NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HIỂN VI VÀ PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LOÀI Balanophora subcupularis P. C. Tam, HỌ DÓ ĐẤT (BALANOPHORACEAE RICH.) DỰA TRÊN ĐỊNH HƯỚNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN QUÂN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HIỂN VI VÀ
PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ
LOÀI Balanophora subcupularis P. C. Tam,
HỌ DÓ ĐẤT (BALANOPHORACEAE
RICH.) DỰA TRÊN ĐỊNH HƯỚNG TÁC
DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN QUÂN
1401501

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HIỂN VI VÀ
PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ
LOÀI Balanophora subcupularis P. C. Tam,
HỌ DÓ ĐẤT (BALANOPHORACEAE
RICH.) DỰA TRÊN ĐỊNH HƯỚNG TÁC
DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. NCS. Nguyễn Thanh Tùng

2. TS. Nguyễn Quang Hưng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược Liệu

HÀ NỘI - 2019


LỜI CÁM ƠN
Khóa luận được thực hiện tại Bộ môn Dược liệu – Trường đại học Dược Hà
Nội. Trong thời gian làm khóa luận, tôi đã nhận được sự ủng hộ, động viên, giúp
đỡ của thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên, bạn bè và gia đình.
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
DS.NCS. Nguyễn Thanh Tùng (Bộ môn Dược liệu - Trường đại học Dược Hà
Nội), người đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên, ủng hộ và truyền đạt cho tôi
những kiến thức quý báu trong suốt thời gian làm khóa luận.
Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới TS. Nguyễn Quang Hưng người đã
hỗ trợ tôi trong quá trình lấy mẫu thực địa, hỗ trợ kinh phí thực hiện đề tài cũng
như giúp đỡ tôi hoàn thiện hơn khóa luận của mình.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới DS. Nguyễn Văn Phương, DS.
Nguyễn Văn Hòa cùng toàn thể thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược
liệu- Trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện tốt
khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn bố mẹ, gia đình, bạn bè và những người đã
luôn sát cánh, ủng hộ và động viên tôi trong suốt quãng thời gian làm việc và học
tập tại trường đại học Dược Hà Nội.
Tôi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Văn Quân

MỤC LỤC
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật chi Balanophora. ....................... 3
1.1.1. Vị trí phân loại ................................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm chung của chi Balanophora. ............................................ 3
1.2. Đặc điểm thực vật của các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam ... 4
1.3. Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Balanophora đã được
nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam. .......................................................... 6
1.3.1. Trên thế giới ....................................................................................... 6
1.3.2. Việt Nam ............................................................................................. 8
1.4. Tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam. .. 9
1.5. Công dụng và một số cách dùng của các loài thuộc chi Balanophora
......................................................................................................................... 10
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .................................................................................................. 12
2.1. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu. ............................................ 12
2.1.1. Nguyên liệu....................................................................................... 12
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu .................................................................. 12
2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 13
2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật......................................................... 13
2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học ............................................................ 13
2.3.3. Định tính bằng phương pháp hóa học............................................ 14
2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ức chế enzym xanthin
oxidase in vitro. .......................................................................................... 15
2.3.5. Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc một số hợp chất từ
loài Balanophora subcupularis P.C. Tam ................................................ 17
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................... 19
3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật ............................................................. 19

3.1.1 Đặc điểm thực vật ............................................................................. 19
3.1.2 Đặc điểm vi phẫu............................................................................... 20
3.1.3 Đặc điểm bột toàn cây ....................................................................... 21
3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học ............................................................. 22


3.2.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học............... 22
3.2.2 Chuẩn bị các phân đoạn từ loài Balanophora subcupularis ......... 26
3.2.3. Triển khai sắc ký lớp mỏng các phân đoạn của loài B.
subcupularis ............................................................................................... 28
3.2.4. Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của các phân đoạn loài
B. subcupularis........................................................................................... 29
3.2.5. Phân lập chất từ loài Balanophora subcupularis .......................... 29
3.3. Bàn luận .................................................................................................. 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. ......................................................................... 36


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
B.

Balanophora

MeOH

Methanol

EtOAc

Ethyl acetat

CHCl3

Cloroform

CH2Cl2

Dicloromethan

H2O

Nước

XOD

Xanthin oxidase

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

CC

Column chromatography


Danh mục các bảng
Bảng 1. Danh sách các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam ......................... 4
Bảng 2. Kết quả phản ứng định tính các nhóm chất trong loài B. subcupularis 26
Bảng 3. Kết quả hoạt tính ức chế enzym XOD của các phân đoạn của loài B.
subcupularis ........................................................................................................ 29

Danh mục các hình
Hình 1. Đặc điểm hình thái loài Balanophora subcupularis P.C. Tam. ............. 19
Hình 2. Vi phẫu củ loài Balanophora subcupularis ........................................... 20
Hình 3. Một số đặc điểm bột loài Balanophora subcupularis............................ 21
Hình 4. Sơ đồ chiết xuất loài B. subcupularis .................................................... 27
Hình 5. SKLM của dịch toàn phần và các phân đoạn của loài B. subcupularis
cùng các chất đối chiếu quan sát ở bước sóng λ = 366 nm sau khi phun thuốc
thử NP/PEG......................................................................................................... 28
Hình 6. Sắc ký đồ của chất S1 của hệ EtOAc-CHCl3-Acid formic (5:5:1) ở:.... 32
Hình 7. Cấu trúc hóa học của Coniferaldehyde .................................................. 33
Hình 8. Sắc ký đồ của chất S2 và acid gallic với hệ EtOAc-CHCl3-Acid formic
(5:5:1) .................................................................................................................. 34
Hình 9. Cấu trúc hóa học acid gallic ................................................................... 34


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay ở Việt Nam, Nấm ngọc cẩu hay còn được gọi là Tỏa dương, cu
chó… là tên gọi chung cho các loài thuộc chi Balanophora J.R. & G. Forst, thuộc
họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.). Các loài này hiện nay đang được khai thác,
buôn bán và được sử dụng với nhiều tác dụng như bổ máu, bổ thận, thông tiểu,
chữa nhức mỏi tay chân, đau lưng, tráng dương, giúp phụ nữ phục hồi sức khỏe
sau khi sinh… Số lượng các loài Balanophora hiện nay ở Việt Nam theo các tài
liệu có sự khác biệt: Theo Bertel Hansel (1973) ở Việt Nam có 3 loài là B.
laxiflora, B. latisepala, B. fungosa subsp. indica [12]; theo Danh lục các loài
thực vật Việt Nam của GS. Nguyễn Tiến Bân có 8 loài [4]. Trong các loài đã được
thống kê, ba loài B. fungosa subsp. indica, B. latisepala, B. laxiflora được sử
dụng để làm thuốc (theo Từ điển cây thuốc Việt Nam của TS. Võ Văn Chi) [5].
Tuy nhiên những thông tin khoa học về các loài thuộc chi Balanophora J.R.&G.
Forst ở Việt Nam là tương đối hạn chế.
Trong đề tài mã số VAST.CTG.04/16-17 của Viện sinh thái và tài nguyên

sinh vật (Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam), nhóm nghiên cứu đã
phát hiện thêm ba loài ghi nhận mới cho hệ thực vật Việt Nam bao gồm:
Balanophora subcupularis P.C. Tam, Balanophora harlandii Hook.f. và
Balanophora tobiracola Makino [6]. Trong ba loài kể trên, loài Balanophora
subcupularis P.C. Tam gần như chưa có thông tin khoa học nào đáng kể.
Để bổ sung thêm các thông tin về thành phần hóa học của loài này ở Việt
Nam, chúng tôi tiến hành đề tài: ”Nghiên cứu đặc điểm hiển vi và phân lập một
số hợp chất từ loài Balanophora subcupularis P.C. Tam, họ Dó đất
(Balanophoraceae Rich.) dựa trên định hướng tác dụng ức chế xanthin oxidase”
với mục tiêu phân lập một số hợp chất từ loài này dựa trên định hướng tác dụng
sinh học. Đề tài gồm các nội dung sau:
1. Mô tả đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu.

1


2. Định tính thành phần hóa học, chiết xuất phân đoạn và đánh giá tác dụng
ức chế xanthin oxidase in vitro các phân đoạn của mẫu nghiên cứu.
3. Phân lập một số hợp chất từ loài phân đoạn thể hiện tác dụng mạnh nhất.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật chi Balanophora.
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo Thực vật hiển hoa của Takhtajan 2009 [25], chi Dó đất (Balanophora
J.R.&G.Forst) là 1 trong 16 chi của họ Dó đất (Balanophoraceae Rich.). Vị trí
phân loại của họ Dó đất trong hệ thống phân loại như sau:
Giới thực vật: Plantae.

Ngành Ngọc Lan: Magnoliophyta.
Bộ Dương Đài: Balanophorales.
Họ Dó Đất: Balanophoraceae.
Thế giới hiện họ Dó đất có khoảng 40 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới của châu Á và châu Đại Dương trong đó chi Balanophora
chiếm gần một nửa số loài của họ với khoảng 19 loài đã được ghi nhận đến thời
điểm hiện tại [20].
Ở Việt Nam, chi Dó đất là một trong hai loài thuộc họ Dó đất
(Balanophoraceae Rich.) bao gồm 2 chi Dó đất (Balanophora Forst & Forst.f.)
với 7 loài và chi Dó đất núi cao (Rhopalocnemis Jungh.) với duy nhất 1 loài, phân
bố rải rác ở một số tỉnh Việt Nam [4].
1.1.2. Đặc điểm chung của chi Balanophora.
Chi Balanophora, họ Dó đất (Balanophoraceae). Cây thảo, nạc mềm, nom
như cái nấm, màu đỏ nâu, sống một hay nhiều năm, kí sinh trên rễ cây khác,
thường là cây gỗ lớn trong rừng sâu. Thân thoái hóa thành củ nguyên hoặc phân
nhánh, có nhiều hình dạng khác nhau, sần sùi, không có lá.
Hoa đơn tính cùng gốc hoặc khác gốc, mọc thành cụm lớn. Cụm hoa đực
hình trụ, dài 10 – 15 cm, ở gốc có một vài lá bắc; bao hoa xẻ nhiều thùy (4 – 7)
dày và hẹp, dài bằng nhau, nhị thường có bao phấn hình móng ngựa; cụm hoa cái
hình thoi hoặc hình trứng, dài 2 – 3 cm, không có bao hoa, trên cụm hoa có nhiều
phần phụ hình chùy không sinh sản.
3


Mùa hoa: tháng 10 – 2 [12].
1.2. Đặc điểm thực vật của các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam
Theo Nguyễn Tiến Bân, họ Dó đất (Balanophoraceae) ở Việt Nam có 2 chi
(Balanophora và Rhopalocnemis) trong đó chi Balanophora có 7 loài [4]. Danh
sách các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam bao gồm tên khoa học, tên đồng
nghĩa và tên tiếng Việt, phân bố ở Việt Nam, dạng sống và sinh thái được trình

bày ở bảng 1:
Bảng 1. Danh sách các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam
Tên đồng nghĩa &

Dạng sống &

STT

Tên loài

1

Balanophora

B. laosensis Lecomte, Ninh

abbreviata

1925 (FGI, 5: 223). – (Cúc Phương), lục, ký sinh trên rễ

Blume. 1827.

Cu chó đồng châu, Quảng

tên tiếng Việt

Dương đài ngắn

Phân bố

sinh thái

Bình Cỏ mập không diệp

Nam (Hibiscus tiliaceus

(Hiên). Còn có hoặc các loài Ficus
ở Trung Quốc, subsp. ). Mọc rải
Malaysia,

rác

trong

rừng

Indonesia.

nguyên sinh, nơi
ẩm. Ra hoa tháng 912.

2

Balanophora

Dó đất cúc phương

Bình Cỏ mập không diệp

(Cúc Phương).

cucphuongens
is

Ninh

lục, cao 8-15 cm,
ký sinh trên rễ. Mọc

N.T.Ban.

rải rác trong rừng

1996.

nguyên sinh vùng
núi đá vôi, ở độ cao
200-300 m. Ra hoa
tháng 10-12.

4


3

Balanophora

Dó đất thuôn

Bình Cỏ mập không diệp

Ninh

elongata

(Cúc Phương). lục, ký sinh trên rễ.

Blume. 1827.

Còn

có

ở Mọc rải rác trong

Indonesia.

rừng nguyên sinh.
Ra hoa tháng 12-3
(năm sau).

4

Balanophora

Dó đất đồng châu

Ninh

Bình Cỏ mập không diệp

fungosa Forst.

(Cúc Phương), lục, ký sinh trên rễ.

&

Kon Tum (Đác Mọc rải rác trong

Forst.

f.

Giâu,

1776.

Ngọc rừng nguyên sinh, ở

Linh). Còn có ở độ cao 500-2000m.
các nước Đông Ra hoa tháng 1-4.
Nam

Á

đến

Australia.
5a

indica Hà Tây (Ba Vì, Cỏ mập không diệp

Balanophora

Langsdorffia

indica

Arnott – Balanophora Làng Cốc), Hà lục, cao 15-25 cm,
(Kiện ký sinh trên rễ. Mọc

(Amott) Griff. Fungosa subsp. indica - Nam
1846.

Balanophora pierrei… Phê), Đà Nẵng rải rác trong rừng
- Dó đất, Dương đài (Bà Nà, Hải nguyên sinh, ở độ
nam, Tỏa dương, Chu Vân),
Hòa

ca ra.

Khánh cao 500-2500 m.
(

Nha Ra hoa tháng 12-1

Trang),

Kon (năm sau).

Tum

(Đác

Giây,

Ngọc

Linh, Đác Tô,
Ngọc

Pan),

Lâm Đồng (Đà
Lạt…

5


5b

6

Balanophora

Balanophora globosa – Ninh

indica

Dó đất sần.

Bình Cỏ mập không diệp

(Cúc Phương).

lục, cao 15-25 cm,

(Amott) Griff.

ký sinh trên rễ. Mọc

var.

globosa

rải rác trong rừng

(Jungh.) Ban,

nguyên sinh. Ra

1996.

hoa tháng 10-12.
latisepala, Thanh

Hóa Cỏ mập không diệp

Balanophora

Balaniella

latisepala

Balaniella fasciculata, (Đác

(Tiegh.)

Balanophora

Lecomte.

fasciculata … - Cu chó, (Nha

Trang), rải rác trong rừng

1915.

Dương đài hình cầu, Ninh

Thuận nguyên sinh, ở độ

Khánh

Dó đất hình cầu…

Kiệt), luc, cao 10-20 cm,
Hòa ký sinh trên rễ. mọc

(Cà Ná), Đồng cao 600-2300 m.

Nai (Cho Ben), Ra hoa tháng 11Bà Rịa- Vũng 12.
Tàu (Côn Đảo),
An Giang (Thất
Sơn).

7

Balanophora

Nấm đất, Dó đất hoa Ninh

Bình Cỏ mập không diệp

laxiflora

thưa, Dương đài hoa (Cúc Phương), luc,sống ký sinh

Hemsl. In F. thưa, Cu chó, Xà Cô, Kon Tum (Đác trên rễ. mọc rải rác
Forbes

& Net din, Tang din.

Hemsl. 1894.

Giây,

Ngọc trong rừng nguyên

Guga,

Ngọc sinh.

Pan).
1.3. Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Balanophora đã được nghiên
cứu trên thế giới và Việt Nam.
1.3.1. Trên thế giới
Ngày nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học của một
số loài thuộc chi Balanophora. Theo những công trình đã được công bố cho thấy,
thành phần hóa học của chi Balanophora bao gồm các nhóm chất chính như:
6


coumarin, flavonoid, terpenoid, sterol, acid palmitic, chất béo phenylpropanoid,
tanin thủy phân. [16], [23], [24].
 Các hợp chất C6 – C3
Từ năm 1969, các hợp chất này đã được công bố tìm thấy ở chi
Balanophora [16]. Các phenylpropanoid được phân lập chủ yếu là các
phenylpropanoid đơn giản, lignan, coumarin và các dẫn chất đơn giản của acid
phenylacrylic.
Các lignan được phân lập từ một số loài như: (+)-Pinoresinol-di-O-β-Dglucopyranosid là một glycosid của disacarit lignin, balaxiflorin A-(7'S, 8R, 8'R)9-O-galloyllariciresinol-4'-O-β-D-glucopyranosid từ loài B. laxiflora[24]

,

lariciresinol-4-O-β-D-glucoside và lariciresinol-4'-O-β-D-glucoside từ loài B.
polyandra, (−)-lariciresinol từ B. harlandii, B. japonica, B. abbreviate [27],
Balanophonin là một neoligan phân lập được từ dịch chiết của B. japonica, 3,3’bis(3,4-dihydro-6-methoxy-2H-1-benzopyran) là chất được tìm thấy từ thân rễ
của cây B. fungosa [26].
Các coumarin được tìm thấy lần đầu vào năm 1969 ở loài B. simaoensis là
brevifolin [17], tiếp đó là một số chất khác được phân lập như methyl
brevifolincarboxylat ở loài B. involucrata [22], balajaponin A ở B. japonica [29].

 Flavonoid
Flavonoid và flavonoid glycosid trong chi Balanophora đã được tìm thấy
nhưng không nhiều. Cho đến nay, các flavonoid phân lập từ Balanophora chủ yếu
là nhóm flavonol, flavonon, flavanonol, dihydrochalcon và auron [16].
 Terpenoid
Năm 1962, Balanophorin A và Balanophorin B là 2 terpenoid được tìm thấy
đầu tiên bởi Ultee và cộng sự [21]. Một số triterpenoid pentacyclic và iridoid được
tìm thấy trong chi Balanophora từ nghiên cứu các loài như B. spicata, B.

7


simaoensis, B. involucrata, B. japonica và B. tobiracola, các loại triterpenoid
pentacyclic này bao gồm các loại lupinan, oleanan và ursan [16], [28].
 Sterol
Một số sterol được tìm thấy như: clerosterol và clerosterol-3-O-(6'-Opalmitoyl)-β-D-glucopyranoside từ B. harlandii [16]; β-sitosterol từ B. polyndra,
B. japonica, B. involucrat; daucosterol từ B. simaoensis, B. involucrat [16], [21],
β-sitosterylglucoside-3'-O-linoleat được phân lập từ B. involucrata [19].
1.3.2. Việt Nam
Ở Việt Nam, các nghiên cứu mới chủ yếu tập trung trên loài Balanophora
laxiflora Hemsl. Năm 2014, tác giả Cầm Thị Ích và các cộng sự đã phân lập được
hai hợp chất pinoresinol (1) và daucosterol (2) từ loài B. laxiflora [10].
Năm 2014, Nguyễn Văn Tường và các cộng sự đã phân lập được hai hợp
chất từ loài Balanophora laxiflora Hemsl là lupeol (3) và β- sitosterol (5) [15].
Năm 2015, tác giả Đỗ Thị Hà và cộng sự cũng đã phân lập được 5 hợp chất
triterpenoids từ cao chiết ethanol cây tỏa dương bao gồm: lupeol (3), β- amyrin
(4), β- sitosterol (5), (21β)-22-hydroxyhopan-3-on (6), daucosterol (2) và (21α)22-hydroxyhopan-3-on (7). Trong đó hợp chất (3), (6), (7) lần đầu tiên được công
bố từ loài Balanophora laxiflora [18].
Năm 2017, tác giả Nguyễn Quyết Tiến và cộng sự đã phân lập được 6 hợp
chất bằng sắc ký cột từ các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat và dichlomethan của

cây tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.). Kết hợp các phương pháp phổ
hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, hai chiều, và
so sánh dữ liệu phổ của chúng với tài liệu đã được công bố, đã xác định được cấu
trúc hóa học của chúng là 1-hexacosanoylglycerol (8), daucosterol (2), methyl
gallat

(9),

4-hydroxyl-3-methoxycinnamaldehyd

(10),

methyl-4-hydroxy

cinnamat (11) và methyl caffeat (12) [14].
Năm 2017, tác giả Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã phân lập được một
chalcon mới với 8 hợp chất khác từ cao chiết ethyl acetat của cây tỏa dương:
8


Balanochalcon (13), methyl caffeat (12), β-hydroxydihydrochalcon (14), methyl
gallat (9), dimethyl-6,9,10-trihydroxybenzo (15), xanthen-1,2-dicarboxylat (16),
acid p-coumaric (17), quercetin (18), scopoletin (19) và pinoresinol (1) [23].
Năm 2017, tác giả Nguyễn Thị Hồng Anh và cộng sự đã phân lập được 4
hợp chất phenolic từ cặn ethyl acetat của cây tỏa dương. Bốn hợp chất đã được
phân lập bao gồm epoxyconiferyl alcohol (20), salicifoliol (21), 5(hydroxymethyl)-2-furaldehyd (22) và ethyl caffeat (23). Các hợp chất này đều
được phân lập lần đầu từ loài này [1].
1.4. Tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Balanophora ở Việt Nam.
Giống như nghiên cứu về thành phần hóa học, ở Việt Nam đã có những
nghiên cứu bước đầu về tác dụng sinh học trên loài B. laxiflora, kết quả cho thấy:

- Năm 2017, tác giả Đặng Ngọc Quang và các cộng sự đã phân lập được 8
hợp chất và thử tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập đó qua thử
nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH. Kết quả cho thấy, 2 hợp
chất (13) và (15) có hoạt tính chống oxy hóa [23].
- Năm 2017, tác giả Nguyễn Thùy Dương và các cộng sự đã đánh giá tác
dụng hạ acid uric máu theo con đường ức chế xanthin oxidase của tỏa
dương trên chuột nhắt trắng dựa trên mô hình gây tăng acid uric cấp. Kết
quả cho thấy cao toàn phần tỏa dương với liều 300mg/kg/ngày, sử dụng
trong vòng 5 ngày có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh
chuột nhắt trắng thực nghiệm [2]. Năm 2017, tác giả Nguyễn Thị Hồng Anh
và các cộng sự đã sàng lọc tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các
phân đoạn và chất phân lập từ tỏa dương. Kết quả cho thấy phân đoạn
EtOAc thể hiện tác dụng vượt trội so với các phân đoạn khác. Trong số các
chất phân lập được từ phân đoạn này, BLE1 ((21α)-22-hydroxyhopan-3on) thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase và theo cơ chế ức chế không
cạnh tranh [3].
- Năm 2015, tác giả Nguyễn Thanh Hương và cộng sự nghiên cứu hoạt tính
androgen của cao lỏng tỏa dương (B. laxiflora) trên chuột cống đực non
9


thiến và chuột cống đực trưởng thành. Kết quả cho thấy cao lỏng tỏa dương
thể hiện hoạt tính androgen rõ rệt thông qua việc tăng nồng độ testosteron
máu và khối lượng các cơ quan sinh dục phụ. Khi đánh giá ảnh hưởng của
cao chiết tỏa dương ở các mức liều 0,28 g/kg; 1,4 g/kg; 2,8 g/kg ta thấy làm
tăng ham muốn tình dục, làm tăng hiệu quả giao cấu. Tác dụng này phụ
thuộc vào thời gian dùng thuốc, khi sử dụng với liều lặp lại sau 10 ngày
hiệu quả trên các hoạt động tình dục thể hiện rõ rệt hơn khi sử dụng liều
đơn sau 15 phút dùng thuốc [8], [7], [9].
- Năm 2017, Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã chỉ ra hợp chất (12) và (15)
cho thấy có độc tính tế bào ở mức trung bình đối với bốn dòng tế bào ung

thư: KB (ung thư biểu bì ở người), MCF7 (ung thư vú ở người), SK-LU-1
(ung thư phổi người) và HepG2 (ung thư biểu mô tế bào) [10], [23].
1.5. Công dụng và một số cách dùng của các loài thuộc chi Balanophora
Nhân dân dùng vị tỏa dương làm thuốc bổ máu, kích thích ăn ngon miệng,
hồi phục sức khỏe, còn dùng chữa nhức mỏi chân tay, đau bụng, hồi phục sức
khỏe cho phụ nữ sau khi sinh nở.
Dùng dưới dạng thuốc rượu: Vị tỏa dương thái mỏng ngâm rượu: 1 phần tỏa
dương, 5 phần rượu 35-40o. Ngâm trên một tháng mới sử dụng. Rượu có màu, đỏ
sẫm, vị hơi đắng, chát. Có thể thêm đường hay mật ong cho dễ uống. Ngày uống
hai lần vào trước bữa ăn, mỗi lần một chén con (chừng 30 ml) [11].
Một số bài thuốc bổ được sử dụng:
- Bài thuốc giúp phục hồi sức khỏe phụ nữ sau sinh: Tỏa dương 15 -20 g,
ích mẫu thảo khô 30 g.
- Bài thuốc chữa nam sinh lý yếu: Tỏa dương 100 g, rễ đinh lăng 10 g, ba
kích 80 g, dâm dương hoắc (sao với mỡ dê) 50 g, đương quy 50 g, hà thủ
ô đỏ 50 g, câu kỳ tử 50 g, thục địa 50 g, bạch truật 50 g, trần bì 30 g.
- Bài thuốc chữa liệt dương: Tỏa dương 12 g, thục địa 15 g, sơn thù 15 g,
sơn dược 15 g, phục linh 12 g, câu kỳ tử 15 g, nhục thung dung 12 g, dâm
10


dương hoắc 30 g, ba kích 12 g, bạch nhân sâm 12 g, lộc nhung 6 g, táo
nhân (sao) 12 g, thỏ ty tử 12 g, thiên môn đông 9 g, cam thảo 9 g. Tất cả
đem tán mịn trộn mật làm hoàn, mỗi viên 9 g, mỗi ngày uống 3 lần, mỗi
lần 1 viên, uống với nước đun sôi để nguội. Kiêng ăn thức ăn tanh, lạnh
[13].
- Bài thuốc bổ thận tráng dương: tỏa dương 15 g, nhân sâm 12 g, hoàng kỳ
16 g, đỗ trọng 16 g, nhục thung dung 8 g, thỏ ty tử 12 g, xa sàng từ 12 g,
phúc bồn từ 12 g, đương quy 12 g, bạch truật 12 g, thục địa 16 g, ba kích
12 g, dâm dương hoắc 12 g, lộc nhung 12 g, câu kỳ tử 12 g, đại táo 5 quả,

long nhãn 10 g, cam thảo 6 g, xuyên khung 8 g, hà thủ ô đỏ 12 g. Tất cả
cho vào 750 ml nước vào sắc kỹ còn 250 ml chia làm 3 lần uống trong
ngày. Uống 7-10 tháng [13].
Như vậy ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu chi Balanophora
nhưng hầu hết chỉ là nghiên cứu loài B. laxiflora, chưa có nhiều nghiên cứu trên
các loài khác.

11


Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu.
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu dược liệu tươi được thu tại Lạc Dương (Lâm Đồng) vào tháng 11/2016:
kí hiệu mẫu NTT-LD1116. Mẫu nghiên cứu được mô tả đặc điểm hình thái, đối
chiếu với các tài liệu về thực vật để giám định tên khoa học. Một phần mẫu được
ngâm trong hỗn hợp ethanol – nước (1:1) để bảo quản phục vụ cho nghiên cứu
đặc điểm hình thái và hiển vi. Phần còn lại được sấy trong tủ sấy có thông gió đến
khô và bảo quản trong túi nilon kín để phục vụ cho nghiên cứu hóa học.
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
2.1.2.1. Hóa chất và dụng cụ
- Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo Dược
Điển Việt Nam V.
- Hóa chất: Javen, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn, nước cất, cloral
hydrat, glycerin.
- Dung môi hữu cơ: methanol, chloroform, ethyl acetat, acid acetic, nước
cất, toluen.
- Thuốc thử: các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính và sắc ký.
- Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 của Merck.

- Dụng cụ: dụng cụ thủy tinh và các dụng cụ khác dùng trong phòng thí
nghiệm (cốc có mỏ, bát sứ, chày, cối, thuyền tán, đũa thủy tinh, phiến kính,
lam kính…).
2.1.2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Kính hiển vi quang học Leica.
- Máy quang phổ UV-VIS ở bước song 254 nm và 366 nm.
- Hệ thống sắc ký lớp mỏng CAMAG.
- Tủ sấy dược liệu Memmert, Binder - FD115.
12


- Cân kỹ thuật PRESICA 262 SMA-FR.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Mô tả đặc điểm thực vật mẫu nghiên cứu, so sánh với các tài liệu về thực
vật để giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu. Tiêu bản mẫu nghiên cứu
được lưu tại bảo tàng thực vật, khoa sinh học trường Đại học Khoa Học Tự
Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
- Định tính các nhóm chất có trong loài Balanophora subcupularis P.C. Tam
bằng các phản ứng hóa học.
- Chiết xuất dịch toàn phần bằng methanol, cất thu hồi dung môi để thu cắn
toàn phần, phân tán cắn trong nước và lắc phân đoạn lần lượt với n-hexan,
ethyl acetat để thu được các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat và nước. Triển
khai sắc ký lớp mỏng cũng như đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin
oxidase (XOD) in vitro của các của các phân đoạn thu được.
- Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc một số hợp chất từ phân đoạn
thể hiện tác dụng mạnh nhất của mẫu nghiên cứu.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật
- Mẫu dược liệu tươi (có đủ tiêu chuẩn dể định loài gồm có: cơ quan sinh
sản, cơ quan sinh dưỡng và các thông tin ghi chép tại thực địa).

- Quan sát, mô tả sơ bộ.
- Giám định tên khoa học dưới sự tư vấn của các chuyên gia tại Bảo tàng
Thực vật thuộc khoa Sinh Học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên thuộc
Đại học Quốc Gia Hà Nội.
2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học
 Đặc điểm vi phẫu lá, rễ
Cắt vi phẫu và nhuộm kép theo tài liệu.
Cắt vi phẫu bằng dao lam, chọn những lát mỏng và tiến hành nhuộm kép
theo các bước:
13


- Ngâm lát cắt vào dung dịch Javen từ 15-30 phút, rửa bằng nước cất nhiều
lần.
- Ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic 1%-3% trong 2 phút để tẩy Javen
còn sót lại. Rửa bằng nước cất 3 lần.
- Có thế ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch cloral hydrat 50% ( nếu thấy lát cắt
chưa thật trắng và trong) trong 10-15 phút. Rửa bằng nước cất 3 lần.
- Ngâm vào dung dịch xanh methylen từ 5-10 giây (có thể pha loãng). Rửa
bằng nước cất 3 lần.
- Ngâm tiếp vào dung dịch đỏ sòn phen khoảng 15-30 phút. Rửa bằng nước
cất đến khi dung dịch rửa hết màu.
- Sau khi được nhuộm tẩy, tiến hành quan sát hình ảnh vi phẫu dưới kính
hiển vi, chụp ảnh.
 Đặc điểm bột:
Toàn cây sau khi thu về tiền hành phơi sấy khô sau đó nghiền thành bột
bằng cối sứ, rây qua rây thu được bột mịn.
Quan sát trên kính hiển vi Labomed.
2.3.3. Định tính bằng phương pháp hóa học.
2.3.3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong mẫu nghiên cứu

Tiến hành thực hiện các phản ứng định tính các nhóm chất chính trong dược
liệu theo phương pháp hóa học ghi trong sách thực tập Dược liệu và giáo trình
Dược liệu học tập I và tập II.
2.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Sử dụng bản mỏng Silicagel tráng sẵn của Merck. Chấm sắc ký bằng máy
chấm sắc ký CAMAG Linomat. Bản mỏng sắc ký sau khi được triển khai ở hệ
dung môi thích hợp sẽ được chụp ảnh ở buồng chụp TLC Visualizer II ở bước
sóng λ = 254 nm và λ = 366 nm. Sau khi phun thuốc thử bản mỏng sẽ hiện màu
và được chụp ảnh ở ánh sáng thích hợp.

14


2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ức chế enzym xanthin oxidase
in vitro.
Nguyên tắc: Dựa trên phương pháp của Tadataka Noro và cộng sự (1983) có
điều chỉnh để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [30]. Nguyên tắc định
lượng dựa trên phản ứng sau:

Xanthin oxidase
Xanthin + H2O + O2

Acid uric + H2O2

Hoạt độ xanthin oxidase được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành
được đo ở bước sóng 295 nm ở 37oC, pH 7,5 hoặc 8,0. Một đơn vị enzym được
định nghĩa là tổng lượng enzym sản xuất ra 1 µmol acid uric trong mỗi phút ở
nhiệt độ 37ºC.
Quy trình xác định IC50 của mẫu thử trên hoạt tính enzym xanthin
oxidase (XOD)

 Chuẩn bị các hóa chất cần thiết
- Đệm phosphat 70 mM, pH = 7,5
NaH2PO4.H2O = 0,1817% ; Na2HPO4.7H2O = 1,5231%
Cân 0,896 g KH2PO4 và 12,068 g Na2HPO4.12H2O => 500 ml (đo lại pH)
- Enzym xanthin oxidase 0,01 U/ml trong đệm phosphat (kiểm tra lại hoạt độ
ghi trên lọ enzym)
Pha loãng dựa trên hoạt độ ghi trên lọ
(9,6 µl E => 10ml (đệm) (để trong nước đá đang tan)
- Cơ chất : dung dịch xanthin 150 µM trong đệm phosphat
Cân 0,0057 g (5,7 mg) => 250 ml/đệm (M =152,11)
Khuấy từ + gia nhiệt khoảng 3 giờ
- Hóa chất dừng phản ứng: dung dịch HCl 1N.
8,5 ml đặc => 100 ml
 Pha dung dịch thử
- Dung dịch gốc C0: 10000 µg/ml (trong DMSO)
15


- Quy đổi từ nồng độ trong giếng thành nồng độ ngoài giếng:
Tên

C ngoài giếng

C trong giếng

Cách pha

C1

300

1050 µg/ml

52,5 µl C0 + 447,5 µl đệm

C2

100

350 µg/ml

17,5 µl C0 + 482,5 µl đệm

C3

50

175 µg/ml

8,75 µl C0 + 491,25 µl đệm

C4

30

105 µg/ml

50 µl C1 + 450 µl đệm

C5

10

35 µg/ml

50 µl C2 + 450 µl đệm

C6

3

10,5 µg/ml

50 µl C4 + 450 µl đệm

 Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng
Bước

Giếng chứng

Các giếng thử

1

Dung dịch thử

0

50 µl

2

Đệm phosphat pH 7,5

85 µl

35 µl

3

Lắc

4

XOD 0,01 U/ml

5

Lắc, ủ ở 25oC trong 15 phút

6

Xanthin 150 µM

7

Lắc, ủ ở 25oC trong 30 phút

8

30 µl
60 µl

60 µl

HCl 1N

25 µl

25 µl

9

XOD 0,01 U/ml

30 µl

10

Đo quang ở 290 nm

Tác dụng ức chế hoạt động của enzym XOD được tính theo công thức:
I% = (1-B/A) x 100
Trong đó:
A: Hoạt độ enzym của mẫu chứng
B: Hoạt độ enzym của mẫu thử

16

Hoạt tính ức chế XOD được biểu thị bằng phần trăm ức chế XOD. Các giá trị IC50
được tính từ các giá trị trung bình của dữ liệu từ bốn lần.
2.3.5. Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc một số hợp chất từ loài
Balanophora subcupularis P.C. Tam
- Chiết xuất: Tiến hành chiết hồi lưu mẫu với methanol. Sau đó gộp dịch chiết, cất
thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn thu được cao methanol toàn phần.
- Chiết các phân đoạn: Phân tán cao methanol vào một lượng tối thiểu nước rồi
đem đi siêu âm, chiết lần lượt với các dung môi tăng dần độ phân cực: n-hexan,
ethyl acetat, mỗi dung môi chiết 3 lần. Sau đó cất thu hồi dung môi dưới áp suất
giảm thu được cắn tương ứng: cắn n-hexan, cắn ethyl acetat và cắn nước.
- Chọn phân đoạn để phân lập: Qua việc tìm hiểu các tài liệu, chúng tôi nhận thấy
chưa có một nghiên cứu nào trong nước về đối tượng Balanophora subcupularis
P.C. Tam. Do đây là nghiên cứu đầu tiên về đối tượng này và qua khảo sát sơ bộ
các phân đoạn bằng SKLM và dựa vào tác dụng sinh học ức chế enzym XO, chúng
tôi thấy phân đoạn ethyl acetat có nhiều tiềm năng nên trong đề tài này chúng tôi
chọn phân đoạn ethyl acetat để phân lập các chất.
- Phân lập trên sắc ký cột:
+ Lựa chọn phân đoạn ethyl acetat để tiến hành sắc ký.
+ Chất hấp phụ: Silicagel 60 (cỡ hạt 0,04 – 0,063 nm) được hoạt hóa ở 110oC
trong 1h, để nguội trong bình hút ẩm.
+ Cột sắc ký với các kích cỡ khác nhau phù hợp với từng khối lượng chất lên cột
khác nhau.
+ Hệ dung môi rửa giải: CH2Cl2 - MeOH với các tỉ lệ khác nhau theo hướng tăng
dần độ phân cực.
+ Tinh chế chất thu được bằng phương pháp kết tinh, rửa tủa với các dung môi
thích hợp nhằm tinh chế các chất đến mức kết tinh nhất có thể.
+ Độ tinh khiết của các hợp chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, các
phương pháp phân tích khối phổ MS, phổ 1H - NMR đo ở Viện hóa học – Viện

17

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tham khảo cơ sở dữ liệu phổ của các
tài liệu đã công bố để biện giải cấu trúc chất phân lập được.

18