nghiên cứu sự đột biến gene k-ras và mối liên quan đột biến gene k-ras với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng bản tóm tắt

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là bệnh phổ biến trên thế giới và là nguyên nhân gây tử vong cao hàng thứ 3 trong các tử
vong do ung thư (UT) nói chung. Theo Hiệp hội phòng chống UT quốc tế (Union for International Cancer Control - UICC), ước
tính trên thế giới mỗi năm có khoảng 1.000.000 trường hợp UTĐTT mới được phát hiện và khoảng hơn 500.000 người chết vì
căn bệnh này. Tỉ lệ mắc bệnh giữa các vùng miền, các châu lục có sự khác nhau. Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ 5 sau các UT
của dạ dày, phổi, vú và vòm họng. Trong UT đường tiêu hóa thì UTĐTT đứng thứ 2, sau UT dạ dày. Theo thống kê của Bệnh
viện K Hà Nội, tỉ lệ mắc UTĐTT là 9% tổng số bệnh nhân (BN) UT nói chung. Tuy nhiên, so với các UT của đường tiêu hóa thì
UTĐTT là loại có tiên lượng tốt nhất.
Cơ chế hình thành và phát triển của UTĐTT là do biến đổi và tích lũy các gen trong tế bào của niêm mạc đại trực tràng
(ĐTT). Sự tích lũy dần các biến dị di truyền thường phải trải qua nhiều năm (từ 10 - 20 năm), và điều này phù hợp với các nghiên
cứu dịch tễ học di truyền về diễn biến của UTĐTT trải qua nhiều bước.
Sự phát triển vượt bậc của ngành Công nghệ y sinh, hiện nay đã cho phép xác định tương đối chính xác, đầy đủ và nhanh
hầu như tất cả các dạng đột biến quan trọng trong những dòng tế bào UT phổ biến như UT phổi, u lympho ác tính, UTĐTT….
Điều đáng ngạc nhiên là mặc dù mang nhiều đột biến nhưng khả năng phát triển của tế bào UT dường như lại lệ thuộc chủ yếu
vào nguồn tín hiệu sinh trưởng của một hoặc một nhóm gen sinh UT (oncogene) nhất định. Những oncogene này mã hóa các
protein đóng vai trò mắt xích trong các con đường tín hiệu nội bào. Những đột biến này làm cho các tế bào UT có khả năng tăng
sinh vô hạn, liên tục phân chia và thực hiện quá trình xâm lấn, di căn… Tuy nhiên, chính đặc điểm này cũng làm phơi bày “gót
chân Achilles” của tế bào UT. Bằng việc “đánh sập” các oncogene chủ chốt như HER2, K-RAS, β-catenin, cyclin E, B-Raf… bằng
công nghệ iRNA, các nhà khoa học đã thành công trong việc ức chế sự phát triển của nhiều loại tế bào UT in vitro [49]. Những
nghiên cứu trên mô hình chuột biến đổi gen tiếp tục khẳng định tầm quan trọng của các gen đích trong nhiều bệnh UT, trong đó
2
có oncogene K-ras trong UTĐTT Từ những bằng chứng trên, một thế hệ mới các thuốc điều trị UT có khả năng tác động chính
xác tới các đích tiềm năng trong tế bào UT đã ra đời - đó là liệu pháp điều trị đích.
Ở Việt Nam, cũng đã có nhiều nghiên cứu về UTĐTT, nhưng chủ yếu là về đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi và mô
bệnh học (MBH), còn ít thấy có những nghiên cứu về đột biến gen trong UT nói chung và trong UTĐTT nói riêng. Vì vậy, đề tài
“Nghiên cứu đột biến gen K-RAS và mối liên quan với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thư đại trực tràng”
được tiến hành nhằm 2 mục tiêu chính sau:
1. Nghiên cứu tình trạng đột biến gen K-RAS ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng.
2. Tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với một số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh và
nồng độ CEA ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng.

Luận án dài 109 trang, trong đó: Đặt vấn đề: 2 trang, Tổng quan: 34 trang, Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 17
trang, Kết quả nghiên cứu: 29 trang, Bàn luận: 25 trang. 26 bảng, 10 biểu đồ, 13 hình.
Luận án tham khảo 147 tài liệu, trong đó: Tiếng Việt: 30 tài liệu; Tiếng Anh: 117 tài liệu.

3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Gen và ung thư đại trực tràng
Từ những nghiên cứu về cơ chế phát sinh và phát triển UTĐTT có sự liên quan đến sự biến đổi các gen tham gia vào sự
chuyển dạng từ tế bào lành sang tế bào UT. Các gen này được chia thành 3 nhóm: gen UT, gen ức chế UT và các gen sửa chữa
DNA. Để hình thành UT phải có sự đột biến ở cả 2 nhóm gen UT và gen ức chế UT. Khi gen tiền UT bị đột biến thành gen UT
và gen ức chế UT bị bất hoạt hoặc bị tổn thương, lúc đó các tín hiệu cho tế bào phát triển vượt quá các tín hiệu điều hòa thì sự
phát triển của tế bào sẽ nhanh chóng vượt khỏi tầm kiểm soát và ung thư hình thành .
1.1.1. Các gen ung thư
Gen RAS; Giảm methyl hóa DNA; Gen C-MYC
1.1.2. Các gen áp chế ung thư
Gen APC;. Gen P53; Gen MCC; Gen DCC; Gen R11; Gen SMAD4
1.1.3. Các gen sửa chữa lỗi ghép cặp sai (DNA-mismatch repair)
1.2. Gen K-RAS và ung thư đại trực tràng
1.2.1. Gen K-RAS
Kể từ khi được phát hiện ra từ những thập niên 70 của thế kỉ 20, cấu trúc, chức năng và vai trò của gen K-RAS ngày càng
được sáng tỏ.
1.2.1.1. Cấu trúc gen K-RAS
4
Gen K-RAS nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 12, ở vị trí 12.1: (12p12.1). Cụ thể là các gen K-RAS nằm từ nucleotid
25358179 đến nucleotid 25403853 trên nhiễm sắc thể 12.
1.2.1.2. Chức năng của gen K-RAS
Gen K-RAS là các gen sinh UT, mỗi gen K-RAS mã hóa cho một protein tham gia chủ yếu trong việc điều hành phân chia tế bào.
Thông qua một quá trình truyền tín hiệu (transduction), protein truyền tín hiệu từ ngoài tế bào vào đến nhân tế bào. Các tín hiệu này
kích hoạt tế bào để phát triển và phân chia hoặc trưởng thành với những chức năng chuyên biệt. Các protein K-RAS là một GTPase.

GTPase là một enzym có chức năng chuyển đổi một phân tử gọi là GTP (Guanosine-5
,
-Triphosphate) đến một phân tử gọi là GDP
(Guanosine-5
,
-Diphosphate). Các protein K-RAS hoạt động như một chuyển đổi, nó có thể hoạt động (kích hoạt) hay yên nghỉ (bất
hoạt). Để truyền tín hiệu, các protein K-RAS phải được kích hoạt bằng cách gắn vào một phân tử của GTP. Các protein K-RAS được
bất hoạt khi nó chuyển đổi các GTP tới GDP, khi protein kết hợp với GDP, nó không truyền tín hiệu tới nhân tế bào.
Những sản phẩm protein của gen K-RAS đóng vai trò quan trọng trong phân bào, sự khác biệt tế bào và sự chết tế bào theo
chương trình (apoptosis).
1.2.1.3. Cơ chế sinh ung thư của gen K-RAS
Dưới tác dụng của các yếu tố môi trường (bức xạ, hóa chất ), sự đột biến gen K-RAS có thể xảy ra. Khi đột biến, các gen K-
RAS có tiềm năng gây chuyển biến tế bào bình thường thành tế bào UT. Đột biến gen K-RAS làm thay đổi một protein (amino
acid) trong một khu vực quan trọng của protein K-RAS, gây ra các protein để được tiếp tục hoạt động. Thay vì kích hoạt sự tăng
trưởng tế bào để phản ứng lại các tín hiệu đặc biệt từ bên ngoài tế bào, protein hoạt động quá mức (overactive protein) chỉ đạo
các tế bào phát triển và phân chia không ngừng. Trong quá trình phát triển phôi, các protein K-RAS hoạt động quá mức phá vỡ sự
phát triển bình thường và trở thành các mô nhất định.
Một số đột biến gen được hình thành trong thời gian của mỗi con người và chỉ có mặt trong các tế bào nhất định. Những
thay đổi này gọi là đột biến thân (hay đột biến soma). Sự đột biến soma trong gen K-RAS có liên quan đến sự phát triển của nhiều
5
loại UT. Những đột biến này dẫn đến một protein K-RAS đó là luôn luôn chủ động và có thể tác động trực tiếp đến tế bào để phát
triển và phân chia không có kiểm soát.
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, đột biến gen K-RAS là phổ biến trong UTĐTT.
1.2.2. Các phương pháp xác định đột biến gen K-RAS
Nhiều phương phương pháp khác nhau có thể được áp dụng để xác định đột biến gen K-RAS trên cơ sở tỉ lệ tế bào UT trong
mô phân tích.
- Kỹ thuật giải trình tự gen
- Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)
- Kỹ thuật Scorpions-Amplification Refractory Mutation System (Scorpions ARMS)
- Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp)

1.2.3. Đột biến gen K-RAS và hiệu quả điều trị đích trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng
Đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới được thực hiện nhằm phân tích tình trạng gen K-RAS (mã hóa cho protein
RAS) ở các BN UTĐTT được điều trị bằng cetuximab hoặc panitumumab. Theo thống kê, oncogene KRAS bị đột biến trong hơn
30% các ca UTĐTT. Cho đến nay, có hơn 3000 đột biến điểm trong gen K-RAS đã được báo cáo, trong đó đột biến hay gặp nhất
là đột biến thay thế nucleotit ở codon 12 (chiếm 82%) và codon 13 (chiếm 17%) ở exon 2 của gen K-RAS.
Đột biến tại codon 12 và 13 đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tiến triển bệnh UTĐTT và nguy cơ kháng thuốc ức
chế EGFR của khối u. Đột biến tại những vị trí khác như codon 61 và 146 cũng đã được báo cáo nhưng chiếm tỉ lệ nhỏ và ảnh
hưởng của những dạng đột biến này trên lâm sàng chưa được làm sáng tỏ. Gen K-RAS mã hóa cho một protein G đóng vai trò
truyền tín hiệu nội bào xuôi dòng từ EGFR. Protein G này thuộc họ protein RAS có chức năng truyền tín hiệu từ các thụ thể bề
mặt tế bào tới những đích nội bào thông qua các dòng thác tín hiệu (bao gồm con đường RAS-MAPK). Trong tế bào, protein
RAS được giữ cân bằng thông qua sự hình thành 2 phức hợp tương ứng với các trạng thái của protein RAS: Phức hợp RAS-GTP
6
(protein RAS được hoạt hóa) và phức hợp RAS-GDP (protein RAS bị bất hoạt). Protein RAS được hoạt hóa nhờ yếu tố chuyển
nucleotide guanine (guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Việc truyền tín hiệu của protein RAS bị ức chế khi phức hợp
RAS-GTP bị thủy phân thành phức hợp RAS-GDP nhờ một loại protein có chức năng hoạt hóa GTPase (GAPs). Ở điều kiện sinh
lý bình thường, nồng độ RAS-GTP trong cơ thể được kiểm soát chặt chẽ nhờ sự hoạt động nhịp nhàng của 2 yếu tố GEFs và
GAPs. Khi gen K-RAS bị đột biến sẽ mã hóa cho những protein RAS mới có khả năng chống lại hoạt tính GTPase của GAPs. Do
đó, những protein RAS đột biến này luôn luôn tồn tại ở trạng thái hoạt hóa RAS-GTP. Không giống như các protein RAS kiểu
hoang dại luôn bị bất hoạt sau một khoảng thời gian rất ngắn, các protein RAS đột biến có khả năng kích hoạt vĩnh viễn các con
đường truyền tín hiệu nằm xuôi dòng nó bất kể có sự hoạt hóa của thụ thể EGFR nào hay không. Đây chính là cơ chế phân tử lý
giải cho tình trạng kháng thuốc điều trị đích ở những BN mang khối u bị đột biến gen K-RAS.
1.3. Yếu tố nguy cơ và quá trình phát sinh ung thư đại trực tràng
1.3.1. Các yếu tố nguy cơ
- Tuổi và giới
- Địa dư
- Polype đại trực tràng
- Yếu tố di truyền
- Bệnh viêm ruột
+ Bệnh viêm loét ĐTT chảy máu
+ Bệnh Crohn

'
s.
- Những yếu tố nguy cơ khác
+ Chế độ ăn nhiều mỡ động vật
+ Thừa cân béo phì.
+ Khói thuốc lá
+ Đái tháo đường type II
7
1.3.2. Cơ chế hình thành và phát triển của ung thư đại trực tràng
1.3.2.1. Quá trình phát sinh ung thư đại trực tràng qua nhiều bước
UTĐTT hình thành và phát triển do tích lũy các biến đổi gen trong tế bào biểu mô của niêm mạc của ĐTT. Các biến đổi gen
kết hợp với những tác nhân gây UT sẽ gây đột biến hoặc khiếm khuyết gen, tạo nên UT và làm mất chức năng của gen ức chế
UT. Sự tích lũy dần các biến dị di truyền thường cần phải qua nhiều năm (từ 10 - 20 năm), và điều này phù hợp với các nghiên
cứu dịch tễ học di truyền về diễn biến của phát sinh UTĐTT trải qua nhiều bước.
1.3.2.2. Tính không ổn định vi vệ tinh và các gen sửa chữa DNA
Cơ chế phân tử sinh UTĐTT gần đây được đưa ra là sự nhân lên của các sai sót, hay còn gọi là tính không ổn định của các vi
vệ tinh MSI. Quá trình này có thể xảy ra qua hai giai đoạn kéo dài tách biệt hoặc giao thoa nhau. Sự không ổn định này có thể
xảy ra đối với toàn bộ nhiễm sắc thể hoặc chỉ xảy ra đối với một vùng gen lặp lại gọi là vùng vi vệ tinh (microsatellite). Các
microsatellite là các đoạn lặp lại đặc biệt của DNA. Các trình tự này chứa Cytosine (C) và Adenine (A) hoặc các Dinucleotide
(lặp lại CA). Những trình tự này được tìm thấy rải rác trong toàn bộ gen (genome), tuy nhiên chức năng chính xác của chúng còn
chưa được biết rõ.
1.5. Tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài luận án
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu nhằm phân tích tình trạng đột biến gen K-RAS cũng như hiệu quả đáp ứng thuốc
ức chế EGFR ở BN UTĐTT.
1.5.2. Nghiên cứu ở Việt Nam
Các nghiên cứu về đột biến gen K-RAS ở BN UTĐTT mới chỉ là bước đầu và số lượng BN còn khiêm tốn.
8
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Bệnh nhân UTĐTT được khám lâm sàng, xét nghiệm, nội soi ĐTT và sinh thiết, xét nghiệm MBH cả trước và sau phẫu thuật
điều trị tại Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng, được làm xét nghiệm xác định đột biến gen K-RAS tại Trung tâm Nghiên cứu gen và
protein của Trường Đại học Y Hà Nội.
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân
- Bệnh nhân được khám, xét nghiệm, chẩn đoán xác định UTBMĐTT và được phẫu thuật cắt bỏ khối u triệt căn.
- Kết quả xét nghiệm MBH sau mổ khẳng định là UTBMĐTT.
- Chưa được điều trị hóa chất hoặc xạ trị trước mổ.
- Có kết quả xét nghiệm đột biến gen K-RAS.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Bệnh nhân UTBMĐTT không còn giai đoạn phẫu thuật triệt căn.
- Những trường hợp MBH sau mổ không phải là UTBMĐTT.
- Những trường hợp UTBMĐTT tái phát hoặc đã được điều trị bằng hóa chất, xạ trị trước phẫu thuật.
- Những trường hợp UTBMĐTT có thêm UT khác kèm theo.
- Không có kết quả xét nghiệm đột biến gen K-RAS.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu tiến cứu, mô tả, cắt ngang.
2.2 Cỡ mẫu
Áp dụng theo công thức:
9
n =
).(

2
2
2/1
ε
α
p

qp
z
−
Trong đó: n: số bệnh nhân cần nghiên cứu
Z
2
1-
α
/2
= 1,96
p: tỉ lệ mắc bệnh dựa theo nghiên cứu trước
q = 1 – p
ε = 0,3 (giá trị sai số tương đối)
Theo kết quả nghiên cứu của Stefanius (Phần Lan - 2011), nghiên cứu xác định đột biến gen K-RAS tại codon 12 và 13 ở
BN UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS là 45%. Vì vậy, chúng tôi ước lượng tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở BN mắc UTĐTT là
40% (p = 0,4).
Thay các giá trị vào công thức ta có :
n =
)( 3,04,0
6,04,0
96,1
2
2
X
XX
n = 64
Như vậy, để có độ chính xác 95%, cỡ mẫu nghiên cứu phải có ít nhất là 64 bệnh nhân. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã
chọn được 79 BN đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu.
2.2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 01/2010 đến tháng 7/2012.

2.2.4. Địa điểm nghiên cứu
- Nghiên cứu lâm sàng, nội soi, MBH tại Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng; kết quả MBH được đọc xác định lại tại Khoa
Giải phẫu bệnh - Bệnh viện Trung Ương Quân đội 108.
- Nghiên cứu xác định đột biến gen K-RAS tại Trung tâm Nghiên cứu gen và protein, Trường Đại học Y Hà Nội.
10
2.2.5. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu về nội soi
- Máy nội soi đại tràng ống mềm Olympus CF – Q150I do Nhật Bản sản xuất.
- Kìm sinh thiết: loại có kim cố định.
- Lọ đựng bệnh phẩm có chứa dung dịch formon 10% để ngâm cố định bệnh phẩm.
2.2.6. Nghiên cứu về gen
Kỹ thuật giải trình tự gen:
Sau khi khuyếch đại vùng codon 12, 13 của gen K-RAS bằng kỹ thuật nested PCR, sản phẩm PCR được tinh sạch từ agarose gel
sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA). Sản phẩm PCR sau tinh sạch được đưa vào giải trình tự sử
dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA). Trình tự gen được đối chiếu và so sánh
với trình tự của gen K-RAS hoang dại (wild type) trên GenBank (National center for biotechnology information, NCBI).
2.4. Chỉ tiêu nghiên cứu và tiêu chuẩn đánh giá
2.4.1. Lâm sàng
Các đặc điểm lâm sàng thường gặp:
- Tuổi, giới tính.
- Các triệu chứng lâm sàng chính:
+ Đau bụng: có hay không, vị trí, tính chất đau.
+ Đại tiện: phân có máu, có nhày, “nhày + máu” lẫn lộn.
+ Tính chất phân: lỏng, táo, táo lỏng xen kẽ, sống phân, thay đổi khuôn phân…
+ Các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như: thay đổi thói quen đại tiện, cảm giác đi ngoài không hết phân, chướng hơi…
+ Các triệu chứng khác: gầy sút cân, bán tắc ruột, u ở bụng, thiếu máu (hoa mắt, chóng mặt, da, niêm mạc nhợt).
+ Thời gian từ khi xuất hiện triệu chứng đến khi phát hiện bệnh: dưới 3 tháng, 3 - 6 tháng, 6 - 12 tháng, trên 12 tháng.
2.4.2. Cận lâm sàng
11
2.4.2.1. Xét nghiệm máu
- Các xét nghiệm huyết học và sinh hoá máu thường quy

- Định lượng nồng độ CEA bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trên máy Immuline one của Đức.
2.4.2.2. Nội soi
- Vị trí u: TT, ĐT xích ma, ĐT xuống, ĐT góc lách, ĐT ngang, ĐT góc gan, ĐT lên, manh tràng .
- Đánh giá hình thể khối u: thể sùi, thể loét, thể “loét + sùi” thể thâm nhiễm (thể trai), thể chít hẹp (thể nhẫn) và thể dưới niêm.
- Kích thước khối u so với chu vi lòng ĐTT: dưới 1/4 chu vi, từ 1/4 - 1/2 chu vi, từ 1/2 – 3/4 chu vi và trên 3/4 chu vi.
2.4.4. Hình thái mô bệnh học
* Phân loại UTBM của ĐTT theo phân loại của WHO năm 2000:
- Ung thư biểu mô tuyến:
+ UTBMT biệt hóa cao
+ UTBMT biệt hóa vừa hay trung bình
+ UTBMT biệt hóa thấp
- UTBM tuyến nhầy
- UTBM tế bào nhẫn
- UTBM tế bào vảy/dạng biểu bì
- UTBM tuyến vảy
- UTBM tủy
- UTBM không biệt hóa
* Đánh giá độ ác tính của khối u bao gồm: độ ác tính thấp và độ ác tính cao.
* Đánh giá mức độ xâm lấn của u theo chiều sâu vào thành ĐTT theo T (Tumor).
2.4.5. Chẩn đoán di căn hạch
12
- Tất cả các hạch phẫu tích được từ bệnh phẩm sau phẫu thuật đều được xét nghiệm MBH.
- Chẩn đoán MBH của hạch: các hạch nhỏ < 0,5 cm được chuyển đúc cả hạch, các hạch lớn > 1cm được cắt mỏng 2 mm qua
thiết diện lớn nhất của hạch trước khi cố định và xử lý. Xác định hạch di căn khi có cấu trúc UT xâm nhập trong mô hạch.
- Xác định BN có di căn hạch khi kết quả MBH có 01 hạch di căn trở lên.
2.4.6. Đánh giá kết quả xét nghiệm sự đột biến gen K-RAS
- Có đột biến:
+ Vị trí đột biến: xác định đột biến tại codon 12 và codon 13.
+ Kiểu đột biến: xác định kiểu đột biến kiểu thay thế GGT → GAT và kiểu thay thế GGT → GTT.
+ Dạng đột biến: đồng hợp tử; dị hợp tử.

- Không đột biến.
2.6. Phương pháp xử lý số liệu
- Các thông tin về BN và số liệu nghiên cứu thu thập từ phiếu nghiên cứu đã được thiết kế thống nhất từ trước, được nhập vào
máy tính, sau đó xử lý số liệu phần lâm sàng, nội soi, MBH bằng phần mềm SPSS statistics 20.
- Tính tần xuất, tỉ lệ phần trăm, so sánh số liệu từng cặp, kiểm định χ
2
, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
13
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu 79 trường hợp UTBMĐTT được khám lâm sàng, nội soi ĐTT ống mềm, xét nghiệm MBH, định lượng nồng
độ CEA và phẫu thuật tại Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp Hải Phòng từ tháng 1/2010 đến 7/2012. Tất cả những BN này đều được
làm xét nghiệm xác định sự đột biến gen K-RAS tại Trung tâm Nghiên cứu gen và protein, Trường Đại học Y Hà Nội, kết quả thu
được như sau:
3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu
Bảng 3.1. Phân bố bệnh nhân theo tuổi
Nhóm tuổi N = 79 Tỷ lệ %
< 30 2 2,5
30 - 39 1 1,3
40 - 49 7 8,9
50 - 59 20 25,3
60 - 69 26 32,9
70 - 79 20 25,3
≥ 80
3 3,8
Tổng 79 100
Nhận xét: Tuổi mắc bệnh trung bình là 61,7 ± 12,3; tuổi của BN thấp nhất 21, cao nhất là 81 tuổi; bệnh gặp chủ yếu ở tuổi
từ 50 - 79 (83,5%); nhóm tuổi gặp nhiều nhất là từ 60 - 69 (32,9%).
14
Biểu đồ 3.1. Phân bố tỉ lệ bệnh nhân theo giới tính

Nhận xét: Tỉ lệ mắc bệnh UTĐTT ở nam giới là 60,8% - cao hơn so với nữ (39,2%); tỉ lệ nam/nữ là 1,55/1.
3.2. Đột biến gen K-RAS ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng
3.2.1. Tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng
Bảng 3.10. Tỉ lệ đột biến gen K-RAS
Đột biến N = 79 Tỉ lệ %
Có đột biến 46 58,2
Không đột biến 33 41,8
Tổng 79 100
Nhận xét: Tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở BN UTĐTT là 58,2%. Tất cả đều đột biến dạng dị hợp tử.
Bảng 3.11. Đột biến gen K-RAS theo giới tính
p < ,05
15
Giới
Có đột biến Không đột biến Tổng
p
n (%) n (%) N (%)
Nam 29 (63,0) 19 (57,6) 48 (60,8)
> 0,05
Nữ 17 (37,0) 14 (42,4) 31 (39,2)
Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100)
Nhận xét: Đột biến gen K-RAS ở nam chiếm tỉ lệ 63,0%; ở nữ chiếm tỉ lệ 37,0%.
Bảng 3.12. Đột biến gen K-RAS theo nhóm tuổi
Tuổi
Có đột biến Không đột biến Tổng
p
n (%) n (%) N (%)
16
≤ 40 4 (8,7) 1 (3,0) 5 (6,3)
> 0,05
> 40 42 (91,3) 32 (97,0) 74 (93,7)

Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100)
Nhận xét: Đột biến gen K-RAS ở nhóm tuổi ≤ 40 chiếm tỉ lệ 8,7%; ở nhóm tuổi > 40 chiếm tỉ lệ 91,3%.
3.2.2.Tỉ lệ kiểu đột biến gen K-RAS ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng
Bảng 3.13. Tỉ lệ kiểu đột biến gen K-RAS
Kiểu đột biến n = 46 Tỉ lệ %
GGT → GAT
43 93,5
GGT → GTT
3 6,5
Tổng 46 100
Nhận xét: Đột biến gen K-RAS kiểu thay thế GGT → GAT chiếm tỉ lệ cao (93,5%), kiểu thay thế GGT → GTT chiếm tỉ lệ
thấp (6,5%).
17
3.3. Mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với một số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh và nồng độ
CEA ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng
3.3.1. Mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với một số đặc điểm lâm sàng
Bảng 3.15. Mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS
với triệu chứng thiếu máu và đại tiện ra máu đại thể
Triệu chứng
Có đột biến Không đột biến Tổng
p
n (%) n (%) N (%)
Triệu chứng đại tiện ra máu đại thể
Có máu 29 (63,0) 13 (39,4) 42 (53,2)
> 0,05
Không có máu 17 (37,0) 20 (60,6) 37 (46,8)
Triệu chứng thiếu máu
Có 27 (58,7) 2 (6,1) 29 (36,7)
< 0,05
Không 19 (41,3) 31 (93,9) 50 (63,3)

18
Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100)
Nhận xét: Ở BN có đột biến gen K-RAS, triệu chứng thiếu máu gặp nhiều hơn (58,7%) ở BN không có đột biến gen K-RAS
(p < 0,05).
3.3.2. Đột biến gen K-RAS với một số đặc điểm hình ảnh nội soi
- Đột biến gen K-RAS với kích thước khối u
Bảng 3.18. Mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS
với kích thước khối u
Kích thước
u (cm)
Có đột biến Không đột biến Tổng
P
n (%) n (%) N (%)
19
< 5 2 (4,3) 8 (24,2) 10 (12,7)
< 0,055 - 10 15 (32,6) 14 (42,4) 29 (36,7)
> 10 29 (63,1) 11 (33,4) 40 (50,6)
Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100)
Nhận xét: Tỉ lệ đột biến gen K-RAS tăng theo kích thước khối u (p < 0,05).
- Đột biến gen K-RAS theo mức độ xâm lấn u so với chu vi lòng ĐTT
Bảng 3.19. Mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS
với mức độ xâm lấn u so với chu vi lòng đại trực tràng
Mức độ xâm
lấn u
Có đột biến Không đột biến Tổng
p
n (%) n (%) N (%)
< 1/4 chu vi 1 (2,2) 6 (18,2) 7 (8,9)
< 0,05
1/4 - 1/2 chu vi 5 (10,9) 8 (24,2) 13 (16,5)

1/2 - 3/4 chu vi 11 (23,9) 12 (36,4) 23 (29,1)
> 3/4 chu vi 29 (63,0) 7 (21,2) 36 (45,5)
Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100)
Nhận xét: Tỉ lệ đột biến gen K-RAS tăng theo mức độ xâm lấn khối u so với chu vi lòng ĐTT (p < 0,05).
20
3.3.3. Mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với một số đặc điểm giải phẫu bệnh
- Đột biến gen K-RAS với độ ác tính khối u
Bảng 3.21. Mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với độ ác tính khối u
Độ ác tính
Có đột biến Không đột biến Tổng
P
n (%) n (%) N (%)
Thấp 34 (73,9) 25 (23,3) 59 (74,7)
> 0,05
Cao 12 (26,1) 8 (76,7) 20 (25,3)
Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100)
Nhận xét: Chưa thấy mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với mức độ ác tính của khối u (p > 0,05).
- Đột biến gen K-RAS với mức độ xâm lấn khối u vào thành đại trực tràng
Bảng 3.23. Mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS
với mức độ xâm lấn khối u vào thành đại trực tràng
Mức độ
xâm lấn u
Có đột biến Không đột biến Tổng
P
n (%) n (%) N (%)
Niêm mạc 0 (0) 0 (0) 0 (0)
21
Dưới niêm mạc 0 (0) 0 (0) 0 (0)
Lớp cơ 7 (15,2) 13 (39,4) 20 (25,3)
< 0,05Thanh mạc 15 (32,6) 10 (30,3) 25 (31,7)

Qua thanh mạc 24 (52,2) 10 (30,3) 34 (43,0)
Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100)
Nhận xét: Tỉ lệ đột biến gen K-RAS tăng theo mức độ xâm lấn khối u vào thành ĐTT (p < 0,05).
CHƯƠNG 4
BÀN LUẬN
4.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu
4.1.1. Tuối và giới tính
Tuổi trung bình của nhóm BN nghiên cứu là 61,7 ± 12,3, tuổi thấp nhất là 21, tuổi cao nhất là 81, trong đó ba nhóm tuổi có
tỉ lệ gặp cao nhất là nhóm tuổi từ 60 - 69 chiếm tỉ lệ là 32,9%, nhóm tuổi từ 50 - 59 và 70 - 79 đều chiếm tỉ lệ 25,3%. Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác như: Fuszek P., Horváth H.C. và CS (2006),
tuổi mắc bệnh trung bình là 65,2 ± 12,5; McFarlane và CS (2004), tuổi mắc bệnh trung bình là 65,5; Vũ Văn Khiên và CS (2012),
tuổi mắc bệnh trung bình là 63,86 ± 12,21; Phạm Văn Duyệt (2002), tuổi mắc bệnh trung bình là 63,7. Như vậy, theo kết quả của
22
nhiều nghiên cứu thì tỉ lệ mắc bệnh gặp chủ yếu ở lứa tuổi 60 - 79. Theo Benson A.B (2007), tuổi trên 50 là nguy cơ cho
UTĐTT; theo Mayer R.J (2007), UTĐTT hay xảy ra ở tuổi trên 50. Theo Nguyễn Văn Vân (2000), tuổi mắc bệnh trung bình ở
thời điểm được chẩn đoán là 60, hay gặp ở tuổi trên 40 và tần số tăng gấp đôi sau mỗi 10 năm.
Tỉ lệ nam mắc bệnh trong nghiên cứu của chúng tôi chiếm tỉ lệ là 60,8%, nữ chiếm tỉ lệ là 39,2%, tỉ lệ nam/nữ là 1,55/1.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Phan Văn Hạnh (2004), tỉ lệ nam/nữ là 1,98/1; Phạm
Văn Duyệt (2002), tỉ lệ nam/nữ là 1,09/1; Hoàng Kim Ngân (2006), tỉ lệ nam/nữ là 1,16/1; Nguyễn Viết Nguyệt (2008), tỉ lệ
nam/nữ là 1,1/1 [20]. Tuy nhiên một số nghiên cứu khác, tỉ lệ nam/nữ lại cho kết quả: Lê Quang Minh (2011), tỉ lệ nam/nữ là
0,93/1; Phạm Văn Nhiên (2000), tỉ lệ nam/nữ là 0,96/1. Như vậy, số liệu về tỉ lệ nam/nữ giữa các nghiên cứu còn chưa có sự
thống nhất. Tuy nhiên, sự khác biệt này là không nhiều, theo chúng tôi tỉ lệ UTĐTT ở nam thường cao hơn nữ và số liệu nghiên
cứu thường bị ảnh hưởng bới địa điểm nghiên cứu cũng như cách chọn mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu.
4.2. Đột biến gen K-RAS ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng
4.2.1. Kết quả tách chiết DNA
Với sự phát triển vượt bậc của ngành công nghệ Y sinh, hiện nay trên thế giới có nhiều kỹ thuật được áp dụng nhằm xác
định sự đột biến gen K-RAS ở BN mắc UTĐTT.
Tách chiết DNA là bước đầu tiên quan trọng của quy trình thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử. Tách chiết DNA tốt, các
phân tử DNA không bị đứt gãy, không bị tạp nhiễm thì các phản ứng tiếp theo sẽ có độ chính xác cao. Có nhiều phương pháp
tách chiết DNA, tuy nhiên phương pháp phenol/chlorroform được lựa chọn để tách chiết DNA trong nghiên cứu này. Đây là

phương pháp tách chiết DNA cổ điển, cần nhiều thời gian hơn so với những phương pháp tách chiết DNA sử dụng các kit thường
quy nhưng sản phẩm DNA thu được có nồng độ và độ tinh sạch cao.
Tất cả mẫu DNA được tách chiết từ mô UTĐTT đều có nồng độ và độ tinh sạch nằm trong khoảng 1,8 - 2,17 khi đo trên
23
máy Nano-drop ở bước sóng 260/280 nm. Như vậy, những mẫu DNA được tách chiết đều đảm bảo chất lượng, đủ điều kiện cho
các bước xét nghiệm tiếp theo.
Hiện nay, trên thế giới có nhiều phương pháp khác nhau để xác định sự đột biến gen K-RAS. Trong nghiên cứu này, chúng
tôi áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen. Sau khi khuếch đại vùng codon 12, 13 của gen K-RAS bằng kỹ thuật nested PCR, sản phẩm
PCR được tinh sạch từ agarose gel sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA). Sản phẩm PCR sau tinh
sạch được đưa vào giải trình tự sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA).
Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự của gen K-RAS hoang dại (wild type) trên GenBank (National center for
biotechnology information, NCBI)
Tất cả BN trong nhóm nghiên cứu đều được làm xét nghiệm đột biến gen K-RAS và đều có kết quả xác định sự đột
biến gen K-RAS. Tất cả những BN có đột biến gen K-RAS trong nghiên cứu này đều bị đột biến tại codon 12, chưa phát hiện
BN nhân nào có đột biến tại codon 13.
4.2.2. Tỉ lệ đột biến và kiểu đột biến gen K-RAS ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng
Sự mất ổn định trong cấu trúc bộ gen có thể khởi đầu cho sự phát triển UTĐTT, đánh dấu bằng việc tích lũy các đột biến
phát sinh UT với nhiều nguyên nhân khác nhau. Thông thường nhất là sự thiếu ổn định của bộ nhiễm sắc thể biểu hiện bằng việc
thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể và số lượng các bản copy. Những biến đổi này là nguyên nhân làm giảm sút sao chép thể hoạt
động của các gen kháng UT như APC, p53 và SMAD4. Sự phát sinh, phát triển UTĐTT cũng liên quan đến đột biến dẫn đến sự
tăng cường hoạt động của các gen gây UT, đó là các gen trong con đường tín hiệu thông qua thụ thể EGFR trong đó có gen K-
RAS.
Cho đến nay, có hơn 3000 đột biến điểm gen K-RAS đã được báo cáo, trong đó đột biến hay gặp nhất là đột biến thay thế
nucleotit ở codon 12 (chiếm 82%) và codon 13 (chiếm 17%) ở exon 2 trên gen K-RAS. Đột biến tại codon 12 và 13 đã được
chứng minh đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tiến triển UT và nguy cơ kháng thuốc ức chế EGFR của khối u. Đột biến
tại những vị trí khác như codon 61 và 146 cũng đã được báo cáo nhưng thường chiếm tỉ lệ nhỏ và ảnh hưởng của những dạng đột
24
biến này lên lâm sàng chưa được làm sáng tỏ. Như vậy, việc xác định sự đột biến gen K-RAS ở BN UTĐTT có ý nghĩa rất quan
trọng trong việc tiên lượng điều trị. Tuy nhiên, do hạn chế về mặt kinh phí nên trong nghiên cứu này chúng tôi mới chỉ dừng lại ở
nghiên cứu sự đột biến gen K-RAS và mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với một số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi,

MBH và nồng độ CEA ở BN UTĐTT.
Trong nghiên cứu này, xác định đột biến gen K-RAS ở codon 12 và codon 13 đã được tiến hành trên 79 BN bị UTĐTT, kết
quả nghiên cứu bảng 3.10 cho thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở BN bị UTĐTT trong nghiên cứu của chúng tôi là 58,2%; tất cả đều
đột biến dạng dị hợp tử. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Cunningham C. và CS (1996) nhận xét
rằng tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở BN UTĐTT khoảng 50%. Theo kết quả nghiên cứu của Breivik J. và CS (1994), khi tiến hành
nghiên cứu đột biến gen K-RAS tại codon thứ 12 và codon thứ 13 trên 251 BN bị UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS là 39,4%;
Karapetis. và CS (2008), nghiên cứu 572 BN UT trong đó có 394 BN (68,9%) UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS là 41,6%;
Beranek (1999), khi tiến hành nghiên cứu đột biến gen K-RAS tại codon 12 trên 53 BN bị UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến là 34%;
Tortola S. (1999), nghiên cứu 132 BN bị UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS là 54 BN chiếm tỉ lệ 41%; Monstein và CS
(2004), nghiên cứu xác định tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở BN UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến ở khối u TT là 30%, khối u ĐT là 44%;
Prall F. (2007), nghiên cứu xác định tỉ lệ đột biến gen K-RAS trong UTĐTT giai đoạn sớm, đột biến gen K-RAS đã được xác định
tại vị trí codon 12 và codon 13 thấy tỉ lệ đột biến là 34,7%. Gần đây, Stefanius (2011) nghiên cứu sự đột biến gen K-RAS ở BN bị
UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến là 45%.
Như vậy, tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở BN bị UTĐTT giữa các nghiên cứu còn chưa có sự thống nhất. Theo chúng tôi, có lẽ
do cách chọn mẫu cũng như kỹ thuật chon mẫu có sự khác nhau, hơn nữa mỗi nghiên cứu lại sử dụng kỹ thuật khác nhau và thời
điểm cũng như địa điểm nghiên cứu khác nhau nên các kết quả nghiên cứu cũng có sự khác nhau.
Khi nghiên cứu về kiểu đột biến gen K-RAS, kết quả bảng 3.13 cho thấy gặp chủ yếu là kiểu đột biến thay thế GGT →
GAT (93,5%), kiểu thay thế GGT → GTT chiếm tỉ lệ thấp (6,5%). Theo kết quả nghiên cứu Rako I. và CS (2011) cho thấy tỉ lệ
đột biến gen K-RAS tại codon 12 kiểu thay thế G → A chiếm tỉ lệ 50,0%; Esteller M. và CS (2000), để nghiên cứu sự liên quan
25
của quá trình giảm methyl hóa liên quan đến sự hiện diện của đột biến gen K-RAS, các tác giả đã nghiên cứu 244 mẫu khối u
ĐTT, kết quả cho thấy một mối liên quan rõ ràng giữa ngừng hoặc giảm hoạt động methyl hóa và sự xuất hiện của đột biến gen
K-RAS kiểu thay thế G → A chiếm tỉ lệ 71% ; Prall F. (2007), thấy trong đột biến gen K-RAS thì ti lệ đột biến tại codon 12 là
90,6% và chủ yếu gặp kiểu chuyển đổi G → A. Như vậy, tỉ lệ kiểu đột biến gen K-RAS ở BN bị UTĐTT giữa các nghiên cứu
cũng chưa có sự thống nhất. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu đều thấy rằng đột biến gen K-RAS ở BN bị UTĐTT chủ yếu là
kiểu đột biến GGT → GAT. Vì vậy, theo chúng tôi cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa với số lượng BN lớn hơn trong việc xác
định tỉ lệ đột biến cũng như kiểu đột biến gen K-RAS ở BN mắc UTĐTT.
4.2.3. Đột biến gen K-RAS với tuổi và giới tính
Ung thư ĐTT là bệnh chung cho cả hai giới nhưng nam thường bị nhiều hơn nữ, tỉ lệ nam/nữ thay đổi từ 1,1 đến 2,1 lần.
Phụ nữ ở các vùng khác nhau có tỉ lệ mắc tương tự nhau, vào khoảng 60 - 80% so với nam giới. Khi tiến hành nghiên cứu tỉ lệ

đột biến gen K-RAS theo giới tính ở BN bị UTĐTT, kết quả nghiên cứu bảng 3.11 cho thấy tỉ lệ đột biến ở nam có 29/46 trường
hợp chiếm tỉ lệ 63,0%, ở nữ có 17/46 trường hợp chiếm tỉ lệ 37,0%, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Theo
kết quả nghiên cứu Brink M. và CS (2003), thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở BN bị UTĐTT đối với nam là 57%, nữ là 43% (p >
0,05); Breivik J. và CS (1994), tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở nam chiếm tỉ lệ 33,3%, nữ chiếm tỉ lệ 45,3% (p > 0,05). Gần đây, theo
kết quả nghiên cứu của Zulhabri O (2012), tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở nam là 25%, nữ là 16% (p > 0,05). Như vậy, kết quả nghiên
cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác đều thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS ở BN bị UTĐTT
không có sự khác biệt giữa hai giới.
4.3. Mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với một số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh và nồng độ
CEA ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng
- Mối liên quan đột biến gen K-RAS với một số triệu chứng thực thể:
Thiếu máu là do chảy máu rỉ rả kéo dài từ khối u, đặc biệt là các khối u từ manh tràng thường là thể “sùi + loét”, dễ chảy
máu dẫn tới thiếu máu nặng, được xác định là thiếu máu khi BN có các biểu hiện lâm sàng như da xanh, niêm mạc nhạt, số lượng