Phát hiện đột biến gen cKIT trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy có chuyển vị t(8;21)(q22;q22)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 

Nghiên cứu Y học

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN cKIT TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP  
DÒNG TỦY CÓ CHUYỂN VỊ t(8;21)(q22;q22) 
Phan Thị Xinh*,**, Hoàng Anh Vũ* 

TÓM TẮT 
Đặt vấn đề: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự DNA khảo sát đột biến gen cKIT trên bệnh nhân (BN) bạch 
cầu cấp dòng tủy (BCCDT) có chuyển vị t(8;21)(q22;q22). 
Đối tượng và phương pháp: Mẫu tủy xương của 15 BN BCCDT có t(8;21) và/hoặc có biểu hiện AML1‐
ETO được khảo sát đột biến gen cKIT từ exon 8 đến exon 17 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ 05/2012 
đến 05/2013. 
Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi khuếch đại được sản phẩm PCR dài 1751 bp từ exon 7 đến exon 
21 cho phép phát hiện hầu hết các kiểu đột biến trong vùng từ exon 8 đến exon 17 của cKIT. Phân tích kết quả 
của 15 BN phát hiện 5 BN (33,3%) có đột biến, trong đó BN6 mang cùng lúc 2 kiểu đột biến cho thấy có tiên 
lượng xấu do không đáp ứng với điều trị hóa trị liệu và dị ghép tủy. Các kiểu đột biến trong nghiên cứu gồm 
D816V, D816Y, N822K và N822Y, là các đột biến thường gặp đã được báo cáo. 
Kết luận: Xây dựng thành công quy trình khảo sát đột biến gen cKIT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học, 
giúp việc phân nhóm tiên lượng tốt hơn trên nhóm BN BCCDT có t(8;21). 
Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng tủy, t(8;21)(q22;q22), đột biến cKIT. 

ABSTRACT 
DETECTION OF cKIT MUTATIONS IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA PATIENT  
WITH t(8;21)(q22;q22) TRANSLOCATION 
Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu  
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 277 ‐ 231 
Background: Detection of cKIT mutations in acute myeloid leukemia (AML) patient with t(8;21)(q22;q22) 
translocation using direct DNA sequencing technique. 
Methods: Bone marrow samples of 15 AML patients with t(8;21) and/or AML1‐ETO expression were used 

for detection of cKIT mutations from exons 8 to exon 17 at Blood Transfusion and Hematology Hospital from 
May 2012 to May 2013. 
Result: In this study, we were able to amplify PCR product of 1751 bp, expanding from exon 7 to exon 21 of 
cKIT,  which  harbored  almost  all  mutations  within  exon  8  to  exon  17.  Analyzing  the  DNA  sequences  of  15 
patients, we detected 5 patients (33.3%) carrying cKIT mutations. Among 5 patients positive for cKIT mutation, 
Patient  6  had  2  kinds  of  mutation  and  poor  prognosis  without  response  to  chemotherapy  and  allogeneic  bone 
marrow transplantation. Mutations  in  this  study  are  previously  reported,  including  D816V,  D816Y,  N822K, 
and N822Y. 
Conclusion: We successfully developed a procedure for detecting cKIT mutation at Blood Transfusion and 
Hematology Hospital, which may help to divide AML patients with t(8;21) to different prognostic groups. 
Key words: acute myeloid leukemia, t(8;21), cKIT mutation. 

* Đại  học Y Dược TP.HCM 
Tác giả liên lạc: TS.BS. Phan Thị Xinh  

Huyết Học

** Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM. 
ĐT: 0932728115  
Email:

227


Nghiên cứu Y học 

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014

ĐẶT VẤN ĐỀ 

ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 

Bạch  cầu  cấp  dòng  tủy  (BCCDT)  là  bệnh  lý 
ác  tính  về  máu  đặc  trưng  bởi  sự  tăng  sinh  quá 
mức tế bào non trong tủy xương và trong  máu 
gây giảm 3 dòng tế bào máu bình thường. Dựa 
vào  bất  thường  nhiễm  sắc  thể  (NST)  và  gen, 
BCCDT được chia thành 3 nhóm tiên lượng tốt, 
trung  bình  và  xấu.  Nhóm  tiên  lượng  tốt  gồm 
những bệnh nhân (BN) có mang chuyển vị NST 
t(8;21)(q22;q22), 
t(15;17)(q22;q12‐21) 
và 
inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22),  trong  đó 
nhóm t(15;17) có bệnh cảnh lâm sàng đặc biệt là 
BCCDT thể M3 có tiên lượng rất tốt với điều trị 
phối hợp hóa trị liệu chuẩn và ATRA, còn nhóm 
t(8;21)  và  inv(16)/t(16;16)  thì  đáp  ứng  với  phác 
đồ điều trị hóa trị liệu cytarabine ‐ anthracycline 
không đồng nhất(5,10). Một số nghiên cứu trên thế 
giới  cho  thấy  khoảng  46%  BN  với  t(8;21)  và 
inv(16)/t(16;16)  có  thêm  đột  biến  ở  exon  8  và 
exon  17  của  gen  cKIT  sẽ  tái  phát  sớm  sau  lui 
bệnh hoàn toàn(1,6,7). Vì thế, hướng dẫn của Mạng 
Lưới  Ung  Thư  Quốc  Gia  của  Hoa  Kỳ  đề  nghị 
khảo sát đột biến cKIT thường quy trong nhóm 
BN  có  chuyển  vị  NST  t(8;21)  và  inv(16)/t(16;16) 
và những BN này nếu có kèm đột biến cKIT thì 
được xếp vào nhóm tiên lượng trung bình. 

Đối tượng 

Có  nhiều  kiểu  đột  biến  cKIT  được  tìm  thấy 
trong BCCDT với t(8;21) như đột biến thêm hoặc 
mất  đoạn  tại  exon  8  dẫn  tới  mất  amino  acid 
aspartic  tại  codon  419,  đột  biến  cKIT‐ITD  tại 
exon 11, 12 hoặc đột biến điểm làm thay đổi cấu 
trúc  trong  vùng  tyrosine  kinase  (exon  17).  Đột 
biến  trên  exon  17  phổ  biến  nhất  là  D816V  và  ít 
phổ biến hơn là D816Y, D816H, D816F và D816I 
hoặc  đột  biến  điểm  tại  một  số  codon  khác  như 
821, 822 và 823(8). 
Tại  Bệnh  viện  Truyền  máu  Huyết  học 
(BVTMHH)  mỗi  năm  có  khoảng  30  BN  mới 
được  chẩn  đoán  BCCDT  có  t(8;21).  Việc  chẩn 
đoán đột biến gen cKIT một nhu cầu rất cần thiết 
giúp bác sĩ lâm sàng phân nhóm nguy cơ và lựa 
chọn hướng điều trị phù hợp cho bệnh nhân. 

228

15  mẫu  tủy  xương  của  BN  bạch  cầu  cấp 
dòng  tủy  (BCCDT)  lúc  chẩn  đoán  có  biểu  hiện 
chuyển  vị  t(8;21)(q22;q22)  bằng  kỹ  thuật  lai  tại 
chỗ  phát  huỳnh  quang  (FISH)  hoặc  biểu  hiện 
AML1‐ETO  bằng  kỹ  thuật  khuếch  đại  gen  sao 
chép  ngược  (RT‐PCR)  tại  BVTMHH  từ  tháng 
5/2012 đến tháng 5/2013. 

Phương pháp 

RT–PCR 
Mẫu  tủy  trong  chống  đông  EDTA  được  xử 
lý loại hồng cầu  và  ly  trích  RNA  từ  máu  ngoại 
biên  bằng  RNeasy  Mini  Kit  (Qiagen,  Hoa  Kỳ). 
cDNA  được  tổng  hợp  từ  1  μg  RNA  với 
Superscript  II  reverse  transcriptase  (Invitrogen, 
Hoa  Kỳ)  theo  hướng  dẫn  của  nhà  sản  xuất.  Để 
khuếch  đại  đoạn  gen  cKIT  từ  exon  8  đến  exon 
17,  chúng  tôi  thiết  kế  mồi  xuôi  F1  (5’‐
TGTCCAATTCTGACGTCAAT‐3’)  nằm  trên 
exon  7  và  mồi  ngược  R1  (5’‐
TCAGACATCGTCGTGCACAAGC‐3’) 
nằm 
trên  exon  21  bằng  phần  mềm  Oligo  4.1. 
Polymerase  dùng  cho  PCR  là  Takara  Taq  HS 
(Takara,  Nhật  Bản).  Chương  trình  luân  nhiệt 
trên máy GeneAmp PCR System 2720 (Applied 
Biosystems,  Hoa  Kỳ)  trong  45  chu  kỳ  với  nhiệt 
độ  bắt  cặp  là  60oC.  Sản  phẩm  PCR  được  kiểm 
chứng  bằng  điện  di  trên  thạch  1,2%  (Hình  1), 
tinh  sạch  bằng  QIAquick  Gel  extraction  kit 
(Qiagen, Hoa Kỳ). 
Giải trình tự chuỗi DNA 
Thực  hiện  phản  ứng  cycle  sequencing  với 
BigDye Terminator v3.1 sử dụng sản phẩm PCR 
đã được tinh sạch theo hai chiều xuôi và ngược. 
Các mồi dùng cho cycle sequencing gồm có F1, 
F2, F3, F4 và R1 (Hình 1). Sau khi kết tủa bằng 
ethanol, biến tính trong Hi‐Di formamide ở 960C 
trong 2 phút, sản phẩm được đọc trình tự bằng 

máy  ABI  3130  Genetic  Analyzer  và  dữ  liệu  thô 
được phân tích bằng phần mềm SeqScape. 

Chuyên Đề Nội Khoa 


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 

Nghiên cứu Y học

cKIT
F1
1

F2
2

3

1500 bp

F3

F4

R

4

1751 bp

750 bp

1. Thang chuẩn 1 kb
2. Nước
3. Mẫu bệnh nhân 1
4. Mẫu bệnh nhân 2

 
Hình 1: Vị trí mồi và sản phẩm PCR 
mặt  tế  bào  và  đã  được  xác  định  có  chuyển  vị 

KẾT QUẢ  
Trong BCCDT, vùng gen cKIT thường xảy ra 
đột biến là từ exon 8 đến exon 17. Sử dụng cặp 
mồi F1 và R1, chúng tôi đã khuếch đại được sản 
phẩm PCR dài 1751 bp phủ từ exon 7 đến exon 
21 (Hình 1) cho phép nhận diện hầu hết các kiểu 
đột  biến  điểm,  mất  đoạn  hay  chèn  đoạn  có  thể 
xảy ra trên cKIT. 
Các bệnh nhân trong nghiên cứu được chẩn 

t(8;21) và/hoặc biểu hiện tổ hợp gen AML1‐ETO, 
là bất thường NST và gen đặc hiệu của BCCDT. 
Phân  tích  trình  tự  cKIT  của  15  BN  gồm  8  BN 
nam  và  7  BN  nữ,  chúng  tôi  phát  hiện  5  BN  có 
đột biến cKIT, chiếm 33,3%. Đột biến trong 5 BN 
là các đột biến điểm, trong đó BN6 có 2 kiểu đột 
biến  và  2  thay  đổi  acid  amin  M541L,  L862L  có 
tính đa hình (Bảng 1). 

đoán BCCDT dựa vào lâm sàng, tủy đồ, dấu bề 
Bảng 1: Kết quả FISH, RT‐PCR và đột biến cKIT  
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Tuổi
56
49
10
26
37
37
45
19
47

52
24
25
16
48
26

Giới
Nữ
Nam
Nam
Nữ
Nam
Nữ
Nữ
Nam
Nam
Nam
Nữ
Nam
Nữ
Nam
Nữ

FISH (% tế bào dương tính)
t(8;21) (13,5%)
t(8;21) (94,5%)
t(8;21) (96%)

t(8;21) (92%)

t(8;21) (85,5%)
t(8;21) (97,5%)
t(8;21) (96%)
t(8;21) (95,5%)
t(8;21) (98%)
t(8;21) (95,5%)

RT-PCR
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO
AML1/ETO

c-KIT
WT
D816V
WT
WT
WT
M541L, D816Y, N822K, L862L

WT
WT
WT
WT
D816V
WT
WT
N822Y
D816Y

Đột  biến  thường  gặp  nhất  là  vị  trí  D816  và 

(Hình 2A) gặp trong BN6 và BN15 và D816V là 

N822  trên  exon  17.  D816  có  nhiều  biến  thể, 

thay  đổi  aspartic  acid  thành  valine  (Hình  2B) 

D816Y  là  thay  đổi  aspartic  acid  thành  tyrosine 

gặp trong BN2 và BN11. 

Huyết Học

229


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014

Nghiên cứu Y học 

A

B

 
Hình 2: Các kiểu đột biến cKIT phát hiên trên bệnh nhân. 
2 kiểu đột biến và 2 biến thể (đa hình) phát hiện trên BN6 (A), và hình ảnh đột biến D816V (B) 

BÀN LUẬN 

số nghiên cứu khác đã khảo sát ảnh hưởng của 

Bằng việc thay đổi điều kiện nhiệt độ bắt cặp 
mồi  từ  58oC  đến  64oC  và  sử  dụng  Takara  Taq 
HS,  chúng  tôi  đã  khuếch  đại  thành  công  sản 
phẩm PCR  đặc  hiệu  dài  1751  bp  từ  exon  7  đến 
exon 21 ở nhiệt bắt cặp 60oC. Giải trình tự DNA 
sản  phẩm  PCR  trên  đã  giúp  phát  hiện  các  kiểu 
đột biến thường gặp trên BN BCCDT. 

các kiểu đột biến cKIT trên nhóm BN có t(8;21) 

Kết quả khảo sát đột biến cKIT trên 15 BN 
BCCDT 

có 

t(8;21) 

và/hoặc 

biểu 

hiện 

AML1/ETO cho thấy 33,3% BN có đột biến. Các 
đột  biến  được  phát  hiện  gồm  D816V,  D816Y, 
N822K,  N822Y  (Bảng  1)  là  các  đột  biến  đã 
được báo cáo nằm trên exon 17 có ảnh hưởng 
đến  tiên  lượng  bệnh(4,9).  Cairoli  và  cộng  sự 
nghiên cứu trên 49 BN có t(8;21) cho thấy 22% 
BN biểu hiện đột biến cKIT, và theo dõi 5 năm 
sau  khi  điều  trị  bằng  phác  đồ  hóa  trị  liệu 
chuẩn  cho  thấy  tỉ  lệ  tái  phát  cao  ở  nhóm  BN 
mang đột biến cKIT exon 17 (70%) so với nhóm 
không  mang  đột  biến  (36%)(1,7).  Ngoài  ra,  một 

230

và kết quả cho thấy đột biến cKIT exon 17 ảnh 
hưởng  đến  tiên  lượng  bệnh,  làm  tăng  tỉ  lệ  tái 
phát  so  với  đột  biến  cKIT  ở  các  vị  trí  khác(1,9). 
Trong nghiên cứu này, mặc dù chúng tôi chưa 
theo dõi điều trị vì số lượng BN ít và thời gian 
điều trị ngắn dưới 24 tháng, nhưng BN6 mang 
cùng  lúc  2  kiểu  đột  biến  D816Y  và  N822K  đã 
tái  phát  sớm  ngay  sau  khi  ngưng  hóa  trị  liệu 
giai đoạn củng cố 2 và cũng tái phát vào ngày 
thứ  35  sau  khi  được  dị  ghép  tế  bào  gốc  tạo 

máu, cho thấy BN có tiên lượng rất xấu kháng 
với các phương pháp điều trị hiện tại.  
Đột biến cKIT trong BCCDT là đột biến tăng 
chức  năng  và  bị  ức  chế  bởi  các  thuốc  ức  chế 
tyrosine  kinase,  vì  vậy  các  nghiên  cứu  gần  đây 
đề  nghị  phối  hợp  hóa  trị  liệu  với  các  thuốc  ức 
chế  tyrosine  kinase  trong  điều  trị  nhóm  BN 
mang t(8;21) có đột biến cKIT nhằm cải thiện tiên 
lượng và kéo dài thời gian sống cho BN(2,3). 

Chuyên Đề Nội Khoa 


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 
KẾT LUẬN 
Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình 
khảo  sát  đột  biến  gen  cKIT  trong  BCCDT.  Kết 
quả  của  nghiên  cứu  giúp  các  bác  sĩ  lâm  sàng 
phân nhóm tiên lượng chính xác hơn trên nhóm 
BN  có  t(8;21)  nhằm  lựa  chọn  phác  đồ  điều  trị 
phù hợp cho BN, để có hiệu quả điều trị cao hơn 
đặc biệt trên nhóm BN có đột biến cKIT. 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1.

2.
3.

4.

Cairoli  R,  Beghini  A,  Grillo  G,  et al.  Prognostic  impact  of  cKIT 
mutations  in  core  binding  factor  leukemias:  an  Italian 
retrospective study. Blood 2006;107(9):3463‐3468. 
Jae  HP, Cyrus  VH, Martin  ST.  Blood consult:  acute  myeloid 
leukemia and the t(8;21)(q22;22). Blood 2011;117(10):2775‐2777. 
Jitakshi De, Reza Z, Michele H, et al. Immunophenotypic Profile 
Predictive  of  cKIT  Activating  Mutations  in  AML1‐ETO 
Leukemia. Am J Clin Pathol 2007;128:550‐557. 
Kim HJ, Ahn HK, Jung CW, et al. KIT D816 mutation associates 
with  adverse  outcomes  in  core  binding  factor  acute  myeloid 
leukemia,  especially  in  the  subgroup  with  RUNX1/RUNX1T1 
rearrangement. Ann Hematol. 2013;92(2):163‐71. 

Nghiên cứu Y học

5.

Longley  BJ,  Reguera  MJ,  Ma  Y.  Classes  of  c‐KIT  activating 
mutations: proposed mechanisms of action and implications for 
disease classification and therapy. Leuk Res 2001;25(7):571‐6. 
6. Park  SH,  Chi  HS,  Min  SK,  et  al.  Prognostic  impact  of  c‐KIT 
mutations in core binding factor acute myeloid leukemia. Leuk 
Res 2011;35(10):1376‐83. 
7. Pollard  JA,  Alonzo  TA,  Gerbing  RB,  et  al.  Prevalence  and 
prognostic  significance  of  KIT  mutations  in  pediatric  patients 
with  core  binding  factor  AML  enrolled  on  serial  pediatric 
cooperative trials for de novo AML. Blood 2010;115(12):2372‐9. 
8. Renneville  A,  Roumier  C,  Biggio  V,  et  al.  Cooperating  gene 
mutations in acute myeloid leukemia: a review of the literature. 

Leukemia 2008, 22: 915–931. 
9. Schnittger S, Kohl TM, Haferlach T, et al. cKIT‐D816 mutations 
in  AML1‐ETO‐positive  AML  are  associated  with  impaired 
event‐free and overall survival. Blood 2006;107(5):1791‐1799. 
10. Shimada  A,  Taki  T,  Tabuchi  K,  et  al.  KIT  mutations,  and  not 
FLT3 internal tandem duplication, are strongly associated with 
a  poor  prognosis  in  pediatric  acute  myeloid  leukemia  with 
t(8;21):  a  study  of  the  Japanese  Childhood  AML  Cooperative 
Study Group. Blood 2006;107(5):1806‐9. 

 
Ngày nhận bài báo:  

 

 

24/10/2013 

Ngày phản biện nhận xét bài báo:  

20/11/2013 

Ngày bài báo được đăng:  

05/01/2014 

 

 

Huyết Học

231