luận văn thạc sĩ nghiên cứu chiết tách và phân tích đặc điểm cấu trúc của glycosaminoglycan từ hải sâm holothuria atra

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Phạm Đức Thịnh và tham khảo thêm các tài liệu đã
được công bố trước đó có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu nêu trong luận văn
là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên
cứu và Ứng dụng công nghệ Nha trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.

Nha trang, tháng 6 năm 2019
Tác giả

Mai Ngô Thương Hoài


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và
Công nghệ. Ban lãnh đạo và các Phòng ban thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học
Thạc sĩ Hóa phân tích 2017-2019. Cảm ơn Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam thông qua Đề tài HTQT mã số QTRU04.06/18-19 đã hỗ trợ
kinh phí thực hiện đề tài
Tiếp theo, tôi xin cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Phạm Đức
Thịnh - Phó Viện trưởng, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang
và TS. Đào Việt Hà - Viện trưởng, Viện Hải dương học đã tận tình trong việc
hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại Viện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giảng dạy và các anh chị cùng lớp cao học
CHE17 đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi bổ sung thêm kiến thức trong suốt
khóa học.
Tôi xin cảm ơn các anh chị Phòng Hóa Phân tích và Triển khai công nghệ
thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện và
giúp đỡ những thiếu sót về kiến thức chuyên ngành khi tôi làm thực nghiệm đề

tài của mình.
Cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn gia đình và bạn bè của tôi, đã luôn bên
cạnh ủng hộ và hỗ trợ về mặt kinh tế cũng như tinh thần để tôi tiếp tục con
đường học tập của mình.
Học viên

Mai Ngô Thương Hoài


Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt
CS

: Chondroitin sulfate

Cetavlon

: Trimethyl Hexadecyl lammonium bromide

13

: Carbon-13 NMR Spectroscopy

C-NMR

DEAE -Sepharose Fast Flow

: Diethylaminoethyl-

EtOH

: Ethanol

FCS

: Fucosylated chondroitin sulfate

FS

: Fucan sulfate

Fuc

: Fucose

GAG

: Glycosaminoglycan

GalNAC

: N-Acetyl galactosamine

Gal

: Glactose

GlcA

: Glucuronic axit

Gluc

: Glucose

GLC

: Gas Liquid Chromatography

GPC

: Gel permeation chromatography

HPLC

: High Performance Liquid

1

: Proton NMR Spectroscopy

H-NMR

Sepharose Fast Flow

IR

: Infrared Spectroscopydesorption/ionization

NMR

: Nuclear Magnetic Resonance

PS

: Polysaccharide sulfates

TCA

: Triclorua acetic acid

TFA

: Triflorua acetic acid


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Hình thái chung bên ngoài của hải sâm [13]………………………8
Hình 1.2. Hải sâm Holothuria atra………………………………………. 10
Hình 1.3. Cấu trúc của Fucan sulfate được phân lập
từ các loài hải sâm...........................................................................................14
Hình 1.4. Cấu trúc Fucan sulfated từ hải sâm Holothuria edulis và
Ludwigothurea Grise .....................................................................................16
Hình 1.5. Cấu trúc minh họa của
Fucosylated chondroitin sulfate (R: ester sulfate)…………………………...16
Hình 1.6. Cấu trúc của Fucosylate chondroitin sulfate……………………...17
Hình 2.1. Hải sâm Holothuria atra đã được xử lý mẫu ……………………27
Hình 2.2. Quy trình chiết tách glycosaminoglycan từ hải sâm
Holothuria atra…………...............................................................................30
Hình 2.3. Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan bằng
sắc ký trao đổi anion………...........................................................................31

Hình 2.4. Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR
của polysaccharide…………………………………………………………41
Hình 3.1. Sắc ký đồ GPC của glycosaminoglycan
từ hải sâm Holothuria atra………….............................................................45
Hình 3.2. Phân đoạn glycosaminoglycan bằng
sắc ký trao đổi anion……………………........................................................50
Hình 3.3. Sắc ký đồ đường chuẩn của sắc kí khí GC ………………………51
Hình 3.4. Sắc ký đồ GC của thành phần đường đơn
phân đoạn F2 ……………………………………………………………….52
Hình 3.5. Phổ IR của phân đoạn F1 ………………………………………..55
Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của phân đoạn F1 …………………………………58


Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của phân đoạn F1………………………………... 59
Hình 3.8. Phổ IR của phân đoạn F2 ………………………………………..60
Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của phân đoạn F2 …………………………………61
Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của phân đoạn F2 ……………………………….62


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm
tại một số vùng biển trên thế giới[15] ………………………………………11
Bảng 1.2. Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng
của một số loài hải sâm [16]……………………………………………….. 12
Bảng 1. 3. Thành phần hóa học của Fucosylated chondroitin sulfate được phân
lập từ thành tế bào của một số loài hải sâm [22]……………………………. 18
Bảng 2.1. Các đỉnh phổ đặc trưng fucoidan trên phổ hồng ngoại [58]………..39
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết glycosaminoglycan của các loài hải sâm ………..44
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của glycosaminoglycan
từ mẫu thô hải sâm Holothuria atra…………………………………………48

Bảng 3.3. Thông số các mẫu đường đơn chuẩn
được đo bằng phương pháp sắc kí khí GC………………………………….51
Bảng 3.4. Thành phần hóa học của phân đoạn glycosaminoglycan
từ hải sâm Holothuria atra ………………………………………………….54
Bảng 3.5.Thành phần hóa học của phân đoạn glycosaminoglycan
từ hải sâm Stichopus variegatus [49]………………………………………. 55


1

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN......................................................................... 7
1.1.GIỚI THIỆU VỀ HẢI SÂM .................................................................. 7
1.1.1. Giới thiệu chung về hải sâm ......................................................... 7
1.1.2. Giới thiệu về hải sâm Holothuria atra.......................................... 8
1.1.2.1.Đặc điểm hình thái và sinh sản .................................................. 8
1.1.2.2. Phân bố và môi trường sống..................................................... 9
1.1.2.3. Phân loại .................................................................................. 9
1.1.3. Thành phần hóa học của hải sâm .............................................. 10
1.1.3.1. Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm tại một số vùng biển
trên thế giới......................................................................................... 10
1.1.3.2. Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng của một số
loài hải sâm......................................................................................... 12
1.2. TỔNG QUAN VỀ CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLICAN ... 13
1.2.1. Các nghiên cứu về Fucan sulfate................................................ 13
1.2.2. Các nghiên cứu về Fucosylate chondroitin sulfate ................... 16
1.2.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của glycosaminoglycan .......... 19
1.3. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM VỀ
GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ HẢI SÂM ............................................. 23

1.3.1. Lịch sử nghiên cứu trên thế giới ................................................ 23
1.3.2. Lịch sử nghiên cứu tại Việt Nam ............................................... 24
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 27
2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................... 27
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................. 27
2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất ..................................................... 27
2.1.2.1. Dụng cụ .................................................................................. 27
2.1.2.2. Thiết bị ................................................................................... 28
2.1.2.3. Hóa chất ................................................................................. 28
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 29


2

2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn glycosaminoglycan từ hải
sâm ........................................................................................................ 29
2.2.1.1. Phương pháp chiết tách glycosaminoglycan ........................... 29
2.2.1.2. Phương pháp tách phân đoạn glycosaminoglycan .................. 31
2.2.2. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của
glycosaminoglycan ............................................................................... 31
2.2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate ............... 31
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng sulfate ................................. 32
2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng uronic axít ........................... 32
2.2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein .............................. 32
2.2.2.5. Phương pháp xác định thành phần monosaccharide ................. 32
2.2.2.6. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ...................................................... 32
2.2.2.7. Phương pháp phổ hồng ngoại IR ............................................... 33
2.2.2.8. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ...................... 33
2.3. THỰC NGHIỆM ................................................................................ 33
2.3.1. Chiết tách và phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm

Holothuria atra ..................................................................................... 33
2.3.1.1. Xử lý mẫu ............................................................................... 33
2.3.1.2. Chiết tách glycosaminoglycan ................................................ 34
2.3.1.3. Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan bằng phương pháp sắc
kí trao đổi anion DEAE-Sepharose fast flow (1,5 x 20 cm) .................. 34
2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate .................................. 35
2.3.4. Phân tích hàm lượng uronic axit ............................................... 36
2.3.5. Phân tích hàm lượng protein ..................................................... 37
2.3.6. Phân tích thành phần đường đơn .............................................. 37
2.3.7. Phương pháp sắc kí thẩm thấu Gel (GPC) ............................... 38
2.3.8. Phương pháp phân tích phổ IR .................................................... 39
2.3.9. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ....................... 40
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................ 43
3.1. PHÂN LẬP VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
GLYCOSAMINOGLYACAN TỪ HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA ....... 43


3

3.1.1. Phân lập glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra ......... 43
3.1.2. Thành phần hóa học của glycosaminoglycan từ hải sâm
Holothuria atra ..................................................................................... 45
3.2. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN
ĐOẠN CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN
TỪ HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA........................................................ 48
3.2.1. Tách phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm
Holothuria atra ..................................................................................... 48
3.2.2. Thành phần hóa học của các phân đoạn glycosaminoglycan
từ hải sâm Holothuria atra ................................................................... 50
3.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ

HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA .............................................................. 55
3.3.1. Đặc điểm cấu trúc của phân đoạn F1 được chiết tách từ
glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra ................................ 55
3.3.1.1. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F1 .................................... 55
3.3.1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của phân đoạn F1....... 56
3.3.1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của phân đoạn F1 ..... 58
3.3.2. Đặc điểm cấu trúc của phân đoạn F2 được chiết tách từ
glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra ................................ 59
3.3.1.2. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F2 .................................... 59
3.3.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của phân đoạn F2....... 60
3.3.2.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của phân đoạn F2..... 61
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 63
4.1.KẾT LUẬN ......................................................................................... 63
4.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 65


4

MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI:
Trong những năm gần đây, khái niệm về thực phẩm chức năng đã đưa ra
một cách tiếp cận mới và thiết thực để có được một sức khỏe tốt đó là khuyến
khích sử dụng các sản phẩm thiên nhiên giúp mang lại nhiều lợi ích sinh lý từ
đó làm giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính khác nhau. Hầu hết các thực phẩm
chức năng và thuốc hiện nay có nguồn gốc trực tiếp hoặc gián tiếp từ tự nhiên,
đặc biệt là các loài thực vật trên cạn và các loài sinh vật dưới biển. Điển hình
là các hợp chất glycosaminoglycan (GAG) được phân lập từ động vật biển nói
chung và hải sâm nói riêng, còn được gọi là polysaccharide sulfate (PS) là một
trong những hợp chất tự nhiên có giá trị cao và đang được nghiên cứu rộng rãi

gần đây nhờ sở hữu phổ hoạt tính sinh học rộng như: chống tạo mạch, kháng u,
chống đông máu, kháng viêm, chống tăng huyết áp, chống huyết khối,...[1, 2].
Glycosaminoglycan từ hải sâm được phân chia thành hai nhóm khác
nhau là fucosylated chondroitin sulfate (FCS) và fucan sulfate (FS). FS là một
polymer mạch thẳng được cấu tạo bởi gốc fucose và /hoặc fucose (sulfate), FS
từ mỗi loài hải sâm có sự khác biệt chủ yếu về mật độ và vị trí của các nhóm
sulfate trong gốc đường fucose [2]. FCS là một polymer có mạch nhánh và cấu
trúc được tạo nên bởi các đơn vị lặp lại của disaccharide (1→3)-β-D-GalNAc(1→4)-β-D-Gluc-(1→n). Cấu trúc mạch chính này cũng tương tự như cấu trúc
của các chondroitin có nguồn gốc từ động vật có vú, tuy nhiên sự khác biệt độc
đáo nhất của FCS hải sâm mà không một loài động vật hay thực vật ở cả trên
cạn và dưới biển có được chính là ở cấu trúc mạch nhánh được tạo nên bởi các
fucan sulfate ở vị trí C-3 của gốc Glucuronic axit [3]. FCS của các loài hải sâm
khác nhau được phân biệt dựa vào cấu tạo của mạch nhánh, số mạch nhánh và
mức độ sulfate hóa ở mạch nhánh cũng như ở mạch chính [1, 2, 4]. Cho tới nay,
nhóm các hợp chất GAG đã được nghiên cứu từ nhiều loài hải sâm khác nhau


5

như Thelenata ananas [5], Peasonnothuria gaefei, Stichopus tremulus,
Holothuria vagabunda [6], Cucumaria japonica [7], Apostichopus japonicus,
Actinopyga mauritiana [8]. Các nghiên cứu này đều cho thấy sự khác biệt về
đặc điểm cấu trúc lẫn hoạt tính sinh học của GAG giữa các loài hải sâm.
Ở nước ta mặc dù đã có một số nghiên cứu về các hợp chất có hoạt tính
sinh học từ hải sâm, tuy nhiên phần lớn các nghiên cứu này tập trung phân lập,
nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất phân tử lượng thấp,
các hợp chất polymer sinh học như GAG từ đối tượng này vẫn còn rất ít được
quan tâm nghiên cứu. Trong số gần 70 loài hải sâm được phát hiện ở biển Việt
Nam mới chỉ có hai loài Holothuria spinifera và Stichopus variegatus được
nghiên cứu về hợp chất GAG [9, 10]. Holothuria atra là một trong số các loài

hải sâm tự nhiên có phân bố rất phổ biến ở nước ta, tuy nhiên cho tới nay vẫn
chưa có công bố nào nghiên cứu về hợp chất GAG từ hải sâm này.Vì vậy, thực
hiện đề tài “Nghiên cứu chiết tách và phân tích đặc trưng cấu trúc của
glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra” là cần thiết, các kết quả
nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp
theo về mối tương quan giữa đặc trưng cấu trúc và hoạt tính sinh học nhằm
định hướng phát triển và ứng dụng hiệu quả các hoạt chất tự nhiên thành thuốc
hoặc thực phẩm chức năng, đóng góp một phần quan trọng vào việc phục vụ
sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội.
2. MỤC ĐÍCH CỦA LUẬN VĂN:
Chiết tách và thu nhận glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra.
Phân tích một số đặc trưng cấu trúc của glycosaminoglycan từ loài hải sâm
Holothuria atra.
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU:
3.1. Đối tượng nghiên cứu:


6

Glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra
3.2. Phạm vi nghiên cứu:
Hải sâm Holothuria atra thu thập ở vùng biển Nha trang, tỉnh Khánh Hòa.
4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:
- Chiết tách và thu nhận hợp chất glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria
atra.
- Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan bằng phương pháp sắc ký
- Xác định thành phần hóa học của các phân đoạn glycosaminoglycan thu
nhận được (gồm: tổng carbohydarte, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic axit,
hàm lượng protein, thành phần các gốc đường đơn).
- Xác định được một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn glycosaminoglycan

đại diện từ loài hải sâm Holothuria atra.
5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
5.1. Ý nghĩa khoa học:
Các kết quả nghiên cứu của đề tài là số liệu khoa học mới về thành phần
hóa học và đặc điểm cấu trúc của glycosaminoglycan được phân lập từ hải sâm
Holothuria atra.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn:
Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo,
giúp tìm kiếm và phát hiện những hoạt chất mới có giá trị dược dụng cao từ hải
sâm, nhằm tạo ra các dược liệu mới phục vụ sức khỏe xã hội và nâng cao giá
trị kinh tế của hải sâm.


7

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.TỔNG QUAN VỀ HẢI SÂM
1.1.1. Giới thiệu chung về hải sâm
Việc sử dụng hải sâm làm mặt hàng thực phẩm và hàng hóa đã bắt đầu ở
Trung quốc khoảng 1000 năm trước, sau đó do nhu cầu về giá trị dinh dưỡng
cũng như khả năng chữa một số loại bệnh truyền thống như: cao huyết áp, thấp
khớp, hen suyễn, liệt dương, táo bón...[4], dẫn đến việc khai thác hải sâm đã
lan rộng ra các nước châu Á. Hải sâm là một loại động vật không xương sống
thuộc lớp Holothuroidea, do đó còn được gọi là Holothurian, là một trong năm
lớp thuộc ngành động vật Da Gai (Echidermata). Tên khoa học của hải
sâm "Cucumis marimus" có nghĩa là "dưa chuột biển". Hải sâm còn được gọi
với những cái tên như đỉa biển, con rum, sâm biển, hải thử, đồn độp, sa tốn,…
[11]. Lớp hải sâm có khoảng 11 nghìn loài thuộc 5 bộ. Ở vùng biển Việt Nam
hiện nay ước tính có khoảng 70 loài hải sâm : Hải sâm trắng (Holothuria
scabra); Hải sâm đen (Holothuria vagabunda); Hải sâm vú (Holothuria

nobilis); Hải sâm mít (Actinopyga echinites)....
Hải sâm có một cơ thể thon dài, cấu tạo chính bên ngoài gồm miệng nằm
ở mặt bụng, quanh miệng có 20 xúc tu. Hậu môn nằm cuối thân. Mặt lưng có
2-3 hàng gai thịt lớn dạng hình nón khá dài chạy dọc theo hai đường biên lưng
cơ thể. Những chiếc gai thịt dài cũng xuất hiện ở mặt bên và phần rìa bụng. Mặt
bụng phẳng, có thể thấy rất nhiều chân ống tập trung thành 3 dải, dải ở giữa
rộng gấp đôi hai dải bên ngoài. Chân ống hình trụ, nhỏ và dài, cuối chân có đĩa
bám (Hình 1.1)[12]. Hải sâm được tìm thấy trên tất cả các đại dương và biển,
ở tất cả các vĩ độ, nhưng chủ yếu chúng sống ở đáy biển, trên bề mặt hoặc ngay
cả nằm sâu trong các lớp trầm tích, một số loài khác thì lại nằm ở các rạn san
hô, trên các thềm đá cứng. Thức ăn của hải sâm là các xác chết của động vật,
loài phù du và các chất hữu cơ dưới biển, nên các nhà khoa học còn đặt cho


8

chúng cái tên là nhân viên vệ sinh biển. Một trong những cách hải sâm bắt mồi
là nằm trong sóng và bắt những loài trôi trong đó bằng các xúc tu, nên nhiều
khi có thể tìm thấy chúng với số lượng lớn ở cạnh các trang trại nuôi cá biển
của con người [13]. Hải sâm là động vật phân tính (trừ một số loài thuộc bộ
không chân (Apoda)), sinh sản bằng cách phóng tinh trùng và trứng vào nước
biển, trứng thụ tinh và phát triển ngoài cơ thể mẹ. Tùy vào điều kiện thời tiết,
nếu điều kiện thời tiết thuận lợi một cá thể có thể sản xuất hàng ngàn giao tử
[14].

Hình 1.1: Hình thái chung bên ngoài của hải sâm [13]
1.1.2. Giới thiệu về hải sâm Holothuria atra
1.1.2.1.Đặc điểm hình thái và sinh sản
Holothuria atra có hình trụ hẹp, toàn bộ bề mặt cơ thể mịn màng và hoàn
toàn đen, một số con ở các rặn san hô thì lại có nếp nhăn ngang trên bề mặt

lưng. Miệng nằm ở mặt dưới được bao quanh bởi một rìa gồm 20 xúc tu màu
đen, phân nhánh, hậu môn ở đầu còn lại. Chiều dài tối đa khi trưởng thành vào
khoảng 60 cm nhưng khích thước phổ biến là 20 cm . Trọng lượng và chiều dài
trung bình của hải sâm Holothuria atra tại các nước trên thế lần lượt là: 200 g
và 20 cm (Ấn Độ), 300 g và 30 cm (Ai Cập), 335 g và 23 cm (Việt Nam), 400
g và 15 cm (Mauritius) [13]. H. atra là loài ăn tạp, chúng dùng xúc tu tìm kiếm
các mảnh vụn từ xác động vật và các chất hữu cơ khác trong lớp trầm tích. Để


9

chống lại kẻ săn mồi, chúng sẽ phát ra một chất độc màu đỏ qua da khi bị xâm
phạm. Mùa sinh sản của H. atra chủ yếu là mùa hè và mùa thu, nhưng ở các
vùng xích đạo thì chúng có thể sinh sản quanh năm. H. atra là loài phân tính,
nhưng chúng cũng có thể sinh sản bằng cách phân hạch ( các cá thể sống tự
phân chia theo cách co thắt dần dần, sau một thời gian có thể tách ra thành hai
cá thể riêng biệt).
1.1.2.2. Phân bố và môi trường sống
Holothuria atra sống ở các rạn san hô, đầm , bùn cát, trên các lớp đá vụn
và các thảm cỏ biển từ 0 đến 20 cm hoặc ở các khu vực đá vôi trầm tích dưới
biển ở Mauritius. Màu sắc của chúng làm cho chúng dễ bị nhận ra, chính vì thế
chúng hay ngụy trang thêm lớp cát trên lưng, đồng thời để giữ mát cho cơ thể
và tránh tia nắng mặt trời. Chúng rất thích các rạn san hô, nơi chúng không phải
tiếp xúc hoàn toàn với sóng nhưng nước lại được sục khí tốt và mát. Holothuria
atra có khả năng chịu được mức nhiệt ở 390C.
Trên thế giới, hải sâm phân bố nhiều ở các nước Trung Quốc, Nhật Bản,
Australia, Ấn Độ, Malaysia và vùng biển Đông Phi. Ở Việt Nam, hải sâm phân bố
chủ yếu ở các vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu,
Phú Quốc, Côn Đảo, Kiên Giang,... [15].
1.1.2.3. Phân loại

Hải sâm đen (Holothuria atra).
Phân lớp Aspidochirotacea.
Bộ Aspidochirotida.
Họ Holothuriidae.
Chi Holothuria.
Loài Holothuria atra.


10

Hình 1.2. Hải sâm Holothuria atra
1.1.3. Thành phần hóa học của hải sâm
Thành phần hóa học chủ yếu là protein, lipid, khoáng, các nguyên tố vi
lượng quý hiếm... Thông qua hàm lượng các chất trên, ta có thể đánh giá được
giá trị dinh dưỡng của hải sâm [6]. Cũng giống như các loài thuỷ sản khác, hàm
lượng các chất hóa học trong cơ thịt hải sâm cũng phụ thuộc vào giống loài,
môi trường sống, trạng thái sinh lý, mùa vụ, nguồn thức ăn, thời tiết…
1.1.3.1. Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm tại một số vùng biển
trên thế giới
Thành phần hóa học tính theo % trọng lượng khô của một số loài hải sâm
được thể hiện ở Bảng 1.1 cho ta thấy hải sâm ở các vùng biển trên thế giới
thường gặp đều có hàm lượng protein đạt giá trị cao (32,0-65,0%) và hàm lượng
lipid thấp (0,1-0,8%).
Protein trong mô hải sâm chứa nhiều thể keo (colagen) và chiếm 40÷60%


11

tổng số protein, đặc biệt có 1 số loài collagen có thể lên đến 77,5% [15]. Hàm
lượng protein trong hải sâm rất dễ tiêu hóa nên thích hợp cho người già yếu và

suy nhược cơ thể. Hàm lượng lipid trong hải sâm thấp nhưng lại chứa các hợp
chất đặc biệt như phospholipid, monoglyceride, diglyceride, triglyceride, acid
béo no và không no (34 loại acid béo), trong đó acid béo không bão hòa chiếm
ưu thế và các acid béo có nhiều nối đôi chiếm từ 43,1-75,0% gồm: linoleic,
arachidoric, eicosatrrienic, eicosapentaenoic là các acid béo không thay thế có
hoạt tính sinh học cao và là tiền chất của prostaglandin một loại dược phẩm
quý. Lipid trong hải sâm có khả năng chữa bệnh xơ cứng động mạch do dư thừa
cholesterol. Khi tiêm lipid của hải sâm cho thỏ bị bệnh cholesterol thì hàm
lượng cholesterol huyết giảm 36,6%; lipoprotein giảm 31,6%; hệ số cholesterol
trên phospholipid giảm 14,8%. Dưới tác dụng của lipid hải sâm, khả năng làm
đông máu tăng đáng kể. Một số giả thuyết cho rằng lipid của hải sâm có khả
năng tạo este hòa tan cholesterol và đào thải nó qua cơ quan bài tiết. Vậy, thịt
hải sâm giàu protein và nghèo lipid (nhưng lại chứa các hợp chất có hoạt tính
sinh học cao) là một loại thực phẩm thích hợp cho những người bị rối loạn lipid
máu và các bệnh lý về động mạch vành. Hơn nữa, trong hải sâm có holothurin
(trong cơ thịt) có tác dụng ức chế, đình chỉ sự phân bào, lipid hải sâm làm tăng
trạng thái trao đổi lipid và protein trong máu, trong gan động vật, tăng cường
quá trình oxy hóa khử trong cơ thể và góp phần chống xơ cứng động mạch ở
người [8]
Bảng 1.1. Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm tại một số vùng
biển trên thế giới[15]
TT Vùng biển
1

Địa Trung Hải

Hàm lượng % trọng lượng khô
Protein

Lipit

55,0÷ 65,0

0,7


12

2

Trung Quốc -Nhật Bản

3

64,0

0,8

Ấn Độ Dương-Thái Bình Dương

32,0÷ 52,0

0,5÷ 0,7

4

Liên Xô ( cũ)

60,0÷ 65,0

0,1÷ 0,8

5

Nha Trang- Khánh Hòa

40,76÷ 77,54

0,1÷ 0,65

1.1.3.2. Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng của một số loài hải
sâm
Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng trong mô cơ của một số loài
hải sâm được trình bày ở Bảng 1.2 cho ta thấy trong thịt hải sâm chứa nhiều
nguyên tố vi lượng quý hiếm như Se là chất giải độc, làm vô hiệu hóa các kim
loại nặng đi vào cơ thể qua đường ăn uống (như chì và thủy ngân) để thải ra
nước tiểu.
Bảng 1.2. Thành phần khoáng vi lượng của một số loài hải sâm [16]
Hàm lượng (g/g trọng lượng khô)
TT

Tên loài

Fe

Cu

Mg

N

(x106)

(x106)

(x106)

(x106)

1

Hải sâm vú trắng

6,80

3,86

11,13

17,57

2

Hải sâm hài

4,08

2,93

9,72

15,73

3

Hải sâm da trăn

1,57

1,05

5,12

12,11

4

Hải sâm đen

2,25

2,20

3,77

28,09

5

Hải sâm cát

7,54

1,88

12,66

24,24

6

Hải sâm đỏ

2,88

1,19

6,14

19,33


13

Ngoài các yếu tố protein, lipid, khoáng, nguyên tố vi lượng… trong thành
cơ thể của hải sâm còn chứa một loại hợp chất quý hiếm có giá trị cực kì cao
về mặt dược liệu đó là polysaccharide sulfate (PS) hay glycosaminoglycan
(GAG) là một trong những hợp chất có giá trị nhất của hải sâm vì chúng sở hữu
những hoạt tính sinh học được đánh giá cao như: chống tạo mạch, kháng u,
chống đông máu, kháng viêm, chống tăng huyết áp, chống huyết khối,…[1, 2].

Glycosaminoglycan được phân chia thành hai nhóm khác nhau là fucosylated
chondroitin sulfate (FCS) và fucan sulfate (FS). FS là một polymer mạch thẳng
được cấu tạo bởi gốc fucose và /hoặc fucose (sulfate), FS từ mỗi loài hải sâm
có sự khác biệt chủ yếu về mật độ và vị trí của các nhóm sulfate trong gốc
đường. FS từ mỗi loài hải sâm có sự khác biệt chủ yếu về mật độ và vị trí của
các nhóm sulfate trong gốc đường fucose [2]. FCS là một polymer có mạch
nhánh, cấu trúc mạch nhánh của fucosylfated chondroitin sulfate được tạo nên
bởi các đơn vị lặp lại của disaccharide (1→3)-β-D-GalNAc-(1→4)-β-D-Gluc(1→n). Cấu trúc mạch chính này cũng tương tự như cấu trúc của các
chondroitin có nguồn gốc từ động vật có vú, tuy nhiên sự khác biệt độc đáo
nhất của FCS hải sâm mà không một loài động vật hay thực vật ở cả trên cạn
và dưới biển có được chính là ở cấu trúc mạch nhánh được tạo nên bởi các
fucan sulfate ở vị trí C-3 của gốc Glucuronic axit [3]. FCS của các loài hải sâm
khác nhau được phân biệt dựa vào cấu tạo của mạch nhánh, số mạch nhánh và
mức độ sulfate hóa ở mạch nhánh cũng như ở mạch chính [1, 2, 4].
1.2. TỔNG QUAN VỀ CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN
1.2.1. Các nghiên cứu về Fucan sulfate
Nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc của Fucan sulfate từ hải sâm được thực
hiện bởi Ana - Cristina và cộng sự, nhóm tác giả này đã chiết tách và phân tích
cấu trúc fucan sulfate từ hải sâm Ludwigothurea grisea thu ở vùng biển Brazil,
fucan này được tạo nên bởi gốc đường đơn Fuc(2OSO3-) liên kết 1,3 với gốc


14

Fuc(2,4OSO3-) [17]. Mười năm sau Kariya và cộng sự đã công bố một fucan
sulfate khác từ hải sâm Stichopus japonicus có cấu trúc tương tự với hải sâm
Ludwigothurea grisea, chỉ khác nhau về tỉ lệ liên kết giữa các gốc Fuc(2OSO3) và gốc Fuc(2,4OSO3-) [18]. Kể từ đó tới nay các nghiên cứu về cấu trúc của
fucan sulfate từ hải sâm liên tục được công bố, đặc biệt trong vài năm gần đây
nhờ các cải tiến về trang thiết bị kỹ thuật sử dụng trong phân tích cấu trúc của
các polymer ngày càng hiện đại. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm

Isostichopus badionotus được Chen và các cộng sự [4] giải thích chi tiết có cấu
tạo từ các đơn vị lặp lại của tetrasaccharide (Hình1.3). Một số fucan sulfate
khác được phân lập từ hải sâm Acaudina molpadioides cũng có cấu trúc gồm
các tetrasaccharide lặp lại tương tự như cấu trúc của fucan sulfate hải sâm
Isostichiopus Badionotus, chỉ khác nhau ở trình tự liên kết của các gốc fucose
sulfat (Hình 1.3).

Hình 1.3. Cấu trúc của Sulfate fucan được phân lập từ các loài hải sâm
Thelenota ananas, Isostichiopus badionotus [19], Acaudina molpadioides và
Stichopus japonicus [18]
Bằng phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR ở nhiệt


15

độ cao, Wu và cộng sự [20] đã xác định và so sánh cấu trúc của fucan từ 4 loài
hải sâm khác nhau gồm Pearsonothuria graeffei, Holothuria vagabunda,
Stichopus tremulu và Isostichopus badionotus, kết quả thu được cho thấy fucan
sulfate của hải sâm Pearsonothuria graeffei có chứa chủ yếu các gốc 2,4disulfate và non-sulfate fucose, fucan sulfate của hải sâm Isostichopus
badionotus có chứa chủ yếu là các gốc non- sulfate fucose , 2-sulfate fucose và
2-4-disulfate fucose, trái ngược với hai loài trên, hải sâm Stichopus tremulu ở
vùng biển lạnh và hải sâm Holothuria vagabunda ở vùng biển nóng (biển nhiệt
đới) có chứa chủ yếu các gốc non-sulfate fucose. Một năm sau đó nhóm tác giả
này đã công bố chi tiết cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Pearsonothuria
graeffei được tạo nên bằng sự lặp lại của tetrasaccaride [19]. Năm 2015, Long
và các cộng sự [21] đã công bố một cấu trúc nhánh mới của fucan sulfate (Hình
1.3 D) từ hải sâm Apostichopus japonicus hoàn toàn khác so với cấu trúc của
fucan này đã được công bố trước đó bởi Kariya và cộng sự [18]. Sau đó khi
nghiên cứu cấu trúc của sulfate fucan từ hai loài hải sâm Holothuria edulis và
Ludwigothurea grise từ tác giả Myron và cộng sự [22] đã công bố rằng cấu

trúc của fucan sulfate từ hai loài hải sâm này cũng có cấu trúc mạch nhánh
(Hình 1.4) chứ không phải có cấu trúc mạch thẳng như các công bố trước đó,
như vậy có thể thấy cấu trúc của fucan sulfate không chỉ biến đổi theo loài mà
còn phụ thuộc vào điều kiện môi trường sống cũng như các kỹ thuật chiết tách
và phân tích khác nhau [23]. Trong khi đó, hoạt tính sinh học của
glycosaminoglycan nói chung và fucan sulfate nói riêng chịu ảnh hưởng của
các đặc trưng cấu trúc, với mỗi biến đổi về cấu trúc có thể dẫn đến những hoạt
tính sinh học khác nhau và khả năng úng dụng khác nhau.


16

Hình 1.4. Cấu trúc fucan sulfate từ hải sâm Holothuria edulis và
Ludwigothurea Grise
1.2.2. Các nghiên cứu về fucosylate chondroitin sulfate
Fucosylate chondroitin sulfate (FCS) là một hợp chất đặc biệt chỉ có duy
nhất ở hải sâm [20]. Về mặt cấu trúc, glycosaminoglycan của hải sâm được tạo
nên bởi dạng polysaccharide phổ biến thường thấy ở động vật có vú là
chondroitin sulfate , nhưng khác nhau ở vị trí C-3 của gốc uronic axit có tạo
mạch nhánh bởi nhóm fucose sulfate, (Hình 1.5)[24]. Nhóm fucose sulfate
mạch nhánh có khả năng làm nhiệm vụ là tránh sự phân hủy của
glycosaminoglycan bởi enzyme chondroitin được sinh ra bởi sinh vật biển, làm
tăng mật độ điện tích để thích nghi với điều kiện môi trường biển và đồng thời
có hoạt tính sinh học cao hơn so với các hợp chất tương tự về mặt dược dụng,
ví dụ như hợp chất Heparin [25] nên FCS được nghiên cứu rất nhiều, đặc biệt
là những năm gần đây.

.
Hình 1.5. Cấu trúc minh họa của fucosylated chondroitin sulfate (R: ester
sulfate)

17

 Sự đa dạng về cấu trúc của Fucosylate chondroitin sulfate (FCS)

Hình 1.6. Cấu trúc của fucosylate chondroitin sulfate
(a) β-D-glucuronic acid, Glucuronic Acid. (b) N-acetyl- β-Dgalactosamine, N-Acetyl galactosamine .(c) mạch nhánh fucose, α-Lfucose [18]
Dựa vào sự phát triển của các kỹ thuật quang phổ hiện đại, sử dụng
phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phương pháp phân tích
methyl hóa đã xác định được cấu trúc phân tử của FCS, nhìn chung gồm 3 thành
phần chính là: uronic acid, sulfate, các gốc đường amin, cấu trúc mạch khung
thì tương tự như chondroitin sulfate ở động vật có vú (CS), tuy nhiên mạch
nhánh fucopyranose được phát hiện có thể gắn ở một vài vị trí khác nhau trên
mạch chính (có thể ở gốc D-glucuronic acid hoặc gốc D-galactosamin). Hơn
nữa các nhánh fucose này có mô hình sulfate có thể phân biệt được so với mạch


18

chondroitin sulfate [26] và mô hình sulfate của fucan nhìn chung thường ở vị
trí C-2, 3 và 4, mặc dù một số công bố tồn tại kiểu liên kết glycosidic giữa các
gốc fucose theo dạng liên kết (1→2, 1→3 hoặc 1→4) và liên kết glycosidic của
các fucan này với mạch chính CS có thể ở vị trí C-3 của gốc glucuronic acid.
Cho tới nay, cấu trúc hóa học ưu thế của vài loài đã nhận biết được mức độ biến
đổi cấu trúc bởi sự biến đổi lớn liên quan đến sự sulfat hóa và thành phần nhánh
(Hình 1.6). Dựa trên thành phần monosaccharide từ mỗi loài, các tài liệu tham
khảo cho thấy hầu hết tỉ lệ giống nhau giữa D-glucoronic acid và Dglucosamine nhưng tỷ lệ của sulfate và fucose có sự thay đổi lớn. Theo tác giả
Zhao và cộng sự [27] đã nhận định thành phần monosaccharide không chỉ phụ
thuộc vào loài khác nhau mà còn bị ảnh hưởng bởi phương pháp chiết tách.

Ngoài ra, kết quả nghiên cứu của Chen và cộng sự [19] đã chỉ ra rằng,
mùa vụ thu hoạch và môi trường sống có thể ảnh hưởng đến sự thay đổi cấu
trúc FSC. Bảng 1.3 mô tả tổng hợp về tỷ lệ thành phần monosaccharide theocác
tài liệu đã được công bố về FSC các loài hải sâm khác nhau.
Bảng 1. 3. Thành phần hóa học của FCS được phân lập từ thành tế bào
của một số loài hải sâm [22]
Loài hải sâm

Thành phần hóa học (tỉ lệ mol)
U:N:F:-OSO3-

Stichopus variegatus

1:0,83:1,07:3,82

Holothuria leucospilota

1:1,06:0,89:3,83 1:1,04:0,81:2,06

Holothuria atra

1:0,87:0,69:2,35

Holothuria scabra

1:0,78:0,53:1,34

Ludwigothurea grisea

1:0,85:1,85:2,04 1:1,10:1,07:2,93

Pearsonothuria graeffei

1:0,8:1,5:2,6 1:0,8:1,3:2,5

Holothuria vagabunda

1:1,1:0,9:2,7


19

Stichopus tremulus

1:0,8:1,2:3,0

Isostichopus badionotus

1:0,7:0,9:3,1

Thelenota ananas

1:1,09:1,12:3,83

Holothuria nobilis

1:0,96:0,82:2,99

Holothuria edulis

1:1,28:0,82:3,5

1.2.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của glycosaminoglycan
Hải sâm được xem là món cao lương mỹ vị ở Malaysia, Trung Quốc,
Nhật Bản, Indonesia do người ta tin tưởng vào tác dụng chữa bệnh của nó: cao
huyết áp, thấp khớp, hen suyễn, liệt dương, táo bón…[11, 25]. Người ta thường
mua hải sâm khô và nấu cho mềm dưới dạng món súp hoặc món hầm hoặc om
và món hải sâm nhìn giống món thạch nhưng ăn không ngon lắm. Trong ẩm
thực Nhật Bản, món Konotawa được nấu bằng hải sâm nấu thành cao, ướp muối
và xử lý khô để ăn dần. Nhìn chung món ăn chế biến từ hải sâm không ngon
lắm, và cũng không thể sử dụng được hết giá trị vốn có của nó.
Sau này nhờ sự phát triển của khoa học kỹ thuật các nghiên cứu về hải
sâm cho thấy chúng có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý như: các
polysaccharide sulfates hóa, saponin, collagen, glycosyl shingolipid, sialic
acid, … [26], trong đó được quan tâm nhất chính là các hoạt tính sinh học của
các glycosaminoglycan (polysaccharide sulfates) . Các glycosaminoglycan của
hải sâm có thể được chia thành hai dạng chính là fucan sulfate hóa (FS) hay
còn gọi là fucoidan Hải sâm và fucosylated chondroitin sulfate hóa (FSC) [27].
Các thành phần này đã và đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu nhờ sở hữu
nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ, chống tắc nghẽn mạch máu
[27], điều chỉnh sự hình thành mạch máu [28] ức sự di căn của tế bào ung thư
[29], kháng tế bào hủy xương và kháng ung thư [27]. Trong đó hoạt tính kháng
đông tụ là một trong số các hoạt tính được nghiên cứu sâu rộng nhất của các