Xây dựng phương pháp LCMSMS phân tích lisinopril trong huyết tương người và ứng dụng trong nghiên cứu tương đương sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THÙY DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS
PHÂN TÍCH LISINOPRIL TRONG
HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI VÀ ỨNG DỤNG TRONG
NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THÙY DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS
PHÂN TÍCH LISINOPRIL TRONG
HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI VÀ ỨNG DỤNG TRONG
NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
Người hướng dẫn khoa học:
TS. Trần Nguyên Hà
TS. Tạ Mạnh Hùng

HÀ NỘI 2019


LỜI CÁM ƠN
Luận văn được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Trần Nguyên Hà – Trường
Đại học Dược Hà Nội và TS. Tạ Mạnh Hùng – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương. Để
hoàn thành luận văn này:
Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các thầy cô
hướng dẫn đã tận tình chỉ bảo, quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận
văn.
Tôi xin gửi cám ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo, các Thầy Cô Bộ
môn Hóa Phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian học tập tại trường.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo, các Thầy
Cô cùng đồng nghiệp Khoa Dược – Đại học Y Dược Hải Phòng đã tạo điều kiện cho tôi
trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn DS. Nguyễn Thị Dung, DS. Phạm Thanh Huyền và toàn
thể cán bộ của Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ương đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
giúp đỡ và động viện và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận
văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, tháng 04 năm 2019

Học viên: Vũ Thùy Dung


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
Chương 1: TỔNG QUAN ............................................................................................... 3
1.1. Lisinopril ................................................................................................................... 3
1.1.1. Tính chất ................................................................................................................. 3
1.1.2. Tác dụng dược lý và dược động học ........................................................................ 3
1.1.3. Chỉ định và chống chỉ định...................................................................................... 5
1.1.4. Một số phương pháp định lượng lisinopril trong chế phẩm thuốc và trong dịch sinh
học .................................................................................................................................... 5
1.2. Sắc lý lỏng – khối phổ (LC-MS) ................................................................................ 8
1.3. Phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học .................................................... 10
1.3.1. Kỹ thuật xử lý mẫu................................................................................................ 10
1.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học ......................................... 11
1.4. Tổng quan về sinh khả dụng và tương đương sinh học ............................................. 14
1.4.1. Khái niệm chung ................................................................................................... 14
1.4.2. Quy trình thực hiện đánh giá tương đương sinh học .............................................. 14
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .............................................................................................................. 19
2.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu .................................................................... 19
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi ........................................................................... 19
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị.................................................................................................... 19
2.2. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 20

2.2.1. Mẫu huyết tương ................................................................................................... 20
2.2.2. Mẫu thuốc ............................................................................................................. 20
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 21


2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 21
2.4.1. Xây dựng phương pháp phân tích trên hệ thống LC-MS/MS ................................. 21
2.4.2. Thẩm định phương pháp phân tích ........................................................................ 22
2.5. Xác định nồng độ thuốc trong huyết tương của người tình nguyện ........................... 27
2.5.1. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................................... 27
2.5.2. Cho uống thuốc, lấy mẫu máu ............................................................................... 27
2.5.3. Định lượng lisinopril trong huyết tương ................................................................ 27
2.5.4. Phân tích dược động học và đánh giá kết quả ........................................................ 28
2.5.5. Thông qua hội đồng đạo đức ................................................................................. 29
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU......................................................................... 30
3.1. Kết quả xây dựng phương pháp phân tích ................................................................ 30
3.1.1. Xây dựng điều kiện khối phổ phân tích lisinopril .................................................. 30
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ...................................................................................... 32
3.1.3. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương ........................................................ 34
3.1.4. Khảo sát lựa chọn chuẩn nội ................................................................................. 36
3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích ............................................................... 38
3.2.1. Độ đặc hiệu- chọn lọc ........................................................................................... 38
3.2.2. Ảnh hưởng của nền mẫu....................................................................................... 40
3.2.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ....................................................................... 41
3.2.4. Xác định giới hạn định lượng dưới ........................................................................ 42
3.2.5. Độ đúng - độ chính xác trong ngày........................................................................ 44
3.2.6. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp .............................................................................. 49
3.2.7. Khảo sát độ ổn định .............................................................................................. 50
3.3. Kết quả đánh giá TĐSH viên nén Lizectric 10 mg ................................................... 57
3.3.1. Tuyển chọn NTN .................................................................................................. 57

3.3.2. Uống thuốc và lấy máu ......................................................................................... 57
3.3.3. Định lượng lisinopril trong máu NTN sau khi uống thuốc thử và chứng ................ 58
3.3.4. Phân tích dược động học và đánh giá tương đương sinh học ................................. 63


Chương 4: BÀN LUẬN................................................................................................ 67
4.1. Phương pháp phân tích định lượng lisinopril trong huyết tương người ..................... 67
4.1.1. Phương pháp định lượng lisinopril ........................................................................ 67
4.1.2. Kỹ thuật xử lý mẫu................................................................................................ 67
4.1.3. Thẩm định phương pháp phân tích ........................................................................ 68
4.2. Kết quả phân tích mẫu huyết tương NTN ................................................................. 69
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Giải thích

Chữ viết tắt
AN

Chất phân tích (Analyte)

ASEAN

Liên hiệp các quốc gia Đông Nam Á

AUC

Diện tích dưới đường cong

Cmax

Nồng độ đỉnh

CV

Hệ số biến thiên

EMA

Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu

GABA

Gabapentin

GLP

Thực hành tốt phòng thí nghiệm

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HQC

Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao

HT

Huyết tương

IS

Chuẩn nội

LC-MS

Sắc ký lỏng khối phổ

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng khối phổ hai lần

LISI

Lisinopril

LLOQ

Giới hạn định lượng dưới

LQC

Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp

m/z

Khối lượng/điện tích

MeCN

Acetonitril

MeOH

Methanol

MEL

Meloxicam

MET

Metformin

MF

Hệ số nền mẫu

MQC

Mẫu kiểm tra ở nồng độ trung bình

NTN

Người tình nguyện

PRT

Piracetam


QC

Mẫu kiểm tra

SD

Độ lệch chuẩn

SKD

Sinh khả dụng

SKĐ

Sắc ký đồ

SPE

Chiết pha rắn

STT

Số thứ tự

SQC

Mẫu kiểm tra bổ sung

TĐSH

Tương đương sinh học

Tmax

Thời gian đạt nồng độ cực đại

TFA

Trifluoroacetic

ULOQ

Giới hạn định lượng trên

US-FDA

Hiệp hội thực dược phẩm Mỹ

UV-VIS

Tử ngoại - khả kiến

VKNTTW

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

v/v

Thể tích/thể tích


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của lisinopril ........................................................................ 3
Hình 1.2: Sơ đồ khối của máy khổi phổ ............................................................................ 8
Hình 1.3: Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập 3 ................................. 9
Hình 3.1: Khối phổ MS dung dịch chuẩn LISI….................................................................30
Hình 3.2: Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có số khối 406 Da .................. 31
Hình 3.3: Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [LISI-H]+ .................................................... 31
Hình 3.4: Giản đồ năng lượng phân mảnh [LISI-H]+ ..................................................... 32
Hình 3.5: SKĐ mẫu chuẩn chứa LISI khi sử dụng hệ pha động MeOH-amoniformat pH4
(70:30, v/v) ..................................................................................................................... 33
Hình 3.6: SKĐ mẫu chuẩn chứa LISI khi sử dụng hệ dung môi pha động....................... 33
Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu chuẩn chứa LISI khi sử dụng hệ MeOH-acid forcmic 0,1%
(50:50, v/v) ..................................................................................................................... 33
Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chuẩn chứa LISI khi chiết lỏng lỏng .................... 34
Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chuẩn chứa LISI khi tủa protein .......................... 35
Hình 3.10: Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn IS ..................................................................... 36
Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (Blank) ..................................................... 39
Hình 3.12: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha IS và chuẩn LISI ở nồng độ 1 ng/mL
....................................................................................................................................... 39
Hình 3.13: Đường cong trung bình nồng độ Lisinopril theo thời gian của 24 NTN ........ 58


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Tóm tắt các thông số dược động học của LISI trong một số nghiên cứu ........... 4

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng lisinopril bằng LC-MS/MS................................ 6
Bảng 2.1: Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương................................................24
Bảng 2.2: Cách chuẩn bị mẫu LLOQ trong huyết tương ................................................. 24
Bảng 2.3: Cách chuẩn bị mẫu QC trong huyết tương .................................................... 24
Bảng 3.1: Điều kiện khối phổ định lượng LISI và IS…......................................................38
Bảng 3.2: Kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống..................................................... 39
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng Rt của LISI và IS .................... 40
Bảng 3.4: Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu ..................................................... 41
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát đường chuẩn theo mô hình weighting 1/x2 ........................... 42
Bảng 3.6: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới trong 3 ngày................................ 43
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ đúng- độ chính xác trong ngày mẫu LLOQ (1,0 ng/mL) . 45
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ đúng- độ chính xác trong ngày mẫu LQC (3,0 ng/mL) .... 45
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ đúng- độ chính xác trong ngày mẫu MQC (101,5 ng/mL)
....................................................................................................................................... 46
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng- độ chính xác trong ngày mẫu HQC (162,5 ng/mL)
....................................................................................................................................... 46
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ đúng- độ chính xác trong ngày mẫu SQC (24,4 ng/mL) 47
Bảng 3.12: Kết quả khảo sát độ chính xác khác ngày (n=5) ........................................... 47
Bảng 3.13: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của IS ............................................................ 49
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của Lisinopril ................................................ 50
Bảng 3.15: Khảo sát độ ổn định dung dịch chuẩn gốc và chuẩn nội gốc thời gian ngắn
nhiệt độ phòng ................................................................................................................ 51
Bảng 3.16: Khảo sát độ ổn định dung dịch chuẩn gốc và chuẩn nội gốc thời gian dài ở
nhiệt độ 20C – 80C .......................................................................................................... 52
Bảng 3.17: Kết quả độ ổn định của mẫu HT ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ .................... 53
Bảng 3.18: Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau 5 chu kỳ đông–rã ................... 54


Bảng 3.19: Độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương .................................................. 55
Bảng 3.20: Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý trong autosampler. ........................... 56

Bảng 3.21: Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo................................................................... 56
Bảng 3.22: Kết quả ngẫu nhiên và phác đồ sử dụng thuốc ............................................. 57
Bảng 3.23: Nồng độ lisinopril throng huyết tương sau khi uống thuốc thử (ng/mL) ........ 59
Bảng 3.24: Nồng độ Lisinopril trong huyết tương sau khi uống thuốc chứng (ng/mL) .... 61
Bảng 3.25: Các thông số dược động học của NTN sau khi uống thuốc thử và thuốc chứng
....................................................................................................................................... 63
Bảng 3.26: Phân tích phương sai giá trị Cmax, AUClast, AUCinf ......................................... 64
Bảng 3.27: Tóm tắt số liệu so sánh sinh khả dụng ......................................................... 65
Bảng 3.28: So sánh giá trị Tmax theo phương pháp thống kê phi tham số ........................ 65
Bảng 3.29: DĐH của ZESTRIL trên 24 NTN Việt Nam và số liệu DĐH đã được công bố
của AC Leary .................................................................................................................. 70
Bảng 3.30: Các thông số khám và xét nghiệm lâm sàng của 24 NTN chính thức tham gia
nghiên cứu ........................................................................Error! Bookmark not defined.


ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh về tim mạch là bệnh phổ biến trong cộng đồng và nếu không điều trị đúng
đắn và kịp thời sẽ dẫn tới nhiều biến chứng nguy hiểm, thậm trí có thể gây tử vong.
Lisinopril, (S)-1-[N2-(1-carboxy-3-phenylpropyl)-L-lysyl]-L-prolin là thuốc ức chế men
chuyển (ACE) và là một dẫn chất lysin có cấu trúc tương tự enalapril với tác dụng kéo dài.
Thuốc được dùng chỉ định cho người tăng huyết áp (dùng đơn trị liệu và trong phối hợp
thuốc) và điều trị phụ trợ suy tim [1]. Theo thực tế lâm sàng, lisinopril là một trong những
thuốc hiệu quả nhất trong lớp thuốc ức chế men chuyển angiotensin ACE, nên lisinopril
được sử dụng rộng rãi trong điều trị.
Trên thị trường Việt Nam có khá nhiều chế phẩm chứa hoạt chất lisinopril như viên
nén 2,5 mg; 5 mg; 10 mg; 20 mg; 30 mg và 40 mg hoặc ở dạng phối hợp viên nén lisinopril
kết hợp với 12,5 mg hoặc 25 mg hydrocorothiazid...., tuy nhiên hầu hết đều chưa được đánh
giá tương đương sinh học (TĐSH) với biệt dược gốc để chứng minh khả năng thay thế so
với thuốc biệt dược gốc trên lâm sàng. Vì vậy, để góp phần nâng cao chất lượng thuốc trong
nước, cung cấp các thuốc chứa lisonopril có chất lượng tốt với giá thành hợp lý, thay thế

các thuốc biệt dược gốc tới người bệnh, thì việc đánh giá TĐSH giữa chế phẩm chứa
lisinopril với biệt dược gốc là cần thiết.
Đối với các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) và TĐSH, một trong những
nội dung quan trọng là phải xây dựng được một phương pháp định lượng đủ độ nhạy và đủ
độ tin cậy. Với lisinopril, quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều
khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thấp. Ở mức liều 10 mg, nồng độ lisinopril tối đa
(Cmax) trong huyết tương người khoảng 61 ng/mL [18], ngoài ra do nền mẫu dịch sinh học
thường rất phức tạp, các thiết bị thông thường như máy quang phổ, sắc ký lỏng không đủ
độ nhạy, thời gian phân tích kéo dài và quy trình xử lý mẫu phức tạp [11], [14], [23].
Hiện nay, bằng việc phối hợp kỹ thuật sắc ký lỏng và phân tích khối phổ hai lần có
thể giải quyết được vấn đề về độ chọn lọc, độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp phân
tích định lượng lisinopril trong dịch sinh học và nghiên cứu TĐSH [14], [22], [23]. Vì vậy,
1


chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp LC-MS/MS phân tích
lisinopril trong huyết tương người và ứng dụng trong nghiên cứu tương đương sinh
học” với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng lisinopril trong huyết tương
bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS).
2. Ứng dụng phương pháp định lượng nồng độ lisinopril trong huyết tương người
tình nguyện và đánh giá TĐSH chế phẩm viên nén lisinopril sản xuất tại Việt
Nam.

2


Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Lisinopril

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của lisinopril

Công thức phân tử của lisinopril: C21H31N3O5 [10].
Khối lượng phân tử của lisinopril: 405,488 g/mol.
1.1.1. Tính chất
Bột tinh thể trắng. Nóng chảy ở khoảng 160°C. Tan trong nước, ít tan trong methanol,
không tan trong ethanol, aceton, acetonitril và cloroform [7]. Hệ số phân bố dầu nước logP
= -1,01, pka = 2,5.
1.1.2. Tác dụng dược lý và dược động học
1.1.2.1. Dược lý và cơ chế tác dụng
Lisinopril là thuốc ức chế enzym chuyển angiotensin và là một dẫn chất
lysin có cấu trúc tương tự enalapril với tác dụng kéo dài. Enzym chuyển angiotensin là một
enzym nội sinh có vai trò chuyển angiotesin I thành angiotensin II. Angiotensin I tăng trong
một số bệnh như suy tim và bệnh thận, do đáp ứng tăng với renin. Angiotensin II có tác
dụng kích thích tăng trưởng cơ tim, gây tim to (phì đại cơ tìm) và tác dụng co mạch, gây
tăng huyết áp. Thuốc ức chế enzym chuyển làm giảm nồng độ angiotensin II và aldosteron
do đó làm giảm ứ Na+ và nước, làm giãn mạch ngoại vi, làm giảm sức cản ngoại vi ở cả đại
tuần hoàn và tuần hoàn phổi. Ngoài ra thuốc còn ảnh hưởng tới hệ kallikrein-kinin, làm
giảm sự phân hủy của bradykinin, dẫn đến tăng nồng độ của bradykinin, đây chính là
nguyên nhân gây ra một số tác dụng không mong muốn như phù mạch và ho kéo dài của
các thuốc ức chế men chuyển [1].

3


1.1.2.2. Dược động học
Lisinopril được hấp thu chậm và không hoàn toàn qua đường tiêu hóa. Sự hấp thu của
lisinopril rất khác nhau giữa các cá thể, có thể từ 6 - 60% liều dùng được hấp thu, nhưng
trung bình khoảng 25%. Bản thân lisinopril là một diacid có sẵn hoạt tính khi vào trong cơ
thể không cần phải qua quá trình chuyển hóa mới có hoạt tính như một số thuốc ức chế

enzym chuyển khác; đạt nồng độ tối đa trong huyết tương sau khoảng 7 giờ và duy trì tác
dụng khoảng 24 giờ. Lisinopril gắn với protein huyết tương khoảng 25%. Thuốc thải trừ
qua nước tiểu ở dạng không biến đổi. Nửa đời thải trừ sau khi uống nhiều liều ở người bệnh
có chức năng thận bình thường là 12 giờ [1].
Bảng 1.1: Tóm tắt các thông số dược động học của LISI trong một số nghiên cứu

Thiết kế
nghiên
cứu

Cmax
(ng/mL)

6,77 ±
1,03
6,35 ±
0,56
6,5 ±
Liều đơn 79,8 ± 39,4*
1,7
20 mg,
78,5 ±
7,0 ±
28 NTN
45,1**
1,39
90,55 ±
6,00 ±
Liều đơn
66,04*

0,4
20 mg,
95,62 ±
6,58 ±
24 NTN
66,33**
0,4
(*): thuốc thử; (**): thuốc chứng
Liều đơn
10 mg,
26 NTN

60,41 ±
20,07*
61,11 ±
19,36**

Tmax
(giờ)

AUC0-t giờ
(ng/mL.giờ)

AUC0-∞
(ng/mL.giờ)

T1/2
(giờ)

792,73 ±

273,41
862,74 ±
303,81

841,66 ±
286,07
906,97 ±
318,72
1016,3 ±
520,0

11,68 ±
4,94
10,03 ±
1,90
10,1 ±
4,5
10,6 ±
6,4
6,786 ±
1,115
6,554 ±
2,534

992,8 ± 520,5
948,3 ± 531,8

974,4 ± 532,7

1063,05 ±

849,58
1160,51 ±
848,04

1181,43 ±
849,99
1264,94 ±
837,79

Tài
liệu

[18]

[19]

[10]

Các thông số dược động học của LISI (bảng 1.1) cho thấy: sau khi uống viên nén LISI
với mức liều 10 mg và 20 mg, nồng độ Cmax dao động từ 60 – 95 ng/mL. Vì vậy phương
pháp phân tích trong dịch sinh học cần có giới hạn định lượng dưới khoảng từ 1 - 2 ng/mL
(khoảng 1/30 – 1/20 Cmax) và giới hạn định lượng trên của đường chuẩn khoảng 200 ng/mL
(khoảng 2-3 lần Cmax).

4


1.1.3. Chỉ định và chống chỉ định
- Điều trị tăng huyết áp: Dùng đơn độc hoặc phối hợp với các thuốc điều trị tăng huyết
áp khác như thuốc lợi tiểu thiazid, thuốc chẹn alpha hoặc chẹn kênh calci.

- Điều trị suy tim: Dùng phối hợp lisinopril với các glycosid tim và các thuốc lợi tiểu
để điều trị suy tim sung huyết cho người bệnh đã dùng glycosid tim hoặc thuốc lợi tiểu đơn
thuần mà không đỡ.
- Nhồi máu cơ tim cấp có huyết động ổn định: Dùng phối hợp lisinopril với các thuốc
làm tan huyết khối, aspirin và/hoặc các thuốc chẹn beta để cải thiện thời gian sống của
người bệnh nhồi máu cơ tim cấp có huyết động ổn định. Nên dùng lisiopril ngay trong vòng
24 giờ sau cơn nhồi máu cơ tim xảy ra.
- Điều trị bệnh thận do đái tháo đường.
1.1.4. Một số phương pháp định lượng lisinopril trong chế phẩm thuốc và trong dịch sinh
học
Để định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu) thường sử
dụng các phương pháp phân tích hóa lý (điện di mao quản, sắc ký khí, sắc ký lỏng...). Do
nền mẫu dịch sinh học thường rất phức tạp, các kỹ thuật phân tích như HPLC kết nối
detector UV thường không đủ độ nhạy để phát hiện và định lượng chính xác nồng độ thuốc.
Hiện nay với kỹ thuật LC-MS/MS với ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ chọn lọc, các pic
không cần phải tách khỏi nhau, nên ngày càng được ứng dụng nhiều trong phân tích thuốc
trong dịch sinh học đặc biệt là thuốc có hàm lượng thấp như lisinopril. Một số nghiên cứu
định lượng lisinopril bằng LC-MS/MS được trình bày ở bảng 1.2.

5


Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng lisinopril bằng LC-MS/MS

STT

1

Xử lý mẫu

Điều kiện sắc ký

Tủa protein

- Cột C18 (150×2,1 mm, 5 µm)

bằng 20 µL

- Pha động: Acid formic-methanol-

HCl (1 M) và acetonitril (58:25:17)
600 µL

- Detector: ESI/MS

MeOH

- Thời gian phân tích: 3,5 phút

LLOQ
(ng/mL)

TLTK

2,5

[23]

10

[21]

2

[14]

6

[10]

0,46

[18]

2

[15]

- Cột C18 (150x3,9 mm, 5 µm)
2

SPE

- Pha động: Methanol-acid acetic (50:50)
- Detector: MS
- Thời gian phân tích: 5 phút
- Cột C8 (150×4,6 mm)
- Pha động: Acetonitril-nước (60:40) + 20

3

SPE

mM acetic acid + 4,3 mM triethylamin
- Detector: MS/MS
- Thời gian phân tích: 6,5 phút
- Cột C18 (250×3,2 mm, 5 µm)

4

SPE

- Pha động: Ammonium format-acetonitrilmethanol (72:7:21)
- Detector: MS
- Cột C18 (50x2,0 mm, 5 μm)
- Pha động: Acid formic-methanol/ acid

5

SPE

formic
- Detector: MS/MS
- Thời gian phân tích: 4 phút

6

Tủa protein
bằng HClO4

- Cột C18 (150x4,6 mm), 5 µm

6


- Pha động: Ammonium acetat (pH=5)methanol (70:30)
- Detector: MS/MS
- Thời gian phân tích: 5 phút
- Cột bảo vệ (4×3 mm); cột phân tích C18
(250×4,6 mm, 5 µm)
7

SPE, dẫn chất - Pha động: Đệm phosphat 0,02 M
hóa trước cột

(pH=3,2)-methanol, gradient

5

[17]

8

[8]

- Detector: FL
- Thời gian phân tích: 25 phút
- Cột phân tích: RP-18 (250×4 mm, 5 µm)
- Pha động: methanol–0,02 M sodium
8

SPE, dẫn chất dihydrogen phosphate (pH=3,0) (55:45,
hóa trước cột

v/v)
- Detector: FL
- Thời gian phân tích: 20 phút

Nhận xét:
- Phương pháp 2: Sử dụng detector khối phổ 1 lần, tuy nhiên giới hạn định lượng cao
(10 ng/mL). Hơn nữa, phương pháp còn sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn nên chi phí thí
nghiệm tốn kém chưa thực sự phù hợp với điều kiện tại Việt Nam.
- Phương pháp 3, 4: Sử dụng detector khối phổ, sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn nên
chi phí thí nghiệm tốn kém. Với phương pháp [14] có thời gian phân tích khá dài (khoảng
6,5 phút), với phương pháp [10] có giới hạn định lượng cao (6 ng/mL).
- Phương pháp 5: Sử dụng detector khối phổ có giới hạn định lượng thấp (0,46 ng/mL)
phù hợp với yêu cầu đề ra, tuy nhiên sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn nên tương đối tốn kém
về chi phí thí nghiệm.

7


- Phương pháp 7, 8: Định lượng LISI bằng HPLC với detector FL, phương pháp này
có ưu điểm nổi bật là trang thiết bị khá phổ biến. Tuy nhiên, giới hạn định lượng cao (5
ng/mL) [16], 8 ng/mL [8]; thời gian phân tích khá dài (25 phút) [16], 20 phút [8]. Ngoài ra,
còn sử dụng kỹ thuật sử lý mẫu phức tạp là phải dẫn suất hóa trước cột và sử dụng kỹ thuật
chiết SPE nên chi phí thí nghiệm tương đối tốn kém. Do đó, các phương pháp này không
phù hợp để phân tích một số lượng mẫu lớn trong nghiên cứu TDSH.
1.2. Sắc lý lỏng – khối phổ (LC-MS)
Nguyên tắc của kỹ thuật này là đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)

được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Các ion được tạo thành
trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector.
Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ chân không có áp suất từ 10-6 Pa đến 10-3 Pa.

Nạp mẫu

Nguồn ion

Phân tích khối

Detector

Xử lý số liệu

Bơm chân không

Hình 1.2: Sơ đồ khối của máy khổi phổ

Một thiết bị phân tích MS bao gồm các bộ phận chính: Bộ nạp mẫu (inlet), bộ nguồn
ion hoá (ion source), bộ phân tích khối (mass analyzer), bộ phát hiện – đếm lượng ion
(detector – đầu dò) và bộ phận ghi/xử lý số liệu (data system).
Trong số các phương pháp LC-MS, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối
với đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa phun sương điện tử (ESI) có độ
đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao thường được sử dụng để phân tích thuốc trong dịch
sinh học. Cơ chế hoạt động của thiết bị LC-MS/MS với nguồn ESI như sau:
-

HPLC: Phân tách (một phần hoặc hoàn toàn) hoạt chất cần phân tích khỏi các thành
phần tạp chất có trong sắc ký, hạn chế số lượng các chất đồng rửa giải cùng với các hoạt
chất đi vào nguồn ESI.

8


- Trong nguồn ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự
hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt.
Khí và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương.
Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương. Khi mật độ điện tích
này tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh), lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt
sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình
thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện.
-

Phổ khối tứ cực kiểu chập ba: Gồm 3 bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2 và Q3 có cấu
tạo như hình 1.3.

Hình 1.3: Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập 3

Tại Q1 sẽ lựa chọn các ion có tỷ số m/z xác định và được đưa đi lên thẳng đến Q2,
những ion khác sẽ bị loại bỏ đi do bị va đập vào các bản điện cực trái dấu. Quá trình phân
mảnh ion mẹ thành các ion nhỏ hơn (ion con) diễn ra tại Q2. Trong buồng Q2, ion mẹ
chuyển động Brown, va chạm với các phân tử khí trơ có mặt trong buồng (khí argon). Nhờ
va chạm này năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng phân tiếp
thành các ion nhỏ hơn (ion con) tùy theo mức độ bền vững của các liên kết trong ion ban
đầu. Các ion con mới hình thành được phân tích khối tách riêng tại Q3 với cơ chế phân tích
khối lượng như tại Q1 và cuối cùng được đưa đến detector để định lượng. Các hợp chất với
cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m/z của ion mẹ cũng như có chế phân mảnh và hình thành
nên các ion con có số khối khác nhau. Vì vậy, có thể định tính, định lượng các hoạt chất
cần phân tích bằng phương pháp LC-MS/MS [3], [4], [5].
9

1.3. Phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học
Trong các nghiên cứu về dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học,...
phương pháp định lượng hoạt chất/ chất chuyển hóa trong dịch sinh học đóng một vai trò
quan trọng, quyết định đến khả năng thành công của các nghiên cứu này. Tuy nhiên, có
nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp như khoảng
nồng độ biến thiên rộng, nồng độ hoạt chất thấp có thể đến cỡ ng/mL, nền mẫu phức tạp
(thường chứa muối, lipid, protein…). Chính vì vậy, khi tiến hành xây dựng phương pháp
phân tích thuốc trong dịch sinh học cần chú trọng ba vấn đề cơ bản đó là kỹ thuật xử lý
mẫu, kỹ thuật phân tích định lượng và cách tiến hành thẩm định phương pháp phân tích
nhằm đảm bảo độ tin cậy của phương pháp.
1.3.1. Kỹ thuật xử lý mẫu
Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu,…) thường chứa một tỷ lệ lớn
các protein làm cản trở khả năng phát hiện và định lượng dược chất. Vì vậy, mẫu phải được
loại tạp trước khi tiến hành phân tích. Hiện nay, để xử lý mẫu huyết tương người ta hay áp
dụng ba kỹ thuật cơ bản sau: tủa protein, chiết lỏng - lỏng và chiết pha rắn [3], [4], [5], [13],
[16].
1.3.1.1. Kỹ thuật tủa protein
Nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng tác nhân tạo tủa để loại đi phần lớn lượng
protein có trong nền mẫu. Đây là kỹ thuật đơn giản, dễ tiến hành nhất trong số các kỹ thuật
trên. Tác nhân tạo tủa thường dùng là acid (acid tricloroacetic, acid percloric) và dung môi
hữu cơ (methanol, acetonitril). Với 2 - 3 mL dung môi hữu cơ hoặc 200 - 500 µL acid có
thể kết tủa được trên 99% lượng protein có trong 1 mL mẫu huyết tương. Tuy nhiên, nhược
điểm của kỹ thuật này là nền mẫu thu được thường không sạch, mẫu bị pha loãng, hoặc
hoạt chất có thể bị biến đổi khi thêm acid vào trong mẫu. Ngoài ra do mẫu không sạch nên
cột hay bị tắc và tuổi thọ của cột bị giảm.
1.3.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng
Nguyên tắc của kỹ thuật chiết lỏng - lỏng trong xử lý mẫu huyết tương là chuyển chất
phân tích từ nền mẫu huyết tương (pha nước) sang dung môi hữu cơ không đồng tan với

10


nước. Trong thực nghiệm, các dung môi hay được lựa chọn là diethylether, tertbutylether,
cloroform, dicloromethan,… Các dung môi này có thể dùng đơn thành phần hoặc dùng phối
hợp với tỷ lệ thích hợp tuỳ theo từng hoạt chất phân tích.
So với kỹ thuật tủa protein thì kỹ thuật chiết lỏng - lỏng phức tạp hơn và trong một số
trường hợp cho tỷ lệ thu hồi thấp hơn. Ưu điểm của kỹ thuật này là mẫu thu được thu được
tương đối sạch và có thể làm giàu mẫu.
Trên thực tế, người ta có thể phối hợp giữa kỹ thuật tủa protein và kỹ thuật chiết lỏng
- lỏng để tăng hiệu quả của quá trình chiết tách mẫu (tăng độ sạch của nền mẫu và tỷ lệ thu
hồi của hoạt chất).
1.3.1.3. Kỹ thuật chiết pha rắn
Là kỹ thuật được phát triển dựa trên nguyên tắc của các kỹ thuật tách sắc ký (chất
phân tích được lưu giữ trên cột và sau đó được rửa giải nhờ một hệ dung môi thích hợp).
Ưu điểm của kỹ thuật này là mẫu sạch, tỷ lệ thu hồi cao và có độ lặp lại tốt hơn hai phương
pháp trên. Nhưng do chi phí thí nghiệm còn tương đối cao nên giai đoạn này kỹ thuật chiết
pha rắn vẫn chưa được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm ở Việt Nam.
1.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học
Thẩm định phương pháp là một nội dung bắt buộc đối với các phương pháp phân tích
nói chung và phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học nói riêng. Mục đích
của thẩm định phương pháp là chứng minh phương pháp đủ độ nhạy, tin cậy và lặp lại tốt.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng theo hướng dẫn US-FDA [20] và EMA [9] bao
gồm các chỉ tiêu sau:
1.3.2.1. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với các thành
phần khác có trong mẫu. Phương pháp LC-MS/MS được coi là chọn lọc đối với chất phân
tích (AN) và chuẩn nội (IS) khi:
- Trên SKĐ mẫu chuẩn, các pic của AN và IS phải được nhận diện rõ ràng và không
bị ảnh hưởng bởi các pic khác.

11


- Trên SKĐ các mẫu trắng (ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau), tín hiệu đo tại
thời điểm trùng với thời gian lưu của pic AN phải không vượt quá 20% tín hiệu đo của mẫu
chuẩn có nồng độ nhỏ nhất trong đường chuẩn và tín hiệu đo của mẫu trắng tại vị trí trùng
với thời gian lưu của pic IS phải nhỏ hơn 5% so với đáp ứng trung bình của IS trong các
mẫu đường và mẫu kiểm tra (QC).
1.3.2.2. Giới hạn định lượng dưới
Mẫu chuẩn có nồng độ AN thấp nhất của đường chuẩn được coi là mẫu giới hạn
định lượng dưới (LLOQ) của phương pháp khi:
- Pic AN được nhận diện rõ ràng, không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác và
có tín hiệu đo ít nhất bằng 5 lần tín hiệu đo của mẫu trắng có thêm IS (zero).
- Độ đúng (so với nồng độ thực) phải đạt từ 80 - 120%, với giá trị CV ≤ 20%.
1.3.2.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đo của thiết bị và nồng độ của chất
phân tích có trong mẫu. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ có sự tương quan tuyến tính
giữa nồng độ AN có trong mẫu với tỷ lệ tín hiệu đo của AN và IS.
Đường chuẩn phải có tối thiểu 6 giá trị nồng độ, bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính,
có hệ số tương quan r > 0,98 và phải đáp ứng các điều kiện sau:
- Độ đúng nằm trong khoảng 85 - 115%, riêng điểm có nồng độ thấp nhất của đường
chuẩn (LLOQ) cho phép độ đúng nằm trong khoảng 80 - 120%;
- Ít nhất 75% số điểm thuộc đường chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm cả mẫu
có nồng độ thấp nhất (LLOQ) và nồng độ cao nhất (ULOQ).
1.3.2.4. Ảnh hưởng của nền mẫu
Phương pháp LC-MS/MS không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu khi giá trị CV của tỷ số
MFAN/MFIS trên ít nhất 6 nền mẫu trắng có nguồn gốc khác nhau phải ≤ 15%. Giá trị MFAN,
MFIS của AN và IS được xác định bằng cách so sánh diện tích pic AN và IS giữa các mẫu
pha trong nền mẫu với các mẫu pha trong pha động.

1.3.2.5. Độ chính xác (độ đúng, độ chụm) trong ngày và khác ngày

12


Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của nồng độ AN định lượng được với nồng
độ thực. Độ chụm phản ánh mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt của nồng độ AN
định lượng được giữa các lần phân tích khác nhau trên cùng một nồng độ.
Độ đúng và độ chụm được thực hiện trên 4 mức nồng độ khác nhau (LLOQ, LQC,
MQC, HQC), mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 5 mẫu.
Độ đúng trong ngày và khác ngày phải đạt trong khoảng 85 - 115%; độ chụm trong
ngày (độ lặp lại) và giữa các ngày (độ tái lặp) với giá trị CV ≤ 15%. Riêng nồng độ LLOQ
cho phép độ đúng trong khoảng 80 - 120% và các giá trị CV ≤ 20%.
1.3.2.6. Độ thu hồi hoạt chất và chuẩn nội
Độ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của AN và IS sau quá trình chiết
tách, xử lý mẫu bằng các kỹ thuật như tủa protein, chiết lỏng – lỏng hoặc chiết SPE. Xác
định độ thu hồi AN và IS bằng cách so sánh nồng độ (hoặc hàm lượng, tín hiệu đo) của AN
hoặc IS trong các mẫu QC có qua quá trình chiết tách, xử lý với nồng độ (hoặc hàm lượng,
tín hiệu đo) tương ứng của các mẫu chuẩn không qua xử lý, chiết tách (mẫu pha trong dung
môi).
1.3.2.7. Nghiên cứu độ ổn định của hoạt chất trong dịch sinh học
Trong các nghiên cứu SKD, TĐSH…quá trình phân tích thường kéo dài vì số lượng
mẫu lớn. Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu độ ổn định của các mẫu này sau các quá trình
phân tích và bảo quản mẫu.
Các nghiên cứu độ ổn định bao gồm: Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông – rã đông; độ
ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng; độ ổn định thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản; độ
ổn định của mẫu sau xử lý và độ ổn định ở điều kiện dài ngày.
Các mẫu được coi là ổn định ở điều kiện nghiên cứu (trừ độ ổn định của dung dịch)
nếu độ đúng của mẫu ổn định nằm trong khoảng 85% - 115% so với nồng độ lý thuyết ban
đầu.

1.3.2.8. Độ nhiễm chéo
Mẫu được coi là không bị nhiễm chéo trong quá trình phân tích khi tại thời điểm trùng
với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của mẫu trắng không lớn hơn 20% so với

13


đáp ứng trung bình của mẫu LLOQ và tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng
pic của mẫu trắng không được lớn hơn 5% đáp ứng trung bình của mẫu LLOQ.
1.4. Tổng quan về sinh khả dụng và tương đương sinh học
1.4.1. Khái niệm chung
- Sinh khả dụng: Trong đánh giá tương đương sinh học invivo thuốc generic thì khái niệm
sinh khả dụng được định nghĩa là tốc độ và mức độ hấp thu dược chất từ chế phẩm thuốc
vào hệ tuần hoàn chung. Các đại lượng được sử dụng để biểu thị tốc độ và mức độ hấp thu
dược chất vào hệ tuần hoàn chinh được ứng dụng trong nghiên cứu TĐSH bao gồm: Cmax
(nồng độ đỉnh) và AUC (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian) [2].
- Tương đương sinh học: Hai chế phẩm được coi là tương đương sinh học nếu sinh khả
dụng của chúng khác nhau không đáng kể khi dùng cùng mức liều trong cùng điều kiện thử
nghiệm [2].
Trên thực tế, nhiều chế phẩm thuốc có cùng hoạt chất, cùng dạng bào chế nhưng tốc
độ và mức độ hấp thu vào tuần hoàn lại khác nhau nên tác dụng điều trị không hoàn toàn
giống nhau. Chất lượng nguyên liệu, thành phần tá dược và kỹ thuật bào chế là những yếu
tố có ảnh hưởng nhiều đến sự hấp thu thuốc. Trong quá trình phát triển sản phẩm, đánh giá
TĐSH là một trong những phương pháp thường được sử dụng để lựa chọn công thức và kỹ
thuật bào chế. Kết quả đánh giá TĐSH là bằng chứng về hiệu quả điều trị của thuốc và làm
cơ sở cho việc lựa chọn và thay thế thuốc trong lâm sàng. Dựa vào kết quả đánh giá TĐSH,
nhà sản xuất có thể tự khẳng định chất lượng cho sản phẩm của mình, nhà quản lý có cơ sở
để xem xét, thẩm định khi cấp phép lưu hành và thầy thuốc có thêm các thông tin về dược
động học để lựa chọn, thay thế thuốc trong điều trị.
1.4.2. Quy trình thực hiện đánh giá tương đương sinh học

1.4.2.1. Đối tượng tham gia nghiên cứu
Trong nghiên cứu tương đương sinh học, đa số trường hợp chọn đối tượng tham gia
nghiên cứu nam giới khỏe mạnh. Một số trường hợp cần thiết chỉ sử dụng đối với phụ nữ,
khi đó cần giải thích rõ. Với thuốc dùng cho trẻ em vẫn nên chọn người lớn để thử nghiệm.
Đối tượng tham gia nghiên cứu phải đạt các tiêu chuẩn theo yêu cầu. NTN cần được kiểm

14