Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm với colistin của một số chủng vi khuẩn gram âm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

TỐNG THỊ KIM TUYẾN

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT
MACRODILUTION VÀ MICRODILUTION TRONG
XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHẠY CẢM VỚI COLISTIN
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN GRAM ÂM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

TỐNG THỊ KIM TUYẾN

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT
MACRODILUTION VÀ MICRODILUTION TRONG
XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHẠY CẢM VỚI COLISTIN
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN GRAM ÂM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 8420101.07.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Nguyễn Vũ Trung
PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - Năm 2019


LỜI CẢM ƠN
Là một Học viên Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội, với chương trình học Cao học 2 năm, luận văn tốt nghiệp này
là dấu mốc quan trọng, đánh dấu cho sự hoàn thành chương trình học Thạc sỹ của
em tại trường. Để thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, em đã
nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên từ nhiều cơ quan, tổ
chức và cá nhân. Nghiên cứu khoa học cũng được hoàn thành dựa trên sự tham
khảo, học tập kinh nghiệm từ các kết quả nghiên cứu liên quan, các sách, báo
chuyên ngành của nhiều tác giả ở các trường Đại học, các tổ chức nghiên cứu
trong và ngoài nước.
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS. Nguyễn Vũ
Trung, Cô PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà – người trực tiếp hướng dẫn khoa học đã luôn
dành nhiều thời gian, công sức đối với em trong suốt quá trình thực hiện nghiên
cứu và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học. Em cũng xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị
Tâm, Trung tâm nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford đã giúp đỡ em rất nhiều
trong quá trình nghiên cứu tại Trung tâm.
Em xin trân trọng cảm ơn Khoa Sinh học, Ban giám hiệu trường Đại học
Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô giáo công
tác trong trường đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu, giúp đỡ em trong
quá trình học tập và nghiên cứu.
Và với lòng biết ơn, em cũng muốn gửi đến lời cảm ơn chân thành và sâu sắc
nhất tới bà, bố mẹ, chồng, con gái, những người thân và bạn bè đã yêu thương,

động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.
Tuy có nhiều cố gắng, nhưng trong đề tài nghiên cứu khoa học này không
tránh khỏi những thiếu sót. Em kính mong Quý thầy cô, các chuyên gia, những
người quan tâm đến đề tài, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè tiếp tục có những ý kiến
đóng góp, giúp đỡ để đề tài được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa em xin chân thành cám ơn!
Học viên
Tống Thị Kim Tuyến


BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Ý nghĩa

1

ADN

Acid Deoxyribonucleic

2

ATCC

American type culture collection

3

CA

Độ tin cậy

4

CAMHB

Canh thang Mueller Hinton có điều chỉnh nồng độ cation

5

CFU

Số lượng vi khuẩn tính trên một đơn vị thể tích huyền dịch
vi khuẩn

6

CLSI

Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm (Hoa Kỳ)

7

CTĐTT

Chưa thay đổi thể tích

8

EA

Độ chụm

9

EUCAST

Ủy ban về thử nghiệm độ nhạy cảm của châu Âu

10

I

Trung gian

11

LPS

Lipopolysaccharide

12

McF

Nồng độ MacFarland

13

MDR

Đa kháng kháng sinh

14

MIC

Nồng độ ức chế tối thiểu

15

MHM

Canh thang Muller Hinton

16

R

Ức chế

17

S

Nhạy cảm

18

TĐTT

Thay đổi thể tích

19

VME

Sai số chính

STT


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................................. 3
1.1. Tổng quan về kháng sinh, sự kháng kháng sinh. ..............................................3
1.1.1. Tổng quan về kháng sinh............................................................................3
1.1.2. Sự kháng kháng sinh ..................................................................................6
1.1.3. Tình hình kháng kháng sinh hiện nay ........................................................8
1.1.4. Tính kháng kháng sinh của một số vi khuẩn Gram âm ..............................9
1.2. Tổng quan về kháng sinh colistin ...................................................................11
1.2.1. Cấu trúc hóa học .......................................................................................11
1.2.2. Lịch sử ra đời và sử dụng .........................................................................12
1.2.3. Phổ tác dụng .............................................................................................13
1.2.4. Cơ chế tác dụng ........................................................................................14
1.2.5 Cơ chế đề kháng ........................................................................................15
1.2.6. Dược động học, liều dùng ........................................................................16
1.2.7. Chống chỉ định và tác dụng không mong muốn ......................................18
1.3. Các kỹ thuật xét nghiệm định danh và xác định nồng độ ức chế tối thiểu của

vi khuẩn ..........................................................................................................18
1.3.1. Các kỹ thuật định danh vi khuẩn ..............................................................18
1.3.2. Các kỹ thuật kháng sinh đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu ...............20
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 28
2.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................28
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu bệnh phẩm .......................................................28
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ...................................................................................28
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................................28
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................28
2.2.2. Thời gian nghiên cứu................................................................................28
2.3. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................28


2.3.1. Trang thiết bị, dụng cụ .............................................................................28
2.3.2. Hóa chất ....................................................................................................29
2.3.3. Môi trường ................................................................................................30
2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................30
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu ..................................................................................30
2.4.2. Cỡ mẫu .....................................................................................................30
2.4.3. Các kỹ thuật nghiên cứu ...........................................................................30
2.5. Các chỉ tiêu nghiên cứu ..................................................................................42
2.6. Đạo đức nghiên cứu ........................................................................................43
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN....................................................................... 44
KẾT LUẬN .......................................................................................................................... 64
KIẾN NGHỊ .......................................................................................................................... 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.

Các thông số dược động học .............................................................................. 5

Bảng 1.2.

Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học ..................................................... 6

Bảng 3.1.

Kết quả MIC colistin của P. aeruginosa bằng kỹ thuật macrodilution (có
thay đổi thể tích và không thay đổi thể tích) và kỹ thuật microdilution....... 44

Bảng 3.2.

Kết quả MIC colistin của A. baumannii bằng kỹ thuật macrodilution (có
thay đổi thể tích và không thay đổi thể tích) và kỹ thuật microdilution....... 46

Bảng 3.3.

Kết quả MIC colistin của Enterobacteriaceae bằng kỹ thuật macrodilution
(có thay đổi thể tích và không thay đổi thể tích) và kỹ thuật microdilution 49

Bảng 3.4.

Tổng hợp EA và CA giữa kỹ thuật macrodilution và kỹ thuật microdilution.. 53


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.

Sự lan truyền vi khuẩn đề kháng............................................................ 7

Hình 1.2.

Cấu trúc hóa học của colistin bao gồm ba phần .................................11

Hình 1.3.

B. polymyxa ............................................................................................12

Hình 1.4.

Cơ chế tác động của colistin lên tế bào vi khuẩn ...............................14

Hình 1.5.

Cơ chế đề kháng colistin của vi khuẩn ................................................15

Hình 1.6.

Một số dạng bào chế của colistin .........................................................16

Hình 1.7.

API .........................................................................................................19

Hình 1.8.

Hệ thống định danh VITEK2 ...............................................................19

Hình 1.9.

Quy trình thực hiện kháng sinh đồ xác định MIC bằng phương pháp
sử dụng E-test ........................................................................................21

Hình 1.10.

E-test và xác định MIC bằng E-test .....................................................22

Hình 1.11.

Hệ thống định danh VITEK 2 ..............................................................22

Hình 1.12.

Quy trình xác định MIC bằng kỹ thuật microdilution .......................24

Hình 1.13.

Quy trình xác định MIC bằng kỹ thuật macrodilution.......................24

Hình 2.1:

Hóa chất định danh MALDI-TOF .......................................................34

Hình 2.2:

Hóa chất chuẩn - BTS ...........................................................................35

Hình 2.3:

Hệ thống máy định danh MALDI-TOF ..............................................35

Hình 2.4:

Sơ đồ định danh bằng máy MALDI-TOF ..........................................36

Hình 2.5.

Kỹ thuật microdilution ..........................................................................41

Hình 3.1:

Một số lưu ý khi cho mẫu vào giếng nhựa bằng pipet đa kênh ........59

Hình 3.2:

Khay 96 giếng với 12 chủng vi khuẩn thử nghiệm ở 8 nồng độ khác
nhau của kháng sinh colistin.................................................................60

Hình 3.3.

Bản nhựa đơn 8 giếng 0,2 ml có nắp. ..................................................61

Hình 3.4:

Kỹ thuật macrodilution tiến hành ở 1 chủng với 5 nồng độ kháng
sinh khác nhau .......................................................................................62

Hình 3.5:

Chuẩn bị dung dịch kháng sinh colistin với các nồng độ khác nhau....63


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, các nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm đa kháng
kháng sinh, đặc biệt là Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii và
Klebsiella pneumoniae đã và đang gia tăng mạnh mẽ. Khi mà các kháng sinh nhóm
beta-lactam, aminoglycoside hoặc quinolone không còn hiệu quả nữa thì kháng sinh
nhóm polymyxin đặc biệt là colistin thường được xem là lựa chọn thích hợp. Kháng
sinh colistin khi kết hợp với một hoặc vài kháng sinh khác sẽ làm tăng hiệu quả
trong điều trị. Tuy nhiên, khi điều trị bằng colistin cho bệnh nhân, thuốc có thể gây
độc trên thận, độc tính tăng khi tăng liều colistin tích lũy. Chính vì vậy, để sử dụng
colistin an toàn và hiệu quả, cần chỉ định liều lượng thuốc dựa trên dược động học
và kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của xét nghiệm kháng sinh đồ để đảm bảo hoạt
tính kháng khuẩn tối đa và độc tính tối thiểu.
Có nhiều phương pháp giúp xác định nồng độ ức chế tối thiểu đối với colistin,
trong đó phương pháp đang sử dụng phổ biến trong vi sinh lâm sàng ở nước ta là Etest. Tuy nhiên, do trọng lượng phân tử colistin lớn, hơn nữa chúng lại có xu hướng bị
hấp thụ trên các bề mặt môi trường thử nghiệm, dẫn đến ảnh hưởng đối với kết quả
của thử nghiệm. Theo khuyến cáo của CLSI và EUCAST, không nên sử dụng E-test
trong xét nghiệm này nữa vì có thể dẫn đến sai số rất lớn, không thể chấp nhận. Có
rất nhiều các nghiên cứu của các tác giả nước ngoài đã chỉ ra phương pháp E-test
không đủ độ chính xác và tin cậy để sử dụng trong lâm sàng trong việc xác định nồng
độ ức chế tối thiểu của colistin với vi khuẩn Gram âm. EUCAST khuyến cáo, chỉ có
duy nhất kỹ thuật vi pha loãng (microdilution) được sử dụng với vai trò là phương
pháp tham chiếu trong xác định nồng độ ức chế tối thiểu của colistin đối với các vi
khuẩn. Mặc dù, kỹ thuật microdilution là kỹ thuật cổ điển trong xác định nồng độ ức
chế tối thiểu của kháng sinh đối với vi khuẩn nhưng trên thực tế, rất ít các phòng xét
nghiệm vi sinh sử dụng kỹ thuật microdilution trong quy trình xét nghiệm thường quy
do yêu cầu thao tác kỹ thuật tỉ mỉ, chính xác. Như vậy, việc tìm ra một phương pháp

chính xác và phù hợp để áp dụng trong thực tế lâm sàng là vô cùng cần thiết. Đã có

1


những nghiên cứu của nước ngoài tiến hành so sánh và chỉ ra sự tương đồng trong
hiệu quả của phương pháp macrodilution (pha loãng trong ống nghiệm) và
microdilution (xem khái niệm về các phương pháp này tại mục 1.3.2) trong xác định
mức độ nhạy cảm của vi khuẩn Gram âm đa kháng với kháng sinh colistin. Phương
pháp macrodilution và microdilution hiện tại chưa được đưa vào sử dụng ở các phòng
xét nghiệm và cũng chưa có nghiên cứu nào về vấn đề so sánh hai kỹ thuật này được
công bố ở Việt Nam. Do vậy, nghiên cứu về sự phù hợp giữa hai phương pháp này
trong xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh colistin là vô cùng cần
thiết. Khi có được kết quả nghiên cứu này, chúng ta sẽ có cơ sở để khuyến cáo triển
khai trên lâm sàng kỹ thuật microdilution và macrodilution trong xác định nồng độ ức
chế tối thiểu của vi khuẩn với colistin, hạn chế tối đa các sai sót trong kết quả MIC
đối với colistin. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Đánh giá hiệu quả
của kỹ thuật macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm với
colistin của một số chủng vi khuẩn Gram âm” này với mục tiêu:
So sánh kỹ thuật macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy
cảm với colistin của một số chủng vi khuẩn Gram âm.

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về kháng sinh, sự kháng kháng sinh.
1.1.1. Tổng quan về kháng sinh
Thuốc kháng sinh là những chất kháng khuẩn có nguồn gốc tổng hợp hoặc được

tạo ra bởi các chủng vi sinh vật có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật
hoặc tiêu diệt vi sinh vật [2] (từ đây, trong luận văn gọi tắt là “Kháng sinh”).
+ Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh:
- Ức chế tổng hợp vách tế bào
Vách tế bào của vi khuẩn (đặc biệt là các vi khuẩn Gram dương) được cấu tạo
bởi các phức hợp peptidoglycan, phức hợp này được trùng hợp bởi các enzyme
transpeptidases. Các kháng sinh nhóm betalactam gắn chọn lọc vào các
transpeptidase này làm cho vách tế bào của vi khuẩn bị tan rã khiến vi khuẩn bị tiêu
diệt.
- Ức chế chức năng màng bào tương
Kháng sinh gắn lên màng bào tương, làm thay đổi tính thấm chọn lọc khiến
một số chất cần thiết cho vi khuẩn (nucleotid, pyrimidin, purin…) lọt ra ngoài, gây
ức chế và làm chết vi khuẩn. Các kháng sinh nhóm polymycin, aminosid tác động
lên vi khuẩn theo cơ chế này.
- Ức chế sinh tổng hợp protein
Nhóm phenicol, macrolid có khả năng gắn vào phần 50S của ribosom vi
khuẩn, phong bế enzyme transferase (enzyme chuyển acid amin từ ARN vận
chuyển) làm quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn bị ngừng.
Tetracyclin và aminoside có khả năng gắn vào phần 30S của ribosom vi
khuẩn, gây nên đọc sai mã của ARN - thông tin khiến protein được tạo ra bất
thường, vô dụng đối với đời sống của vi khuẩn.
3


- Tác động vào acid nucleic
Các quinolon ức chế enzyme ADN-gyrase khiến ADN sợi kép của vi khuẩn
không thể duỗi xoắn, quá trình tổng hợp ADN của vi khuẩn bị ngừng hoàn toàn.
- Cạnh tranh đối kháng
Đây là kiểu tác dụng của các sunfonamit. Acid folic giữ vai trò cần thiết trong
quá trình tổng hợp acid nucleic. Để tổng hợp ra acid folic, một số vi khuẩn phải sử

dụng acid paraaminobenzoic (PAB) có trong môi trường. Sunfonamit có cấu trúc
hóa học tương tự PAB nên đã cạnh tranh thay thế PAB, dẫn đến ngừng tổng hợp
acid nucleic của vi khuẩn.
+ Nguyên lý sử dụng kháng sinh
Điều trị kháng sinh dựa trên sự khác biệt sinh hóa giữa người và vi sinh vật.
Thuốc kháng sinh có hiệu quả trong điều trị nhiễm trùng bởi chúng có “độc tính
chọn lọc”, tức là các kháng sinh có khả năng kìm hãm, tiêu diệt vi khuẩn ký sinh mà
không làm tổn thương tế bào cơ thể. Trong hầu hết các trường hợp, “độc tính chọn
lọc” của kháng sinh chỉ mang tính tương đối, nồng độ thuốc khi sử dụng phải đảm
bảo đủ để kiểm soát nhiễm khuẩn và cơ thể bệnh nhân vẫn dung nạp được [30]. Để
lựa chọn một kháng sinh thích hợp nhất trong điều trị cần phải dựa vào: Loại vi
khuẩn gây bệnh, độ nhạy cảm của vi khuẩn với các kháng sinh, vị trí nhiễm khuẩn,
cơ địa bệnh nhân, tính an toàn của kháng sinh được chọn và chi phí điều trị. Việc
chia liều kháng sinh dùng trong ngày dựa trên dược động học (mối liên hệ giữa
nồng độ và tác dụng diệt khuẩn) và dược động học của thuốc (quá trình hấp thu,
phân bố, chuyển hóa, thải trừ thuốc). Tác dụng diệt khuẩn của kháng sinh phụ thuộc
nồng độ hay thời gian, thuốc có tác dụng kéo dài hay không. Nắm rõ các đặc tính
này giúp tối ưu hóa việc chia liều kháng sinh, từ đó giúp cải thiện hiệu quả điều trị,
giảm sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc [30].

4


Bảng 1.1. Các thông số dƣợc động học
Các

Khái niệm

thông số
Sinh khả

dụng

Là phần thuốc được hấp thu vào tuần hoàn chung sau khi đưa thuốc.
Thuốc dùng theo đường tĩnh mạch có sinh khả dụng là 100%, các đường
dùng khác có sinh khả dụng thấp hơn.

Cmax

Nồng độ thuốc tối đa đạt được trong máu sau khi dùng 1 liều đơn độc

Cmin

Nồng độ thuốc tối thiểu trong máu

Tmax

Thời gian để đạt nồng độ tối đa
Thể tích phân bố, thể hiện sự phân bố của thuốc trong cơ thể. Vd > 3 L

Vd

chứng tỏ thuốc phân bố cả ngoài huyết tương
Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian

AUC

Thời gian bán thải, là thời gian cần thiết để nồng độ thuốc trong máu

t1/2

giảm đi một nửa

T>MIC

Thời gian duy trì nồng độ thuốc trên MIC để có tác dụng kìm khuẩn/diệt
khuẩn, chỉ áp dụng cho kháng sinh.

MIC là một trong những chỉ số quan trọng liên quan đến chiến thuật hiệu
chỉnh liều lượng kháng sinh sử dụng. Vì vậy, việc xác định chỉ số này là rất quan
trọng [30].
Nồng độ ức chế tối thiều (MIC - The minimum inhibitory concentration) là
nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong 24h ở điều
kiện nuôi cấy. Điều này giúp xác định tính nhạy cảm (invitro) của vi khuẩn và
thường được dùng trong thực hành lâm sàng nhằm nâng cao hiệu quả điều trị [30].
Phân loại thuốc kháng sinh theo cấu trúc hóa học:

5


Bảng 1.2. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học (nguồn [2])

1.1.2. Sự kháng kháng sinh
Có rất nhiều cơ chế liên quan đến sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn.
- Phát triển hệ enzyme phá hủy thuốc kháng sinh. Ví dụ: Staphylococci kháng
penicillin bằng cách sản sinh ra β-lactamase phá hủy cấu trúc của thuốc. Nhóm vi
khuẩn Gram âm có khả năng kháng với aminoglycosides (nhờ gen plasmid) sản
sinh ra được enzym adenyl hoá, phosphoryl hoá, acetyl hoá.

6

+ Vi khuẩn biến đổi làm thay đổi tính thấm màng với các hoạt chất trong
thuốc. Ví dụ như tetracycline có thể tích tụ trong tế bào vi sinh vật nhưng không
tích tụ trong các tế bào vi khuẩn kháng thuốc.
+ Vi khuẩn phát triển con đường trao đổi chất thứ cấp bỏ qua các bước phản
ứng bị ảnh hưởng bởi thuốc kháng sinh.
+ Vi khuẩn phát triển hệ enzym thứ cấp có chức năng trao đổi chất bình
thường nhưng lại không bị ảnh hưởng bởi thuốc kháng sinh.
Nguồn gốc của sự kháng thuốc kháng sinh (từ đây, trong luận văn gọi tắt là
“kháng kháng sinh”)
Đề kháng tự nhiên: một số loài vi khuẩn nhất định không chịu tác dụng của
một số kháng sinh nhất định, ví dụ Pseudomonas không chịu tác dụng của penicillin
G hoặc tụ cầu không chịu tác dụng của colistin. Những vi khuẩn không có vách như
Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh ức chế sinh tổng hợp vách, ví
dụ beta-lactam.
Đề kháng thu đƣợc:
+ Khả năng đề kháng liên quan đến di truyền
Hầu hết, sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn là kết quả của sự thay đổi về
mặt di truyền và quá trình chọn lọc tự nhiên dưới tác động của thuốc kháng sinh.

Hình 1.1. Sự lan truyền vi khuẩn đề kháng (nguồn [18])

7


+ Kháng thuốc liên quan đến di truyền nhiễm sắc thể
Là kết quả của đột biến trên locus kiểm soát độ nhạy cảm của vi sinh vật với
thuốc kháng sinh. Sự xuất hiện của thuốc có tác dụng như cơ chế chọn lọc loại bỏ
những chủng vi khuẩn nhạy cảm và kích thích sự phát triển của các chủng kháng
thuốc. Trong tự nhiên, đột biến có thể xảy ra với tần suất 10-12 đến 10-7, đó là

nguyên nhân dẫn đến sự xuất hiện của hiện tượng kháng thuốc trong điều trị.
Đột biến nhiễm sắc thể phổ biến nhất là đột biến gây thay đổi trong cấu trúc
thụ thể của thuốc kháng sinh. Ví dụ, protein P12 (thụ thể để gắn streptomycin) trên
tiểu đơn vị 30S của riboxom vi khuẩn, đột biến ở gen mã hóa cấu trúc protein trên
có tác dụng kháng thuốc streptomycin. Đột biến tương tự cũng có thể gây mất thụ
thể đặc hiệu của penicillin khiến cho vi sinh vật có thể kháng các nhóm thuốc βlactam.
+ Kháng thuốc liên quan đến di truyền ngoài nhiễm sấc thể
Đề kháng giả: Vi khuẩn có biểu hiện là đề kháng nhưng không phải là bản
chất, tức là không do nguồn gốc di truyền. Có thể chỉ do một trong ba yếu tố nói
trên hoặc có thể kết hợp hai hay thậm chí cả ba: (i) do yếu tố kháng sinh: ví dụ
kháng sinh kém chất lượng, mất hoạt tính,… Hoặc do chọn sai phổ tác dụng; (ii) do
yếu tố cơ thể: hệ thống miễn dịch bị suy giảm hoặc vị trí ổ nhiễm khuẩn hạn chế
kháng sinh khuếch tán tới đó; (iii) do yếu tố vi khuẩn: vi khuẩn đang ở trạng thái
nghỉ - không nhân lên, không chuyển hóa nên không chịu tác dụng của kháng sinh,
ví dụ vi khuẩn lao ở trong các “hang” lao.
1.1.3. Tình hình kháng kháng sinh hiện nay
Trong vài thập kỷ gần đây, đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh đã trở
thành mối lo ngại hàng đầu trong lĩnh vực y tế của nhiều quốc gia. Theo thống kê
của Cơ quan Quản lý Dược phẩm Châu Âu (EMA), ước tính hàng năm có khoảng
25000 trường hợp tử vong do nhiễm khuẩn vi khuẩn đa kháng thuốc và gánh nặng
kinh tế của đề kháng kháng sinh lên đến 1,5 tỷ Euro mỗi năm [25]. Đầu năm 2017,
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đưa ra danh sách 12 vi khuẩn kháng thuốc đáng
8


báo động, trong đó có 3 vi khuẩn có mức cảnh báo cao nhất là Pseudomonas
aeruginosa, Acinetobacter baumannii và họ Enterobacteriaceae kháng carbapenem
[64]. Trên thế giới, nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh đã trở nên ngày càng kháng
thuốc kháng sinh. Hầu hết các chủng vi khuẩn gây bệnh đã kháng lại một hoặc
nhiều loại kháng sinh [14]. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng: 70% các chủng vi

khuẩn gây bệnh trong bệnh viện đã kháng lại ít nhất một loại kháng sinh thường
dùng trong điều trị. Đặc biệt, một số chủng vi khuẩn như Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii đã
kháng lại hầu hết các loại kháng sinh bao gồm cả các kháng sinh mạnh nhất hiện
nay như cephalosporin và carbapenem [39, 16, 40, 36].
1.1.4. Tính kháng kháng sinh của một số vi khuẩn Gram âm
Vi khuẩn Gram âm là một nhóm vi khuẩn có lớp màng kép, có nhiều gen
quan trọng nằm trên những ADN vòng tách biệt, rải rác trong nguyên sinh chất của
vi khuẩn gọi là các plasmid. Plasmid thường chứa các gen sản xuất kháng sinh, một
số gen sản xuất các loại độc tố và các protein cho vi khuẩn. Plasmid là công cụ giúp
vận chuyển ADN từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông qua hiện tượng truyền
gen ngang nên chúng đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực y, sinh, nông, dược và
môi trường.
Tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm có thể bắt nguồn từ hai yếu
tố: yếu tố di truyền quy định tính đề kháng của vi sinh vật và hoạt tính của kháng
sinh đã ức chế các vi khuẩn nhạy và chọn lọc những vi khuẩn kháng. Tính đề kháng
sẽ phát triển khi có mặt đồng thời 2 yếu tố này trong môi trường hoặc vật chủ. Các
gen quy định đặc tính kháng và tế bào vi khuẩn sẽ cùng nhân lên và lan rộng dưới
áp lực chọn lọc của kháng sinh có trong môi trường.
Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm thường được phân thành 3
nhóm cơ chế chính: làm giảm sự hấp thụ kháng sinh vào bên trong tế bào vi khuẩn,
thay đổi đích tác động của kháng sinh và sản sinh ra các enzyme để ức chế hoặc
biến đổi kháng sinh.

9


Kháng sinh nhóm carbapenem được xem là “sự lựa chọn cuối cùng”, thường
được chỉ định điều trị các trường hợp nhiễm trùng nặng hoặc nhiễm trùng do vi
khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng.

Tại Việt Nam, vi khuẩn Gram âm đã kháng lại kháng sinh nhóm carbapenem
ở mức độ cao. Tại 6 bệnh viện vào năm 2008 đã ghi nhận mức độ kháng
carbapenem của các chủng P. aeruginosa là 20% và của các chủng A. baumannii là
gần 50%. Theo một nghiên cứu mới nhất ở bệnh nhân nhi thuộc Khoa hồi sức cấp
cứu tại 3 bệnh viện tuyến đầu của Việt Nam đã cho thấy tỉ lệ kháng carbapenem ở
các chủng K. pneumoniae, P. aeruginosa và A. baumannii lần lượt là 55%, 71% và
65%. Các nghiên cứu về cơ chế kháng carbapenem tại Việt Nam cho thấy sự xuất
hiện của các gen NDM-1, KPC, OXA-23, OXA-51 và OXA58 ở các chủng vi
khuẩn đường ruột và A. baumannii phân lập tại một số bệnh viện lớn. Tỉ lệ vi khuẩn
kháng kháng sinh nhóm carbapenem đang có xu hướng tăng và ngày càng lan rộng
ở Việt Nam.
Cơ chế tác động của kháng sinh nhóm carbapenem là gắn và bất hoạt protein
gắn penicillin (PBP), qua đó ức chế quá trình hình thành peptidoglycan của thành tế
bào vi khuẩn. Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram
âm. Ba cơ chế đề kháng carbapenem phổ biến ở vi khuẩn Gram âm bao gồm: các
gen nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid mã hóa sinh tổng hợp các enzyme
carbapenemase phân giải phân tử carbapnenem; tạo ra các đột biến làm giảm tính
thấm của màng tế bào thông qua việc thay đổi biểu hiện và/ hoặc hoạt động của các
lỗ màng và phân tử PBP và sử dụng bơm đẩy để bơm kháng sinh ra ngoài tế bào vi
khuẩn. Trong các cơ chế này, cơ chế sinh tổng hợp carbapenemase là cơ chế phổ
biến và được nghiên cứu sâu rộng nhất. Các enzyme carbapenemase được phát hiện
chủ yếu thuộc nhóm A (ví dụ như enzyme KPC và GES), nhóm B metallo-βlactamase (ví dụ như enzyme VIM, IMP và NDM) và nhóm D (ví dụ các enzyme họ
OXA như OXA-23, OXA-48, OXA-51, OXA-58, OXA-181). Đối với các vi khuẩn
đường ruột Enterobacteriaceae, các carbapenemase có ý nghĩa lâm sàng nhất bao
gồm KPC (nhóm A), VIM, IMP, NDM (nhóm B) và OXA-48 (nhóm D) [5].

10


Nghiên cứu của Pokharel K và cộng sự về tính kháng carbapenem của vi

khuẩn, tiến hành trên 1055 chủng vi khuẩn đường ruột (tháng 2/2018 đến tháng
5/2018). Kết quả cho thấy, có 27% số chủng này đề kháng với carbapenem [54].
Đây chính là lý do, chúng tôi lựa chọn các chủng vi khuẩn đường ruột
Enterobacteriaceae, A. baumannii và P. aeruginosa để tiến hành nghiên cứu này. Có
nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các chủng Enterobacteriaceae, A. baumannii và P.
aeruginosa chính là các chủng thường gặp nhất trong nhiễm trùng bệnh viện [4, 7].
1.2. Tổng quan về kháng sinh colistin
1.2.1. Cấu trúc hóa học

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của colistin bao gồm ba phần: (A) đuôi acyl kỵ nước, (B)
đoạn tripeptide tuyến tính (C) đầu ưa nước, vòng heptapeptide [49].
Colistin là kháng sinh thuộc nhóm polypeptide, được phát hiện lần đầu năm
1947. Colistin có trọng lượng phân tử khoảng 1200 Dalton (Da), đây là một kháng
sinh polypeptide cation đa thành phần. Colistin là sự kết hợp của ít nhất 85%
colistin A (polymyxin E1) và khoảng 15% colistin B (pPolymyxin E2) [28, 33].

11


1.2.2. Lịch sử ra đời và sử dụng

Hình 1.3. B. polymyxa [58]
Colistin được sản xuất bởi Bacillus polymyxa, một loại vi khuẩn ban đầu được
phân lập từ đất. Trước đây, kháng sinh nhóm polymyxin đã được sử dụng rộng rãi
trên toàn thế giới trong điều trị nhãn khoa, tuy nhiên, đến những năm 1980,
polymyxin dần bị bỏ qua khi người ta nghiên cứu được độc tính trên thận của
chúng. Kể từ đó đến nay, polymyxin rất ít được sử dụng trên lâm sàng trừ trong
điều trị nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm đa kháng thuốc (MDR) ở bệnh nhân xơ
nang. Ngày nay, sự xuất hiện của vi khuẩn gram âm đa kháng thuốc ngày một tăng,
dẫn đến việc quay trở lại của polymyxin như sự lựa chọn cuối cùng. Chính vì vậy,

chúng ta cần cân nhắc giữa lợi ích và nguy cơ trong việc sử dụng colistin, xác định
liều lượng chính xác để hạn chế tối đa tác dụng phụ của thuốc trên bệnh nhân [3, 17,
28, 33].
Colistin được lựa chọn để điều trị các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng do các
vi khuẩn đa kháng thuốc như A. baumannii, Enterobacteriaceae như viêm phổi,
nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng xương khớp, nhiễm trùng đường tiết niệu và viêm
màng não [50].

12


Colistin có thể được sử dụng trong điều trị viêm phổi ở các bệnh nhân có thở
máy. Một số nghiên cứu so sánh về hiệu quả của liệu pháp colistin điều trị viêm
phổi thở máy gây ra do A. baumannii và P. aeruginosa đã cho thấy kết quả ngang
bằng hoặc tốt hơn so với liệu pháp carbepenem độc lập. Một nghiên cứu khác từ
Bệnh viện đa khoa Singapore của Kwa và cộng sự năm 2005 đã chỉ ra, việc điều trị
bằng colistin cho các bệnh nhân viêm phổi do thở máy bởi các vi khuẩn đa kháng
(A. baumannii và P. aeruginosa) cho tỷ lệ đáp ứng khoảng 57,1% và 85,7%.
Trong những trường hợp nhiễm trùng huyết nghiêm trọng đe dọa tính mạng, sự
kết hợp của carbapenem và colistin có thể được chỉ định. Một nghiên cứu về
nhiễm trùng huyết do K. pneumoniae của Karabinis và cộng sự tiến hành năm
2004 cho thấy, các trường hợp bệnh nhân bị sốc nhiễm khuẩn đã được điều trị
thành công với colistin [50].
1.2.3. Phổ tác dụng
Phổ kháng khuẩn và cơ chế tác dụng của colistin tương tự như polymyxin B,
tuy nhiên, tác dụng kém hơn polymyxin B. Các polymyxin có tác dụng ngay cả đối
với các tế bào ở trạng thái nghỉ, do cơ chế làm thay đổi tính thấm chọn lọc của
màng tế bào, gây chết tế bào [3].
Colistin có tác dụng tiêu diệt hầu hết các loài vi khuẩn Gram âm hiếu khí,
ngoại trừ Neisseria, Proteus, Serratia, Providencia, Brucella và Edwardsiella,

Pseudomonas mallei, và Burkholderia cepacia. Colistin diệt vi khuẩn nhanh chóng,
thời gian diệt khuẩn phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh. Colistin có hoạt tính invitro
chống lại một số tác nhân gây bệnh đa kháng thuốc (MDR), bao gồm Pseudomonas
aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae và Stenotrophomonas
maltophilia. Colistin không có hoạt tính đối với vi khuẩn Gram dương, các cầu khuẩn
và vi khuẩn kỵ khí. Đã có báo cáo cho rằng, colistin có khả năng diệt khuẩn đối với
một số loài Mycobacteria, bao gồm cả Mycobacterium tuberculosis [17].

13


1.2.4. Cơ chế tác dụng

Hình 1.4. Cơ chế tác động của colistin lên tế bào vi khuẩn (nguồn: EUCAST)
Cơ chế diệt khuẩn của colistin vẫn chưa được biết rõ, tuy nhiên, có một số
nghiên cứu chỉ ra rằng, đích tác động ban đầu của colistin là thành phần
lipopolysaccharide (LPS) của màng ngoài tế bào vi khuẩn. Các polymyxin có điện
tích dương mạnh, có chuỗi acyl kỵ nước làm cho cho chúng mối liên kết cao với các
phân tử lipopolysaccharide. Chúng tương tác tĩnh điện với các phân tử LPS này và
thay thế cạnh tranh cation hóa trị hai, hệ quả là chúng làm phá vỡ màng tế bào. Kết
quả của quá trình này là làm tăng tính thấm của vỏ tế bào, rò rỉ các thành phần của
tế bào, làm chết tế bào [17]. EUCAST cũng chỉ ra cơ chế kháng khuẩn của colistin
tương tự như trên, cụ thể như sau: Thay thế các cation hóa trị hai có vai trò ổn định
LPS bằng các cấu trúc polycationic lớn hơn [45], dẫn đến:
+ Mất ổn định tổ chức cấu trúc của LPS
+ Mất ổn định của màng ngoài vi khuẩn
+ Tăng tính thấm của màng tế bào chất
+ Rò rỉ các thành phần trong tế bào chất gây chết tế bào [45].

14

Tuy nhiên, lại có những ý kiến cho rằng, sự gia tăng tính thấm màng tế bào là
một hệ quả tác động của polymyxin nhưng không phải là nguyên nhân gây chết tế
bào. Cơ chế tác động của polymyxin vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu [17].
1.2.5 Cơ chế đề kháng
Trước đây, do colistin ít được sử dụng nên tỷ lệ kháng colistin tương đối thấp.
Tuy nhiên, gần đây, tỷ lệ kháng colistin đã xuất hiện và ngày càng gia tăng ở một số
chủng vi khuẩn A. baumannii, bên cạnh đó là K. pneumoniae và P. aeruginosa. Sự
đề kháng của P. aeruginosa với colistin ngày càng gia tăng, được mô tả chủ yếu ở
các bệnh nhân bị xơ nang và có sử dụng liệu pháp colistin theo con đường khí dung.

Hình 1.5. Cơ chế đề kháng colistin của vi khuẩn [45]
Cơ chế đề kháng colistin vẫn đang được nghiên cứu, tuy nhiên, có một vài
nghiên cứu đã tiến hành chỉ ra rằng, cơ chế đề kháng colistin của vi khuẩn liên quan
đến sự biến đổi LPS. Các phân loài Paenibacillus polymyxa colistinus đươc cho là
có thể tạo ra colistinase, làm bất hoạt colistin. Tuy nhiên, giả thuyết này còn gây
nhiều tranh cãi. Gần đây, sự kháng colistin qua trung gian do sự mất hoàn toàn sản
xuất LPS đã được mô tả trong các chủng A. baumannii [17].

15


Các vi khuẩn đề kháng tự nhiên với colistin: Vi khuẩn Gram dương, cầu khuẩn
Gram âm, Proteus, Providecia, Mycobacteria và vi khuẩn kỵ khí [3].
1.2.6. Dƣợc động học, liều dùng
Trên thị trường, hiện nay colistin có hai dạng chính: colistin sulphate và natri
colistimethate. Trong dung dịch, natri colistimethate trải qua quá trình thủy phân tự
phát để trở thành colistin dạng hoạt động. Natri colistimethate thường được dùng
đường tiêm tĩnh mạch, dạng này ít độc hơn colistin sulphate. Colistin có thể được

dùng theo đường tiêm bắp, tuy nhiên, tiêm bắp ít được sử dụng trong lâm sàng vì có
thể gây đau dữ dội tại vị trí tiêm và có thể thuốc sẽ bị biến đổi trong quá trình hấp
phụ. Colistin sulphate thường được dùng đường uống (đối với nhiễm trùng đường
tiêu hóa) hoặc dùng tại chỗ (điều trị nhiễm trùng da). Cả colistin sulphate và natri
colistimethate đều có thể dùng trong trường hợp nhiễm trùng đường hô hấp, tuy
nhiên colistin sulphate thường dẫn đến tần suất co thắt phế quản cao hơn so với
natri colistimethate [17].

Hình 1.6. Một số dạng bào chế của colistin [45]
+ Dạng thuốc và hàm lượng:
Viên nén: 500000 IU colistin sulfat (tương đương với 50mg colistin)
Siro: 250000 IU (colistin sulfat)

16


Thuốc tiêm dạng bột 500000 IU/lọ (tương đương với 40 mg colistin
methansulfonat hoặc 16,66 mg colistin), dung môi để pha kèm theo 3ml dung dịch
natri clorid 0,9%.
Thuốc dùng tại chỗ: Thuốc nhỏ tai, thuốc nhỏ mắt, thuốc mỡ tra mắt [3].
Dùng colistin sulfat đường uống để điều trị nhiễm khuẩn đường tiêu hóa và
dùng kết hợp với một số thuốc khác để chống nhiễm khuẩn có chọn lọc ở đường
tiêu hóa đối với các bệnh nhân có nguy cơ cao bị nhiễm khuẩn nội sinh.
Colistin có thể dùng ở dạng thuốc nhỏ hoặc thuốc bôi ngoài da đối với các
trường hợp điều trị viêm tai ngoài, bội nhiễm vết bỏng, vết loét.
Đối với các bệnh nhân có nhiễm khuẩn đường hô hấp, đặc biệt đối với bệnh
nhân xơ nang, có thể dùng colistin dạng khí dung.
Cũng giống như bất kỳ kháng sinh nào, chỉ định dùng colistin phải dựa trên
kháng sinh đồ [3].
Colistin sulfat và natri colistimetat hấp thu kém qua đường uống (chỉ khoảng

0,5%), không được hấp thu qua niêm mạc hoặc da lành. Sau khi uống, thuốc đào
thải qua phân dưới dạng không đổi.
Sau khi tiêm bắp với liều tương đương 150mg colistin, từ 2 – 3 giờ, thuốc đạt
nồng độ đỉnh trong huyết tương. Khi dùng đường tiêm tĩnh mạch, nồng độ đỉnh cao
hơn nhưng giảm nhanh hơn so với đường tiêm bắp. Invitro, có một tỷ lệ nhỏ natri
colismetat có thể tự thủy phân và trở thành dạng colistin hoạt động. Colistin gắn
lỏng lẻo vào các mô còn colismetat thì không kết gắn.
Thời gian bán thải của colistin là khoảng 2 – 3 giờ. Colistin natri colistimetat
đào thải chủ yếu qua quá trình lọc cầu thận dưới dạng ban đầu hoặc dạng chuyển
hóa. Trong vòng 24 giờ, có thể tới 80% liều thuốc đã bài xuất vào nước tiểu. Ở trẻ
em, thuốc đào thải nhanh hơn ở người lớn, thuốc đào thải chậm ở những người có
suy giảm chức năng thận.

17