Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt bưởi (Citrus maxima)

ii

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG-HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Trần Thị Ngọc Yên - TS. Nguyễn Thị Lan Phi

Cán bộ chấm nhận xét 1 : TS. Phan Ngọc Hòa

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Nguyễn Hoài Hương

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 12
tháng 07 năm 2016
Thành phần Hội đồng đánh giả luận văn thạc sĩ gồm:
1. PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu
2. TS. Nguyễn Hoài Hương
3. TS. Phan Ngọc Hòa
4. TS. Trần Thị Thu Trà
5. TS. Tôn Nữ Minh Nguyệt
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận Văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


3

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÓA XÃ HỘI CHÚ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Quách Nhật Hoàng

MSHV: 7140462

Ngày, tháng, năm sinh: 08.11.1988

Nơi sinh: Tây Ninh

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm

Mã số : 60 54 01 01

I. TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng oxy hóa của dịch chiết
từ hạt bưởi (Citrus maxima)
II. NHỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
+ Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật (vi khuẩn và nấm mốc) của dịch chiết hạt
bưởi trích li bằng phương pháp co2 siêu tới hạn và chiết Soxhlet với dung môi ethyl
acetate theo hai phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn và xác định nồng độ ức
chế tối thiểu (MIC).
+ Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hai dịch chiết hạt bưởi kể trên bằng
phương pháp DPPH.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 11/01/2016
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2016
V.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : - TS. Trần Thị Ngọc Yên
- TS. Nguyễn Thị Lan Phi

Tp. HCM, ngày.... tháng.... năm 2016
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


4

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các cô hướng dẫn của tôi là TS.
Trần Thị Ngọc Yên và TS. Nguyễn Thị Lan Phi. Các cô là người đã theo sát hướng dẫn
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ thực phẩm, trường
Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức
và kỹ năng trong suốt quá trình học tập.
Đồng hành trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài, tôi xin gửi lời cảm ơn
đến chị Lan Chi, các em Nam Hải, Hữu Thành và các bạn đồng học lớp Cao học Công
nghệ thực phẩm khóa 2014.
Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ và gia đình
đã đồng hành cùng con trong suốt quá trình học tập.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2016.
Học viên

Nguyễn Quách Nhật Hoàng


V

TÓM TẮT
Đề tài đã sử dụng dịch chiết hạt bưởi (Citrus maxima) có hoạt chất limonin được
trích li bằng co2 siêu tới hạn và chiết Soxhlet với dung môi ethyl acetate từ hạt bưởi
Thanh Trà (Thừa Thiên Huế) để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và kháng vi sinh vật.
Dịch chiết hạt bưởi được trích li bằng co2 siêu tới hạn và ethyl actetate đều có hoạt tính
kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH với giá trị IC50 lần lượt là 45,34 và 7,55
mg/mL.
Đề tài đã khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của dịch chiết hạt bưởi đối với 6
chủng vi sinh vật gây hư hỏng và ngộ độc thực phẩm gồm có: Staphylococcus aureus,
Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Fusarium solani và
Aspergillus flavus.
Kết quả cho thấy dịch chiết hạt bưởi được trích li bằng co2 siêu tới hạn có khả
năng kháng các chủng vi sinh vật nghiên cứu, ngoại trừ Aspergillus flavus. Nồng độ ức
chế tối thiểu (MIC) là 96 mg/mL, 144 mg/mL, 160 mg/mL và 160 mg/mL tương ứng
với các chủng Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhỉ và
Pseudomonas aeruginosa.
Dịch chiết hạt bưởi được trích li bằng ethyl acetate có khả năng kháng các chủng
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa.
MIC đối với Staphylococcus aureus là 128 mg/mL và > 192 mg/mL đối với các chủng
Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa.
Ket quả khảo sát cho thấy dịch chiết hạt bưởi bằng co2 siêu tới hạn có hoạt tính
cao hơn 1,3 lần so với dịch chiết hạt bưởi bằng ethyl acetate đối với Staphylococcus
aureus.


vi

ABSTRACT
In this study, the antioxidant and antimicrobial activities of the supercritical
carbon dioxide extract and the Soxhlet extract with ethyl acetate obtaining from Thanh

Tra pomelo seed were investigated. The IC50 values resulted from DPPH assay were
found to be 45.34 mg/mL for supercritical carbon dioxide extract and 7.55 mg/mL for
ethyl acetate extract.
The study has also examined the antimicrobial activity of pomelo seed extract
extracts against the six food pathogenic microorganisms: Staphylococcus aureus,
Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus flavus and
Fusarium solani.
The supercritical carbon dioxide pomelo extract showed the strong effect against
s. aureus, B. cereus, s. typhi, p. aeruginosa and F. solani. The Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) values were 96 mg/mL, 144 mg/mL, 160 mg/mL and 160 mg/mL
for s. aureus, B. cereus, s. typhi and p. aeruginosa, respectively.
The ethyl acetate extract collected by using Soxhlet equipment showed the effect
against s. aureus, B. cereus, s. typhi and p. aeruginosa . The MIC of this extract was
128 mg/mL for s. aureus and more than 192 mg/mL for B. cereus, s. typhi and p.
aeruginosa.
The results showed that the antibacterial activity on s. aureus of the supercritical
carbon dioxide pomelo seed extract was higher (1.3 times) compared to that of the ethyl
acetate pomelo seed exttact.


7

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu được trình bày trong phần kết quả của luận văn này do bản
thân tôi thực hiện, không sao chép của bất kỳ người nào khác.
Nguyễn Quách Nhật Hoàng



1

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... 3
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................ 5
1.1 Giới thiệu về hạt bưởi ........................................................................................... 5
1.2 .................................................................................................................
Một số phương pháp tách chiết.................................................................................. 8
1.2.1 Trích li bằng Soxhlet .................................................................................. 8
1.2.2 Trích li bằng CŨ2 siêu tới hạn .................................................................. 9
1.2.3 Trích li có sự hỗ trợ của vỉ sóng ............................................................. 10
1.2.4 Trích li có sự hỗ trợ của sóng siêu âm ................................................... 11
1.3. ................................................................................................................
Các phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật ............................................. 12
1.3.1. Một sổ chủng vỉ khuẩn, vỉ nấm gãy bệnh thường gặp............................. 12
1.3.2. Phương pháp xác định hoạt tỉnh kháng vỉ sinh vật ................................ 17
1.4. ................................................................................................................
Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa ................................................. 18
1.4.1 Phương pháp DPPH (Diphenylpicrylhydrazyl radical) ......................... 18
1.4.2 Phương pháp ABTS................................................................................. 19
1.4.3 Phương pháp ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) .............. 19
1.4.4 Phương pháp TRAP (Total Radical - Trapping Antioxidant Potential) 20
1.4.5 Phương pháp FRAP (Ferric Reducing - Antioxidant Power) ................ 20
1.4.6 Phương pháp Reducing power ............................................................... 20
1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .......................................................... 21
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 23
2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 23
2.1.1 Nguyên liệu .............................................................................................. 23
2.1.2 Chủng vi sinh vật ..................................................................................... 23
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chat và môi trường thủ nghiêm ........................... 23

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 26


2

2.2.1. Khảo sát quy trình tách chiết bằng phương pháp co2 siêu tới hạn ........ 26
2.2.2. Khảo sát quy trình tách chiết Soxhlet sử dụng dung môi ethyl acetate...27
2.2.3. Phãn tích hàm lượng lỉmonỉn bằngHPLC .............................................. 27
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vỉ sinh vật ................................. 28
2.2.4.1..................................................................................................
Phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn ....................................................... 28
2.2.4.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) .................. 29
2.2.5 Phương pháp DPPHxác định hoạt tính kháng oxy hóa ............................ 30
2.3. Xử lý số liệu ...................................................................................................... 30
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................ 31
3.1. Quy trình tách chiết dịch chiết hạt ..................................................................... 31
3.1.1. Khảo sát quy trình tách chiết bằng phương pháp co2 siêu tới hạn ....... 31
3.1.2. Khảo sát quy trình chiết Soxhlet sử dụng dung môi ethyl acetate .......... 34
3.1.3 Chuẩn bị mẫu dịch chiết thí nghiệm ........................................................ 36
3.2. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật ................................................................. 36
3.2.1 Kết quả đo đường kỉnh vòng khảng vỉ sinh vật ........................................ 36
3.2.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ................................... 38
3.3. Hoạt tính kháng oxy hóa bằng phuơng pháp DPPH .......................................... 39
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................. 41
4.1 Kết luận ............................................................................................................... 41
4.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 43
PHỤ LỤC 1 ................................................................................................................ 53
PHỤ LỤC 2 ................................................................................................................ 55
PHỤ LỤC 3 ................................................................................................................ 57

PHỤ LỤC 4 ................................................................................................................ 59
PHỤ LỤC 5 ................................................................................................................ 61
PHỤ LỤC 6 ................................................................................................................ 63
PHỤ LỤC 7 ................................................................................................................ 65
PHỤ LỤC 8 ................................................................................................................ 66


3

PHỤ LỤC 9 ................................................................................................................ 67
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng ............................................................................... 24
Bảng 2.2. Thành phần môi trường Tryptone Soya Broth (TSB) ....................... 25
Bảng 2.3. Thành phần môi trường Potato Dextrose Broth (PDB)..................... 25
Bảng 2.4. Thành phần môi trường Mueller - Hinton Agar (MHA) ................... 25
Bảng 2.5. Thành phần môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)...................... 25
Bảng 3.1. Nồng độ

limonin theo nhiệt độ trích li........................................... 31

Bảng 3.2. Nồng độ

limonin theo lượng đồng dung môi................................. 32

Bảng 3.3. Nồng độ

limonin theo áp suất ........................................................ 32

Bảng 3.4. Nồng độ

limonin theo thời gian ..................................................... 33

Bảng 3.5. Nồng độ

limonin theo thời gian ..................................................... 34

Bảng 3.6. Nồng độ

limonin theo tỷ lệ nguyên liệu:dung môi ........................ 35

Bảng 3.7. Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn ....................................... 36
Bảng 3.8. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của DC1 và DC2............................ 39
Bảng 3.9. Giá trị IC50 của dịch chiết hạt bưởi .................................................. 40


4

MỞ ĐẦU
Quả bưởi là một loại trái cây rất được ưa chuộng, nhiều vitamin và khoáng chất.
Theo y học cổ truyền, mỗi bộ phận của quả bưởi đều có tác dụng riêng, trong đó có hạt
bưởi. Hạt bưởi vị đắng, tính ấm, có tác dụng chữa viêm loét dạ dày, hành tá tràng. Tuy
nhiên, trong quy trình sản xuất các sản phẩm, hạt bưởi thường được loại bỏ. Mặt khác,
ở nước ta, nhu cầu về các chất có hoạt tính kháng oxy hóa và kháng vi sinh vật ngày
càng cao, trong khi đó đến thời điểm này có rất ít công trình nghiên cứu về hoạt tính
kháng vi sinh vật của dịch chiết từ hạt bưởi. Do đó, để tận dụng nguồn phế liệu, tăng
giá trị sử dụng và giá trị kinh tế cho các sản phẩm từ quả bưởi, giảm ô nhiễm môi trường,
đồng thời, tìm hiểu về khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt
bưởi, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài:
“Khảo sát hoạt tính kháng vì sình vật và kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt bưởi
(Citrus maxima)

5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Giói thiệu về hạt bưởi
Ngày nay, hầu hết các cây thuộc chi Citrus được trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt
đới ở Bắc bán cầu và Nam bán cầu [1],
Quả bưởi có tên khoa học là Citrus maxima (Burm) Merril hay Citrus grandis
Osbeck, thuộc họ Cam Rutaceae. Bưởi là loại cây to cao 10 - 13 m, vỏ thân màu vàng
nhạt, đôi khi ở kẽ nứt thân chảy ra một thứ gôm nhựa. Cành có gai dài, nhọn. Lá hình
trứng, dài 11 - 12cm, rộng 4,5 - 5,5 cm, hai lá đầu tù, nguyên, dai, cuống có dĩa cánh to.
Hoa đều, to, mọc thành chùm 6-10 hoa, rất thom [2],
Có vài chục giống ở khắp đất nước và có những giống bưởi ngon nổi tiếng. Miền
Nam có bưởi ổi, bưởi Biên Hòa, bưởi Năm Roi; bưởi Thanh Trà ở Huế; miền Bắc có
bưởi Phúc Trạch (Hà Tĩnh), bưởi Đoan Hùng, bưởi đỏ Mê Linh, bưởi Diễn...[3]
Hầu hết các bộ phận của cây bưởi đều được sử dụng [2] như:
+ Lá bưởi tưori thường được dùng nấu với nhiều lá thom khác để xông chữa cảm
cúm, nhức đầu, nhức đầu.
+ Vỏ quả bưởi chữa ăn uống khó tiêu, đau bụng, ho.
+ Vỏ hạt bưởi có thể dùng lấy pectin làm thuốc cầm máu.
+ Dịch ép múi bưởi làm thuốc chữa tiêu khát, thiếu vitamin c, làm nguyên liệu
chế acid citric thiên nhiên.
+ Nước hoa bưởi thường bán ở các hiệu làm bánh được cất từ hoa bưởi phối hợp
với nhiều vị thuốc có vị thom khác như hồi, quế... dùng để tạo hưomg cho thực phẩm.
Trong các bộ phận của cây bưởi có chứa một số hợp chất như:
+ Alkaloids: 5-hydroxyacronycine, acriginine A, atalafoline, baiyumine A &B,
buntanine, buntanmine, grandisine I & II, pumiline, honyumine, natsucrin, prenyl
citpressine, citropone A & B, glycocitrine I có trong rễ và vỏ cây bưởi. Trong hoa bưởi
còn có chứa caffeine [4, 5, 6, 7, 8, 9].

+ Amino acids: Alanine, asparigine, aspartic acid, coline, glutamic acid, glycine
và proline có trong lá bưởi [10,11].
+ Carbohydrates: Phytol, synephrine, methyl antralinate, fructose, glucose và


6

pectin có trong lá, vỏ và hoa bưởi [12, 13, 14, 15].
+ Carotenoids: Carotene và roseoside có trong vỏ bưởi [16, 17].
+Coumarins: 5 - geranoxy - 7 - methoxy - coumarin, aurapte, auraptene,
bergamottin có trong vỏ và 5-methoxy seselin, 5-methyltodannol, 6-hydroxy
methylhemiarin có trong vỏ thân và vỏ rễ cây bưởi [8, 18, 19, 20],
+ Flavonoids: acacetin, rutin, tangeretin, cosmosiin, diosmetin, diosmin,
eriocitrin, hespeidin, naringin [21, 22, 23],
+ Monoterpenes: a-pinene, a-terpineol, anethole, 0-pinene, camphene,
camphor, citral, citronellal, citroonellol, farnesol, geraniol, myrcene, neral, terpinene
[24, 25, 26],
+ Sesquiterpenes: a-bisabolol, a-cadinene, a-copaene, elemol [27, 28, 29],
+ Steroids: 0-sitosterol, campesterol, daucosterol, stigmasterol [30, 31],
+ Ngoài ra, còn có một số thành phần khác như: a - tocopherol, ascorbic acid,
chlorophylls, decyl acetate, malonic acid, fumaric acid, succinic acid và citric acid [11]
Ngoài ra, còn có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất từ các bộ
phận khác nhau của cây bưởi như kháng oxy hóa [32] , giảm đau và kháng viêm [33,
34] , ổn định đường huyết [35, 36], chống trầm cảm [37], giảm sự phát triển của khối u
[38], bảo vệ gan [39, 40], kháng khuẩn [41], ức chế hoạt động của enzyme Angiotensin
- 1- Converting [42],
Hạt bưởi thường có hình dẹt, hạt khá to và có gân ghồ ghề. Thai hạt thường là
đơn phôi. Số múi trong một quả thường từ 13 đến 18 múi [43],
Thành phần chính của hạt bưởi bao gồm chất béo, protein, chất xơ, tro,
limonoids... Đồng thời, limonoids được tìm thấy nhiều nhất trong hạt bưởi so với các

hạt Citrus khác.
Limonin được tìm thấy trong thành phần của các cây thuộc chi Citrus từ những
năm 1841 [44], Limonin thuộc nhóm limonoid aglycones, có dạng tinh thể màu trắng,
vị đắng, được tìm thấy nhiều trong hạt Citrus [45], Limonin có công thức phân tử
C26ÍỈ3O08.
Limonoids được tìm thấy ở hạt bưởi được phân thành hai nhóm: limonoids
aglycones và limonoids glucosides [46,47],
Limonoids aglycones trong hạt bưởi gồm có: Limonin, nomilin, obacunone và
deacetylnomilin [46, 47],


7

R. Rouseff, s. Nagy [48] và Hasegawa cùng cộng sự [45] đã phân tích thành phần
limonoids trong những hạt của tám loài thuộc chi Citrus và kết quả cho thấy rằng thành
phần limonoid chủ yếu là limonin [45, 48], Trong nghiên cứu của Hasegawa [49] và
Hashinaga cùng cộng sự [50] cũng cho thấy limonin là limonoid chứa nhiều trong các
cây thuộc chi Citrus. Trong 1 kg hạt bưởi khô chứa khoảng 19 g limonin [51], Virkam
và cộng sự đã định lượng limonin từ bốn loài thuộc chi Citrus và kết quả cho thấy
limonin chứa nhiều trong bưởi Rio Red, 616,6 mg/100g hạt [52]. Một số nghiên cứu
khác cho thấy limonin từ loài Citrus wilsonii Tanaka thuộc tỉnh Hồ Nam (Trung Quốc)
là 2,345 mg/g hạt [53], Kết quả nghiên cứu của Liu và cộng sự cho thấy hạt Citrus
reticulate Blanco thu được nhiều limonin nhất (7,85 mg/g) và có độ tinh khiết là 98%.
Limonin có khả năng ức chế sự phiên mã của retrovirus như HTV-I và HTLV I [54], Nghiên cứu của Yoon và cộng sự [55] cho thấy limonin có tác dụng ổn định thần
kinh. Ngoài ra, limonin còn làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư ruột kết, giảm
cholesterol LDL, giảm nguy cơ xơ vữa động mạch [56].
Năm 1995, H. Ohta và s. Hasegawa [57] đã nghiên cứu thành phần limonoid
trong hạt và dịch quả bưởi. Ket quả nghiên cứu cho thấy trong hạt bưởi có chứa limonin,
nomilin, obacunone, deacetylnomilin. Hàm lượng limonoid aglycone trong hạt bưởi
chiếm khoảng 773 - 9900 ppm và hàm lượng limonoid glucosides khoảng 130-1912

ppm.
Đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của limonoids. Thí nghiệm trên
chuột cho thấy limonoids từ quả bưởi có khả năng ức chế enzyme gluthathione Stransferase [58] và ức chế khối u ở dạ dày, miệng, phổi, da, đại tràng trên cơ thể người
[59, 60]. Thí nghiệm trên tế bào ung thư vú ở người cho thấy limonoids có tiềm năng
ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [61]. Ngoài ra, một số nghiên cứu cho thấy
limonoids có khả năng ức chế sự phát triển của sâu bọ [62],
1.2 Một số phương pháp tách chiết
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ. Các kỹ thuật đều xoay quanh hai
phương pháp chính là chiết lỏng - lỏng và chiết rắn - lỏng [63],
Trong thực nghiệm, chiết rắn - lỏng được áp dụng nhiều hơn, bao gồm phương
pháp ngấm kiệt, ngâm dầm, trích li với máy chiết Soxhlet... Ngoài ra, còn có phương
pháp chiết lôi cuốn hơi nước, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn...[63],


8

Nguyên tắc chiết cơ bản là dung môi không phân cực (thí dụ eter dầu hỏa...) sẽ
hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo...), dung
môi phân cực trung bình (thí dụ dietyl eter, cloroform...) hòa tan tốt các hợp chất có tính
phân cực trung bình (các hợp chất chứa nhóm chức eter -O-, aldehyt -CH=O, ceton CO- , ester -COO- ... ) và dung môi phân cực mạnh (thí dụ metanol...) hòa tan tốt các
hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức -OH , - COOH...)
[63],
1.2.1 Trích li bằng Soxhlet
Chiết Soxhlet là quá trình chiết hồi lưu dựa trên nguyên tắc hóa hơi. Dung môi
tinh khiết khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, khi gặp hệ thống làm lạnh, ngưng tụ
thành thể lỏng, rớt thẳng xuống pha rắn chứa chất cần hòa tan. Dung môi ngấm vào và
chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi, theo quá trình đun nóng lượng
dung môi càng lúc càng nhiều sẽ bị trút về bình cầu ban đầu. Các hợp chất được trút
xuống bình cầu và nằm tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là được bốc hơi bay lên để
tiếp tục quá trình chiết.

ưu điểm: Tiết kiệm dung môi, chỉ một lượng ít dung môi mà chiết kiệt được mẫu;
không tốn các thao tác lọc và châm dung môi mới như các kỹ thuật khác; chiết kiệt hợp
chất trong mẫu vì mẫu luôn được chiết liên tục bằng dung môi tinh khiết.


9

Nhược điểm: Kích thước của máy Soxhlet làm giới hạn lượng mẫu cần chiết;
trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ mẫu được trữ lại trong bình cầu, bị
đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các hợp chất kém bền nhiệt có thể bị thay
đổi.
Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp Soxhlet để tách chiết limonoids
từ hạt Citrus. H. Ohta [64] đã sử dụng phương pháp Soxhlet để tách chiết thành phần
limonoids trong hạt Citrus depressa và Citrus ỉyo. Hạt Citrus được loại béo bằng dung
môi n-hexane và sau đó được chiết tiếp bằng acetone và methanol. Cao chiết methanol
được chiết tiếp với dung môi methylene chloride:water (1:1). Kết quả nghiên cứu cho
thấy thành phần limonoids trong hạt Citrus depressa và Citrus ỉyo khác nhau. Trong hạt
Citrus depressa chứa nhiều nomilin glucoside (7,59 mg/g), còn trong hạt Citrus iyo thì
chứa nhiều limonin (4,57 mg/g). Trong một nghiên cứu khác, J. Patil [65] cũng sử dụng
phương pháp Soxhlet để tách chiết các hợp chất trong hạt chanh Citrus aurantifolia.
Trước tiên, hạt Citrus aurantifolia được tách béo bằng phương pháp Soxhlet với nhexane và sau đó được tách chiết với ethyl acetate, acetone, MeOH, MeOH: Water (8:2).
Kết quả cho thấy thành phần limonoids đều có trong các loại cao chiết trong đó cao chiết
ethyl acetate chứa limonin nhiều nhất (390,79 mg/lOOg).
1.2.2 Trích li bằng CO2 siêu tới hạn
Đối với mỗi một chất đang ở trạng thái khí, khi bị nén đẳng nhiệt tới một áp
suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng và ngược lại. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà tại
đó, nếu tăng nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không hóa hơi trở lại mà tồn tại ở một dạng
đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn. Vật chất ở trạng thái trung gian này, mang đặc
tính của cả chất khí và chất lỏng [66].
Các dung môi siêu tới hạn có khả năng hòa tan tốt các chất ở cả ba dạng rắn,

lỏng và khí. Dung môi siêu tới hạn có sự tác động lên cả các chất dễ bay hơi và cả các
cấu tử không bay hơi của mẫu [67],

co2 siêu tới hạn (SCO2) là dung môi được ưu tiên lựa chọn do co2 dễ kiếm,
rẻ tiền và ít có phản ứng với các chất cần tách chiết. Khi được đưa lên đến trạng thái tới
hạn, co2 không gây nổ, không bắt lửa và không duy trì sự cháy; co2 không độc với cơ
thể, không ăn mòn thiết bị; ít tốn năng lượng hơn so với các chất khác để đưa tới vùng
siêu tới hạn; Có khả năng hòa tan tốt các chất tan hữu cơ ở thể rắn và lỏng, đồng thời
cũng hòa tan được cả các chất thơm dễ bay hơi, không hòa tan các kim loại nặng và có
thể điều chỉnh các thông số trạng thái như áp suất và nhiệt độ để nâng cao độ chọn lọc
khi chiết tách; Không có dư lượng cặn độc hại trong chế phẩm chiết [66, 67, 68, 69],
Trên thế giới đã sử dụng công nghệ trích li bằng sco2 vào việc loại cafein của
chè và cà phê trong quá trình sản xuất các loại đồ uống không cafein [66, 70, 71]. Trong


10

công nghiệp thuốc lá, sco2 còn được sử dụng để chiết những thành phần dễ bay hơi và
tách phần hương tự nhiên từ cây thuốc lá để nâng cao chất lượng sản phẩm. Trong công
nghiệp thực phẩm ứng dụng công nghệ sco2 để sản xuất các sản phẩm có hàm lượng
chất béo và cholestesrol thấp hoặc các thực phẩm chức năng (giàu axit béo DHA, EPA,
FOS ,v.v...); SCO2 cũng được dùng để chiết các hợp chất của hoa houblon [66, 67] dùng
trong công nghệ bia và dược phẩm cũng như chiết các hoạt chất chống oxy hóa có nguồn
gốc tự nhiên.
J. Yu và cộng sự [72] đã sử dụng phương pháp co2 siêu tới hạn để trích li
limonoid và naringin từ hạt Citrus parodist Macf. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm
lượng limonin thu được cao nhất (6,3 mg/g hạt) ở 48,3 MPa, 50°C trong 60 phút; hàm
lượng limonin-17-0-d-glucopyranoside thu được cao nhất (0,62 mg/g hạt) ở
41,1 MPa, 60°C trong 40 phút với đồng dung môi là ethanol 30%; và hàm lượng
naringin thu được cao nhất (0,2 mg/g hạt) ở 41,4 MPa, 50°C trong 40 phút với đồng

dung môi là ethanol 20%.
1.2.3 Trích li có sự hỗ trợ của vi sóng
Dưới tác dụng của vi sóng, nước trong các tế bào thực vật bị nóng lên thật nhanh,
áp suất bên trong tăng đột ngột, làm các mô bị vỡ ra, thoát ra bên ngoài, bị lôi cuốn theo
hơi nước sang hệ thống ngưng tụ hoặc hòa tan vào dung môi hữu cơ đang bao phủ bên
ngoài nguyên liệu [73],
Ngoài việc nước bị tác dụng nhanh chóng bởi vi sóng, các cấu tử phân cực (nhóm
hợp chất có chứa oxigen) cũng bị ảnh hưởng bởi vi sóng. Ngược lại, thành phần
hidrocacbon ít chịu ảnh hưởng của vi sóng hơn (do chúng có độ phân cực kém). Nhưng
quá trình ly trích bằng chưng cất hơi nước bình thường sẽ nhanh hơn do nước được đun
nóng nhanh bởi vi sóng [73],
ưu điểm: Có hiệu quả đối với các phân tử phân cực. Thời gian trích li nhanh.
Dung môi sử dụng ít. Thiết bị dễ vận hành.
Nhược điểm: Khó áp dụng quy mô công nghiệp do chi phí đầu tư cho thiết bị tạo
vi sóng là không nhỏ để đủ công suất. Không áp dụng cho các phân tử không phân cực.
Nhiệt độ sôi của dung môi đạt rất nhanh, có thể gây nổ.
1.2.4 Trích li có sự hỗ trợ của sóng siêu âm
Siêu âm là âm thanh có tần số nằm ngoài ngưỡng nghe của con người (16Hz 18kHz). Siêu âm cung cấp năng lượng thông qua hiện tượng tạo và vỡ “bọt”. Trong môi


11

trường chất lỏng, bọt có thể hình thành trong nửa chu kỳ đầu và sẽ vỡ trong nửa chu kỳ
sau, giải phóng một năng lượng rất lớn [73],
Khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các chu trình kéo và
nén liên tiếp được tạo thành. Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở rất
gần nhau nhờ liên kết hóa học. Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén các phân tử ở
gần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa. Áp lực âm trong chu trình kéo
đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành những bọt khí nhỏ [74],
Sóng siêu âm làm rung động những bọt khí này, tạo nên hiện tượng “ sốc sóng “

và hình thành dòng nhiệt bên trong chất lỏng. Bọt khí ổn định có thể lôi kéo những bọt
khí khác vào trong trường sóng, kết hợp lại với nhau và tạo thành dòng nhiệt nhỏ [74],
Sóng siêu âm cường độ cao truyền vào trong lòng chất lỏng sẽ gây nên sự kích
thích mãnh liệt. Tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha lỏng/rắn hay khí/rắn, sóng siêu âm gây
nên sự hỗn loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy. Hiện tượng này làm giảm ranh giới
giữa các pha, tăng cường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy xảy ra sự khuyếch tán ở
một vài trường hợp mà khuấy trộn thông thường không đạt được [74],
1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng vỉ sinh vật
1.3.1. Một số chủng vi khuẩn, vì nấm gây bệnh thường gặp
1.3.1.1 Staphylococcus aureus [75]
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, Gram dương. Theo
phân loại quốc tế Staphylococcus aureus thuộc giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp
Bacilli, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, chi Staphylococcus, loài aureus, s. aureus
có hình cầu, có đường kính từ 0,8 - 1,0 pm và tụ với nhau thành từng đám, không có
lông, không sinh nha bào, thường không có vỏ.
5. aureus thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10 - 45°c và nồng độ
muối cao hơn 10%, thích hợp ở điều kiện hiếu và kỵ khí.
Trên môi trường thạch thường, s. aureus tạo thành khuẩn lạc dạng s, đường kính
1-2 mm, nhẵn, khuẩn lạc và thường có màu vàng chanh. Trên môi trường thạch máu, s.
aureus phát triển nhanh và tạo tan máu hoàn toàn. Trong môi trường canh thang, s.
aureus làm đục môi trường, để lâu có thể lắng cặn.
s. aureus có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi khuẩn
không có nha bào khác. s. aureus bị diệt ở 80°C trong một giờ. s. aureus cũng có thể
gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi trường.


12

s. aureus ký sinh ở da và niêm mạc nên chúng có thể xâm nhập qua các vết
thương hoặc lỗ chân lông gây nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, đầu đinh, các ổ apxe,

eczema... s. aureus là vi khuẩn hay gây nhiễm khuẩn huyết nhất. Nhiễm khuẩn thường
xảy ra sau những nhiễm khuẩn tiên phát, đặc biệt là các nhiễm khuẩn ngoài da, từ đó vi
khuẩn xâm nhập vào máu. s. aureus gây nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp do ăn uống
phải độc tố ruột hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột gây ra.
s. aureus bị tiêu diệt bởi nhiều kháng sinh. Tuy nhiên, hiện nay s. aureus đã
kháng lại nhiều loại kháng sinh thông dụng.
1.3.1.2 Bacillus cereus [76]
Theo phân loại quốc tế, Bacillus cereus thuộc giới Bacteria, ngành Firmicutes,
lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceaem, chi Bacillus, loài cereus.
B. cereus là trục khuẩn, Gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5-1,5 X 2- 4
pm. B. cereus không tạo giáp mô, không có khả năng di động, bào tử dạng hình ovan,
có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm
vào năm 1955.
B. cereus là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, tăng trưởng trong
khoảng nhiệt độ từ 5 - 50°C, tối ưu ở 35 - 40°C; pH dao động từ 4,5 - 9,3, dễ tạo bào tử
và bào tử nảy mầm rất dễ dàng.
Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc rất to, mọc lan, rìa nhăn. Trên
môi trường Nutrient Agar hay Tryptone Soya Agar sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo,
xù xì. Trên môi trường Blood Agar tạo dung huyết rộng. Trên môi trường MYP
(Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hong chung quanh có vòng sáng. Trên môi
trường Mossel (thạch Cereus Selective Agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng.
Trên môi trường canh Nitrate Broth, Tryptone Soya Broth: đục tạo váng, sau cặn lợn
cợn
B. cereus hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp
gia vị, sản phẩm khô...). Vi khuẩn này phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại
thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.
B. cereus lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không lên men
mannitol; khử nitrat thành nitrit; phản ứng Voges - Proskauer (+); phân giải Tyrosine;
catalase (+), kháng lyzozyme (+).
B. cereus có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và

13

emetic toxin gây nôn mửa.
* Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên
thịt, rau quả và gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc
ruột gây bệnh tiêu chảy.
* Độc tố gây nôn mửa (Type 2): Emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, com
nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân
hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể
gây chết nguời. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhung nó
đã góp phần cho sụ phát triển của vi khuẩn.
Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc.

1.3.1.3 Salmonella [77]
Salmonella là trục khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, có khả năng di
động, không tạo bào tủ, lên men glucose và mannitol sinh acid nhung không lên men
saccharose và lactose.
Salmonella là trục khuẩn Gram âm, kích thuớc trung bình từ 2 - 3 X 0,5 - 1 pm,
di chuyển bằng tiên mao trừ s. gallimarum và s. pullorum, không tạo bào tủ, chúng phát
triển tốt ở nhiệt độ 6°c - 42°c, thích hợp nhất ở 35°c - 37°c, pH từ 6 - 9 và thích hợp
nhất ở pH 7,2. Ở nhiệt độ từ 18°c - 40°C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày.
Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển đuợc trên các môi truờng nuôi
cấy thông thuờng. Trên môi truờng thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. Có thể
mọc trên những môi truờng có chất ức chế chọn lọc nhu DCA (Deoxycholate Citrate
Agar) và XLD (Xylose Lysine Deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế
hom nên thường được dùng để phân lập Salmonella. Khuẩn lạc đặc trưng của
Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn

bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ.
Salmonella không lên men lactose, lên men đường glucose và sinh hơi. Thường
không lên men sucrose, salicin và inositol, sử dụng được citrate ở môi trường Simmons.
Tuy nhiên, không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các
ngoại lệ được xác định là s. typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng
citrate trong môi trường Simmon, hầu hết các chủng s. paratyphi và s. cholerasuis không


14

sinh H2S, khoảng 5% các chủng Salmonellla sinh bacteriocin chống lại E. coli, Shigella
và ngay cả một số chủng Salmonella khác.
Các chủng vi khuẩn Salmonella gây bệnh bao gồm s. typhi và s. paratyphi A, B,
c có khả năng gây bệnh thương hàn. Nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn hay viêm dạ dày
- ruột cấp, thường gặp do s. typhymurium , s. enteritidis.

1.3.1.4 Pseudomonas aeruginosa [75] [76]
Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí, Gram âm, có một lông ở một
đầu, di động, không sinh nha bào. p. aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi
cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp 37°c, pH thích hợp 7,2 - 7,5.
Khuẩn lạc của p. aeruginosa có ba dạng: (1) khuẩn lạc nhỏ, thô ở những chủng
hoang dại phân lập từ đất, nước; (2) khuẩn lạc to, trơn, rìa phẳng, nhô cao và (3) khuẩn
lạc có dạng nhầy. Dạng (2) và (3) là đặc điểm của các chủng được phân lập từ bệnh
phẩm.
Trong môi trường lỏng, vi khuẩn mọc váng ở trên, môi trường đục.
Tính chất đặc trưng của trực khuẩn mủ xanh là sinh sắc tố. Có hai loại sắc tố
chính là pyoverdin và pyocyanine. Pyoverdine là sắc tố phát huỳnh quang màu xanh
vàng khi được kích thích bởi bước sóng thấp hơn 260nm. sắc tố này được tạo ra trong
môi trường có nồng độ sắt thấp, dễ khuếch tán và có chức năng trong cơ chế trao đổi sắt
của vi khuẩn. Pyocyanine là sắc tố có màu xanh ở pH trung tính hay kiềm, màu đỏ trong

môi trường acid, sắc tố này là yếu tố tạo màu xanh trong mủ xanh là đặc tính gây bệnh
bởi p. aeruginosa.
Tính chất sinh hóa: Không lên men glucose; có khả năng thủy giải gelatin, tinh
bột; khử nitrate (+), oxidase (+); sử dụng citrate (+); sử dụng maltose (+).
p. aeruginosa hiện diện phổ biến trong đất, nước bề mặt động thực vật, là loài vi
khuẩn gây bệnh cơ hội trên người, p. aeruginosa có thể gây nhiều loại bệnh khác nhau:
gây viêm màng trong tim, viêm đường hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng đường máu,
đường tiết niệu, viêm màng não mủ và áp xe não, viêm tủy xương, viêm tai, gây bệnh
hóa sừng ở mắt, gây nhiễm trùng da, mô mềm... p. aeruginosa là vi khuẩn kháng thuốc
phổ biến đối với nhiều loại kháng sinh. Chỉ có một số ít các kháng sinh có hiệu nghiệm
đối với Pseudomonas là fluoroquinolone, gentamicin và imipenem.


15

1.3.1.5 Aspergillus flavus [77]
Nấm Aspergillus flavus thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp
Eurotiomycetes, bộ Eurotỉales, họ Trichocomaceae, giống Aspergillus, loài Aspergillus
flavus.
Nấm mốc Aspergillus có dạng hình sợi, phân nhánh, có vách ngăn (cấu tạo đa
bào), không màu, màu nhạt hoặc trở nên nâu, nâu nhạt ở một số vùng nhất định của
khuẩn lạc.
Aspergillus flavus tồn tại một cách tụ nhiên trong không khí và đất và có thể gây
bệnh trên các loại ngũ cốc tích trũ trong thời gian dài. Nhiều dòng nấm sinh ra một luợng
lớn độc tố aflatoxin.
Aspergillus flavus ua sống trong điều kiện nhiệt độ khô. Nhiệt độ tố ưu để phát
triển là 37°c, nhưng nấm sẽ phát triển ở nhiệt độ 12-48°c và phát triển nhanh chóng ở
khoảng giữa nhiệt độ là 25 - 42°c.

1.3.1.6 Fusarium solani [77]

Fusarium là chi lớn trong họ Tuberculariaceae. Các loài Fusarium chủ yếu gây
các bệnh héo và thối thân củ, rễ củ trên rau và hoa. Chúng không phải là tác nhân phổ
biến gây bệnh thối rễ. Tuy nhiên, nấm F. oxysporum và F. solani thường sống hoại sinh
trên các mô rễ ảnh hưởng bởi các tác nhân gây bệnh khác, và dễ dàng được phân lập
trên môi trường không chọn lọc.
F. solani chủ yếu gây thối rễ và cổ rễ. Một số dạng F. solani gây thối cổ rễ cây
con họ đậu như đậu Hà Lan, đậu cô ve, và thối rễ ở các cây trưởng thành. Các dạng khác
có thể gây hại ở khu vực gốc thân cây lớn, như cây vải, bị yếu đi do yếu tố môi trường
làm stress và do các bệnh khác.
Trên môi trường PDA, F. solani có màu trắng tới màu kem, một số có sắc tố hơi
xanh lá cây tới xanh lam.
1.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vì sinh vật
Có nhiều phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn. Có thể phân loại các
phương pháp này bằng kỹ thuật đưa chất thử vào hệ thử [78],
1.3.2.1 Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc
Mẩu chứa các hoạt tính kháng sinh trên khoanh giấy sẽ khuếch tán vào môi
trường thạch chứa vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với mẫu chứa


16

hoạt tính kháng sinh được biểu thị bằng đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh
khoanh giấy. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của chất thử càng mạnh [78],
1.3.2.2 Phương pháp dùng ổng trụ trên môi trường đặc
Xác định khả năng kháng khuẩn của chất thử nghiệm cho vào ống trụ ; chất thử
nghiệm khuếch tán vào lớp thạch, gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh
ống trụ đựng chất thử. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của chất thử càng mạnh [78],
1.3.2.3 Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng
Dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng, có chất dinh dưỡng thích hợp
cho vi khuẩn định nghiên cứu. Thêm những nồng độ khác nhau của chất nghiên cứu tác

dụng kháng khuẩn vào các ống. Xác định nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu ức chế
được sự phát triển của vi khuẩn. Nồng độ này được gọi là nồng độ ức chế tối thiểu
(Minimum Inhibitory Concentration - MIC). Phương pháp này còn được gọi là phương
pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp hoặc phương pháp hệ nồng độ [78],
1.3.2.4 Phương pháp vi định lượng trong vi môi trường lỏng (Microbroth microtiter
technique) [78]
Phương pháp này chủ yếu cũng như phương pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp, nhưng
phải có dàn máy ELISA ( Enzyme linked immunosorbent assay: thử nghiệm miễn dịch
gắn enzyme), nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn, tự động, tiết kiệm và có tính định
lượng cao hơn so với phương pháp hệ nồng độ thông thường ở chỗ:
• Kỹ thuật thông thường chỉ dùng một hoặc vài ba dãy thí nghiệm, trong khi ở
đây dùng 8 dãy thí nghiệm.
• Kỹ thuật thông thường dùng 6 - 8 độ pha loãng khác nhau của chất thử còn ở
đây có thể dùng đến 11 độ pha loãng.
• Kỹ thuật thông thường đọc kết quả bằng mắt thường (có thể cho thêm chỉ thị
TTC), nhưng ở đây, được xác định bằng cách đo mật độ quang học ở bước sóng 492 nm
của dàn máy ELISA.
1.3.2.5 Phương pháp sinh ký tự (Bioautography)
Phương pháp này sử dụng khi đã xác định được dịch chiết toàn phần có tác dụng
kháng khuẩn trên một loại vi khuẩn nào đó và muốn xác định xem thành phần nào trong
dược liệu này có tác dụng. Nguyên tắc tương tự như các phương pháp sử dụng môi
trường đặc, sau khi chạy sắc ký dịch chiết tổng có hoạt tính trên bản mỏng, tiến hành
láng môi trường thạch đặc có chứa vi khuẩn nghiên cứu, ủ 18-24 giờ để xác định vùng


17

vết chất làm vi khuẩn không mọc được; đó là chất có tác dụng kháng khuẩn. Để phát
hiện vi khuẩn mọc được dễ dàng nên dùng chỉ thị màu TTC (Triphenyl tetrazolium
Chloride) [78],

1.4. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa
Để nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của các chất, hiện nay có một số phương
pháp sau:
1.4.1 Phương pháp DPPH (Diphenylpicrylhydrazyl Radical)
Xác định khả năng khử gốc tự do 1,1 - diphenyl - 2 picrylhydrazyl (DPPH).
DPPH là một gốc tự do bền, có màu tím và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm.
Khi có mặt chất kháng oxy hóa, DPPH sẽ bị khử thành 2, 2 - Diphenyl - 1 Picrylhydrazine (DPPH - H), có màu vàng. Đo độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517 nm
để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất kháng oxy hóa [79].
Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp DPPH để xác định hoạt tính kháng
oxy hóa của dịch chiết từ hạt Citrus. Mandahi và cộng sự đã sử dụng phương pháp
DPPH để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt của năm loài bưởi
Mexican khác nhau, dịch chiết được chiết bang Soxhlet với dung môi ethyl acetate
(EtOAc), acetone, methanol (MeOH) và nước. Ket quả nghiên cúu cho thấy tất cả dịch
chiết đều có khả năng kháng oxy hóa, trong đó dịch chiết bằng dung môi acetone có khả
năng kháng oxy hóa cao nhất (85,7%) ở nồng độ 500 ppm [80], Nghiên cứu của J. Yu
và cộng sự [81] cho thấy ở nồng độ 10 pM, khả năng ức chế gốc tự do của limonin là
0,5%. s. Kim và K. Shin [82] cũng đã sử dụng phương pháp DPPH để khảo sát hoạt tính
kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt Citrus junos được chiết bằng nước, ethanol và nhexane. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết hạt Citrus junos được chiết với dung
môi là ethanol có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất (63,56%).
1.4.2 Phương pháp ABTS
Cation ABTS+ [2, 2’ - azinobis (3 - ethylbenzothiazoline - 6 - sulfonate) (ABTS)]
là một gốc tự do bền. Đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp
thu 734 nm. Khi cho chất kháng oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất kháng
oxy hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng
734 nm để xác định hoạt tính của chất kháng oxy hóa trong sự so sánh với chất chuẩn
Trolox [6 - hydroxy - 2,5,7,8 - tetramethylchroman - 2 - carboxylic acid]. Trong môi


18

trường kali persulfate, gốc ABTS+ có thể bền 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong tối [83],
1.4.3 Phương pháp ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)
Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxi hóa của fluorescein khi có sự
hiện diện của gốc peroxy. Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứng
trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) và trong hiện diện của mẫu
chứa chất chống oxi hóa cần xác định hoạt tính. Khi fluorescein bị oxi hóa, cường độ
phát huỳnh quang sẽ giảm đi. Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục
trong 35 phút sau khi thêm chất oxi hóa vào. Khi có mặt chất chống oxi hóa, sự phân rã
fluorescein sẽ chậm hơn. Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát
huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán. Kết quả tính
toán là mmol Trolox/g mẫu.
Ưu điểm của phương pháp ORAC là xác định được có hoặc không có sự trễ pha
trong mẫu chứa các chất chống oxi hóa. Đây là một điều rất thuận lợi khi đo các mẫu
thực phẩm chứa cả những hợp chất chống oxi hóa có tốc độ phản ứng khác nhau nhiều
[84],
1.4.4 Phương pháp TRAP (Total Radical - Trapping Antioxidant Potential)
Xác định khả năng kháng oxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do. Phương pháp
TRAP sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2,2’ - azobis (2 - amidinopropane)
dihydrochloride (AAPH). Khi cho AAPH vào môi trường plasma, các chất khử sẽ bị
oxy hóa. Quá trình oxy hóa này được đo đạt thông qua hàm lượng oxy tiêu thụ bằng một
điện cực. Khi có mặt chất kháng oxy hóa trong môi trường plasma, quá trình oxy hóa sẽ
xảy ra chậm hơn. Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha
lag của mẫu so với độ dài pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là
dung dịch Trolox. Kết quả tính toán là rnmol Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/L
mẫu lỏng [85],
1.4.5 Phương pháp FRAP (Ferric Reducing - Antioxidant Power)
Xác định hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng của các chất kháng oxy hoá
trong việc khử phức Fe3+-TPTZ [2,4,ố-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tím) thành
phức Fe2+-TPTZ (màu xanh) ở pH thấp. Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với
hàm lượng chất kháng oxy hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này

được đo ở bước sóng 593 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay