Ứng dụng kỹ thuật reverse transcriptase‐PCR để phát hiện tổ hợp gen BCR/ABL trong bệnh bạch cầu kinh dòng hạt tại Bệnh viện Trung ương Huế

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 

Nghiên cứu Y học

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REVERSE TRANSCRIPTASE‐PCR  
ĐỂ PHÁT HIỆN TỔ HỢP GEN BCR/ABL TRONG BỆNH BẠCH CẦU  
KINH DÒNG HẠT TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG HUẾ 
Bùi Thị Thu Thanh*, Nguyễn Duy Thăng*, Nguyễn Thị Hồng Hạnh*, Ngô Tứ Cương*, Hồ Thành*, 
 Nguyễn Văn Sơn*, Nguyễn Thị Thu Hiền*, Phan Hoàng Duy*, Hoàng Thị Thanh Trang*, Trần Ngọc Vũ* 
Bạch cầu kinh dòng hạt là bệnh lý hay gặp nhất trong hội chứng tăng sinh tủy, được đặc trưng bởi sự tăng 
sinh nổi trội của bạch cầu dòng hạt và sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia. Nhiễm sắc thể Philadelphia có 
khoảng hơn 90% trường hợp và được xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán bạch cầu kinh dòng hạt. Trong 
thời đại điều trị bệnh bằng liệu pháp nhắm đích dựa trên cơ chế bệnh sinh của bệnh, đòi hỏi phải hiện đại hóa các 
kỹ thuật khảo sát nhiễm sắc thể Philadelphia. Khuếch đại chuỗi gen là phương pháp tiên tiến, được ứng dụng để 
xác định sự tồn tại của tổ hợp gen BCR/ABL trong bệnh bạch cầu kinh dòng hạt. Đây là kỹ thuật có độ nhạy và 
độ đặc hiệu cao, giúp cho việc chẩn đoán bệnh bạch cầu kinh dòng hạt nhanh chóng và chính xác hơn.  
Mục tiêu: Xác định tỷ lệ gen tổ hợp BCR/ABL ở bệnh nhân bạch cầu kinh dòng hạt bằng kỹ thuật khuếch 
đại chuỗi gen. So sánh tỷ lệ gen tổ hợp BCR/ABL (kỹ thuật PCR) với tỷ lệ nhiễm sắc thể Philadelphia (kỹ thuật 
nuôi cấy tế bào) ở bệnh nhân bạch cầu kinh dòng hạt. 
Đối tượng và phương pháp: 30 bệnh nhân được chẩn đoán bạch cầu kinh dòng hạt dựa vào hình thái học tế 
bào đến điều trị tại khoa Huyết học Lâm sàng‐Bệnh viện Trung ương Huế. Những bệnh nhân này được tiến 
hành đồng thời 3 kỹ thuật: nuôi cấy tế bào tủy xương tìm NST Ph, nuôi cấy tế bào máu ngoại vi tìm NST Ph và 
kỹ thuật khuếch đại chuỗi gen tìm tổ hợp gen BCR/ABL. 
Kết quả: Tỷ lệ NST Ph bằng phương pháp nuôi cấy tế bào là 70%, tỷ lệ BCR/ABL bằng phương pháp PCR 
là 96,7%.  
Kết  luận: Khi khảo sát tỷ lệ NST Ph hoặc tỷ lệ tổ hợp gen BCR/ABL, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê 
giữa hai phương pháp nuôi cấy tế bào và phương pháp PCR với p < 0,05. Độ phù hợp K giữa kỹ thuật nuôi cấy tế 
bào với kỹ thuật PCR: K = 0,18. 
Từ khóa: Nhiễm sắc thể Philadelphia, Bệnh bạch cầu kinh dòng hạt. 

ABSTRACT 

USING REVERSE TRANSCRIPTASE‐PCR ASSAY TO DETECT BCR/ABL FUSION GENE  
IN CHRONIC MYELOGENEOUS LEUKEMIA IN HUE CENTRAL HOSPITAL 
Bui Thi Thu Thanh, Nguyen Duy Thang, Nguyen Thi Hong Hanh, Ngo Tu Cuong, Ho Thanh, 
 Nguyen Van Son, Nguyen Thi Thu Hien, Phan Hoang Duy, Hoang Thi Thanh Trang, Tran Ngoc Vu 
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 205 - 211 
Chronic Myelogeneous Leukemia (CML) is the most common disease of myeloproliferative neoplasm and is 
characterized  by  proliferation  of  granulocyte  leukocytes  and  the  presence  of  the  Philadelphia  chromosome. 
Philadelphia chromosome is more 90% of cases and is considered the gold standard in the diagnosis of CML. In 
this  era  of  treatment  by  targeting  therapy  based  on  the  pathogenesis  of  the  disease,  requiring  technical 
modernization of the Philadelphia chromosome is necessary. RT‐PCR is one of advanced methods to determine 
BCR/ABL  fusion  gene  in  CML.  These  techniques  have  the  high  sensitivity  and  specificity,  and  help  in  the 
* Trung tâm Huyết học Truyền máu – Bệnh viện Trung ương Huế 
Tác giả liên lạc: ThS. Bùi Thị Thu Thanh 
 ĐT: 0905032055 

Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học 

 Email:  

205


Nghiên cứu Y học 

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013

diagnosis of CML quickly and accurately. 
Objective: Determining the rate of BCR/ABL fusion gene in CML by using RT‐PCR, comparing the rate of 
BCR/ABL fusion gene (using RT‐PCR) with the rate of Philadelphia chromosome (using cell culture methods) in 
CML. 

Methods:  30  patients  were  diagnosed  CML  based  on  cell  morphology  and  treated  at  the  Department  of 
Clinical Hematology‐Hue Central Hospital. These patients were simultaneously conducted three techniques: cell 
culture of bone marrow and cell culture of peripheral blood to find Ph1 chromosome and PCR techniques to find 
BCR/ABL fusion gene. 
Results: Ph chromosome (+) in the cell culture method was 70% and BCR/ABL (+) by RT‐PCR was 96.7%. 
Conclusion: There is the significant difference between cell culture and RT‐PCR (p < 0.05) and their match 
was 0.18 (K = 0.18). 
Keywords: Philadelphia Chromosome, Chronic Myelogeneous Leukemia. 

ĐẶT VẤN ĐỀ 

ĐỐI TƯỢNG ‐PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 

Bạch  cầu  kinh  dòng  hạt  (CML)  là  bệnh  lý 
hay  gặp  nhất  trong  hội  chứng  tăng  sinh  tủy, 
đặc trưng bởi sự tăng sinh nổi trội dòng bạch 
cầu  hạt  và  sự  xuất  hiện  nhiễm  sắc  thể  (NST) 
Philadelphia  (Ph),  do  chuyển  đoạn  t(9;22)  tạo 
ra  gen  tổ  hợp  BCR/ABL.  Trong  CML,  NST  Ph 
có mặt ở hơn 90% bệnh nhân, được xem là tiêu 
chuẩn  vàng  trong  chẩn  đoán  bệnh(6,9).  Sự  hiểu 
biết  rõ  ràng  về  cơ  chế  bệnh  sinh  của  bệnh  đã 
mở  ra  thời  đại  của  các  thuốc  ức  chế  tyrosine 
kinase,  chúng  tác  động  trực  tiếp  và  chính  xác 
lên  sự  hình  thành  gen  đột  biến(1,4).  Ở  BVTW 
Huế, việc khảo sát NST Ph bằng kỹ thuật nuôi 
cấy  tế  bào mang  lại  hiệu  quả  không  cao,  tỷ  lệ 
phát  hiện  NST  Ph  còn  thấp.  RT‐PCR  là  kỹ 
thuật sinh học phân tử có thể phát hiện chính 
xác  tổ  hợp  gen  BCR/ABL  ở  bệnh  nhân  CML. 

RT‐PCR  có  độ  nhạy  và  độ  đặc  hiệu  cao,  tiết 
kiệm thời gian, giúp cho việc chẩn đoán bệnh 
CML  nhanh  chóng  và  chính  xác  hơn,  nhờ  đó 
bệnh nhân CML được điều trị sớm và điều trị 
đích. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện nghiên 
cứu này với 2 mục tiêu: 

Đối tượng nghiên cứu 

‐ Xác định tỷ lệ gen tổ hợp BCR/ABL trên bệnh 
nhân CML bằng kỹ thuật RT‐PCR. 
‐  So  sánh  tỷ  lệ  gen  tổ  hợp  BCR/ABL  (kỹ  thuật 
RT‐PCR)  với  tỷ  lệ  nhiễm  sắc  thể  Philadelphia  (kỹ 
thuật nuôi cấy tế bào) ở bệnh nhân CML. 

206

30  bệnh  nhân  từ  15  tuổi  đến  66  tuổi  (tuổi 
trung  bình  50,43  ±  18,21)  trong  đó  13  nam 
(43,3%) và 17 nữ (56,7%), được chẩn đoán CML 
và  điều  trị  tại  khoa  Huyết  học  Lâm  sàng‐Bệnh 
viện Trung ương Huế từ 5/2011 đến 8/2012. 

Tiêu chuẩn chẩn đoán 
Theo  tiêu  chuẩn  của  Tổ  chức  Y  tế  Thế  giới 
(WHO) năm 2008, bên cạnh sự có mặt gần như 
là hằng định của NST Ph1, chẩn đoán CML cũng 
có  thể  dựa  vào  việc  đánh  giá  hình  thái  học  tế 
bào[9]. 
+ Lâm sàng: Da xanh, thiếu máu, sốt, sút cân, 

lách to, gan to và hạch to. 
 Trong đó, lách to là dấu hiệu đặc trưng nhất. 
+ Cận lâm sàng 
*  Huyết  đồ:  Bạch  cầu  tăng  cao  >  50  x  109/l 
(85% trường hợp). Công thức bạch cầu: 90 ‐ 95% 
tế  bào  thuộc  dòng  hạt,  luôn  có  bạch  cầu  giai 
đoạn trung gian.  Hình  thái  các tế  bào  dòng hạt 
bình  thường.  Giảm  tế  bào  dòng  lympho  và 
mono. 
 *  Tủy  đồ:  Tăng  sinh  mạnh  các  dòng  tế  bào 
máu,  đặc  biệt  là  dòng  bạch  cầu  hạt,  chiếm  90  ‐ 
95%  tế  bào  có  nhân,  có  đầy  đủ  tất  cả  các  giai 
đoạn trưởng thành. 

Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 
Tiêu chuẩn loại trừ 
Các  trường  hợp  thuộc  hội  chứng  tăng  sinh 
tủy ác tính khác; phản ứng giả Lơxêmi; CML giai 
đoạn  chuyển  cấp;  CML  đã  qua  điều  trị  bằng 
thuốc ức chế tyrosine kinase. 

Nghiên cứu Y học
Phương pháp nghiên cứu 

 

Thiết kế nghiên cứu 

Mô tả cắt ngang 

Quy trình nghiên cứu 
CML (lâm sàng và hình thái tế bào)

Nuôi cấy tế bào
tủy xương tìm NST
Ph

Nuôi cấy tế bào
máu ngoại vi tìm
NST Ph

Xét nghiệm RT-PCR
tìm tổ hợp gen BCR/ABL

trong tủ ấm 370C trong 72 giờ. Ngừng quá trình 
phân chia NST ở giờ 71. 

Kỹ thuật thực hiện 
Phương pháp nuôi cấy tế bào 
‐  Cho  1ml  tủy  xương  đã  được  điều  chỉnh 
lượng  bạch  cầu  trong  mẫu  về  5‐10  x  109/lít  vào 
ống  môi  trường  nuôi  cấy  chứa  5ml  RPMI  1640, 
1ml  FBS.  Ủ  trong  tủ  ấm  370C  trong  24  giờ. 
Ngừng quá trình phân chia NST ở giờ 23. 
‐ Cho 1ml máu ngoại vi đã được điều chỉnh 
lượng  bạch  cầu  trong  mẫu  về  5‐10  x  109/lít  vào 
ống  môi  trường  nuôi  cấy  chứa  5ml  RPMI  1640, 
1ml  FBS,  80l  PHA‐M  và  40μl  kháng  sinh.  Ủ 

‐  Thu  hoạch  NST  bằng  phương  pháp  sốc 
nhược trương. 
‐ Dàn cặn tế bào lên lam kính. 
‐ Nhuộm băng G. 
‐ Công thức NST được đọc và phân tích theo 
ISCN  (An  International  System  for  Human 
Cytogenetic  Nomenclature)  2005  và  phần  mềm 
Epo 4.5. 

 
                                                                         NST Ph1  
Hình ảnh nhuộm băng G 
Phương pháp khuếch đại chuỗi gen  
Dùng 

kỹ 

thuật 

RT‐PCR 

(Reverse 

Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học 

Transcriptase ‐ Polymerase Chain Reaction) theo 
quy trình của hãng DNA Technology A/S. 

207

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013

Nghiên cứu Y học 
‐ Ly trích RNA từ máu ngoại vi bằng bộ kít 
QIAampRRNA Blood Mini Kit (Qiagen). 
‐  Tổng  hợp  cDNA  bằng  bộ  kít  HV04‐RM 
(Bio‐rad). 
+ Trong ống PCR 0.2ml, cho vào 3.5μl dung 
dịch  chứa  đoạn  mồi  cDNA  và  8μl  RNA.  Trộn 
nhẹ nhàng bằng pipette rồi đậy nắp ống lại. 
+ Trong ống chứng âm, cho vào 3.5μl dung 
dịch chứa đoạn mồi cDNA và 8μl nước cất. 

+ Đặt các ống vào hệ thống luân nhiệt và bắt 
đầu  quá  trình  luân  nhiệt  ngay  với  chương  tình 
sau: 

Chương trình PCR xác định BCR/ABL 
Bước
1
2

3

+ Khởi động hệ thống luân nhiệt ở 650C. 
+  Đặt  các  ống  PCR  vào  buồng  ủ  của  máy 
luân  nhiệt,  ủ  mẫu  ở  650C  trong  5  phút  để  làm 
biến tính mẫu. 

4

Thời gian / nhiệt độ
15 phút / 950C
30 giây / 950C
60 giây / 650C-0.20C/chu kỳ
1 phút 30 giây / 720C
30 giây / 950C
30 giây / 620C
1 phút 30 giây / 720C
Giữ ở 40C

Số chu kỳ
1
15

22
1

‐  Phát  hiện  gen  tổ  hợp  BCR/ABL  bằng  điện 
di trên thạch agarose. 

+ Thêm 8.5μl dung dịch tổng hợp cDNA vào 
mỗi ống. Trộn nhẹ nhàng bằng pipette. 

+  Pha  thạch  agarose  1.5%  trong  dung  dịch 
đệm  TBE  1x  có  chất  nhuộm  màu  Ethidium 
Bromide. 

+ Đặt các ống vào máy luân nhiệt và lập tức 
khởi động sự tổng hợp cDNA theo chương trình 
dưới đây: 

+ Thêm 3μl dung dịch đệm TBE 10x vào mỗi 
ống  phản  ứng  PCR.  Cho 15μl  dung  dịch  ở  mỗi 
ống vào mỗi giếng trên thạch. 

+ Lập tức chuyển mẫu sang khay đá lạnh. 

+ Thang chuẩn 50bp: 5μl / giếng. 

Chương trình tổng hợp cDNA 
Bước
1
2
3

Thời gian / Nhiệt độ
45 phút / 370C
5 phút / 950C
Giữ ở 40C

Số chu kỳ
1
1
1

+ Tiến hành khuếch đại cDNA ngay hoặc có 
thể bảo quản mẫu ở 50C trong 2 ngày. 

‐  Khuếch  đại  cDNA  bằng  bộ  kít 
HemaVisionR 9;22 (DNA‐technology A/S) 
+  Chuẩn  bị  PCR  polymerase  mix  (thao  tác 
trên khay đá lạnh). 
PCR  polymerase  mix  dùng  cho  một  phản 
ứng chứa: 

+  Chạy  điện  di  30  phút  với  dung  dịch  đệm 
TBE 1x. 
+ Đọc kết quả bằng máy đọc UV. 
‐ Nhận định kết quả 
Một  phản  ứng  RT  ‐  PCR  được  đánh  giá  là 
âm tính với gen tổ hợp BCR/ABL nếu trên hình 
ảnh điện di chỉ có băng chứng nội tại 983bp. 
Một  phản  ứng  RT  ‐  PCR  được  đánh  giá  là 
dương  tính  với  gen  tổ  hợp  BCR/ABL  nếu  trên 
hình  ảnh  điện  di  có  băng  480bp  hoặc  555bp. 
Trong  trường  hợp  này,  băng  983  có  thể  bị  mờ 
hoặc bị mất hoàn toàn. 

2.5μl đệm HotStart PCR 10x 
0.5μl dNTP mix 
0.4 μl HotStartaq DNA polymerase 
13.6μl H2O 
Tổng thể tích: 17μl. 
+ Trộn nhẹ nhàng bằng pipette. 
+ Thêm 5μl PCR primermix.  
+ Thêm 3μl cDNA. 
+  Thêm  3μl  chứng  âm  đã  chuẩn  bị  ở  bước 
trên vào ống chứng âm.  

208

 
Tổ hợp gen BCR/ABL  

Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 
Một  phản  ứng  RT  ‐  PCR  được  đánh  giá  là 
thất  bại  nếu  trên  hình  ảnh  điện  di  không  xuất 
hiện bất cứ một băng nào. 

Xử lý số liệu 
Xử  lý  số  liệu  bằng  phần  mềm  SPSS  phiên 
bản  15.0  (Statistical  Package  for  Social  Science, 
SPSS  Inc.,  Chicago,  IL).  Kết  quả  được  thể  hiện 
dưới dạng trị trung bình và độ lệch chuẩn.  
Dùng test 2 so sánh kết quả thu được, có ý 
nghĩa  khi  p  <  0,05.  Đánh  giá  mức  độ  phù  hợp 
giữa  2  phương  pháp  xét  nghiệm  theo  hệ  số 
Kappa. 

Nghiên cứu Y học
Dấu hiệu thiếu máu khá rõ ràng với số lượng 
hồng  cầu  (SLHC)  trung  bình,  Hb  trung  bình 
giảm.  Số  lượng  bạch  cầu  (SLBC)  tăng  cao,  bạch 
cầu hạt chiếm ưu thế, với đầy đủ các giai đoạn 
từ non đến già. Lympho, mono trong máu ngoại 

vi  giảm  rõ  rệt.  Số  lượng  tiểu  cầu  (SLTC)  trong 
máu ngoại vi tăng. 
Bảng 3. Đặc điểm tủy 
Chỉ số
SLTB tủy (x109/l)

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN  
Đặc điểm lâm sàng và đặc điểm huyết tủy 
đồ của mẫu nghiên cứu 

Tỷ lệ % các giai đoạn
của bạch cầu hạt

Bảng 1. Đặc điểm lâm sàng 
Lâm sàng
Lách to
Gan to
Thiếu máu

n
20
7
27

%
66,7
23,3
90,0

Kết quả cho thấy: Dấu chứng thiếu máu gặp 

ở 90,0%, lách to chiếm tỷ lệ 66,7%, gan to gặp ở 
23,3% bệnh nhân. Với CML, thiếu máu và lách to 
là 2 dấu chứng chủ yếu. Trong mẫu nghiên cứu 
của  chúng  tôi,  thiếu  máu:  90%,  lách  to:  66,7%. 
Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Dũng (82%) cho 
thấy tỷ lệ thiếu máu trong giai đoạn mạn tính là 
82%  và  lách  to  là  89,7%.  Về  tình  trạng  lách  to, 
nghiên cứu của Peruta có tỷ lệ là 57,14%(5,7).  
Bảng 2. Đặc điểm máu ngoại vi 
Chỉ số
SLHC (x1012)
Hb (g/l)
SLBC (x109/l)
SLTC (x109/l)
Tỷ lệ % các giai đoạn
chưa trưởng thành
của BC hạt
BCTT (%)
BC ưa acid (%)
BC ưa base (%)
Mono (%)
Lympho (%)

NTB
TTB
TB
HTB
Stab

X ±SD

3,20±0,80
92,41±19,87
116,12±93,21
477,13±347,60
2,37±3,07
3,17±3,13
8,03±5,50
9,47±5,53
13,00 ± 6,75
46,30 ± 18,27
3,13 ± 3,33
3,80 ± 6,37
2,47 ± 3,88
8,03 ± 9,53

Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học 

NTB
TTB
TB
HTB
Stab
BCTT
BC ưa acid
BC ưa base
Mono
Lympho

X ±SD
188,58±120,02

3,50±3,10
4,17±2,91
10,10±4,12
12,10±4,62
14,17±4,98
29,53±13,87
2,33±2,58
2,60±4,32
1,13±1,14
5,90±11,61

Kết  quả  nghiên  cứu  cho  thấy:  Số  lượng  tế 
bào  (SLTB)  tủy  tăng.  Các  tế  bào  bạch  cầu  dòng 
hạt chiếm ưu thế với đầy đủ các giai đoạn Mono 
và  lympho  giảm  mạnh.  Lượng  tế  bào  tủy 
xương  trong  nghiên  cứu  của  Nguyễn  Ngọc 
Dũng  là  404,7±144,3  (x109/l)  với  tế  bào  blast 
4,6±1,2  (%),  tủy  bào  14,2±1,7  (%),  hậu  tủy  bào 
13,9±1,7  (%),  bạch  cầu  đũa  7,6±2,4  (%),  bạch 
cầu  đoạn  trung  tính  43,7±3,1  (%),  bạch  cầu  ưa 
acid 3,1±1,3 (%), bạch cầu ưa base 4,6±2,2 (%).  
Mặc dù có một số khác biệt với nghiên cứu 
của  chúng  tôi  (có  lẽ  do  thời  điểm  làm  tủy  đồ 
khác  nhau)  nhưng  nhìn  chung,  công  thức  bạch 
cầu ở tủy cho thấy, tủy tăng sinh mạnh mẽ với 
sự giàu quá mức các tế bào tủy, các tế bào dòng 
hạt  chiếm  ưu  thế  và  có  đầy  đủ  các  giai  đoạn 
trưởng thành, không có khoảng trống bạch cầu. 

Tỷ  lệ  nhiễm  sắc  thể  Ph  trên  bệnh  nhân 

bạch cầu kinh dòng hạt 
Bảng 4. Tỷ lệ thực hiện thành công của các phương 
pháp 
Số
trường hợp
Thành công
Thất bại

Nuôi cấy
TB tủy
23 (76,7%)
7 (23,3%)

Nuôi cấy
TB máu
27 (90%)
3 (10%)

PCR
30 (100%)
0

209


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013

Nghiên cứu Y học 
Nghiên cứu của Fitzgerald (n = 12) cho thấy: 
Tỷ lệ nuôi cấy tế bào tủy thành công là 83% và 

nuôi  cấy  TB  máu  thành  công  là  91,6%  với  tỷ  lệ 
NST Ph (+) là 100%. 
Tỷ lệ thành công của các phương pháp nuôi 
cấy tế bào giữa nghiên cứu của chúng tôi và của 
Fitzgerald  tương  đồng  nhau(2)  (p  >  0,05).  Tỷ  lệ 
Ph1  (+)  của  chúng  tôi  thấp  hơn  của  Fitzgerald 
nhưng  sự  khác  biệt  không  có  ý  nghĩa  thống  kê 
((p > 0,05). 
Với  kỹ  thuật  RT‐PCR  phát  hiện  tổ  hợp  gen 
BCR/ABL,  100%  các  mẫu  trong  nghiên  cứu  của 
chúng tôi đều thành công. Điều này khẳng định 
sự ưu việt của phương pháp PCR so với phương 
pháp nuôi cấy tế bào cổ điển. 
Bảng 5. Tỷ lệ Ph (+) hoặc gen tổ hợp BCR/ABL (+) 
theo từng phương pháp 
Kết quả
Dương tính
Âm tính
Tổng cộng

Nuôi cấy
TB tủy
20 (87%)
3 (13%)
23

Nuôi cấy
TB máu
18 (66,7%)
9 (33,3%)

27

PCR
29 (96,7%)
1 (3,3%)
30

Kết  quả  cho  thấy:  Ph  (+)  với  kỹ  thuật  nuôi 
cấy  tủy  là  20  trường  hợp  và  với  kỹ  thuật  nuôi 
cấy  máu  là  18  trường  hợp.  Khi  kết  hợp  cả  hai 
phương pháp cấy tủy xương và cấy máu thì có 
21 trường hợp (70%) Ph (+). Mặc dù tỷ lệ thành 
công khi nuôi cấy cao hơn so với cấy tủy, nhưng 
tỷ  lệ  NST  Ph  (+)  trong  cấy  máu  lại  thấp  hơn. 
Điều  này  có  lẽ  do  loại  PHA  sử  dụng  trong  cấy 
máu chưa mang lại hiệu quả tối ưu. 
Gen tổ hợp BCR/ABL (+) với kỹ thuật PCR là 
96,7% → PCR có độ nhạy cao. PCR đã góp phần 
chẩn đoán sớm và chính xác bệnh lý CML, đồng 
thời là tiêu chuẩn vàng để điều trị nhắm đích (ức 
chế tyrosine kinase) nhằm mục đích điều trị khỏi 
bệnh cho bệnh nhân. 
Bảng 6. Kết quả thu được của các phương pháp   
Ph1 hoặc BCR/ABL
Dương tính (%)
Âm tính hoặc thất bại về kỹ
thuật (%)

Nuôi cấy
PCR

tế bào
70
96,7
30

3,3

p

K

< 0,05 0,18

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: 
70% có Ph (+) với kỹ thuật nuôi cấy tế bào. Bằng 

210

phương  pháp  RT‐PCR,  tỷ  lệ  BCR/ABL  (+)  là 
96,7%.  Do  có  độ  nhạy  cao,  PCR  có  tỷ  lệ  gây 
dương tính giả cao. Tuy nhiên, vấn đề này có thể 
được  khắc  phục  bằng  một  số  biện  pháp  như: 
thực hiện các công đoạn ly trích, phản ứng PCR, 
điện di sản phẩm PCR ở từng địa điểm riêng biệt 
bằng các dụng cụ riêng biệt; dùng tia tử ngoại để 
loại bỏ các sản phẩm còn lại từ những lần thao 
tác trước; chia nhỏ các thành phần của phản ứng 
sao cho vừa đủ với một hoặc hai lần thao tác. 
Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tỷ 
lệ  Ph  (+)  của  phương  pháp  nuôi  cấy  tế  bào  và 

BCR/ABL(+) của PCR (p < 0,05). 
Độ phù hợp Kappa giữa hai phương pháp là 
K= 0,18. 
Kỹ thuật  PCR  mang  lại kết  quả  cao hơn  rất 
nhiều, gần với kết quả của các nghiên cứu khác: 
Fitzgerald (100%), T. Tomiyasu (95,3%)(2,8). Như 
vậy,  một  số  trường  hợp  CML  không  thể  phát 
hiện được đột biến t(9;22) khi phân tích bộ NST, 
lại có mặt tổ hợp gen BCR/ABL khi tiến hành với 
kỹ thuật RT‐PCR (26,7%). 
Công thức NST là xét nghiệm đầu tay nhằm 
phát hiện NST Ph khi chẩn đoán xác định CML, 
đánh giá mức độ lui bệnh về tế bào di truyền và 
tình  trạng  bệnh  tồn  lưu  tương  ứng.  Tuy  nhiên, 
đây là xét nghiệm có độ nhạy thấp (10‐2) và phụ 
thuộc  vào  việc  nuôi  cấy  tế  bào  và  kỹ  thuật 
nhuộm  băng  nên  dẫn  tới  khả  năng  thành  công 
không  cao(3).  Do  vậy,  khi  so  sánh  sự  phù  hợp 
giữa  phương  pháp  nuôi  cấy  tế  bào  và  phương 
pháp RT‐PCR tìm tổ hợp gen BCR/ABL, độ phù 
hợp Kappa rất thấp (K = 0,18). 
Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận giá trị 
của di truyền học tế bào. Đây là phương pháp cổ 
điển được sử dụng rất rộng rãi trên thế giới. Khi 
lập  công  thức  NST,  ngoài  xác  định  NST  Ph,  nó 
còn cho phép phát hiện các dạng đột biến không 
được tiên liệu trước, mà các tổn thương bổ sung 
này có thể là dấu hiệu CML đang chuyển từ pha 
mạn sang pha tăng tốc hoặc pha chuyển cấp. 
Tiếp  thu  những  thành  tựu  hiện  đại  phối 

hợp với các phương pháp cổ điển là cần thiết. 
Định  tính  tổ  hợp  gen  BCR/ABL  bằng  kỹ  thuật 

Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 

Nghiên cứu Y học
3.

PCR giúp bệnh nhân sớm tiếp cận với phác đồ 
điều trị đích. Bên cạnh đó, lập công thức NST 
để củng cố thêm cũng như để xác định các bất 
thường khác trên bộ NST của bệnh nhân. Phối 
hợp 2 phương pháp này sẽ đạt được độ chính 
xác cao hơn. 

4.

5.

KẾT LUẬN 
Tỉ  lệ  NST  Ph  dương  tính  trên  bệnh  nhân 
CML nếu dùng kỹ thuật nuôi cấy tế bào là 70%. 
Tỉ lệ dương tính của tổ hợp gen BCR/ABL ở bệnh 
nhân CML khi sử dụng kỹ thuật PCR là 96,7%. 
Như  vậy,  khi  tiến  hành  song  song  hai  xét 
nghiệm nuôi cấy tế bào và RT‐PCR, tỷ lệ dương 
tính  của  BCR/ABL  (dùng  PCR)  cao  hơn  tỷ  lệ 

dương  tính  của  NST  Ph  (NCTB)  một  cách  có  ý 
nghĩa thống kê với p < 0,05. 

6.

7.

8.

Sự phù hợp giữa 2 phương pháp xét nghiệm 
nuôi cấy tế bào tìm NST Ph và PCR tìm tổ hợp 
gen BCR/ABL qua chỉ số Kappa (K) = 0,18. 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1.

2.

Clarkson  B.,  Strife  A.,  Wisniewski  D.,  Lambek  C.  L.,  Liu  C. 
(2003),  ʺChronic  myelogenous  leukemia  as  a  paradigm  of 
early cancer and possible curative strategiesʺ, Leukemia, 17, pp. 
1211‐1262. 
Fitzgerald  P.  H.,  Adams  A.,  Gunz  F.  W.  (1963),  ʺChronic 
Granulocytic  Leukemia  and  the  Philadelphia  Chromosomeʺ, 
Blood, 21, pp. 183‐196. 
 

Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học 

9.

Kantarjian  H.,  Schiffer  C.,  Jones  D.,  Cortes  J.  (2008), 
ʺMonitoring  the  response  and  course  of  chronic  myeloid 
leukemia  in  the  modern  era  of  BCR‐ABL  tyrosine  kinase 
inhibitors:  practical  advice  on  the  use  and  interpretation  of 
monitoring methodsʺ, Blood, 111, pp. 1774‐1780. 
Kenealy  L.  K.,  Christenson  C.  B.,  Williams  C.  B.  (2008), 
ʺCurrent Therapies for Chronic Myeloid Leukemiaʺ, Journal of 
Pharmacy Practice, 21(2), pp. 116‐125. 
Nguyễn  Ngọc  Dũng,  Nguyễn  Anh  Trí  (2008),  “Nghiên  cứu 
một  số  đặc  điểm  lâm  sàng  và  huyết  học  bệnh  Lơxêmi  kinh 
dòng hạt giai đoạn tăng tốc”, Tạp chí Y học Việt Nam, 344, tr. 
450‐456. 
Nguyễn  Ngọc  Minh  (2007),  “Lơxêmi  kinh  dòng  hạt”,  Bài 
giảng Huyết học‐Truyền máu sau đại học, Nhà xuất bản Y học, tr. 
243‐251. 
Peruta  M.  D.,  Martinelli  G.,  Moratti  E.  (2010),  ʺProtein 
Tyrosine Phosphatase Receptor Type γ Is a Functional Tumor 
Suppressor  Gene  Specifically  Downregulated  in  Chronic 
Myeloid Leukemiaʺ, Cancer Research, 70(21), pp. 8896‐8906. 
Tomiyasu  T.,  Sasaki  M.,  Kondo  K.,  Okada  M.  (1982), 
ʺChromosome  Banding  Sudies  in  106  cases  of  Chronic 
Myelogeneous  Leukemiaʺ,  Jpn.  J.  Human  Genet,  27,  pp.  243‐
258. 
Vardiman J. W., Harris N. L., Brunning R. D. (2009), ʺThe 2008 
revision  of  the  World  Health  Organization  (WHO) 
classification  of  myeloid  neoplasms  and  acute  leukemia: 
rationale and important changesʺ, Blood, 114, pp. 937‐951. 

 

Ngày nhận bài báo:    

30 tháng 7 năm 2013 

Ngày phản biện:  

 30 tháng 8 năm 2013 

 

Ngày bài báo được đăng:   22 tháng 10 năm 2013

211