Nghiên cứu một số biến đổi di truyền và mối liên quan với các yếu tố tiên lượng, định hướng điều trị bệnh nhân u nguyên bào thần kinh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_______________________

VŨ ĐÌNH QUANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN
VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG,
ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN
U NGUYÊN BÀO THẦN KINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_______________________

Vũ Đình Quang

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN
VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG,
ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN
U NGUYÊN BÀO THẦN KINH
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62420121

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
2. TS. BS. Phùng Tuyết Lan

Hà Nội - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là: Vũ Đình Quang, nghiên cứu sinh khóa 2013-2018, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Di truyền học, xin cam
đoan:
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của
PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân và TS. Phùng Tuyết Lan.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được
công bố.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực
và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này.

Hà Nội, ngày 04 tháng 03 năm 2019
NGƯỜI CAM ĐOAN

VŨ ĐÌNH QUANG


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS. Nguyễn
Thị Hồng Vân và TS. BS. Phùng Tuyết Lan, hai người thầy khoa học đã tận tâm
hướng dẫn, chỉ bảo, động viên tôi trong suốt 5 năm thực hiện đề tài nghiên cứu
này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả bệnh nhân và gia đình bệnh

nhân đã đồng ý tham gia vào nghiên cứu này. Chính sự đau đớn, mất mát của
các em là động lực thôi thúc tôi hoàn thiện nghiên cứu này, cho các em và cho
cả những bệnh nhân sau các em nữa.
Tôi xin được cảm ơn tất cả đồng nghiệp ở khoa Di truyền và Sinh học
Phân tử, ngôi nhà thứ hai của tôi, đã luôn ở bên tôi những lúc vui, lúc buồn,
khi thành công hay khi thất bại.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo và cán bộ nghiên
cứu của Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, ĐHQGHN đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập, nghiên
cứu trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu này.
Tôi xin cảm ơn đến các anh chị, bạn bè đồng nghiệp trong bệnh viện Nhi
Trung ương và bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec đã cùng tôi đạt được sản
phẩm khoa học ngày hôm nay.
Tôi xin cảm ơn những người bạn thân thiết đã luôn ở bên tôi.
Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn tới gia đình của mình, tới bố, tới
người mẹ đã khuất, tới người bạn đời yêu thương và hai con của tôi với những
lo lắng, chăm sóc, sẻ chia và tình yêu lớn lao dành cho tôi.
Hà Nội, ngày 04 tháng 03 năm 2019
Vũ Đình Quang


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 11
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 15
1.1. Khái quát về u nguyên bào thần kinh ..........................................................15
1.1.1. Tỷ lệ mắc ............................................................................................... 15
1.1.2. Nguyên nhân hình thành khối u nguyên bào thần kinh ........................ 15
1.1.3. Phôi thai học u nguyên bào thần kinh ................................................... 16
1.1.4. Mô bệnh học u nguyên bào thần kinh ................................................... 18
1.2. Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng u nguyên bào thần kinh ......20

1.2.1. Một số đặc điểm lâm sàng bệnh u nguyên bào thần kinh ..................... 20
1.2.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh u nguyên bào thần kinh .............. 26
1.3. Các đặc điểm di truyền bệnh u nguyên bào thần kinh ...............................27
1.3.1. Biến đổi về số lượng nhiễm sắc thể ...................................................... 27
1.3.2. Biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể ....................................................... 28
1.3.3. Khuếch đại gen MYCN......................................................................... 30
1.3.4. Sự biến đổi biểu hiện gen trong bệnh u nguyên bào thần kinh ............. 36
1.3.5. U nguyên bào thần kinh di truyền ......................................................... 39
1.3.6. Mô hình biến đổi di truyền bệnh u nguyên bào thần kinh .................... 40
1.4. Các kỹ thuật di truyền sử dụng để phát hiện các biến đổi di truyền bệnh u
nguyên bào thần kinh..............................................................................................43
1.4.1. Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ .......................................................... 43
1.4.2. Kỹ thuật khuếch đại đa mồi dựa vào phản ứng nối .............................. 46
1.4.3. Kỹ thuật lai so sánh hệ gen ................................................................... 49
1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh u NBTK ở Việt Nam ......................................52
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 55
2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................55

1


2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu......................................................... 55
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 55
2.1.3. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân ............................................................ 55
2.1.4. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân............................................................... 56
2.1.5. Cỡ mẫu: ................................................................................................. 56
2.1.6. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................... 57
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................57
2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm ................................................. 57
2.2.2. Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ .......................................................... 58

2.2.3. Kỹ thuật tách chiết DNA ....................................................................... 60
2.2.4. Kỹ thuật MLPA ..................................................................................... 61
2.2.5. Kỹ thuật lai so sánh hệ gen ................................................................... 63
2.3. Các bước tiến hành nghiên cứu ....................................................................64
2.3.1. Nghiên cứu một số biến đổi di truyền của bệnh u nguyên bào thần kinh.
..................................................................................................... 64
2.3.2. Nghiên cứu mối liên quan giữa một số biến đổi di truyền với một số biểu
hiện lâm sàng, cận lâm sàng và điều trị của bệnh nhân .................................. 65
2.4. Xử lý số liệu ....................................................................................................65
2.5. Đạo đức trong nghiên cứu .............................................................................65
2.6. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................67
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ............................... 69
3.1. Phát hiện một số bất thường di truyền trên các bệnh nhân nhi mắc u nguyên
bào thần kinh ...........................................................................................................69
3.1.1. Xác định trạng thái khuếch đại gen MYCN bằng kỹ thuật FISH ......... 69
3.1.2. Xác định một số biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật MLPA
và CGH

..................................................................................................... 76

3.1.3. Quy trình xét nghiệm biến đổi di truyền trên bệnh nhân u NBTK ....... 93

2


3.2. Xác định mối liên quan giữa các biến đổi di truyền với một số yếu tố tiên
lượng và định hướng điều trị u nguyên bào thần kinh........................................95
3.2.1. Mối liên quan giữa trạng thái gen MYCN với tuổi chẩn đoán ............. 95
3.2.2. Mối liên quan giữa trạng thái gen MYCN với giới tính ....................... 98
3.2.3. Mối liên quan giữa trạng thái gen MYCN với giai đoạn bệnh ............. 99

3.2.4. Mối liên quan giữa trạng thái gen MYCN với chỉ số VMA/HVA ..... 103
3.2.5. Mối liên quan giữa trạng thái gen MYCN với chỉ số LDH ................ 107
3.2.6. Mối quan hệ giữa trạng thái gen MYCN với trạng thái biệt hóa của tế bào
................................................................................................... 109
3.2.7. Mối quan hệ giữa trạng thái gen MYCN với tiên lượng mô bệnh học .....
................................................................................................... 111
3.2.8. Ý nghĩa các biến đổi di truyền với điều trị ......................................... 114
KẾT LUẬN ................................................................................................... 120
KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ............................. 121
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................................................................... 122
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 124
PHỤ LỤC 1. DANH SÁCH BỆNH NHÂN ...............................................PL01
PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ MLPA CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN ...............PL10
PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ TÁCH DNA CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN .....PL15

3


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
BDNF

Nghĩa tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

Brain-derived neurotrophic

Yếu tố tăng trưởng thần kinh

factor

có nguồn gốc từ não

BH
CGH

Biệt hóa
Comparative Genomic

Lai so sánh hệ gen

Hybridization
CNV

Copy number variation

Thay đổi về số lượng bản sao

DM

Double minute

Đoạn kép ngắn chất nhiễm sắc

EFS

Event-free survival

Tỷ lệ sống không bệnh

FISH

Fluorescent in-situ

Lai huỳnh quang tại chỗ

Hybridization
HSR

Homogeneously staining

Vùng bắt màu đồng nhất

region
HVA
INRGSS

Homo-vanillic Acid

Homo-vanillic Acid

International Neuroblastoma

Hệ thống phân giai đoạn u

Risk Group Staging System

nguyên bào thần kinh theo

nhóm nguy cơ

International Neuroblastoma

Hệ thống phân giai đoạn u

Staging System

nguyên bào thần kinh quốc tế

LDH

Lactate Dehydrogenase

Lactate Dehydrogenase

LTS

Life-threatening symptom

Triệu chứng đe dọa sự sống

INSS

4


Nghĩa tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

MIBG

Meta-iodobenzyl-guanidine

Meta-iodobenzyl-guanidine

MKI

Mitosis karyorrhexis Index

Chỉ số nhân chia/nhân tan

Multiplex ligation-dependent

Khuếch đại đa mồi dựa vào

probe amplification

phản ứng nối

Chữ viết tắt

MLPA

NBTK
NCA

NGF

Nguyên bào thần kinh
Numerical Chromosomal

Biến đổi về số lượng nhiễm

Aberration

sắc thể

Nerve growth factor

Yếu tố tăng trưởng thần kinh

NST

Nhiễm sắc thể

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

SCA

Segmental Chromosomal

Biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc

Aberration

thể

Tyrosine kinase

Tyrosine kinase

Vanillyl-mandellic Acid

Vanillyl-mandellic Acid

Trk
VMA

5


DANH MỤC BẢNG

Bảng

Tên

Trang

Bảng 1.1

Các giai đoạn theo INRGSS..................................................

22

Bảng 1.2

Bảng phân loại nhóm nguy cơ u NBTK................................

23

Bảng 1.3

Bảng phân nhóm điều trị các bệnh nhân nguy cơ không cao

25

Bảng 1.4

Các mất đoạn trong hệ gen ở các khối u NBTK ....................

41

Bảng 3.1

Phân bố trạng thái gen MYCN trong nghiên cứu này............

72

Bảng 3.2

Phân bố các dạng khuếch đại gen MYCN trong nghiên cứu này

72

Bảng 3.3

So sánh kết quả nghiên cứu tỷ lệ khuếch đại gen MYCN ở
nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã công bố...............

73

Bảng 3.4

Kết quả phân tích 10 mẫu bằng kỹ thuật MLPA ..................

77

Bảng 3.5

Kết quả lai so sánh hệ gen của 6 bệnh nhân u NBTK ..........

85

Bảng 3.6

Số lượng các dạng biến đổi số lượng nhiễm sắc thể tìm được

89

Bảng 3.7

Số lượng các dạng biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể tìm được

90

Bảng 3.8

So sánh kết quả phát hiện CNV trên nhiễm sắc thể số 2 và 17
bằng kỹ thuật MLPA và CGH...............................................

92

Phân bố bệnh nhân theo tuổi .................................................

95

Bảng 3.10 Phân bố trạng thái gen MYCN theo các nhóm tuổi ...............

97

Bảng 3.11 Phân bố trạng thái gen MYCN theo giới tính ........................

99

Bảng 3.9

Bảng 3.12 So sánh kết quả nghiên cứu phân bố theo đoạn giai đoạn bệnh
ở nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã công bố ...........

101

Bảng 3.13 Kết quả HVA niệu ..................................................................

103

Bảng 3.13 Kết quả VMA niệu .................................................................

104

Bảng 3.15 Kết quả chỉ số LDH huyết thanh ............................................

107

Bảng 3.16 Kết quả phân tích sự biệt hoá của tế bào................................

109

6


Bảng

Tên

Trang

Bảng 3.17 So sánh kết quả nghiên cứu phân bố theo các mức độ biệt
hóa của khối u ở nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã
công bố ..................................................................................

109

Bảng 3.18 Kết quả tiên lượng mô bệnh học ...........................................

112

Bảng 3.19 So sánh kết quả nghiên cứu phân bố theo tiên lượng mô bệnh
học ở nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã công bố.....

113

Bảng 3.20 Ý nghĩa trong đánh giá nguy cơ của khuếch đại gen MYCN

115

Bảng 3.21 Ý nghĩa trong điều trị của kết quả lai so sánh hệ gen ...........

116

7


DANH MỤC HÌNH

Hình

Tên

Trang

Hình 1.1

Bốn con đường của sự thoái triển ngẫu nhiên .........................

17

Hình 1.2

Vị trí gen MYCN trên nhiễm sắc thể số 2 ................................

32

Hình 1.3

Mô hình tương tác của protein mycN với các protein khác. ...

33

Hình 1.4

Tỷ lệ sống không bệnh 3 năm ở trẻ nhỏ (dưới 1 tuổi) theo trạng
thái gen MYCN .........................................................................

Hình 1.5

35

Tỷ lệ sống chung và sống không bệnh của bệnh nhân có khối
u di căn kèm khuếch đại gen MYCN........................................

36

Hình 1.6

Con đường dẫn truyền tín hiệu của thụ thể TrkA ....................

37

Hình 1.7

Mối quan hệ giữa mất đoạn 1p, thêm đoạn 17q và khuếch đại
gen MYCN trong 260 khối u NBTK nguyên phát ...................

41

Hình 1.8

Mô hình biến đổi di truyền bệnh u NBTK...............................

42

Hình 1.9

Nguyên lý của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ .....................

45

Hình 1.10 Nguyên lý của kỹ thuật MLPA ................................................

48

Hình 1.12 Biến đổi nhiễm sắc thể số 2 và 17 được đánh giá bằng kỹ thuật
MLPA.......................................................................................

49

Hình 1.11 Nguyên lý của kỹ thuật CGH...................................................

51

Hình 1.13 Biến đổi bộ nhiễm sắc thể số được đánh giá bằng kỹ thuật
CGH .........................................................................................

52

Hình 2.1

Vị trí đánh dấu huỳnh quang trên nhiễm sắc thể số 2 .............

58

Hình 2.2

Sơ đồ nghiên cứu .....................................................................

67

Hình 3.1

Hình ảnh kết quả FISH của bệnh nhân NB160902 .................

70

Hình 3.2

Hình ảnh kết quả FISH của bệnh nhân NB160801 .................

71

Hình 3.3

Hình ảnh kết quả FISH của bệnh nhân NB161105P ...............

71

8


Hình

Tên

Trang

Hình 3.4

Tỷ lệ các loại mẫu bệnh phẩm thực hiện kỹ thuật FISH .........

75

Hình 3.5

Kết quả MLPA của bệnh nhân NB150807 ..............................

78

Hình 3.6

Kết quả MLPA của bệnh nhân NB170301 ..............................

79

Hình 3.7

Kết quả MLPA của bệnh nhân NB160101 ..............................

80

Hình 3.8

Kết quả MLPA của bệnh nhân NB161006 ..............................

81

Hình 3.9

Kết quả MLPA của bệnh nhân NB170203 ..............................

82

Hình 3.10 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170201 ............

85

Hình 3.11 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170301 ............

86

Hình 3.12 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170404 ............

87

Hình 3.13 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170203 ............

87

Hình 3.14 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170505 ............

88

Hình 3.15 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170106 ............

88

Hình 3.16 Tỷ lệ các dạng biến đổi số lượng nhiễm sắc thể ở u NBTK ....

90

Hình 3.17 Tỷ lệ các dạng biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể ở u NBTK .....

91

Hình 3.18 Phân bố bệnh theo giai đoạn ....................................................

100

Hình 3.19 Phân bố trạng thái gen MYCN theo giai đoạn.........................

100

Hình 3.20 Phân bố bệnh nhân khuếch đại gen MYCN theo chỉ số VMA

102

Hình 3.21 Phân bố bệnh nhân khuếch đại gen MYCN theo chỉ số HVA

105

Hình 3.22 Phân bố trạng thái gen MYCN theo tỷ lệ VMA/HVA ............

105

Hình 3.23 Phân bố trạng thái gen MYCN theo nồng độ LDH .................

106

Hình 3.24 Phân bố trạng thái gen MYCN theo mức độ biệt hoá .............

108

Hình 3.25 Các nhóm tiên lượng (TL) mô bệnh học .................................

110

Hình 3.26 Phân bố trạng thái gen MYCN theo tiên lượng mô bệnh học .

112

Phụ lục 2.1 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB151005 ..............................

PL10

Phụ lục 2.2 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB151103 ..............................

PL11

Phụ lục 2.3 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB151108 ..............................

PL12

9


Hình

Tên

Trang

Phụ lục 2.4 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB160102 ..............................

PL13

Phụ lục 2.5 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB161005 ..............................

PL14

10


MỞ ĐẦU
Ung thư là hậu quả của sự mất điều hòa tăng sinh tế bào, ở đó các tế bào
tăng sinh không kìm hãm và hình thành các khối u trong cơ thể. Khối u tập hợp
các tế bào phát triển không kiểm soát, xâm lấn và chèn ép vào các cơ quan tổ
chức xung quanh. Nếu các tế bào này chỉ phát triển tại chỗ, không lan rộng
trong cơ thể thì đó là khối u lành tính (benign tumor). Còn nếu các tế bào này
có các biến đổi bất thường về bộ máy di truyền làm thay đổi hình dạng và bản
chất bề mặt tế bào thì sẽ hình thành nên các khối u ác tính. Các tế bào ung thư
này có xu hướng lan rộng ra các nội quan lân cận cũng như theo đường máu và
bạch huyết đến các vị trí xa trong cơ thể để hình thành nên các khối u mới. Hiện
tượng này được gọi là di căn và thường xảy ra vào giai đoạn muộn của bệnh.
Hiện nay có khoảng 200 bệnh ung thư khác nhau, trong đó ung thư nhi chiếm
khoảng 2% tổng số các loại ung thư.
Mặc dù ung thư nhi, với một tỷ lệ nhỏ như vậy, không phổ biến, nhưng
đây chính là nguyên nhân thứ hai gây ra tử vong ở trẻ em, xếp sau tai nạn ở các
nước phương Tây hay các bệnh truyền nhiễm ở các nước đang phát triển. Có
khoảng 130 trẻ mắc ung thư mới trên 1 triệu trẻ em nhỏ hơn 15 tuổi mỗi năm.
Kết quả điều trị ung thư ở trẻ em đã được cải thiện một cách đáng kể và hiện
nay có trên 75% số ca được điều trị thành công.
U NBTK là loại ung thư chủ yếu xảy ra ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (dưới 6
tuổi), hiếm khi tìm thấy trên trẻ hơn 10 tuổi. Đây là loại ung thư đứng thứ 6
trong số các ung thư nhi xếp sau bệnh bạch cầu, u não… Khối u NBTK là khối
u có biểu hiện lâm sàng phụ thuộc vào các đặc điểm sinh học bao gồm tuổi

chẩn đoán, giai đoạn bệnh, tính chất mô bệnh học và các biến đổi trong bộ máy
di truyền. Một số bất thường gen và nhiễm sắc thể đặc hiệu được sử dụng rộng
rãi trên thế giới trong việc tiên lượng, phân nhóm nguy cơ và lựa chọn phác đồ
cho bệnh nhân nhi mắc u NBTK. Đó là khuếch đại gen MYCN hay các biến đổi
nhiễm sắc thể. Khuếch đại gen MYCN, dạng đột biến làm tăng số lượng bản sao
11


của gen lên nhiều lần, là yếu tố di truyền được sàng lọc đầu tiên. Các bệnh nhân
mang đột biến này đều có tiên lượng xấu, cần phải được điều trị bằng phác đồ
mạnh. Một trong những kỹ thuật di truyền đang được sử dụng phổ biến để phát
hiện đột biến gen này là kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ. Các biến đổi nhiễm
sắc thể, như mất đoạn cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1, mất đoạn cánh ngắn nhiễm
sắc thể số 11, thêm đoạn cánh dài nhiễm sắc thể số 17…, là yếu tố góp phần
quan trọng vào việc lựa chọn phác đồ điều trị cho các bệnh nhân nguy cơ thấp,
phụ thuộc vào dạng biến đổi là số lượng hay cấu trúc bộ nhiễm sắc thể. Có
nhiều kỹ thuật di truyền được sử dụng để phát hiện các biến đổi này như kỹ
thuật kỹ thuật khuếch đại đa mồi dựa vào phản ứng nối (MLPA) hay kỹ thuật
lai so sánh hệ gen (CGH). Việc phát hiện các biến đổi di truyền này ở Việt Nam
vẫn chưa được thực hiện, gây nhiều khó khăn cho các bác sĩ lâm sàng trong
việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cho bệnh nhân. Vì vậy, từ nhiều năm
nay, nhu cầu xét nghiệm di truyền cho bệnh u NBTK luôn được đặt ra.
Xuất phát từ yêu cầu lâm sàng thực tiễn như vậy, đề tài nghiên cứu
“Nghiên cứu một số biến đổi di truyền và mối liên quan với các yếu tố tiên
lượng, định hướng điều trị bệnh nhân u nguyên bào thần kinh” được tiến hành
với các mục tiêu sau:
1. Phát hiện một số biến đổi di truyền trên bệnh nhân nhi mắc bệnh u
nguyên bào thần kinh.
2. Xác định mối liên quan giữa các biến đổi di truyền với một số yếu tố
tiên lượng và định hướng điều trị u nguyên bào thần kinh.

Nội dung nghiên cứu của luận án
1. Nghiên cứu một số biến đổi di truyền của bệnh u NBTK
- Phát hiện khuếch đại gen MYCN trên tất cả các bệnh nhân u NBTK
bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ.
- Phát hiện các biến đổi nhiễm sắc thể trên một số bệnh nhân u NBTK
nguy cơ thấp bằng kỹ thuật MLPA.
12


- Phát hiện biến đổi bộ nhiễm sắc thể trên một số bệnh nhân u NBTK
nguy cơ thấp bằng lai so sánh hệ gen.
2. Nghiên cứu mối liên quan giữa khuếch đại gen MYCN với một số yếu
tố tiên lượng.
Phân tích mối liên quan giữa khuếch đại gen MYCN với tuổi chẩn đoán,
giới tính, giai đoạn bệnh, nồng độ VMA, HVA, LDH, trạng thái biệt hóa của tế
bào và tiên lượng mô bệnh học bằng các đánh giá thống kê.
3. Áp dụng kết quả phân tích biến đổi di truyền trong định hướng điều trị
bệnh u NBTK.
Khuếch đại gen MYCN và kết quả biến đổi bộ nhiễm sắc thể cùng với
các đặc điểm sinh học khác của khối u NBTK được sử dụng trong phân nhóm
nguy cơ theo hướng dẫn của tổ chức u NBTK quốc tế và lựa chọn cách thức
điều trị tối ưu cho bệnh nhân theo phác đồ của tổ chức Ung thư nhi Quốc tế.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn luận án
- Cung cấp thông tin về biến đổi gen/ nhiễm sắc thể trên các bệnh
nhân u NBTK, từ đó xây dựng cơ sở dữ liệu về di truyền tại Việt Nam.
- Xác định mối liên quan giữa biến đổi di truyền với một số yếu tố có
giá trị tiên lượng khác trong bệnh u NBTK, hỗ trợ các nhà lâm sàng trong tiên
lượng bệnh.
- Áp dụng các biến đổi di truyền trong điều trị bệnh u NBTK, góp
phần phân nhóm bệnh nhân, lựa chọn phác đồ tối ưu (giảm lượng hóa chất, điều

trị đích…) để đạt được kết quả điều trị tốt nhất cho từng bệnh nhân. Đây chính
là xu hướng cá nhân hóa trong điều trị ung thư hiện đại.
Tính mới của luận án
- Các biến đổi di truyền có giá trị tiên lượng trên khối u NBTK được
xác định bằng các kỹ thuật di truyền hiện đại, lần đầu tiên được áp dụng tại Việt
Nam. Sự khuếch đại gen MYCN, đột biến di truyền được sàng lọc trước hết,
được phát hiện bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ. Các biến đổi nhiễm sắc
13


thể trên một số bệnh nhân không khuếch đại gen MYCN lần đầu tiên được đánh
giá bằng kỹ thuật MLPA và kỹ thuật lai so sánh hệ gen. Các kết quả này góp
phần vào việc phân loại bệnh nhân theo nhóm nguy cơ và đưa ra tiên lượng
điều trị.
- Các đặc điểm về di truyền của khối u NBTK được sử dụng vào việc
định hướng điều trị phù hợp cho các bệnh nhân u NBTK. Nhóm bệnh nhân có
khuếch đại gen MYCN được điều trị theo phác đồ nguy cơ trung bình hoặc cao,
tùy thuộc vào giai đoạn bệnh. Còn với các bệnh nhân không có khuếch đại gen
MYCN và ở nhóm nguy cơ thấp, kết quả phân tích bộ nhiễm sắc thể là yếu tố

quan trọng trong việc quyết định điều trị hóa chất hay có thể chỉ cần theo dõi
định kỳ bệnh nhân. Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam có ý nghĩa định
hướng cá nhân hóa điều trị cho bệnh nhân u NBTK, giúp giảm bớt độc tính và
cho kết quả tốt.

14


1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát về u nguyên bào thần kinh
1.1.1. Tỷ lệ mắc
U NBTK lại là dạng ung thư phổ biến nhất được chẩn đoán trong năm
đầu tiên của cuộc đời [15]. Tỷ lệ mắc mới của u NBTK là 10,2 ca trên một triệu
trẻ em dưới 15 tuổi [16]. Hàng năm có khoảng 700 ca mới ở Hoa Kỳ [73], 150
ca mới ở Pháp [105], 50-60 ca mới tại Bệnh viện Nhi Trung ương, Việt Nam .
Mặc dù chỉ chiếm tỷ lệ khoảng 6%, u NBTK lại là nguyên nhân của 15% số ca
tử vong do ung thư ở trẻ em [89].
Tuổi chẩn đoán trung bình cho u NBTK là khoảng 18 tháng [56]. Một
vài trường hợp thậm chí còn có thể phát hiện dưới siêu âm ngay từ giai đoạn
bào thai. Gần 90% số trường hợp mắc u NBTK là dưới 5 tuổi, hiếm bệnh nhân
trên 10 tuổi.
1.1.2. Nguyên nhân hình thành khối u nguyên bào thần kinh
Nguyên nhân của phần lớn khối u NBTK hiện nay vẫn chưa biết rõ [14].
Khối u này hình thành khi các NBTK không thể biệt hóa hoàn toàn thành các
tế bào thần kinh hay tế bào tủy thượng thận. Thay vào đó, chúng liên tục lớn
lên và phân chia không kiểm soát. Tại thời điểm khối u đã có kích thước đủ lớn
để gây ra các triệu chứng bệnh, nó không thể biệt hóa tiếp nữa mà phát triển và
di căn nếu không được điều trị.
Sự kiện một số nguyên bào thần kinh không thể biệt hóa và dừng phân
chia là do kết quả các bất thường di truyền trong tế bào [100], dẫn đến việc bật
các gen tiền ung thư (thường là các gen giúp tế bào lớn lên, phân chia hoặc tồn
tại) và tắt các gen ức chế khối u (là các gen làm chậm sự phân chia hoặc làm
cho tế bào chết đúng thời điểm). Các biến đổi di truyền đó có thể do di truyền
từ bố mẹ, hoặc phát sinh mới trong đời sống cá thể.
Khoảng 8% các khối u NBTK có tính chất gia đình. Đó thường là các
15


bệnh nhân có tuổi chẩn đoán sớm (9 tháng) và đột biến gen ALK và/hoặc

PHOX2B di truyền từ bố mẹ [56]. Còn lại là các khối u không có nguyên nhân
di truyền, mặc dù 10% đến 15% khối u nhóm này có đột biến gen ALK [67].
Một vài biến đổi gen có tác động làm tăng tốc độ phát triển của một khối
u NBTK. Ví dụ, khuếch đại gen tiền ung thư MYCN làm khối u phát triển nhanh
và khó điều trị, đột biến gen ức chế khối u ATRX gặp ở các khối u tiến triển
chậm nhưng lại đáp ứng không tốt với điều trị [77].
1.1.3. Phôi thai học u nguyên bào thần kinh
U NBTK là dạng khối u có nguồn gốc phôi bào của hệ thần kinh giao
cảm. Tế bào khởi đầu khối u là những tế bào tiền thân đang phát triển và chưa
biệt hóa hoàn toàn, bắt nguồn từ mô mào thần kinh [99]. Chính vì thế, u NBTK
thường xảy ra ở trẻ nhỏ, và xuất hiện ở nhiều vị trí khác nhau như cổ, ngực,
bụng và tiểu khung. Các biểu hiện lâm sàng rất đa dạng phụ thuộc vào vị trí u
tiên phát và các biểu hiện di căn [79]. Một mặt, u NBTK giải thích cho trạng
thái bệnh và tỷ lệ tử vong không cân đối giữa các loại ung thư trẻ em. Mặt khác
nó biểu hiện tỷ lệ thoái triển ngẫu nhiên cao nhất trong tất cả các loại ung thư
của con người. Mặt khác, kết quả điều trị trên các bệnh nhân u NBTK đã được
cải thiện. Tỷ lệ sống trong vòng 5 năm đã tăng từ 52% trong giai đoạn 19751977 lên đến đến 74% từ 1999 đến 2005, tập trung ở nhóm bệnh nhân nguy cơ
không cao. Trong khi đó, tỷ lệ này ở nhóm bệnh nhân nguy cơ cao chỉ có sự
gia tăng khiêm tốn bất chấp sự cải tiến không ngừng các liệu pháp điều trị [56].
1.1.3.1. Sự thoái triển ngẫu nhiên
Sự thoái triển ngẫu nhiên của ung thư được mô tả là sự giảm về kích
thước hoặc biến mất hoàn toàn toàn một khối u tiên phát cũng như ở bệnh ung
thư đã di căn mà không cần có sự can thiệp về điều trị. U NBTK được xem như
một loại ung thư có diễn ra sự thoái triển ngẫu nhiên phổ biến, thông qua sự
chết hàng loạt các tế bào thần kinh trung ương và ngoại vi còn chưa biệt hóa
trong quá trình phát triển phôi (xem hình 1.1). Tuy nhiên, tỷ lệ u NBTK thoái
16


triển ngẫu nhiên vẫn còn chưa rõ ràng [27, 41].

Nguồn: [28]

Hình 1.1. Bốn con đường của sự thoái triển ngẫu nhiên
(1) sự thiếu hụt neurotrophin làm khởi động chết theo chương trình trong quá
trình phát triển; (2) các tế bào bị tiêu diệt bởi các kháng thể kháng u NBTK
và các tế bào diệt tự nhiên; (3) quá trình làm ngắn đầu mút và chết theo
chương trình được kích hoạt bởi nồng độ thấp hay không có enzym
telomerase; (4) các biến đổi epigenetics trong sự biểu hiện gen được kiểm
soát bởi sự methyl hóa DNA, cải biến histone hay thay đổi trong quá trình
hình thành chất nhiễm sắc [27].
1.1.3.2. Sự biệt hóa
Biệt hóa là một hiện tượng đặc biệt khác xảy ra trên khối u NBTK, ở đó
các tế bào NBTK biệt hóa từ dạng tiền thân thành dạng trưởng thành, khi đó
khối u NBTK chuyển thành khối u hạch thần kinh lành tính. Các đặc điểm di
truyền của các tế bào NBTK đang trưởng thành hoặc các tế bào hạch giống với
các NBTK đang thoái triển, ví dụ như gen MYCN không bị đột biến, không mất
đoạn cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 và có bộ nhiễm sắc thể gần tam bội. Sự biệt
17


hóa này có thể là ngẫu nhiên hoặc xuất hiện sau hóa trị. Tỷ lệ các khối u NBTK
đi theo con đường biệt hóa là thấp hơn các khối u thoái triển theo con đường
chết theo chương trình [41, 64].
1.1.3.3. Sự tăng trưởng ác tính
Phần lớn các khối u NBTK ở giai đoạn muộn rất khó thoái triển hoặc tiếp
tục biệt hóa. Đồng thời có một phần không nhỏ các khối u giai đoạn Ms đã tiến
triển thành giai đoạn M (xem thêm phần 1.2.1). Rõ ràng, có một liên kết chặt
chẽ giữa sự tăng trưởng ác tính của khối u với các đặc điểm di truyền bất lợi
như khuếch đại gen MYCN, nhiều thay đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể và bộ

nhiễm sắc thể lưỡng bội/ tứ bội [41].
1.1.4. Mô bệnh học u nguyên bào thần kinh
Các khối u ngoại vi thần kinh gồm có 2 thành phần tế bào là các NBTK
(neuroblastic cells)/tế bào hạch (ganglionic cells) và các tế bào đệm Schwann
(Schwannian cells). Các NBTK ở khối u sản sinh ra chất kích thích phân bào
quan trọng cho các tế bào Schwann tăng sinh và phát triển. Ngược lại, các tế
bào Schwann lại có thể tiết ra các nhân tố kìm hãm tăng sinh và cảm ứng biệt
hóa thiết yếu cho quá trình biệt hóa của các tế bào thần kinh. Chính sự tương
tác qua lại giữa các NBTK với các tế bào mô đệm Schwann này giải thích cho
quá trình trưởng thành của các khối u ngoại vi thần kinh thuận lợi về mặt sinh
học. Còn các khối u không thuận lợi về mặt sinh học nhìn chung có ít thành
phần mô đệm và sự trưởng thành của khối u cũng bị hạn chế [112].
Các khối u NBTK được đánh giá mức độ trưởng thành theo các nhóm
tuổi dựa theo 2 đặc điểm hình thái là mức độ biệt hóa của các NBTK và mức
độ phát triển của các tế bào đệm Schwann. Đại đa số các trường hợp có thể
chẩn đoán thông qua phân tích hình ảnh tế bào học trên tiêu bản nhuộm HE
thông thường. Chỉ có một nhóm nhỏ cần thêm các dấu ấn miễn dịch huỳnh
quang để khẳng định chẩn đoán.
U NBTK (neuroblastoma) là khối u có thành phần mô đệm Schwann
18


chiếm dưới 50% toàn bộ khối u. Có 3 mức độ biệt hoá là chưa biệt hoá, ít biệt
hoá và đang biệt hóa. U NBTK chưa biệt hóa (undifferentiated neuroblastoma)
(chiếm 2-3% tổng số u NBTK) đặc trưng bởi các tế bào u chưa biệt hóa, kích
thước nhỏ hoặc trung bình, vành bào tương không rõ ranh giới, nhân có nhiều
hình dạng (hình tròn hay dài) và có thể chứa nhiều hạch nhân, không có các sợi
tơ thần kinh. U NBTK ít biệt hóa (poorly differentiated neuroblastoma) (chiếm
khoảng 65-75% các u NBTK) là các khối u dưới 5% tế bào có các dấu hiệu biệt
hóa cùng với sự xuất hiện các sợi tơ thần kinh. U NBTK đang biệt hóa

(differentiating neuroblastoma) (khoảng 5% các u NBTK) thường có nhiều sợi
tơ thần kinh với trên 5% tế bào đang ở các mức độ biệt hóa khác nhau. Sự biệt
hóa của tế bào thể hiện ở cả nhân (nhân rộng, lệch tâm, chất nhiễm sắc hình túi
và một hạch nhân lồi lên) và bào tương (ưa kiềm, có hai quai) [42].
U hạch nguyên bào thần kinh bao gồm 2 týp là thể hỗn hợp và thể nốt. U
hạch NBTK thể hỗn hợp (ganglioneuroblastoma, intermixed) (khoảng 2-3%
các u NBTK) là các khối u giàu mô đệm Schwann với những ổ vi thể các NBTK
ở các giai đoạn biệt hóa khác nhau cùng nhiều sợi tơ thần kinh phân bố ngẫu
nhiên, nhưng thành phần biệt hóa phải chiếm trên 50% toàn khối u. U hạch
NBTK thể nốt (ganglioneuroblastoma, nodular) (chiếm 7-8% các u NBTK)
thường là các ổ NBTK (nghèo mô đệm Schwann) kèm theo u hạch NBTK hỗn
hợp (giàu mô đệm Schwann) và u hạch thần kinh (chủ yếu là mô đệm
Schwann), với dấu hiệu đặc trưng là đường phân ranh giới dốc đứng giữa nốt
NBTK và mô đệm Schwann phản ánh quá trình phát triển nhanh của các tế bào
ác tính làm tắc nghẽn thành phần mô đệm Schwann [112].
U hạch thần kinh (ganglioneuroma) (thấp hơn 1% các u NBTK) bao gồm
u hạch thần kinh đang biệt hóa và u hạch thần kinh biệt hóa. U hạch thần kinh
đang biệt hóa là các u mà thành phần mô đệm Schwann chiếm ưu thế chủ yếu
kèm theo các tế bào đang biệt hóa và đã biệt hóa hoàn toàn. U hạch thần kinh
biệt hóa bao gồm mô đệm Schwann và các tế bào hạch trưởng thành, không có
19


thành phần NBTK.
Ngoài ra có khoảng 4-5% các u NBTK không xếp loại được (u NBTK
không đặc hiệu) [112].
Căn cứ vào tuổi chẩn đoán, mức độ biệt hóa của khối u, chỉ số nhân
chia/nhân tan, và nốt canxi hóa, Hiệp hội Giải phẫu bệnh u NBTK Quốc tế chia
u NBTK thành 2 nhóm tiên lượng là mô bệnh học thuận lợi và mô bệnh học
không thuận lợi [72, 95]. Nhóm mô bệnh học thuận lợi gồm các khối u NBTK

ít biệt hóa hoặc đang biệt hóa ở trẻ nhỏ tuổi với chỉ số nhân chia/nhân tan thấp.
Tỷ lệ sống không bệnh trong 3 năm là 85%. Ngược lại, các khối u NBTK không
biệt hóa, ít biệt hóa hoặc đang biệt hóa ở trẻ lớn kèm chỉ số nhân chia/nhân tan
cao đều được xếp vào nhóm mô bệnh học không thuận lợi với tỷ lệ sống không
bệnh trong 3 năm chỉ khoảng 41% [95]. Đây là một trong các yếu tố quan trọng
trong việc lựa chọn chiến lược điều trị của các nhà lâm sàng.
1.2. Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng u nguyên bào thần kinh
1.2.1. Một số đặc điểm lâm sàng bệnh u nguyên bào thần kinh
U nguyên bào thần kinh là một bệnh lý có đặc điểm lâm sàng đa dạng. Tuổi
chẩn đoán, giai đoạn, vị trí nguyên phát cũng như di căn, đặc điểm về hình ảnh là
những yếu tố lâm sàng có nhiều ý nghĩa trong việc điều trị và tiên lượng bệnh.
Độ tuổi chẩn đoán đã được xác định có quan hệ với kết quả điều trị ngay
từ thời điểm ban đầu nghiên cứu và chẩn đoán bệnh u NBTK. Tuổi chẩn đoán
nhỏ hơn 1 tuổi là một yếu tố tiên lượng thuận lợi do các bệnh nhân ở tuổi này
có khả năng điều trị tốt hơn so với các bệnh nhân nhi lớn tuổi [95]. Các nghiên
cứu về tuổi tiếp theo đều diễn ra trên trẻ lớn hơn 1 tuổi. Ba nghiên cứu của
George [47], London [66], Schmidt [88] cùng trong năm 2005 cho thấy có sự
khác nhau về tỷ lệ sống không bệnh giữa các bệnh nhân dưới 18 tháng và trên
18 tháng tuổi. Từ đó, 18 tháng được lựa chọn như một điểm cắt về tuổi thứ hai
để phân biệt các nhóm tiên lượng khác nhau [36]. U NBTK ở trẻ lớn (>13 tuổi)
và người lớn (khoảng 3% tổng số ca) có một số khác biệt về đặc điểm sinh học
20


khác với ở trẻ em như rất hiếm gặp khuếch đại gen MYCN, tỷ lệ dương tính của
catecholamine niệu thấp, ít khi thấy chỉ số LDH huyết thanh tăng cao với tiên
lượng bệnh xấu. Điều này là do sự tiến triển lặng lẽ và kéo dài, hay gặp tái phát
muộn của u NBTK ở trẻ lớn và người lớn, phần lớn dẫn đến tử vong [95].
Khối u NBTK nguyên phát có thể phát triển từ bất cứ vị trí nào của hệ
thần kinh giao cảm (bụng, trung thất, cổ hay tiểu khung). Trẻ lớn thường gặp

khối u ở tuyến thượng thận, trong khi trẻ nhỏ hay gặp ở trung thất hoặc ở cổ.
Các khối u ở vùng bụng thường gây ra chướng bụng, đau bụng, nôn và kém ăn,
đôi khi chèn ép mạch máu gây phù nề chi dưới hoặc huyết áp cao. Các khối u
vùng ngực khó phát hiện hơn, thường tình cờ phát hiện khi bệnh nhân chụp X
quang tim phổi. Ngoài ra, có khoảng 5-16% số ca u NBTK nằm cạnh cột sống
có thể phát triển lan qua các lỗ giữa thân cột sống xâm lấn vào màng cứng hoặc
nội tủy của tủy sống gây nên hội chứng chèn ép rễ thần kinh hay tủy sống. Các
bệnh nhân này có thể có các triệu chứng như đau, mất cảm giác, giảm vận động
hoặc liệt các chi [6]. Khoảng 1-5% các trường hợp không tìm thấy u tiên phát.
Tế bào u NBTK hoặc theo con đường bạch huyết di căn vào hạch lympho
khu vực hay hạch xa, hoặc theo đường máu di căn vào tủy xương, xương, gan,
da. Ngoài ra, một biểu hiện di căn khác của u NBTK là lồi mắt, u ở đầu (di căn
vào hốc mắt/sọ). Biểu hiện di căn trên lâm sàng ở trẻ dưới 1 tuổi có một số đặc
điểm khác biệt với trẻ lớn: di căn gan và da, có khả năng thoái triển ngẫu nhiên,
và tiên lượng tốt [21]. Khoảng hơn 50% số ca, đặc biệt là các bệnh nhân hơn 1
tuổi và có khuếch đại gen MYCN xuất hiện di căn tại thời điểm chẩn đoán [81].
Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh như siêu âm, chụp cắt lớp vi tính,
chụp cộng hưởng từ cho phép khảo sát khối u nguyên phát để đánh giá khả
năng phẫu thuật cắt bỏ; phát hiện di căn xa để phân loại giai đoạn bệnh; hướng
dẫn cho thủ thuật sinh thiết khối u bằng kim nhỏ; và là công cụ theo dõi, đánh
giá tiến triển bệnh trong quá trình điều trị (chụp nhấp nháy đồ bằng metaiodobenzyl-guanidine (MIBG) với đồng vị phóng xạ 123I) [76]. Từ năm 2011,
21