc 6, 60, 72 và 78 giờ.
Phương pháp HPLC-PDA tuy có độ nhạy không
bằng phương pháp LC-MS/MS nhưng giá trị giới
hạn định lượng dưới chấp nhận được để định
lượng hoạt chất trong huyết tương. Các kết quả
định lượng ban đầu cho thấy qui trình có thể

Chuyên Đề Dược Học

KẾT LUẬN
Đề tài đã xây dựng được qui trình định
lượng clonidin trong huyết tương thỏ bằng
phương pháp HPLC với đầu dò PDA. Qui trình
định lượng clonidin đã được thẩm định về tính
phù hợp của hệ thống, tính chọn lọc, tính tuyến
tính, giới hạn định lượng dưới, độ chính xác, độ
đúng, tỷ lệ hồi phục và độ ổn định. Qui trình đã
được ứng dụng để định lượng clonidin trong
huyết tương thỏ sau khi được dán thuốc thử
nghiệm và có thể được tiếp tục ứng dụng để

19


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc trên
huyết tương thỏ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

20

Chux LC, Bayne WF, Tao FT, Schmitt LG, Shaw JE (1979).
Determination of submicrogram quantities of clonidin in
biological fluids, Journal of Pharmaceutical Sciences, 68(1), 72-74.
Mote M, Inamdar S, Ghosh C, Chakraborty B (2009). A
sensitive, selective, precise and accurate LC-MS method for
determination of clonidine in human plasma, Chromatography,
69, 11-12.

3.
4.

United States Pharmacopoeia 32, NF27 (2009). The United
States Pharmacopeial Convention. 557-563.
US Food and Drug Administration, Center for Drug
Evaluation and Research (2001). Guidance for Industry:
Bioanalytical method validation, 3 – 15.

Ngày nhận bài báo:

14.12.2012

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

22.12.2012

Ngày bài báo được đăng:

10.03.2014

Chuyên Đề Dược Học