Nghiên cứu đột biến ở một số vùng trọng điểm và mức độ methyl hóa gen CDH1 ở bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư dạ dày (UTDD) là loại ung thư thường gặp, là nguyên nhân
gây tử vong thứ hai, chỉ đứng sau ung thư phổi. Theo ước tính, h ằng năm
trên thế giới có khoảng 738.000 trường hợp tử vong do ung th ư d ạ dày
[1]. Việt Nam là một trong những nước thuộc khu vực có nguy c ơ ung
thư dạ dày trung bình cao, với tỷ lệ mắc chuẩn hóa theo tu ổi là 21,8 ở
nam và 10,0 ở nữ mỗi 100.000 dân [2].
Theo phân loại của Lauren (1965) ung thư dạ dày gồm 3 th ể: th ể
ruột, thể lan tỏa và thể hỗn hợp. Trong 50 năm trở lại đây, tỷ lệ m ắc ung
thư dạ dày có xu hướng g iảm [3], tuy nhiên, chủ yếu giảm thể đường
ruột trong khi tỷ lệ m ắc th ể lan t ỏa không đ ổi ho ặc có xu h ướng tăng
lên [4],[5]. Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền đã được chứng minh có
liên quan đến đột bi ến gen CDH1 l ần đ ầu tiên vào năm 1998 trong 1
gia đình người New Zealand [6].Sau đó, trên th ế gi ới đã có nhi ều
nghiên cứu về mối liên quan này, đ ột bi ến dòng m ầm CDH1 đ ược tìm
thấy ở khoảng 40% các bệnh nhân b ị UTDD lan t ỏa di truy ền[7].
Gene CDH1 nằm trên NST số 16q22.1, gồm 16 exon, mã hóa protein
kết dính ngoại bào E-cadherin, protein xuyên màng này có ch ức năng
như 1 chất ức chế ung thư, đóng vai trò quan trọng trong duy trì c ấu trúc
biểu mô. Đột biến gen CDH1 ảnh hưởng cả phần trong và ngoài tế bào
của protein này, vì vậy dẫn đến rối loạn trong kết dính gi ữa các tế bào
biểu mô, tăng sự di động tế bào, tăng xâm lấn và di căn c ủa t ế bào ung
thư [8]. Phổ đột biến CDH1 hay gặp các đột biến điểm, mất đo ạn, đ ảo
đoạn phân bố dọc theo toàn bộ chuỗi mã hóa trong 16 exon. Tuy nhiên,
theo nghiên cứu về phân bố đột biến gen CDH1, các đột biến gen này hay


2

gặp nhất trên exon 8, 9, exon 15 [9], [10], trong đó, ở Đông Nam Á thường
xảy ra trên exon 9 [11].
Đột biến CDH1 là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc th ể th ường,
tồn tại dưới dạng dị hợp tử, để trở thành UTDD lan tỏa di truyền cần có
1 cơ chế khác bất hoạt hoàn toàn cả 2 alen của gen này, đ ược g ọi là
“second hit”. Tăng cường methyl hóa đảo CpG ở vùng promoter c ủa gen
CDH1 được coi là một trong những cơ chế như vậy trong UTDD lan t ỏa
di truyền [12], [13], [14].
Vì vậy, việc nghiên cứu về tình trạng đột biến gen CDH1, m ối liên
quan giữa tình trạng tăng cường methyl hóa ở vùng promoter của gen
CDH1 và đột biến CDH1 ở bệnh nhân UTDD lan tỏa di truy ền sẽ giúp tiên
lượng bệnh nhân, xây dựng chiến lược trong điều trị bệnh nhân ung th ư
dạ dày.
Trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên cứu v ề đ ột biến gen CDH1
trên bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền, tuy nhiên, ở Việt Nam hi ện t ại
chưa có bất kì nghiên cứu nào về vấn đề này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành
đề tài: “Nghiên cứu đột biến ở một số vùng trọng điểm và mức độ
methyl hóa gen CDH1 ở bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền”
với 2 mục tiêu chính:
1. Xác định đột biến gen ở một số vùng trọng điểm gen CDH1 ở
bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền.
2. Phân tích mức độ methyl hóa vùng promoter gen CDH1 ở bệnh
nhân ung thư dạ dày di truyền.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về ung thư dạ dày

1.1.1. Dịch tễ học
UTDD là loại ung thư xuất phát từ những tế bào dạ dày, sau đó có thể
lan tới các cơ quan khác. Các triệu chứng của bệnh thường không điển
hình, nên rất khó phát hiện, hầu hết bệnh nhân khi phát hiện bệnh đã ở
giai đoạn cuối.
UTDD là ung thư phổ biến trên thế giới, có ảnh h ưởng to l ớn đ ến
sức khỏe cộng đồng. Theo nghiên cứu ước tính gánh nặng ung th ư trên
thế giới năm 2013, UTDD đứng thứ 5 trong 10 loại ung th ư hay g ặp
nhất, có 984.000 trường hợp mắc mới và 841.000 tr ường h ợp t ử vong.
UTDD phân bố không đồng đều về mặt địa lý, với 77% ở các n ước đang
phát triển, 23% ở các nước phát triển [15]. Tỷ lệ mắc cao nh ất được th ấy
ở Nhật Bản, Nam Mỹ, Đông Âu, tỷ lệ mắc thấp nhất ở Bắc Mỹ, Ấn Đ ộ,
Nigieria và Úc [16]. Bệnh gặp ở nam giới nhiều hơn phụ nữ. Trung bình
cứ 36 nam giới hoặc 84 nữ giới thì có 1 trường hợp phát triển thành ung
thư dạ dày trước tuổi 79 [15].
Việt Nam nằm trong khu vực có tỷ lệ mắc UTDD cao, v ới tỷ l ệ m ắc
UTDD chuẩn hóa theo tuổi ở nam là 21,8/100.000 và 10,0/100.000 ở
nữ [17]. Theo tác gi ả L ại Phú Th ưởng và c ộng s ự nghiên c ứu v ề UTDD
ở 5 tỉnh, thành ph ố: Hà N ội, H ải Phòng, Thái Nguyên, Hu ế và C ần Th ơ


4

giai đoạn 2001 – 2004 cho th ấy t ỷ l ệ m ắc UTDD ở Hà N ội là cao nh ất,
chiếm tỷ lệ 2309/3311 (69,3%) [18]. Các tác gi ả cũng cho th ấy, tu ổi
hay gặp UTDD ở n ước ta là 50 – 60 tu ổi, b ệnh hi ếm g ặp ở nh ững
người Việt Nam dưới 40 tuổi [19].

1.1.2. Các yếu tố nguy cơ của ung thư dạ dày:
UTDD là hậu quả của tương tác phức tạp gi ữa yếu tố v ật ch ủ v ới

môi trường, trong đó đáng lưu ý nhất là nhiễm Helicobacter pylori (H.
pylori).
1.1.2.1. Yếu tố môi trường
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy nhóm nguy cơ môi trường quan trọng
nhất là chế độ ăn uống, hút thuốc và nhiễm Helicobacter Pylori (H.
pylori); ngoài ra còn có yếu tố tiền sử phẫu thuật cắt dạ dày và nội tiết
tố nữ.
Chế độ ăn uống: Chế độ ăn có vai trò quan trọng trong sự phát triển của
ung thư dạ dày. Nitrosamin có trong thức ăn hoặc do một số loại thức ăn chứa
nitrate tạo ra là một chất gây UTDD. Ăn ít rau và trái cây cũng làm tăng nguy
cơ UTDD [20].
Hút thuốc lá làm tăng nguy cơ UTDD lên 1,56 l ần [21]. Nguy c ơ
UTDD tăng theo thời gian hút thuốc và giảm đi sau 10 năm cai thu ốc [22].
Nhiễm H.pylori là một yếu tố nguy cơ mạnh của ung thư dạ dày và
được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp loại là tác nhân
ung thư nhóm I [23]. H. pylori có khả năng thích nghi đặc biệt để sống
trong môi trường acid ở dạ dày, sự cư trú của H. pylori gây nên viêm dạ
dày ở hầu hết đối tượng bị nhiễm vi khuẩn này. Sự bám dính của vi
khuẩn vào tế bào biểu mô gây nên đáp ứng viêm, v ới s ự t ập trung c ủa
bạch cầu trung tính rồi sau đó là các tế bào lympho B và T, đ ại th ực bào


5

và tương bào, phần lớn đều sản sinh ra 1 lượng lớn các nhóm oxy ho ặc
nito phản ứng [24], những gốc tự do gây hư tổn tế bào biểu mô và sinh
ung thư [25], [26]. Đối với UTDD loại ruột thì thấy sự có m ặt c ủa H.
pylori ở mô không ung thư là 90% so với loại lan tỏa là 32% [15].
1.1.2.2. Yếu tố nguy cơ liên quan với vật chủ
Yếu tố di truyền: UTDD thường xảy ra trên người có nhóm máu A và

cũng thường gặp trong cùng gia đình và anh em sinh đôi [27]. Kho ảng
10% ung thư biểu mô dạ dày có biểu hiện yếu tố gia đình, tuy nhiên ch ỉ
1 – 3% gây ra bởi các hội chứng ung thư dạ dày di truy ền [28]. UTDD th ể
lan tỏa di truyền là một loại UTDD di truyền được xác đ ịnh rõ là do đ ột
biến dòng phôi trong gen E-cadherin (CDH1) [28].
Polyp dạ dày: Một số loại polyp dạ dày có tiềm năng ác tính. U tuyến
(adenoma) là các khối u xuất phát từ tổ chức tuyến của dạ dày, có nguy cơ
tiến triển thành ung thư cao nhất.
1.1.3. Giải phẫu bệnh ung thư dạ dày
1.1.3.1. Vị trí
Trên thế giới hiện nay có xu hướng chia UTDD thành 2 loại chính là
ung thư tâm vị và ung thư không thuộc tâm vị vì hai lo ại này khác nhau
rất rõ về dịch tễ, bệnh sinh, mô bệnh học, cũng nh ư c ả điều tr ị và tiên
lượng.
Ung thư tâm vị là ung th ư trong kho ảng 1 cm trên đ ến 2 cm d ưới
đường nối thực quản dạ dày. Ung th ư không thu ộc tâm v ị là ung th ư
trong các vị trí còn l ại, g ồm có phình v ị, thân v ị, b ờ cong l ớn, b ờ cong
nhỏ, hang vị và môn v ị [29].
Trong những năm gần đây, ung thư tâm vị tăng đột biến từ 6,3% lên
20,1% trong vòng 25 năm. Tiên lượng ung th ư tâm vị thường xấu h ơn
UTDD không thuộc tâm vị [29].
1.1.3.2. Đại thể


6

Hiệp hội Ung thư Dạ dày Nhật Bản chia UTDD sớm thành 3 th ể
[30].
− Type I (thể lồi): tổ chức ung thư lồi lên trên niêm mạc, có hình
nấm, hình giống polyp, chạm vào dễ chảy máu.

− Type II (thể phẳng hay thể bề mặt): Gồm 3 phân type như sau:
IIa (phẳng gồ), IIb (phẳng dẹt), IIc (phẳng lõm)
− Type III (dạng loét): tổn thương có độ sâu rõ rệt. Ung th ư dạng
loét thường nông, bờ gồ ghề, bẩn, niêm mạc quanh ổ loét không
đều, các nếp niêm mạc có thể tập trung, riêng rẽ hay cắt c ụt.

Hình 1.1. Phân loại ung thư dạ dày sớm [30].
1.1.3.3. Vi thể
 Phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày của Lauren
UTDD được Lauren chia thành 2 thể mô bệnh học riêng bi ệt là th ể
ruột và thể lan tỏa (Lauren,1926, được trích trong Leung, 2009,tr.264)
[26].


7

a. Ung thư dạ dày thể ruột

b. Ung th ư d ạ dày th ể lan t ỏa

Hình 1.2. Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren
 Phân loại mô bệnh học theo Tổ chức y tế thế giới:
Phân loại của tổ chức y tế thế giới năm 2010 chi tiết hơn so với phân
loại Lauren , trong đó ung thư dạ dày thể lan tỏa của phân loại Lauren
tương ứng với UTBM tế bào nhẫn và ung thư kém kết dính trong phân loại
WHO.

Bảng 1.1. Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dạ dày
của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2010 và so sánh với phân lo ại Lauren [31].
WHO (2010)

Lauren (1965)
Ung thư biểu mô tuyến (UTBMT) thể Thể ruột ( Intestinal)
nhú
(papillary)
UTBMT thể ống nhỏ (tubular)
UTBMT thể nhầy (mucinous)
UTBM thể tế bào nhẫn (signet-ring Thể lan tỏa (diffuse)
cell)
Các ung thư kém kết dính khác (poorly
cohesive carcinoma)
Thể hỗn hợp
Thể hỗn hợp ( không xác
định)


8

UTBM tuyến vảy
UTBM tế bào vảy
UTBM tế bào nhỏ
UTMB không biệt hóa
Các loại UTBM khác
1.1.4. Chẩn đoán UTDD
1.1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng
Đa phần các triệu chứng lâm sàng của UTDD là không đặc hiệu và có
thể gặp trong nhiều bệnh lý khác. Trên thực tế, bệnh nhân khi có các triệu
chứng rõ ràng thì UTDD đã ở giai đoạn tiến triển.
Triệu chứng cơ năng có thể gặp: đau bụng thượng vị, sút cân, khó nuốt,
buồn nôn, nôn, xuất huyết tiêu hóa, thiếu máu,…
Triệu chứng thực thể: Thường xuất hiện muộn, sờ thấy khối u ở bụng,

hạch bạch huyết ở thượng đòn trái, quanh rốn, gan lớn khi UTDD đã di căn
[22].
1.1.4.2. Chẩn đoán cận lâm sàng
Các phương pháp này có vai trò chủ yếu là đánh giá giai đoạn UTDD
trước khi quyết định liệu pháp điều trị.
Nội soi dạ dày: là phương pháp quan trọng đánh giá giai đoạn. Nội soi
dạ dày kết hợp với sinh thiết là biện pháp có độ chính xác cao nếu số
mảnh sinh thiết lấy được càng nhiều. Nội soi cho biết vị trí và tính chất
của khối u. Độ chính xác của nội soi > 95% với những trường hợp UT tiến
triển. [11].
Siêu âm nội soi: Phương pháp này đóng vai trò quan trọng trong UTDD
giai đoạn sớm. Phối hợp với chọc hút kim nhỏ làm tăng độ chính xác của
nội soi.


9

Nội soi ổ bụng, siêu âm ổ bụng: Giúp phát hiện những tổn thương do
di căn gan, phúc mạc, buồng trứng và phần nào chẩn đoán m ức đ ộ xâm
lấn cơ quan lân cận.
Chụp cắt lớp vi tính (CT): CT giúp xác định chính xác tình trạn g di căn
hạch bạch huyết cũng như di căn xa. Các tổn thương nghi ngờ trên CT cần
phải được sinh thiết.
Chụp cắt lớp phát Positron (PET): Kỹ thuật này kết hợp với CT và siêu
âm nội soi cải thiện độ chính xác trong đánh giá giai đoạn, với độ nhạy
phát hiện tổn thương tiên phát là 93%, độ đặc hiệu 100% và độ chính xác
95% [32].
Chẩn đoán mô bệnh học: Là phương pháp không th ể thiếu và là tiêu
chuẩn vàng giúp chẩn đoán xác định UTDD.
Xét nghiệm dấu ấn ung thư huyết thanh: Hiện nay, chưa có một dấu

ấn ung thư huyết thanh nào được xác định đủ độ nhạy và đặc hiệu đ ể
chẩn đoán xác định UTDD [26]. Nồng độ pepsinogen <70 ng/mL và t ỷ s ố
pepsinogen I/pepsinogen II <3 là các dấu ấn hữu ích trong phát hi ện
UTDD [26]. Ngoài ra, có thể một số chất chỉ điểm ung th ư nh ư CEA,
CA19-9, CA72-4 cũng tăng trong một vài tr ường h ợp nh ưng đ ộ nh ạy, đ ộ
đặc hiệu thấp [22].
1.1.5. Điều trị và tiên lượng UTDD
1.1.5.1. Điều trị
Phẫu thuật: Phẫu thuật cắt bỏ khối u được áp dụng đối với các bệnh
nhân khối u ở giai đoạn T1 đến T3, N1 hoặc N2 (giai đoạn I-III). Các kh ối
u dạ dày sớm có thể được điều trị bằng phương pháp cắt niêm mạc qua
nội soi hoặc phẫu tích dưới niêm mạc qua nội soi [26].


10

Xạ trị: UTDD tương đối đề kháng đối với xạ trị [26].
Hóa trị: Hóa trị liệu giữ vai trò khá quan trọng trong điều tr ị UTDD
nhằm giảm tỷ lệ tái phát sau phẫu thuật và kéo dài thời gian sống thêm.
Điều trị đích: đây là một trong những tiến bộ mới nhất hiện nay
trong điều trị UTDD.
1.1.5.2. Tiên lượng của UTDD
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tiên lượng UTDD, gồm có: tổng
trạng, tuổi, giới tính, vị trí, kích thước, đặc điểm đại th ể, phân lo ại mô
bệnh học của khối u [33]. Tuy nhiên, quan trọng nhất vẫn là phân loại
giai đoạn theo TNM.
Ngày nay, bên cạnh các yếu tố lâm sàng, giải phẫu bệnh, nghiên cứu
những thay đổi về gen là hướng đi mới giúp điều trị, tiên lượng cho bệnh
nhân.
1.2. Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền

1.2.1. Định nghĩa
Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền là do đột biến gen trội trên nhiễm
sắc thể thường; ung thư biểu mô tuyến kém biệt hóa, thâm nhiễm thành
dạ dày, làm mỏng thành dạ dày nhưng không hình thành các kh ối riêng
biệt [34].

1.2.2. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng
Dịch tễ
Trong ung thư dạ dày, có khoảng 10% thuộc ung th ư dạ dày phân
nhóm gia đình, trong số đó chiếm từ 1-3% thuộc h ội ch ứng ung th ư d ạ
dày lan tỏa di truyền [35].


11

Tuổi khởi phát bệnh
Tuổi trung bình khởi phát của UTDD lan tỏa di truy ền là 38 tu ổi, dao
động trong phạm vi từ 14 đến 69 tuổi. Ph ần l ớn các b ệnh nhân UTDD
lan tỏa di truyền khởi phát bệnh trước tuổi 40 [34]. Tuổi kh ởi phát cũng
rất thay đổi giữa các thành viên trong gia đình [36].
Mô bệnh học
Ở bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền, mô bệnh học th ường là th ể ung
thư tế bào nhẫn và các ung thư kết dính kém theo phân loại c ủa WHO,
2010.

Hình 1.3. Hình ảnh vi thể chủ yếu là các tế bào nhẫn ở niêm mạc dạ dày
[37].
∗ Chẩn đoán ung thư dạ dày lan tỏa di truyền
Theo hướng dẫn của International Gastric Cancer Linkage
Consortium (IGCLC)[38], tiêu chuẩn lâm sàng cho sàng lọc di truyền ở

các gia đình bị ung thư dạ dày di truyền bao gồm m ột trong các tiêu
chuẩn sau:
− Trong gia đình có từ hai trường hợp mắc UTDD th ể lan tỏa t ỏa trong
quan hệ họ hàng bậc 1 hoặc bậc 2, với ít nhất một trường h ợp ch ẩn
đoán trước tuổi 50.


12

− Trong gia đình có từ ba trường hợp mắc UTDD th ể lan tỏa t ỏa trong
quan hệ họ hàng bậc 1 hoặc bậc 2, không phụ thuộc vào tuổi phát hiện
bệnh.
− Bệnh nhân mắc ung thư dạ dày lan tỏa < 40 tuổi, chưa phát hiện yếu t ố
gia đình.
− Bệnh nhân hoặc gia đình bệnh nhân có tiền sử bị ung thư vú tiểu thuỳ có
ít nhất 1 trường hợp chẩn đoán trước 50 tuổi.
1.3. Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền và đột biến gen CDH1
Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền là hội chứng ung th ư bẩm sinh do
đột biến gen trội trên NST thường. Năm 1998, Guilford và cộng s ự đã xác
định đột biến dòng mầm gen CDH1 là nguyên nhân gây nên UTDD lan t ỏa
di truyền [6].
1.3.1. Sơ lược về gen CDH1
∗ Cấu trúc gen CDH1
Trên bản đồ gen CDH1 nằm tại vị trí 16q22.1, gồm 16 exon tr ải dài
khoảng 100 kb DNA, khi phiên mã sẽ hình thành m ột mRNA 4,5 kb.

Hình 1.4. Vị trí của gen CDH1 [39].

∗ Chức năng gen CDH1
E-cadherin là một thành viên của gia đình Cadherin, các phân t ử đ ều

là các glycoprotein xuyên màng, là trung gian kết dính tế bào – tế bào


13

phụ thuộc vào canxi, đóng vai trò cơ bản trong việc duy trì s ự phân hóa
và kiến trúc bình thường của biểu mô[40]. E-cad herin cần có sự k ết h ợp
giữa phức hợp catenin- phức hợp actin trong khung x ương t ế bào trong
tế bào chất, và giữa các dimer E-cadherin của các tế bào lân c ận ở
khoảng gian bào. Đặc biệt, các đầu tận N ở khu vực ngoại bào c ủa dimer
tương tác với các dimer E-cadherin tương tự của tế bào đ ối di ện, và các
đầu tận C trong tế bào chất có liên quan đến catenin và khung tế bào
actin. Phức hợp E-cadherin-catenin giữa các tế bào lân cận hình thành
các mối nối adherens, loại phổ biến nhất gây bám dính gian bào[41].
Sự suy giảm chức năng của E-cadherin sẽ làm suy giảm tính dính
của tế bào, con đường truyền tín hiệu tế bào tăng sinh, gây nên hình thái
bất thường về kiến trúc của biểu mô, mất phân cực tế bào và ức ch ế
liên lạc, tăng sinh không được kiểm soát và sự xâm lấn của các mô lân
cận đã được chứng minh trong hệ thống tế bào khối u [41] [42]. Qua đây
có thể thấy, CDH1 có thể được coi là một gen ức chế kh ối u mà có th ể
liên quan đến ung thư ở người nhạy cảm [41].


14

Hình 1.5. Vị trí của E-cadherin và vai trò của nó trong kết dính tế bào – tế
bào.
1.3.2. Cơ chế gây bệnh UTDD lan tỏa di truyền do đột biến gen CDH1
Con đường tín hiệu được điều hòa bởi E-cadherin
Ngoài vai trò trong kết dính tế bào, E-cadherin tham gia vào m ột số

con đường tín hiệu trong phát sinh ung thư. Khi giảm bi ểu hiện c ủa Ecadherin trong các tế bào biểu mô sẽ dẫn đến phân cực tế bào gi ảm và
tăng di dộng và xâm lấn, mất biểu hiện E-cadherin kích thích tín hi ệu
chuyển đổi biểu mô trung mô (epithelial mesenchymal transition:EMT)
hoạt động [43] [44]. Dựa trên các thành phần tương tác khác nhau của Ecadherin và sự kết nối giữa phức hợp bám dính tế bào trong tế bào ch ất
(cytoplasmic cell-adhesion complex: CCC) với actin khung x ương t ế bào,
một số con đường tín hiệu bao gồm Wnt, Rho GTPases, và EGFR đ ược
cho là có vai trò tích cực trong quá trình EMT [45].

Hình 1.6. Con đường tín hiệu tế bào qua trung gian E-cadherin [46].
Các đột biến dòng mầm của gen CDH1


15

Đột biến xóa đoạn và sai nghĩa dẫn đến gây bất hoạt E- cadherin, đã
được xác định trong UTDD lan tỏa di truyền [47].

Hình 1.7. Lược đồ của các gen đột biến dòng mầm CDH1.
1.3.3. Nghiên cứu trên thế giới về đột biến gen CDH1 trong ung th ư
dạ dày lan tỏa.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về gen CDH1 trong UTDD
lan tỏa di truyền. Chúng tôi có lập bảng tóm tắt về tần số đột biến, ki ểu
đột biến gen CDH1 tổng hợp 34 tài liệu tham khảo khác nhau:
Bảng 1.2. Bảng thống kê tần suất mắc đột biến gen CDH1 trong UTDD lan
tỏa di truyền.
BẢNG THỐNG KÊ TẦN SUẤT MẮC ĐỘT BIẾN GEN CDH1 TRONG UTDD
LAN TỎA DI TRUYỀN
Số người mang
Tổng số
Tài liệu

đột biến/số
người
Tỷ lệ
tham
Đột biến
Exon
người UTDD lan
mang
%
khảo
tỏa di truyền
đột biến
65
3GC
1
1/11
6
0,0072
66
1/59
41delT
67 và 14
3/12 và 1/23
45insT
68
53delC
2
2/125
4
0.0048

69/14
59 G  A
1/9; 1/23;
70/71
185 G  T
3
1/13; 2/9
12
0,0143
72/65
1/18; 1/11
187 C  T
73/74
3/3; 1/24
283 C  T
75
1/21
353  G
74
1/7
372 delC
76
1/44
382delC
77
525 C  G
4
1/41
1
0,0012

16

8
7
75/78
79
80
67/14
76/80
65/81
6
67/82
83
65
76/14
75
84
76/85/1
4
75/86/7
8
76/87
76
88
65
89
80
80

75
78
79
14
67/14
76
80
90
91
78
68
80
76
65/68/7
2

641 T  C
670 C  T
715 G  A
731 A  G
820 G  A
832 G  A
892 G  A
1003 C  T
1008 G  T
1018 A  G
1023 T  G
1063 del T
1064 del T
1107 del C

1118 C  T
1134del8ins
1137 G  A

5

1212 delC
1226 T  A
1243 A  T
1285 C  T
1306-1303 insA
1306-1307 delTT
1409 C  T
1416 C  T
13911392delTC
13971398delC
1460 T  C
1466 ins C
1472 insA
1476 del AG
1680 G  C
1610del C
1619insG
1682insA
1710delT
1774 G  A
1779 insC
1792 C  T
1896 C  T

9

10

6

7
8

11

12

1/7
1/21
1/21; 1/24
1/19
1/26
3/12; 1/23
1/44;1/26
3/11; 2/3
6/36
1/12; 2/101
2/7
1/11
1/44;1/23
1/21
1/14
1/44; 1/9; 1/23
2/21; 2/8; 2/24

2

0,0002

7

0,0084

13

0,0155

19

0,0227

1/44; 1/6
1/44
3/87
1/11
8/9

13

0,0155

1/26
1/26
1/21

1/24
1/19
1/23
1/12; 1/23
1/44
1/26
3/3
1/14
2/41
3/18
1/26
1/44
1/11; 1/41; 2/18
1/26; 1/9

9

0,0108

10

0,0119

11

0,0131


17

80/85
75/78/8
5
76
78
6/75
65
92/80
80
76/78
78
65
92/80
78
6
91
78
93
92
94

1901 C  T

1/21; 1/24; 1/9

1774 G  A
1779 insC
1792 C  T
1896 C  T
1901 C  T

13

2195 G  A
2245 C  T
2276delG
2253 C  T
2343 A  T
2381 insC
2396 C  G
2398delC
2399 del G
2494 G A
Del exon 16

14

15

16

1/44
1/24
1/36; 1/21
1/11
1/17; 1/26
1/26
1/44; 1/24
1/24
2/11

1/17; 1/26
1/24
3/36
1/30
2/24
7/15
1/17
1/93

8

0,0095

7

0,0084

16

0,0191

2

0,0024

T ổng c ộng

0,165

Như vậy theo tổng kết đến năm 2016 trong 34 tài liệu tham kh ảo

của chúng tôi trong 837 bệnh nhân thì tần số đột biến gen CDH1 chiếm
16,5%, trong đó 2 exon có tần số hay gặp nhất là 8 và 15.
Tại Việt Nam chúng tôi chưa thấy một công trình nào nghiên c ứu về
đột biến gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền.
1.3.4. Methyl hóa gen CDH1 được coi là cơ chế phân t ừ th ứ 2 trong
UTDD lan tỏa di truyền
Như đã biết, những biến đổi di truyền bao gồm các đột bi ến trong
gen gây ung thư, các gen gây ức chế khối u gây ung th ư, tuy nhiên chỉ
khoảng 10% bệnh nhân thuộc kiểu genotype kiểu cổ điển này. Ngoài ra,
sự phát sinh ung thư còn có thể do cơ chế biến đổi ngoại di truy ền gây
ra.


18

Di truyền ngoại sinh (Epigenetics) là sự biến đổi trong biểu hiện
gen mà sự biến đổi này không phải do những biến đổi trình t ự base trên
ADN, bao gồm sự methyl hóa ADN, biến đổi histone,…Trong đó, di truy ền
ngoại sinh được nghiên cứu nhiều nhất là sự methyl hóa ADN.
Methyl hóa là sự gắn nhóm methyl vào vị trí C thứ 5 ở cytosine của
vòng pyrymidine nhờ enzyme methyl transferase. Có 3 d ạng methyl hóa
ADN khác nhau được biết đến liên quan tới ung th ư, đó là: s ự gi ảm
methyl

hóa

(hypomethylation),

tăng

cường

methyl

hóa

(hypermethylation) và sự mất đi dấu ấn gen (loss of imprinting – LOI).
Sự tăng cường methyl hóa ADN lại xảy ra tại các vị trí điều hòa đặc
hiệu ở các vùng promoter, dẫn tới sự ngăn cản phiên mã từ đó gây b ất
hoạt gen (như ở các gen ức chế khối u). Có nhiều nghiên c ứu đã ch ứng
minh rằng sự tăng cường methyl hóa ở vùng promoter của gen CDH1 là
cơ chế phân tử thứ hai kết hợp với đột biến dòng mầm gen CDH1 để
hình thành UTDD lan tỏa di truyền[48],[49],[50].
Sự methyl hóa ADN có thể được phát hiện trong các ADN bắt nguồn
từ mẫu mô, mẫu phân hoặc dịch cơ thể.
Vì vậy, nếu các phương pháp nghiên cứu sự methyl hóa ADN khi
được tối ưu hóa về độ nhạy và độ đặc hiệu của nó sẽ giúp xác đ ịnh
chính xác nh ững khác bi ệt trong tình tr ạng methyl hóa ADN gi ữa b ệnh
nhân ung th ư và người bình th ường, cho th ấy r ằng đây có th ể là m ột
công cụ hữu hiệu cho việc phát hi ện s ớm b ệnh và là m ột ch ỉ th ị t ầm
soát mới cho ung th ư d ạ dày di truy ền lan t ỏa.
1.3.5. Nghiên cứu trên thế giới về tăng cường methyl hóa vùng
promoter của gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa.


19

Trong nghiên cứu của Anne M. Slavotinek và cộng sự năm 2000 [49]
tiến hành nghiên cứu trên 2 gia đình được chẩn đoán UTDD lan tỏa di
truyền, trong đó, nghiên cứu tình trạng methyl hóa của 6 người đã đ ược

xác định E-cadherin âm tính trên hóa mô miễn dịch, có 3 trong 6 ng ười có
tăng cường methyl hóa ở vùng promoter. Đồng thời, ở những bệnh nhân
không có đột biến dòng mầm CDH1 không có tình tr ạng tăng c ường
methyl hóa.

Hình 1.8. Tình trạng methyl hóa promoter ở các bệnh nhân UTDD lan
tỏa di truyền[49]
(MCF-7: mẫu chứng, M: methyl hóa, U: unmetylation – không methyl
hóa)
Năm 2009, trong nghiên cứu của mình, Carla oliveira và c ộng s ự
cũng chỉ ra được mối liên quan giữa tăng cường methyl hóa và UTDD lan
tỏa di truyền [51]. Kết quả là trong 28 mẫu phân tích có đ ột bi ến UTDD
lan tỏa di truyền có tăng cường methyl hóa vùng promoter chiếm 32,1%,


20

trong đó gặp ở các đột biến UTDD lan tỏa di truy ền : 283C T (exon 3),
1018 AG (exon 8), 1137 G A (exon 8), 2195G  A (exon14), 2494 G  A
(exon 16). Trong nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng sự methyl hóa vùng
promoter không có mối liên quan đến tuổi của bệnh nhân, có 9/13
(69%) bệnh nhân có tăng cường methyl hóa dưới 50 tuổi, có 2/4
(50%)bệnh nhân trên 50 tuổi. Có thể giải thích do phần lớn các bệnh
nhân trong nghiên cứu được chẩn đoán dưới 50 tuổi.
1.3.6. Nghiên cứu methyl hóa DNA trong ung thư ở Việt Nam
Nghiên cứu của Trinh HT cho thấy 87,5 % mẫu UT đại tr ực tràng có
sự methyl hóa quá mức ở gen ức chế khối u APC. Tran THT và cs.; Le NQ
và cs. phát hiện tỷ lệ methyl hóa gen ER tương ứng ở 26/28 (92,9 %) và
21/24 (87,5 %) bệnh phẩm UT vú. Vi Thuật Thắng và cs. nh ận th ấy
11/20 (55 %) mẫu UT và 2/10 (20 %) mẫu PĐTTL có RASSF1A bị methyl

hóa. Phân tích methyl hóa DNA trên từng gen riêng rẽ hay phân tích k ết
hợp sự methyl hóa đồng thời nhiều gen đối với UT còn rất ít. Vo LT và cs.
phân tích đồng thời các dấu chuẩn methyl hóa trên gen BRCA1, RASSF1A
và ER ở các bệnh nhân UT buồng trứng với tỷ lệ methyl hóa lần l ượt là
11/59 (18,6 %) ở gen BRCA1, 40/59 (67,8 %) ở gen RASSF1A và 15/59
(25,4 %) ở gen ER. Tác giả cũng chỉ ra 45/59 (78 %) các bệnh nhân b ị
methyl hóa quá mức ít nhất một trong ba gen này. Ở Việt Nam, ch ưa có
công bố nào phân tích sự methyl hóa CDH1 trong ung th ư dạ dày lan t ỏa
di truyền. Như vậy, phân tích dấu chuẩn di truyền ngoại gen và dấu
chuẩn methyl hóa gen CDH1 nói riêng vẫn là một lĩnh v ực m ới ở Vi ệt
Nam.
1.4. Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến trên gen CDH1
1.4.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)


21

Nguyên tắc chung
Dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase xúc tác sự tổng h ợp m ột
mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại
nucleotid. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của nh ững mồi xuôi và m ồi
ngược có trình tự bổ xung với hai đầu của trình t ự DNA khuôn.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ n ối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm ba bước: Biến tính, bắt cặp, kéo dài chuỗi.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp t ục đ ược
dùng để làm các DNA nền để tổng hợp các DNA m ới trong chu kỳ ti ếp
theo. Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA chuỗi đôi có
chiều dài là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của
sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5 của hai đoạn gen m ồi.
Số lượng chu kỳ trong PCR thường không vượt quá 40. Sau m ỗi chu

kỳ, số sợi DNA tăng gấp đôi. Như vậy sau n chu kỳ số sợi DNA là .

Hình 1.9. Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR
(nguồn: Andy Vierstraete,1999)
1.4.2. Điện di kiểm tra sản phẩm
Do tính chất tích điện âm của các phân tử acid nucleic nên d ưới tác


22

dụng của dòng điện một chiều, các phân tử này sẽ chuy ển động t ừ c ực
âm sang cực dương. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc
chủ yếu vào kích thước phân tử acid nucleic, nhờ đó mà nh ững đo ạn
ADN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện
di thường sử dụng là agarose và polyacrylamide.
1.4.3. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA sequencing)
Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các
nucleotid trong phân tử DNA. Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng
như trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đ ầu từ vị trí
gắn mồi. Hỗn hợp của deoxy- và dideoxynucleotid được sử d ụng trong
phản ứng với nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào m ỗi v ị trí
mà các deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang đ ược t ổng h ợp.
Sự gắn của các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các
đoạn DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích
thước khác nhau. Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA có th ể đ ược xác
định bằng cách chạy đồng thời bốn phản ứng riêng biệt trong đó mỗi
phản ứng chứa một loại dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)
hoặc bởi một phản ứng hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid đ ược
đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác nhau.
Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên

GenBank (National Center for Biotechnology Information – NCBI).
1.5. Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện tình trạng tăng c ường
methyl hóa ở vùng promoter của gen CDH1:
∗ PCR dựa vào sự biến đổi bisulfite:
Nguyên lý


23

Hình 1.10. Sơ đồ phản ứng SnuPE.
Kéo dài mồi đơn nucleotid (single nucleotid primer extention:
SnuPE) là một phương pháp rất hiệu quả để phân tích chính xác s ự
methyl hóa.
DNA được xử lý với bisulfite và sau đó bắt cặp với một mồi kết thúc
ngay trước vị trí phân tích methyl hóa. Sau đó thực hiện 2 ph ản ứng kéo
dài mồi, một với dCTP, một với dTTP đều được đánh d ấu phóng x ạ.
Trong các phản ứng này chỉ có 1 nucleotid được bổ sung vào m ồi. Sau đó
phải biến tính phản ứng, chạy sản phẩm trên gel acrylamid và phân tích
độ phóng xạ của mồi đánh dấu.
Cytosin của trình tự CG bị methyl hóa trên DNA sau khi xử lý v ới


24

bisulfite sẽ giữ nguyên, còn cytosin không bị methyl hóa sẽ chuyển đổi
thành uracil.
PCR đặc hiệu methyl hóa ( Methylation – Specific PCR: MSP)
Nguyên lý tượng tự như PCR thông thường, chỉ khác s ử dụng c ặp
mồi đặc hiệu cho phản ứng khuếch đại trình tự bị methyl hóa và không
bị methyl hóa DNA.

Hiện nay, kỹ thuật MSP được sử dụng phổ biến nh ất do tính đ ơn
giản, và chi phí hợp lý của nó, chủ yếu để phát hiện s ự tăng c ường
methyl hóa tại một vùng promoter quan tâm của một số gen có ch ức
năng quan trọng, liên quan tới sự bất hoạt gen đó trong các bệnh ung
thư ở người. Đây là kỹ thuật nhanh chóng phát hiện được sự methyl hóa
của bất kỳ vị trí CpG nào trong một đảo CpG. Đầu tiên, ADN đ ược bi ến
đổi với sodium bisulfite để chuyển hóa tất cả các cytosine không bị
methyl hóa thành uracil, sau đó, ADN này được khuếch đ ại lên qua ph ản
ứng PCR bằng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho đoạn trình tự bị methyl
hóa và không bị methyl hóa. Kỹ thuật MSP đòi hỏi lượng ADN rất ít, phát
hiện nhạy tới 0,1% các alen bị methyl hóa trên locus đảo CpG quan tâm
và cũng có thể thực hiện được với ADN tách chiết từ các mẫu đúc
paraffin. Kỹ thuật MSP hạn chế được các kết quả dương tính gi ả t ừ các
nghiên cứu trước đó dựa trên PCR và sự phân cắt của enzyme gi ới h ạn
để phân biệt giữa ADN bị methyl hóa và không bị methyl hóa.
Phân tích đường nóng chảy với độ phân giải cao (High
Resolution Melt– HRM hoặc HRMA)
Đây là một kỹ thuật phân tích sau PCR. ADN đích được x ử lý v ới
sodium bisulfit, khi đó cytosine không methyl hóa bị chuy ển thành uracil,
còn cytosine bị methyl được giữ nguyên. Sau đó th ực hiện phản ứng
khuếch đại PCR với cặp mồi được thiết kế để khuếch đại cả khuôn ADN


25

methyl hóa và không methyl hóa. Sau quá trình khuếch đại này, các trình
tự ADN methyl hóa cao có chứa một số lượng lớn của các v ị trí CpG so
với mẫu không methyl hóa, điều này dẫn đến sự khác biệt về nhiệt đ ộ
nóng chảy và có thể được sử dụng trong việc định lượng s ự methyl hóa.
PCR Giải trình tự trực tiếp bisulfit

Kỹ thuật phân tích hệ gen đầu vào cao cho sự methyl hóa ADN. Nó
dựa trên sự chuyển đổi sodium bisulfit DNA hệ gen, sau đó đ ược gi ải
trình tự bằng Next-generation sequencing platform. Các trình t ự thu
được sau đó được sắp xếp lại với hệ gen tham chiếu để xác đ ịnh tr ạng
thái methyl hóa của dinucleotide CpG dựa trên s ự bắt cặp sai là do vi ệc
chuyển các cytosine không bị methyl hóa thành uracil