Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic trong đinh lăng lá xẻ [polyscias fruticosa (L.) harms.] bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID OLEANOLIC
TRONG ĐINH LĂNG LÁ XẺ [POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS.]
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Nguyễn Thị Phương Thảo*, Võ Thị Bạch Tuyết*, Nguyễn Minh Đức*

TÓM TẮT
Mục tiêu: Nghiên cứu phương pháp định lượng acid oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC)
Phương pháp: Cao Đinh lăng lá xẻ sau khi chiết xuất và thủy phân sẽ được tiến hành sắc ký lỏng hiệu năng
cao nhằm xác định hàm lượng acid oleanolic.
Kết quả: Đã xây dựng hoàn chỉnh và thẩm định quy trình định lượng acid oleanolic trong thân lá và rễ
Đinh lăng bằng HPLC.
Kết luận: Phương pháp định lượng HPLC xây dựng đáng tin cậy. Hàm lượng acid oleanolic trong thân và
lá Đinh lăng lá xẻ khá cao (1,5%), trong khi hàm lượng trong rễ rất thấp (0,063%)
Từ khóa: Đinh lăng, saponin, acid oleanolic, HPLC.

ABSTRACT
QUANTITATIVE DETERMINATION OFOLEANOLIC ACID
IN POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS - ARALIACEAE) BY HPLC
Nguyen Thi Phuong Thao, Vo Thi Bach Tuyet, Nguyen Minh Duc
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 593 - 597
Objectives: Study on a HPLC method for quantitative determination of oleanolic acid in Polyscias fruticosa
(stems and leaves, and roots).
Methods: Extracts of Polyscias fruticosa were hydrolyzed, purifified prior to quantity determination of
oleanolic acid by HPLC.
Results:: A HPLC method to determine oleanolic acid in Polyscias fruticosa was established..
Conclusions: The analytical method was proven to be reliable. The content of oleanolic acid in stems and

leaves, and in roots were determined to be 1,5% and 0,063%, respectively.
Keywords: Polyscias fruticosa, saponin, oleanolic acid, HPLC.
phẩm đang lưu hành hiện nay còn rất đơn giản.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đinh lăng lá xẻ (Polyscias fruticosa (L.) Harms
- Araliaceace), còn được gọi là cây Gỏi cá, là một
dược liệu được sử dụng khá rộng rãi với tác
dụng bổ, tăng lực, chống mệt mỏi, giúp tăng
cường khả năng lao động và hoạt động trí
não…(1,3). Đinh lăng lá xẻ chứa saponin triterpen
với aglycon chính là acid oleanolic(4). Tuy nhiên,
các tiêu chí kiểm nghiệm Đinh lăng và các chế
*Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM
Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức

Chuyên Đề Dược Khoa

Vì vậy mục tiêu của đề tài này là nhằm
nghiên cứu phương pháp định lượng acid
oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC)(2) với chất chuẩn là acid
oleanolic, nhằm góp phần phục vụ cho việc
kiểm định Đinh lăng lá xẻ và các chế phẩm hơn
hiệu quả.

ĐT: 0908989865

Email:

593

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
- Rễ Đinh lăng thu hái ở Phú Yên, thân lá
Đinh lăng thu hái ở Tây Ninh vào tháng 4/2010.
- Acid oleanolic chuẩn (độ tinh khiết 99%) do
Ban Nghiên cứu Khoa học-Thư viện, Khoa
Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
cung cấp.

Phương pháp
Máy sắc ký
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu
LC-10AD, detector SPD-M10AVP. Cột HPLC
pha đảo Prontosil LC8 (150 x 4.6 mm, 3 μm).
Quy trình chiết xuất và định lượng acid
oleanolic
Rễ, thân và lá Đinh lăng, rửa sạch, phơi khô,
xay nhỏ, xác định độ ẩm. Cân chính xác khoảng
2 g (thân lá) hoặc 5 g (rễ). Chiết kiệt bằng 150 ml
methanol với dụng cụ Soxhlet trong 20 giờ. Cô
dịch chiết đến cắn, hòa với 30 ml dung dịch HCl
10% trong cồn. Thủy phân hồi lưu ở nhiệt độ sôi
trong 6 giờ. Lắc dịch thủy phân với 200 ml

dichloromethan (20 ml x 5 lần + 10 ml x 5 lần + 5
ml x 10 lần). Lắc dịch dichloromethan với 500 ml
nước cất (100 ml x 5 lần). Làm khan dịch
dichloromethan với muối Na2SO4 khan. Cô dịch
dichloromethan đến cắn và sấy chân không ở
nhiệt độ 50oC thu được sapogenin toàn phần
(chứa chủ yếu acid oleanolic). Cân chính xác
khoảng 3 mg sapogenin toàn phần (thân lá) hoặc
10 mg (rễ), hòa tan trong methanol HPLC trong
bình định mức 5 ml. Lọc qua giấy lọc đường
kính lỗ lọc 0.45 μm, tiến hành sắc ký HPLC, tính
hàm lượng acid oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ.

Điều kiện tiến hành HPLC định lượng acid
oleanolic
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu
Pha động: CH3CN- H2O (72:28)
Cột sắc ký: Prontosil LC8 (150 x 4,6 mm, 3
μm).
Detector SPD phát hiện ở bước sóng 203 nm.
Tốc độ dòng 0,768 ml/ phút
Thể tích bơm mẫu: 20 μl

Hình 1. Sắc đồ HPLC của acid oleanolic chuẩn (trái, Rt ~ 6,5) và sapogenin toàn phần cao thân lá Đinh lăng
(phải).

Thẩm định phương pháp HPLC
Xác định tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại của phương pháp.

594

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
Kết quả điều chế mẫu để định lượng hoạt chất trong Đinh lăng bằng HPLC
Bảng 1. Kết quả điều chế mẫu để định lượng hoạt chất trong Đinh lăng bằng HPLC
Tên mẫu

Độ ẩm dược liệu

Thân lá

8,65%

Lượng dược liệu
ban đầu (g)
2,0004

Lượng dược liêu
Lượng cắn
khô (g)
sapogenin (mg)
1,8274
136,9

Định lượng acid oleanolic trong thân và lá
Đinh lăng
Đường chuẩn HPLC định lượng acid oleanolic
trong thân và lá Đinh lăng
Tiến hành xác định diện tích đỉnh acid
oleanolic của các mẫu chuẩn có nồng độ từ 24
đến 300 μg/ml ta thu được kết quả sau:
Diện tích đỉnh

4500000
4000000

y = 13855x + 21100

3500000

R = 0.9998

2

3000000
2500000

Lượng cắn pha mẫu
định lượng (mg)
3,49

Bảng 3. Các thông số sắc ký ứng với đỉnh acid
oleanolic
Số lần

bơm
1
2
3
4
5
6
TB
SD
RSD%

Thời Diện tích Hệ số Độ phân Số đĩa lý
gian lưu đỉnh
bất đối
giải
thuyết
6.507 2354748 0.88
1.6
1604
6.461 2378642 0.86
1.55
1628
6.425 2315583 0.83
1.54
1611
6.44 2398933 0.86
1.62
1592
6.471 2439432 0.86
1.58

1546
6.548 2433719 0.87
1.59
1562
6.475333 2386843 0.86
1.58
1590.5
0.045364 47506.76 0.016733 0.030332 30.99516
0.700562 1.99036 1.945721 1.919715 1.948768

2000000

RSD% của thời gian lưu là 0.7% (<2%) và của

1500000
1000000

diện tích đỉnh là 1.99% (<2%) nên hệ thống đạt

500000
0
0

50

100

150

200

250
300
350
Nồng độ (mcg/ml)

Hình 2. Đồ thị biểu diễn tính tương quan tuyến tính
giữa diện tích đỉnh và nồng độ acid oleanolic
Nhận xét: R2 = 0,9998 > 0,995
Như vậy có sự tương quan tuyến tính giữa
nồng độ acid oleanolic và diện tích đỉnh

Kết quả định lượng acid oleanolic trong thân
và lá Đinh lăng
Bảng 2. Kết quả định lượng acid oleanolic trong thân
và lá Đinh lăng
Tên
mẫu

Diện tích Nồng độ acid % acid oleanolic tính
đỉnh acid
oleanolic
trên dược liệu khô
oleanolic
(mg/ml)
Thân lá 2634708
0,1886
2,02%

Thẩm định quy trình định lượng acid

oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ
Tính tương thích hệ thống
Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống
khi xét hệ số phân tán của 6 lần bơm dung dịch
mẫu thử thân và lá Đinh lăng lá xẻ (Bảng 3).

Chuyên Đề Dược Khoa

tính tương thích.
Độ lặp lại
Kết quả đánh giá độ lặp lại được trình bày
trong Bảng 4. Nồng độ mẫu chuẩn 0,22 mg/ml,
diện tích đỉnh 3069709.
Bảng 4. Độ lặp lại của phương pháp định lượng acid
oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ
Mẫu
1
2
3
4
5
6
TB
SD
RSD%

Diện tích đỉnh mẫu
thử
2404815
2713779

2030165
2680677
2419096
2496939

Hàm lượng acid
oleanolic (%)
1.55
1.52
1.43
1.5
1.49
1.49
1.5
0.04
2.66

Nhận xét: hàm lượng trung bình acid
oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ là
1,5%. RSD = 2,66%. Hàm lượng chất phân tích <
10% nên RSD < 2,8% là được chấp nhận. Như
vậy phương pháp đạt độ chính xác.

595


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học
Độ đúng

Kết quả đánh giá độ đúng được trình bày
trong Bảng 5.
Bảng 5. Độ đúng của phương pháp định lượng acid
oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ
Mẫu
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TB
SD
RSD%

Mức Lượng acid
hàm oleanolic thêm
lượng
vào (mg)
17,99
80%
18,24
18,14
22,49
100%
22,49

22,45
27,03
120%
27,31
26,75

Lượng acid
oleanolic tìm
thấy (mg)
17,48
18,11
17,96
22,41
23,07
22,36
26,61
26,78
26,41

Tỷ lệ
phục
hồi (%)
97,17
99,29
99,01
99,64
102,58
99,6
98,45
98,06

98,73
99,17
1,5
1,51

Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục là 99,17%. Hàm
lượng chất phân tích ≥ 1% nên tỉ lệ phục hồi nằm
trong khoảng 97-103% là được chấp nhận. Như
vậy phương pháp đạt độ đúng.
Kết luận: Như vậy, kết quả thẩm định quy
trình định lượng acid oleanolic đã cho thấy: với
quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đã trình
bày, phương pháp đạt độ đúng và độ lặp lại cần
thiết để định lượng acid oleanolic trong dược
liệu thân và lá Đinh lăng lá xẻ.

Thẩm định quy trình định lượng acid
oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ
Độ lặp lại
Kết quả đánh giá độ lặp lại được trình bày
trong Bảng 6. Nồng độ mẫu chuẩn 0,235 mg/ml,
diện tích đỉnh 3279022.
Bảng 6. Độ lặp lại của phương pháp định lượng acid
oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ
Mẫu
1
2
3
4

596

Diện tích đỉnh mẫu Hàm lượng acid oleanolic
(%)
thử
5
1488948
0,065
6
1430635
0,064
TB
0.063
SD
0,002
RSD%
3,59
Mẫu

Diện tích đỉnh mẫu Hàm lượng acid oleanolic
(%)
thử
1465489
0,063
1476281
0,064
1251069
0,061
1175139
0,059

Nhận xét: hàm lượng trung bình acid
oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ là 0,063%.
RSD = 3,59%. Hàm lượng chất phân tích <
0,1% nên RSD < 3,7% là được chấp nhận. Như
vậy phương pháp đạt độ chính xác.
Độ đúng
Kết quả đánh giá độ đúng được trình bày
trong Bảng 7.
Bảng 7. Độ đúng của phương pháp định lượng acid
oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ
Mẫu
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Mức Lượng acid
hàm oleanolic thêm
lượng
vào (mg)
2,3
80%
2,28
2.25

3,35
100%
3,34
3.3
3.75
120%
3.72
3.8

Lượng acid
oleanolic tìm
thấy (mg)
2,21
2.2
2.2
3,27
3,27
3.23
3.62
3.59
3.71

TB
SD
RSD%

Tỷ lệ
phục
hồi (%)
96,09

96,49
97,78
97,61
97,9
98,48
96,53
96,51
97,63
97,22
0,83
0,85

Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục là 97,22%. RSD =
0,85%. Hàm lượng chất phân tích
< 0,1% nên tỉ lệ phục hồi nằm trong khoảng
95-105% là được chấp nhận. Như vậy phương
pháp đạt độ đúng.
Kết luận: Như vậy, kết quả thẩm định quy
trình định lượng acid oleanolic đã cho thấy: với
quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đã trình
bày, phương pháp đạt độ đúng và độ lặp lại cần
thiết để định lượng acid oleanolic trong dược
liệu rễ Đinh lăng lá xẻ.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã xây
dựng được hoàn chỉnh và thẩm định quy trình

Chuyên Đề Dược Khoa

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
định lượng acid oleanolic trong thân lá và rễ
Đinh lăng lá xẻ. Qua kết quả định lượng thấy
được thân lá Đinh lăng lá xẻ chứa hàm lượng
acid oleanolic khá cao (1,5%) trong khi rễ chứa
rất ít (0,063%).
Phương pháp chiết xuất, loại tạp và định
lượng acid oleanolic trong thân là và rễ Định
lăng đã được chứng minh là đáng tin cậy và ổn
định, có thể dùng để kiểm định acid oleanolic
trong Đinh lăng và các chế phẩm, cũng như mở
rộng ứng dụng cho các dược liệu chứa acid
oleanolic khác.

Chuyên Đề Dược Khoa

Nghiên cứu Y học

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.

3.

4.

Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà
xuất bản Y Học, Hà Nội, tr. 828-830.
Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số

ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và
hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản Y Học, Thành phố Hồ Chí
Minh.
Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, tập II, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.793796.
Vo Duy Huan, Satoshi Yamamura, Kazuhiro Otani, Ryoji
Kasai, Kazuo Yamasaki, Nguyen Thoi Nham, Hoang Minh
Chau (1998), “Oleannolic saponins from Polyscias fruticosa”,
Phytochemmistry, Vol. 47, No. 3, pp. 451-457.

597