Xác định đột biến Exon 2 gen RHOA trên bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN EXON 2 GEN RHOA
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY THỂ LAN TỎA
Đặng Thị Nga, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Tạ Thành Văn, Đặng Thị Ngọc Dung
Trường Đại học Y Hà Nội
Ung thư dạ dày thể lan tỏa là type ung thư có xu hướng xâm lấn dẫn đến di căn sớm và tỷ lệ sống thêm
thấp. Không giống như ung thư dạ dày thể ruột nơi mà khối u có sự khuếch đại HER2 được điều trị bằng
trastuzumab, thì chúng ta thiếu các liệu pháp điều trị đích hiệu quả cho ung thư dạ dày thể lan tỏa. Sự khác
biệt này đang dần được làm sáng tỏ khi đột biến gen RHOA- gen mã hoá RhoA GTPase nhỏ được quan sát
thấy ở các bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa trong một số nghiên cứu gần đây. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi tiến hành giải trình tự exon 2 gen RHOA cho 38 bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa nhằm phát
hiện đột biến exon 2 gen RHOA. Kết quả cho thấy tần số đột biến RHOA là 5,3% (2/38) với điểm nóng là
Tyr42 trong chuỗi protein RHOA. Các đột biến này ảnh hướng đến vùng chức năng và gây nên những thiếu
sót trong tín hiệu RHOA, điều khiển quá trình né tránh anoikis trong phát triển bào quan. Những nghiên cứu
của chúng tôi có thể giúp tìm ra những liệu pháp điều trị đích đầy tiềm năng cho thể ung thư dạ dày tiên
lượng nghèo nàn cũng như không có thuốc điều trị phân tử đích hữu hiệu này.
Từ khóa: Ung thư dạ dày thể lan tỏa, gen RHOA

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

phát hiện ở các bệnh nhân ung thư dạ dày

Ung thư dạ dày là một trong các loại ung

lan tỏa có tính chất gia đình và đột biến gen

thư phổ biến nhất trên thế giới và đứng hàng

RHOA - gen mã hoá RhoA GTPase nhỏ được

đầu trong các ung thư đường tiêu hóa [1].

quan sát thấy ở các bệnh nhân ung thư dạ

Ung thư dạ dày được Lauren chia thành 2

dày thể lan tỏa [6 - 10].

thể mô bệnh học riêng biệt là thể ruột và thể

Gen RHOA nẳm trên nhánh ngắn nhiễm

lan tỏa với sự khác biệt rõ rệt về dịch tễ, bệnh

sắc thể số 3, mã hóa protein RhoA GTPase

nguyên và đặc biệt là tiên lượng [2; 3]. Thể lan

đóng vai trò quan trọng trong sự di chuyển,

tỏa có xu hướng xâm lấn chuyển thành di căn

kết dính, sự sống sót, phân chia của tế bào và

sớm và có tiên lượng xấu hơn. Hơn nữa,

sự biểu hiện gen. RHOA ban đầu được mô tả

không giống như trong thể ruột, nơi các khối u

như một gen sinh ung thư vì sự tăng cường

tăng cường biểu hiện HER2 được điều trị hiệu

biểu hiện nó dẫn đến chuyển dạng ác tính và

quả bằng Trastuzumab, hiện nay chúng ta

hình thành khối u trong in vivo [11; 12]. Trong

đang thiếu các phương pháp điều trị đích hiệu

thực tế, tăng cường biểu hiện của gen RHOA

quả cho bệnh nhân thể lan tỏa [4; 5]. Sự khác

được quan sát thấy ở nhiều bệnh lý ác tính và

biệt này đang dần được làm sáng tỏ khi đột

thường liên quan đến sự tiến triển của nhiều

biến gen CDH1-gen mã hóa E-cadherin được

loại ung thư như ung thư vú, u Lympho, ung
thư gan nguyên phát, ung thư đại trực tràng

Địa chỉ liên hệ: Đặng Thị Ngọc Dung, Bộ môn Hóa Sinh,
Trường Đại học Y Hà Nội.
Email:

Ngày nhận: 24/9/2018
Ngày được chấp thuận: 22/10/2018

32

[13; 14]. Một số nghiên cứu gần đây nhận thấy
đột biến gen RHOA xuất hiện một cách đặc
hiệu trong ung thư dạ dày thể lan tỏa và gợi ý
rằng đây có thể là một phân tử đích đầy tiềm

TCNCYH 115 (6) - 2018


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
năng để điều trị thể ung thư dạ dày có tiên

thư dạ dày nguyên phát với mô bệnh học

lượng xấu này [15; 16].

thuộc type lan tỏa theo phân loại Lauren 1965.

Tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào
về đột biến gen RHOA ở bệnh nhân ung thư
dạ dày thể lan tỏa, vì vậy chúng tôi tiến hành
nghiên cứu với mục tiêu: Xác định đột biến
exon 2 gen RHOA trên bệnh nhân ung thư dạ
dày thể lan tỏa.

+ Tình nguyện tham gia vào nghiên cứu.

- Tiêu chuẩn loại trừ:
+ Bệnh nhân, gia đình bệnh nhân không
đồng ý tham gia nghiên cứu.
+ Không đủ hồ sơ và thông tin bệnh nhân
ở thời điểm kết thúc nghiên cứu.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
38 bệnh nhân được chẩn đoán xác định
ung thư dạ dày thể lan tỏa theo phân loại Lauren 1965 dựa trên mô bệnh học tại bệnh viện

2.3. Lấy mẫu
Mẫu mô ung thư dạ dày lan tỏa sinh thiết
đúc trong khối nến được thu thập sau khi
bệnh nhân được chẩn đoán xác định dựa vào
kết quả mô bệnh học.

K cơ sở Tân Triều, Bệnh viện 108 và Bệnh

2.4. Kỹ thuật tách chiết DNA

viện Đại học Y Hà Nội được đưa vào nghiên

Các mẫu mô được lựa chọn vùng tập trung

cứu từ tháng 06/2017 đến tháng 06/2018.
Các bệnh nhân được xác định đột biến
exon 2 gen RHOA tại Trung tâm Kiểm chuẩn
chất lượng Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
2. Phương pháp

2.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán ung thư dạ
dày thể lan tỏa
Bệnh nhân được chẩn đoán ung thư dạ
dày thể lan tỏa theo phân loại mô bệnh học
của Lauren 1965: gồm những mảng tế bào
dạng thượng bì hoặc những tế bào rải rác

tế bào ung thư (tại Khoa Giải phẫu bệnh)
bằng cách đánh dấu vùng mô ung thư để
phân biệt với vùng mô lành xung quanh.
Các mẫu DNA được tách chiết từ mẫu mô
farafin theo QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN,
Đức). Nồng độ và độ tinh sạch DNA được
kiểm tra nhờ phương pháp quang phổ (OD
260/280).
2.5. Kỹ thuật PCR
- Phản ứng PCR khuếch đại exon 2 gen
RHOA sử dụng cặp mồi:

trong chất căn bản mô đệm không có bằng

+ Mồi xuôi: GGATCGGCGTACTAGAAGTTTG

chứng tạo tuyến, không có tính kết dính. Ung

+ Mồi ngược: ACATGGAAAATGGCAT-

thư thể lan tỏa có thể gồm các tế bào nhẫn,

CAGTTGTT.

lan rộng theo lớp dưới niêm mạc, ít thâm nhập

- Thành phần phản ứng PCR (thể tích 25
µl): 12.5 µl Hotstart, 0.5 µl mồi xuôi, 0.5 µl mồi

tế bào viêm, thường có mức độ biệt hóa kém.
2.2. Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ

ngược, 1 µl DNA và 10.5 µl H2O.
- Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 950C/5

- Tiêu chuẩn lựa chọn:

phút, 40 chu kỳ [950C/30 giây, 600C/30 giây,

+ Tuổi ≥ 18 tuổi.

720C/30 giây], 720C/5 phút.

+ Bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung

TCNCYH 115 (6) - 2018

- Bảo quản mẫu ở: 100C.

33


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC

ngày 21 tháng 9 năm 2016. Các đối tượng

2.6. Tinh sạch DNA
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng
phương pháp Ethanol precipitation.

tham gia hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút
khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục
tham gia. Các thông tin liên quan đến bệnh

2.7. Kỹ thuật giải trình gen trực tiếp

nhân được đảm bảo bí mật.

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được tiến
hành giải trình tự trược tiếp trên máy ABI se-

III. KẾT QUẢ

quencer 3500. Kết quả được thu thập và sử lý

1. Kết quả khuếch đại exon 2 gen RHOA

bằng phần mềm BioEdit 7.2.6 và ApE-A plasmid Editor 2.0.3. Trình tự được so sánh trên
GeneBank để phát hiện đột biến DNA
(NG_051308.1), mRNA (NM_001313941.1).

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon 2 gen
RHOA để khuếch đại DNA tách từ mẫu mô
farafin.

Kết quả hình 1 cho thấy, sản phẩm PCR

3. Đạo đức nghiên cứu

thu được chỉ có 1 băng đặc hiệu, rõ nét, kích

Nghiên cứu này đã được chấp thuận của

thước 307 bp, không có sản phẩm phụ. Sản

hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học

phẩm PCR đảm bảo phản ứng giải trình tự

Trường Đại học Y Hà Nội, số 198/HĐĐĐĐHYHN

tiếp theo để phát hiện đột biến.

M

1

2

3

4

5

6

7

(+)

(-)

307 bp

Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 2, gen RHOA
M: marker; (-) chứng âm; (+): chứng dương, 1 - 7: mẫu bệnh nhân.
2. Kết quả xác định đột biến exon 2 gen RHOA
Tiến hành xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự exon 2 gen RHOA.
Bảng 1. Kết quả đột biến exon 2 gen RHOA của bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa
MS

Thay đổi c.DNA

Thay đổi acid amin

Tài liệu công bố

4249

c.36634 A > G

Tyrocine 42 Cysteine (Y42C)

Kakiuchi (2014) [8]

65360

c.36634 A > G

Tyrocine 42 Cysteine (Y42C)

Wang(2014) [9]

Kết quả đã phát hiện được 2/38 (5,3%) có đột biến điểm trên exon 2 gen RHOA. Cả hai đột
34

TCNCYH 115 (6) - 2018


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
biến đều là đột biến sai nghĩa (missense mutation). Tại vị trí 36634 trên phân tử mRNA của gen
RHOA tương ứng với nucleotid A ở người bình thường đã được thay thế bằng nucleotid G dẫn
đến sự thay đổi acid amin Tyrocine ở vị trí 42 thành Cystein.

Hình 2. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân 65360

IV. BÀN LUẬN
Ung thư dạ dày thể lan tỏa được đặc trưng
bởi sự mất kết dính giữa các tế bào nên có xu
hướng di căn sớm, là một thể ác tính với mức
độ biệt hóa kém và có tiên lượng xấu ở hai
giới. Ở Việt Nam, hàng năm một số lượng lớn
người bị bệnh và thường đến viện ở giai đoạn
muộn với nhiều tổn thương phức tạp và biến

chứng nặng nề. Tuy nhiên, hầu hết các
nghiên cứu mới chỉ đề cập về tỷ lệ mắc bệnh,
biểu hiện lâm sàng, kết quả điều trị và các
biến chứng của bệnh. Việc phát hiện đột biến
gen RHOA ở bệnh nhân ung thư dạ dày thể
lan tỏa nhưng lại hiếm khi quan sát thấy ở các
type ung thư dạ dày khác có thể làm cơ sở
đầy tiềm năng triển khai liệu pháp điều trị đích

tỉ lệ đột biến trên exon 2 là 13,3% và tỷ lệ đột
biến của hotspot Tyr42Cys là 4,1%, theo
Kakiuchi thì tỷ lệ này lần lượt là 18,4% (16/87)
và 6,9% (6/87) [8; 9]. Đây là loại đột biến nằm
ở vị trí gắn GTP, ảnh hưởng sau sắc đến hoạt
động của chính bản thân protein, làm mất khả
năng gắn GTP. Wang và cộng sự nhận thấy
RHOA đột biến Tyr42Cys khiến tế bào thoát
khỏi quá trình anoikis (một dạng đặc biệt của
apoptosis) trên mô hình nuôi cấy mô ruột non
ở chuột có thể liên quan đến đặc trưng hình
thái của type lan tỏa. Kakiuchi cũng đã chứng
minh ảnh hưởng thúc đẩy sự tăng trưởng của
các đột biến RHOA Tyr42Cys trên dòng tế bào
bị đột biến RHOA (SW948).

hướng đến những bệnh nhân có HER2 âm

Tất cả các đột biến này đều ở dạng dị hợp

tính. Đột biến gen RHOA chủ yếu nằm trên hai

tử, điều này có thể giải thích bệnh nhân mang

exon 2 và 3. Vì vậy nghiên cứu này bước đầu

đột biến dù ở dạng dị hợp tử nhưng ở các

tiến hành giải trình tự ở exon 2 là vùng có đột

vùng chức năng có thể ảnh hưởng sâu sắc

biến thường gặp trên gen RHOA.

đến quá trình phát triển của bệnh.

Nghiên cứu đã phát hiện được 2/38 (5,3%)

Tần suất mắc các đột biến này là khác

bệnh nhân mang đột biến trên exon 2 gen

nhau ở các quốc gia và các nghiên cứu khác

RHOA, cả hai đều là đột biến Tyr42Cys. Tỷ lệ

nhau, tuy nhiên đều có một đặc điểm chung

này thấp hơn so với nghiên cứu của Wang khi

rằng đột biến Tyr42Cys là các hotspots đang

TCNCYH 115 (6) - 2018

35


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
được chú ý nhiều nhất trong nghiên cứu gen

vanced gastric or gastro-oesophageal junction

RHOA ở bệnh nhân ưng thư dạ dày thể lan

cancer (ToGA): a phase 3, open-label, ran-

tỏa.

domised controlled trial. Lancet, 376(9742),
687 - 697.

V. KẾT LUẬN
Đã phát hiện được 2/38 bệnh nhân có đột
biến dị hợp tử Tyr42Cys trên exon 2 gen
RHOA. Đây là các đột biến hotspot có tính
chất quyết định trong chức năng của gen và
đã được nhiều nghiên cứu đề cập tới. Tuy
nhiên, để hiểu cặn kẽ hơn về cơ chế bệnh
sinh của RHOA trong ung thư dạ dày thể lan
tỏa cần các nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn
nữa và nghiên cứu chuyên sâu hơn nữa.

Lời cảm ơn

5. Jin Zhou., Yoku Hayakawa., Timothy
C. Wang et al (2014). RhoA Mutations Identified in Diffuse Gastric Cancer. Cancer Cell, 26
(1), 9 - 11.
6. Guilford P., Hopkins J., Harraway J et
al (1998). E-cadherin germline mutations in
familial gastric cancer. Nature, 392(6674), 402
- 405.
7. Ina Chen., Lesley Mathews‑Greiner.,
Dandan Li et al (2017). Transcriptomic profiling and quantitative high-throughput (qHTS)
drug screening of CDH1 deficient hereditary
diffuse gastric cancer (HDGC) cells identify

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát

treatment leads for familial gastric cancer.

triển khoa học và công nghệ Quốc gia

Journal of Translational Medicine, 15(1), 1 - 16.

(NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-YS.02-

8. Kakiuchi M., Nishizawa T., Ueda H.,et
al (2014). Recurrent gain-of- function mutations of RHOA in diffuse-type gastric carci-

2015.37. Nhóm nghiên cứu xin chân thành
cảm ơn những bệnh nhân đã đồng ý tham gia

nghiên cứu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. WHO (2014). World Cancer Report
2014.
2. Lauren P (1965). The two histological
main types of gastric carcinoma: diffuse and
so-called intestinal-type carcinoma. An attempt at a histo - clinical classification. Acta
Pathol Microbiol Scand, 64, 31 - 49.
3. Lazăr D., Tăban S., Sporea I et al
(2009). Gastric cancer: Correlation between
clinicopathological factors and survival of patients. Romanian Journal of Morphology and

noma. Nature genetics, 46(6), 583 - 587.
9. Wang K., Yuen S.T., Xu J et al (2014).
Whole-genome sequencing and comprehensive molecular profiling identify new driver mutations in gastric cancer. Nature genetics, 46
(6), 573 - 582.
10. TCGA (2014). Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma. Nature, 513(7517), 202 - 209.
11. Yoshizaki H., Ohba Y., Kurokawa K
et al (2003). Activity of Rho- family GTPases
during cell division as visualized with FRETbased probes. J Cell Biol, 162(2), 223 - 232.
12.

Kathleen

O'Connor.,

Min

Chen

Embryology, 50(2), 185 - 194.
4. Bang Y.J., Van Cutsem E., Feyereis-

(2013). Dynamic functions of RhoA in tumor

lova A et al (2010). Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy

(3), 141 - 147.

alone for treatment of HER2-positive ad36

cell migration and invasion. Small GTPases, 4
13. Sakata-Yanagimoto M., Enami T.,
Yoshida K et al (2014). Somatic RHOA mutaTCNCYH 115 (6) - 2018


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
tion in angioimmunoblastic T cell lymphoma.

ated with diffuse-type gastric cancer progres-

Nat Genet, 46(2), 171 - 175.
14. Hu T., Guo H., Wang W et al (2013).
Loss of P57 Expression and RhoA Overexpression Are Associated With Poor Survival of

sion, but is it gain or loss? Gastric Cancer, 19
(2), 326 - 328.

Patients With Hepatocellular Carcinoma. On-

tric cancer: a comparative clinicopathology

col Rep, 30(4), 1707 - 1714.

analysis of 87 cases. Gastric Cancer, 19(2),

15. Masahiro Maeda., Toshikazu Ushijima (2016). RHOA mutation may be associ-

16. Ushiku T., Ishikawa S., Kakiuchi M et
al (2016). RHOA mutation in diffuse-type gas-

403 - 411.

Summary
MUTATE EXON 2 GENE RHOA IN DIFFUSE GASTRIC CANCER
The propensity of diffuse gastric cancer for invasion translates into early metastasis and poor
survival. Unlike in IGC where tumors with HER2-amplification are treated with trastuzumab, we
lack effective targeted therapies for DGC. This difference is gradually being clarified as mutations
of RHOA - encoding the small GTPase RhoA have been observed in DGC patients in recent
studies. In this study, we performed exon 2 RHOA sequencing on 38 DGC cases to detect mutations at exon 2 RHOA gene. The results showed that RHOA mutations occurs in 5.3% (2/38) of
diffuse-type tumors with mutational hotspot Tyr42 in RHOA protein. The hotspot affected the functional domains resulting in defective RHOA signaling and promoting escape from anoikis in organoid cultures. Our findings identify a potential therapeutic target for this poor-prognosis subtype of
gastric cancer with no available molecularly targeted drugs.
Keywords: RHOA, diffuse gastric cancer

TCNCYH 115 (6) - 2018

37