Ứng dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng xác định mức độ sao chép của heparansulphat interacting protein ở mô ung thư

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007

ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PCR BÁN ĐỊNH LƢỢNG
VÀ ĐỊNH LƢỢNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ SAO CHÉP
CỦA HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN Ở MÔ UNG THƢ
Trần Vân Khánh*, Tạ Thành Văn*
Phương pháp PCR bán định lượng và định lượng là những phương pháp đơn giản, chính xác và cho độ
tin cậy tương đối cao được sử dụng rất rộng rãi để xác định mức độ biểu hiện của mỗi gen được khuyếch đại
sau mỗi phản ứng PCR.
Mục tiêu: Sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng để đánh giá mức độ sao chép của
Heparansulphat Interacting Protein (HIP) ở mô ung thư so với mô lành tính; so sánh kết quả của 2 phương
pháp trên.
Phương pháp: Tách triết mRNA tổng số từ mô ung thư và lành tính; tổng hợp cDNA; xác định mức
độ sao chép của HIP sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng.
Kết quả: Cả phương pháp này đều cho kết quả tương tự như nhau; HIP được tăng cường sao chép rất
rõ ở những mô ung thư trong khi đó phát hiện được rất thấp trên mẫu lành tính.
Kết luận: Mức độ biểu hiện của HIP ở mô ung thư và mô lành tính khác biệt nhau một cách rõ rệt.
Chúng ta có thể dùng một trong hai phương pháp PCR bán định lượng và định lượng trên để đánh giá mức
độ sao chép của HIP trong chẩn đoán bệnh ung thư.
Từ khóa: HIP/L29; cancer; transcript.

ABSTRACT
THE DETERMINATION HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN (HIP) TRANSCRIPT IN
CANCER TISSUES USING SEMIQUANTITATIVE PCR AND QUANTITATIVE PCR METHODS
Tran Van Khanh, Ta Thanh Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 – Supplement of No 3 – 2007: 36 – 40
Semiquantitative PCR and quantitative PCR are accurate and simple methods. They are commonly
used to determine amplified gene levels in PCR reaction.
Objective: Using semiquantitative PCR and quantitative PCR methods to determine HIP transcript
levels in cancer and normal tissue; to evaluate sensibility of tow methods.

Methods: mRNA was extracted from cancer and normal tissues, cDNA synthesis by reverse
transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR); HIP transcript determination using semiquantitative PCR
and quantitative PCR methods.
Results: Both methods showed the same results: HIP transcript was up regulated in cancer tissues.
Conclusion: Levels of HIP transcript was different between cancer tissue and the normal control.
Semiquantitative PCR and quantitative PCR are useful methods to determine HIP transcript for cancer
diagnosis.
Key words: HIP/L29; cancer; transcript

ĐẶT VẤNĐỀ
Heparin và heparansulfate (HP/HS) là đại
phân tử mang điện âm với độ sulphate hóa rất

cao, chính vì vậy chúng có khả năng tương tác
với nhiều loại protein trong các quá trình sinh
học khác nhau và đóng vai trò rất quan trọng
trong việc hình thành và duy trì cấu trúc chức

* Trường Đại học Y Hà Nội

36

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007
năng của tế bào(6). Daniel D. Carson và cộng sự
đã phát hiện ra một protein bề mặt tế bào biểu
mô thận người và một số dòng tế bào khác,
protein này được đặt tên là Heparansulphat

Interacting Protein (HIP)(2). Đây là một protein
có chiều dài 155 aa với trọng lượng phân tử
khoảng 18 kDa(3). Khi nghiên cứu sâu hơn về
chức năng sinh học của HIP các tác giả đã phát
hiện ra rằng HIP cũng có chức năng tương tự
như những protein gắn ái lực với HP/HS và
chúng được tổng hợp nhiều ở các dòng tế bào
nội mạc và tế bào biểu mô trưởng thành. Một
số nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng
HIP được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế
bào và mô ung thư ở cả mức độ RNA thông
tin và protein như: ung thư tuyến giáp trạng
và ung thư vú, ung thư đại tràng... Đặc biệt
mức độ biểu hiện của HIP liên quan chặt chẽ
với quá trình phát triển và xâm lấn của ung
thư và phụ thuộc vào mức độ ác tính của các
dòng ung thư(1,7). Việc nghiên cứu tìm hiểu cơ
chế ung thư ở mức độ phân tử, từ đó tìm ra
phương pháp chẩn đoán hữu hiệu và điều trị
sớm là một lĩnh vực đang được rất nhiều nhà
khoa học quan tâm. Trong một vài nghiên cứu
gần đây, bằng phương pháp RT-PCR chúng
tôi đã phát hiện thấy mRNA của HIP được sao
chép với một lượng đáng kể trong mô ung thư
vú và ung thư tuyến tiền liệt trong khi đó
không phát hiện được hoặc phát hiện rất thấp
ở mô u xơ(4,5). Trong nghiên cứu này, chúng tôi
đã sử dụng phương pháp RT-PCR bán định
lượng và định lượng để xác định mức độ sao
chép của HIP ở mô ung thư, từ đó so sánh kết

quả, đánh giá độ tin cậy của 2 phương pháp
trên để ứng dụng chúng xác định mức độ sao
chép của HIP và các gen khác trong chẩn đoán
bệnh ung thư.

ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
Đối tƣợng
30 bệnh nhân ung thư được chẩn đoán xác
định dựa trên lâm sàng, cận lâm sàng (siêu
âm, hoá sinh, mô bệnh học) tại Bệnh viện K

Nghiên cứu Y học

Hà nội. Chúng tôi sử dụng 15 mẫu mô lành
tính để làm đối chứng.

Phƣơng pháp nghiên cứu
Tách chiết mRNA và tổng hợp cDNA
RNA tổng số được tách chiết từ mô ung
thư theo quy trình chuẩn đã được mô tả trước
đây(5). 5µg RNA tổng số được sử dụng để tổng
hợp chuỗi cDNA bổ xung bằng phản ứng
reverse transcript-polymerase chain reaction
RT- PCR.
Phương pháp PCR bán định lượng
Cặp mồi đặc hiệu với HIP có trình tự như
sau: HIP-F: 5’-GCT TAT GGT GCA GAC ATG
G -3’; HIP-R: 5’-CAG AGA TAT CTA CTC
TGA AGC-3’. PCR được tiến hành với tổng
thể tích 20µl gồm: 4 µl cDNA, 2 µl 10x Ex Taq

Buffer, 2 µl 2.5mM dNTPs, 10 pmol mồi xuôi
và ngược, 1 unit Ex Taq Polymerase (Takara
Bio Inc.Kyoto, Japan). Chu trình nhiệt của
phản ứng PCR như sau: Biến tính 940C - 5
phút, 35 chu kỳ 940C - 50 giây, 580C - 50 giây,
720C - 50 giây , 720C - 5 phút. Sử dụng gen nội
chuẩn GAPDH để đánh giá chất lượng RNA
và so sánh lượng mẫu sử dụng trong phản
ứng RT-PCR. Đậm độ mỗi vạch HIP và
GAPDH được xác định nhờ phần mềm chuyên
dụng. Mức độ sao chép của HIP được tính bằng tỉ
lệ HIP/GAPDH rồi vẽ đồ thị.
Phương pháp PCR định lượng
(Agilent 2100 Bioanalyzer with DNA 1000
Lab Chips; Agilent Technologies, Palo Alto,
CA): Phương pháp PCR định lượng được ứng
dụng để đánh giá độ tin cậy của phương pháp
trên. Quy trình PCR được tiến hành tương tự
như phương pháp PCR bán định lượng. Vì
phương pháp này rất nhạy và có thể đánh giá
được mức độ sao chép của HIP cho dù ở mức
độ rất thấp nên chu kỳ của phản ứng được
giảm từ 35 xuống 24 chu kỳ. Sản phẩm PCR
sau đó được điện di trên hệ thống capillary
(Capillary electrophoresis) và mức độ sao
chép của HIP được xác định thông qua hệ
thống máy tính. Kết quả PCR định lượng được

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh – Tế Bào Bệnh Học

37


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007

Nghiên cứu Y học

biểu thị trên đồ thị tương ứng với các đỉnh.
GAPDH cũng được sử dụng để so sánh lượng
mẫu sử dụng trong mỗi phản ứng.

và mẫu lành tính. Sau khi được điện di trên
agarose 2%, sản phẩm PCR nhận được có kích
thước phân tử 444 bp (hình 1a). Quan sát
chúng ta thấy đậm độ vạch PCR ở những mẫu
ung thư rõ hơn so với những mẫu lành tính,
kết quả gợi ý rằng HIP tăng cường sao chép ở
những mô ung thư trong khi đó sao chép rất thấp
ở những mô lành tính.

KẾT QUẢ NGHIÊNCỨU
Để xác định mức độ sao chép của HIP, sử
dụng cặp mồi đặc hiệu với HIP chúng tôi tiến
hành phản ứng RT-PCR bán định lượng trên
những mẫu RNA tổng số tách từ mẫu ung thư

a.

1

2

3

4

5

6

7

HIP

GAPDH

b.
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20

1

0
1

2
2

3
3

4

5

4

5

6
6

7
7

Hình 1: Kết quả của phản ứng RT-PCR của HIP và GAPDH ở mô ung thư và mô lành tính (a). Sản phẩm
được khuyếch đại từ cDNA của mô ung thư (1-5) và mô lành tính (6-7). Kết quả định lượng của
HIP/GAPDH tương ứng với hình a đã được tính và vẽ đồ thị (b).
Nhận xét: Sản phẩm PCR đặc hiệu của gen

mRNA tốt đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng,

GAPDH trên những mẫu ung thư và những

đồng thời không có sự khác biệt về lượng mẫu

mẫu lành tính tương ứng có kích thước 350 bp

đã sử dụng trong mỗi phản ứng PCR. Kết quả vẽ

(hình 1a). GAPDH là một gen thể hiện trên

đồ thị của tỉ lệ HIP/GAPDH ở hình 1b cho thấy

mọi tế bào, không phụ thuộc vào thể loại,

HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở những

trạng thái hoạt động hay nguồn gốc nên được

mô ung thư trong khi đó phát hiện được rất thấp

dùng như một gen nội chuẩn. Kết quả của

trên những mẫu lành tính. Điều này khẳng định

phản ứng khuếch đại GAPDH chỉ ra rằng cả 7

rõ sự khác biệt về mức độ biểu hiện của HIP ở

bệnh nhân nghiên cứu đều có chất lượng

mô ung thư so với mô lành tính.

38

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007

M

Nghiên cứu Y học

G

H
M
M

1
M

M

H

M
G

M

M

2
M

M

3**

G

M

i

3
***

***

G

***

4
***

***

M
M

M

G
M

***

5
***

G

6

***

***

M

***

M

G

7

***

***

M

HIP

M

GAPDH

Hình 2: Hình ảnh của phản ứng RT-PCR định lượng. Kết quả PCR định lượng của HIP tương ứng với đỉnh
H ở mô ung thư và mô lành tính (bên trái). Kết quả PCR của gen GAPDH tương ứng với đỉnh G (bên
phải). Đỉnh M tương ứng với marker 15 và 1500 bp. Sản phẩm được khuyếch đại từ cDNA của mô ung thư
(1-5) và mô lành tính (6-7)
phản ứng. Kết quả này một lần nữa khẳng
Nhận xét: Kết quả PCR định lượng đánh
định HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở
giá mức độ sao chép của HIP sử dụng hệ
những mô ung thư.
thống điện di cappilary (hình 2) chỉ rõ: đỉnh H
(bên trái) tương ứng với mức độ mức độ biểu
hiện của HIP ở những mẫu ung thư (1-5) cao
hơn rõ ràng so với những mẫu lành tính (6-7)
trong khi đó đỉnh G (bên phải) tương ứng với
mức độ biểu hiện của gen GAPDH không thấy
có sự khác biệt, điều này chứng tỏ không có sự
khác biệt về lượng mẫu sử dụng trong mỗi

BÀNLUẬN
Việc nghiên cứu tìm hiểu những gen tăng
cường tổng hợp ở mô ung thư sẽ giúp hiểu rõ
hơn về cơ chế phân tử của bệnh, từ đó cho
phép chúng ta tìm ra những marker có giá trị
để chẩn đoán xác định và mức độ tiến triển

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh – Tế Bào Bệnh Học

39


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007

của mô ung thư. HIP là một protein bề mặt tế
bào được phát hiện lần đầu tiên ở dòng tế bào
biểu mô thận người và được tổng hợp rất
nhiều ở các dòng tế bào nội mạc và tế bào biểu
mô trưởng thành. HIP gắn trực tiếp vào
Heparin, một loại protein có khả năng tương
tác với nhiều loại protein khác nhau vì vậy
HIP tham gia vào quá trình liên kết tế bào – tế
bào, tế bào – khoảng gian bào. Rohde và cộng
sự đã chứng minh rằng HIP giúp cho những tế
bào trophoblast gắn vào biểu mô thận và tăng
cường quá trình xâm lấn tế bào. Một vài
nghiên cứu trong và ngoài nước gần đây đã

chứng minh rằng HIP được tăng cường tổng
hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả mức
độ RNA thông tin và protein(1,4,5,7). Sự tăng
cường tổng hợp của HIP ở những mô ung thư
sẽ thúc đẩy sự tương tác tế bào-tế bào, tế bàongoại bào đồng thời nó có thể đóng vai trò
quan trọng cho sự phát triển, khư trú và xâm
lấn của khối u.
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã dùng
phương pháp RT-PCR bán định lượng và định
lượng để xác định mức độ biểu hiện của gen
HIP ở mô ung thư so sánh với mô lành tính.
Đây là những kỹ thuật đơn giản, chính xác và
cho độ tin cậy tương đối cao. Cả 2 phương
pháp này đều cho kết quả tương tự như nhau:
HIP được tăng cường tổng hợp rất rõ ở những
mô ung thư trong khi đó phát hiện được rất
thấp ở mô lành tính. Điều này giúp cho chúng
tôi có những định hướng tiếp theo và có thể
ứng dụng những phương pháp này như một
công cụ hữu ích không chỉ trong việc đánh giá
mức độ biểu hiện của HIP ở những mô ung
thư mà trong cả việc nghiên cứu tìm hiểu
đánh giá mức độ biểu hiên của những marker
khác trong chẩn đoán bệnh ung thư.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp
với các nghiên cứu của các tác giả nước ngoài
cho thấy mức độ sao chép mRNA của HIP
được tăng cường ở dòng tế bào và mô ung thư

40

trong khi đó không biểu hiện hoặc biểu hiện
rất thấp ở mô lành tính. Sự tăng cường tổng
hợp của HIP ở những mô ung thư cho phép
chúng ta kết luận rằng, HIP có mối liên hệ
chặt chẽ với sự phát triển mô ung thư và có
thể dùng HIP như một marker có giá trị góp
phần chẩn đoán bệnh ung thư.

KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên cho
phép chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
- Mức độ biểu hiện của HIP giữa mô ung
thư và mô lành tính khác biệt nhau một cách
rõ rệt.
- Cả 2 phương pháp PCR bán định lượng
và định lượng đều cho kết quả tương tự nhau
với độ tin cậy cao. Chúng ta có thể dùng một
trong hai phương pháp này để đánh giá mức
độ sao chép của HIP và một số marker khác
trong chẩn đoán xác định bệnh ung thư.

TÀI LIỆU THAM KHẢO.
1.

2.

3.

4.

5.

6.
7.

De Nigris, F., Visconti, R.,Fusco, A., et al. (1998).
Overexpression of the HIP gene coding for a heparin/
heparin sulfate – binding protein in human thyroid
carcinomas. Cancer Res. 58, 4745-4751.
Jacobs, A.L., Julian, J.A., Sahin, A.A., and Carson, D.D.
(1997). Heparin/Heparansulfate interacting protein
expression and functions in human breast cancer cells and
normal breast epithelia. Cancer Research 57, 5148-5154.
Liu. S., Smith, E. Sott, Julian, J., Rohde, H.L, Karin, J.
Norman., and Carson, D.D. (1996). cDNA Cloning and
expression of HIP, a novel cell surface heparan
sulfate/heparin-binding protein of human uterine
Epithelial cells and cell lines. Journal of biological
chemistry.271, 11817-11823.
Nguyễn Thị Phương Ngọc, Trần Vân Khánh, Đào Kim
Chi, Phạm Thị Lý và Tạ Thành Văn (2006). Tăng cường
tổng hợp heparan sulfate interacting protein ở mô ung
thư tuyến tiền liệt. Tạp chí dược học. 367, 132-135.
Phan Tôn Hoàng và Tạ Thành Văn (2005). Sự sao chép
Heparin/Heparan Sulfate Interacting Protein (HIP) ở mô
ung thư vú. Tạp chí nghiên cứu Y học. 38, 5-10.
Tạ Thành Văn (1989). Heparin: Sự tương tác với protein
Tạp chí nghiên cứu Y học 6, 69-72.
Wang, Y., Cheong, D., Chan, S., Chuan Hooi, S. (1997).

heparin/heparan sulfate interacting protein gene
expression is up – regulated in human colorectal
carcinoma and correlated with differentiation status and
metastasis. Cancer Res. 59, 2989-2994.

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học