Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2 liên quan đến tính chịu hạn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------

Nguyễn Thùy Linh

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN
DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------

Nguyễn Thùy Linh

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN
DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420101.14
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. Huỳnh Thị Thu Huệ
TS. Lê Hồng Điệp

Hà Nội, 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn
khoa học của TS. Huỳnh Thị Thu Huệ và TS. Lê Hồng Điệp. Các nội dung nghiên
cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ
hình thức nào.
Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của
các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ.
Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung
luận văn.
Học viên

Nguyễn Thùy Linh


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo khoa Sinh học,
trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã trang bị kiến
thức cho tôi trong suốt quá trình học tập.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Huỳnh Thị Thu Huệ –
Viện Nghiên cứu hệ gen và TS. Lê Hồng Điệp –Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận
tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản
Luận văn Thạc sĩ này. Xin được cảm ơn đề tài cấp nhà nước: ―Phân lập thiết kế gen
chịu hạn phục vụ công tác tạo giống ngô biến đổi gen‖ do Viện Nghiên cứu hệ gen
chủ trì, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ quản đã hỗ trợ tôi về mọi
phương diện để thực hiện nghiên cứu này.
Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen - Viện Nghiên
cứu hệ gen đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã
luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

Học viên

Nguyễn Thùy Linh

i

năm


MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. iv
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ vi
BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. vii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ....................................................................................... 3
1.1.

Cây ngô và hạn hán ....................................................................................... 3

1.1.1.

Tình hình về cây ngô ở nước ta .............................................................. 3

1.1.2.

Hạn hán ảnh hưởng đến năng suất cây ngô ............................................ 4

1.1.3.

Nâng cao năng suất ngô trong điều kiện hạn hán .................................. 5

1.2.

Nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen chịu hạn ............................................. 6

1.2.1.

Tình hình nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen trên thế giới ............. 6

1.2.2.

Tình hình nghiên cứu tạo giông ngô biến đổi gen chịu hạn trên thế giới
................................................................................................................ 7

1.2.3.

Tình hình nghiên cứu cây ngô biến đổi gen ở Việt Nam ....................... 9

1.3.

Tính trạng chịu hạn ở thực vật và nhân tố phiên mã DREB ....................... 10

1.3.1.

Cơ sở phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật ............................... 10

1.3.2.

Họ nhân tố phiên mã DREB................................................................. 12

1.3.3.

Nhân tố phiên mã ZmDREB2.7 .......................................................... 13

Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................... 15
2.1.

Vật liệu ........................................................................................................ 15

2.1.1.

Mẫu thực vật......................................................................................... 15

2.1.2.

Chủng vi khuẩn, vector và mồi ............................................................ 15

2.1.3.

Hóa chất và môi trường ........................................................................ 17

2.1.4.

Thiết bị nghiên cứu .............................................................................. 18

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 19

2.2.1.

Tách chiết DNA ................................................................................... 19

2.2.2.

Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA .................................................... 20

2.2.3.

Phương pháp PCR ................................................................................ 21

2.2.4.

Tinh sạch DNA .................................................................................... 21
ii


2.2.5.

Tạo tế bào khả biến E. coli và biến nạp bằng sốc nhiệt ....................... 21

2.2.6.

Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens và biến nạp bằng xung điện ........ 22

2.2.7.

Nhân dòng gen ZmDREB2.7tv ............................................................. 22

2.2.8. Tạo vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv:
:polyA .............................................................................................................. 23
2.2.9.

Chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .............. 24

2.2.10. Real-time PCR định lượng để ước lượng số bản sao của gen trong
cây chuyển gen................................................................................................... 26
2.2.11. Real-time PCR định lượng để đánh giá sự biểu hiện của gen trong
cây chuyển gen................................................................................................... 27
2.2.12.

Phân tích cây chuyển gen ................................................................. 28

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 29
3.1.

Kết quả phân lập gen ZmDREB2.7tv từ cây ngô Tẻ vàng 1 ....................... 29

3.1.1.

Tách chiết DNA tổng số từ lá cây ngô Tẻ vàng 1 ................................ 29

3.1.2.

Phân lập và tạo dòng gen ZmDREB2.7tv ............................................. 30

3.1.3.

Phân tích trình tự gen ZmDREB2.7tv ................................................... 32

3.2.

Kết quả thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2.7tv ......... 35

3.2.1.

Thiết kế vector trung gian pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv................... 35

3.2.2.

Thiết kế vector biểu hiện pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv ...... 39

3.2.3.

Tạo chủng A. tumefaciens EHA105 mang vector biểu hiện ................ 42

3.3.

Kết quả tạo cây ngô biến đổi gen mang gen ZmDREB2.7tv ....................... 42

3.3.1.

Chuyển gen ZmDREB2.7tv vào cây ngô thế hệ T0 .............................. 42

3.3.2.

Đánh giá cây chuyển gen thế hệ T0 ..................................................... 47

3.3.3.

Tạo và đánh giá cây chuyển gen thế hệ T1 .......................................... 50

3.3.4.
hệ T1

Ước lượng số bản sao của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế
.............................................................................................................. 51

3.3.5. Đánh giá sự biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7tv trong cây
chuyển gen thế hệ T2 ......................................................................................... 53
KẾT LUẬN ............................................................................................................. 56
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 58

iii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tổng sản lượng ngô tiêu thụ theo năm tài chính giai đoạn 2015-2018 ở
nước ta. .................................................................................................................... 4
Hình 1.2. Số lượng các thử nghiệm cây biến đổi gen trên đồng ruộng qua các năm

[32]. ......................................................................................................................... 7
Hình 1.3. Số lượng các thử nghiệm đồng ruộng của cây biến đổi gen chịu hạn
[32]. ......................................................................................................................... 8
Hình 1.4. Các nhóm protein tham gia vào quá trình đáp ứng của cây khi gặp hạn
[28]. ....................................................................................................................... 11
Hình 2.1. Phương pháp tạo vector biểu hiện mang gen ZmDREB2.7tv ................ 24
Hình 3.1. Điện di đồ kiểm tra DNA tổng số từ ba mẫu lá ngô Tẻ vàng 1 ............ 29
Hình 3.2. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp
pJET1.2/ZmDREB2.7tv ......................................................................................... 31
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm xử lý plasmid pJET1.2/ZmDREB2.7tv bằng
enzyme giới hạn BglII. .......................................................................................... 32
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự ZmDREB2tv phân lập từ giống ngô Tẻ vàng 1
và trình tự tham chiếu ngô B73 bằng công cụ BioEdit. ........................................ 34
Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv
............................................................................................................................... 36
Hình 3.6. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pRTL2/rd29A:
:ZmDREB2.7tv ...................................................................................................... 37
Hình 3.7. Kết quả kiểm tra plasmid pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv..................... 38
Hình 3.8. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pCAMBIA1300/
rd29A::ZmDREB2.7tv ........................................................................................... 40
Hình 3.9. Kết quả tạo plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv .............. 41
Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra vi khuẩn A. tumefaciens EHA105
mang vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA ....
............................................................................................................................... 42
Hình 3.11. Quá trình chuyển gen vào ngô trung gian qua vi khuẩn
Agrobacterium....................................................................................................... 43
Hình 3.12. Điện di đồ DNA tổng số tách từ các cây chuyển gen ZmDREB2.7tv
thế hệ T0 ................................................................................................................ 47
Hình 3.13. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn
rd29A::ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T0 ....................................... 48

iv


Hình 3.14. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen HygR trong cây
chuyển gen thế hệ T0 ............................................................................................ 49
Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm trong cây
chuyển gen ZmDREB2.7tv thế hệ T2 .................................................................... 54
Hình 3.17. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7
của cây chuyển gen khi gặp hạn............................................................................ 54

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................... 16
Bảng 2.2. Thành phần các môi trường được sử dụng trong nghiên cứu ............... 17
Bảng 3.1. Kết quả chuyển gen ZmDREB2.7tv vào cây ngô .................................. 46
Bảng 3.2: Kết quả phân ly của gen ZmDREB2tv trong cây chuyển gen thế hệ T1
............................................................................................................................... 50
Bảng 3.3. Đường chuẩn khuếch đại của hai gen ZmDREB2.7tv và Glb-1 ........... 52
Bảng 3.4. Giá trị Ct và số lượng bản sao gen ZmDREB2.7tv của trong các cây
chuyển gen thế hệ T1 ............................................................................................ 53

vi


BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Actin-1

Gen actin-1

AP2/ERF2

AP2/ethylene-responsive element-binding

AS

Acetone syringone

CBF

C-repeat Binding Factors

DNA

Deoxyribonucleic acid

DREB

Dehydration-responsive element-binding

Glb-1

Gen globulin-1

HygR

Gen hygromycin

ISAAA

International Service for the Acquisition of Agribiotech
Applications

KL

Khuẩn Lạc

MS

Murashige and Skoog Medium

PCR

Polymerization Chain Reaction

rd29A

Gen/promoter của gen rd29A

RNA

Ribonucleic acid

USDA

The United States Department of Agriculture

ZmDREB2.7tv

Gen ZmDREB2.7 phân lập từ ngô Tẻ vàng 1

vii


MỞ ĐẦU
Cây ngô là một trong các loài cây trồng quan trọng đối với con người. Ở Việt
Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa. Mặc dù sản lượng tăng lên
đáng kể trong vài năm trở lại đây, năng suất trồng ngô vẫn chưa đạt được giá trị
tiềm năng của nó do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đó, nguyên nhân chính
ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất ngô là khô hạn, nhất là khi hiện tượng biến đổi
khí hậu khiến các đợt hạn hán xảy ra thường xuyên hơn và nghiêm trọng hơn. Do
đó, bên cạnh các biện pháp thủy lợi, việc nghiên cứu tạo giống ngô có khả năng
thích ứng cao với điều kiện hạn hán là một trong những mục tiêu chính trong các
chương trình lai tạo giống. Với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật và sự chấp thuận
cây trồng biến đổi gen ở nước ta đã mở ra một cơ hội, đồng thời là thách thức lớn
trong việc tạo ra giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn. Nguyên nhân gồm cả
khách quan và chủ quan như nguồn gen chưa được tập trung khai thác/nghiên cứu
nhiều, công nghệ chuyển gen chưa được tiếp cận sớm, đồng thời cây ngô cũng là
đối tượng khó để chuyển gen.
Giống ngô Tẻ vàng 1 sống ở vùng núi đá thuộc tỉnh Điện Biên, nơi có nhiệt
độ và lượng mưa hằng năm thấp. Giống ngô này đang được sử dụng làm nguồn
nguyên liệu cho các chương trình cải tạo giống bởi khả năng chịu hạn và chịu lạnh
tốt. Đặc điểm có lợi này có thể liên quan đến các gen tham gia vào con đường
chống chịu với bất lợi của cây. Thực vật đáp ứng với các yếu tố bất lợi thông qua
các thay đổi về hình thái và sinh lý, mà cơ sở là thay đổi sự biểu hiện của các gen
tham gia quá trình đáp ứng và bảo vệ. Sự biểu hiện của gen có liên quan chặt chẽ
với hoạt động của các nhân tố khởi đầu phiên mã. DREB (Dehydration Responsive
Element Binding) là một họ nhân tố phiên mã lớn, tham gia vào con đường đáp ứng

với bất lợi của cây. Các gen mã hóa cho các protein trong họ này lần lượt được phân
lập và nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau. Ở ngô, họ gen DREB gồm nhiều
thành viên và trong đó ZmDREB2.7 đã được nhận định là một gen tiềm năng và
tham gia đáng kể vào phản ứng chịu hạn ở cây.

1


Do đó, với mục đích cung cấp nguyên liệu cho việc tạo giống ngô biến đổi
gen có khả năng chịu hạn, luận văn thạc sĩ được tiến hành với nội dung: ―Nghiên
cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2.7 liên quan đến tính chịu hạn‖. Mục tiêu
của nghiên cứu là phân lập gen DREB2.7 từ dòng ngô Tẻ vàng 1 chịu hạn. Từ đó,
phân tích đặc điểm trình tự của gen và protein được dự đoán. Tiếp theo, gen
ZmDREB2.7tv dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng mạnh với hạn - rd29A
được chuyển vào dòng ngô thuần để đánh giá khả năng chống chịu hạn của cây ngô
chuyển gen.

2


Chƣơng 1 - TỔNG QUAN
1.1.
1.1.1.

Cây ngô và hạn hán
Tình hình về cây ngô ở nước ta
Ngô là cây lương thực quan trọng ở nước ta, đứng vị trí thứ hai sau lúa. Ngô

là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng và là bữa ăn chính của người dân tại nhiều khu
vực đồi núi Việt Nam. Ngô cũng được sử dụng để sản xuất một vài sản phẩm công

nghiệp như cồn, siro ngô, bột ngô... Đồng thời, thân và hạt ngô được sử dụng làm
thức ăn chăn nuôi. Trong đó, 80% tổng sản lượng ngô tiêu thụ hằng năm phục vụ
cho ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, diện tích trồng
ngô ở nước ta vào năm 2017 là 1,1 triệu héc ta [1]. Con số này được dự báo sẽ tăng
trưởng nhẹ vào các năm tới, sau đó giữ ổn định trong khoảng 0,95 – 1,1 triệu héc ta
sau năm 2025 [1]. Theo số liệu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp
Quốc, Việt Nam đứng thứ 24 về sản lượng ngô và thứ 28 về diện tích trồng ngô
nhưng chỉ đứng thứ 56 về năng suất ngô vào năm 2016 [31]. Năng suất ngô trung
bình năm 2016/2017 chỉ đạt 4,60 tấn/ha và với chi phí sản xuất lớn, sản lượng ngô
quốc nội không thể cạnh tranh với ngô từ các nước khác. Ngô sản xuất trong nước
chỉ đủ để đáp ứng từ 40 - 50% nhu cầu của thị trường. Do đó, hàng năm, Việt Nam
phải nhập khẩu hàng triệu tấn hạt để phục vụ công nghiệp sản xuất thức ăn chăn
nuôi (Hình 1.1). Vài năm trở lại đây, lượng ngô nhập nhẩu tăng đáng kể khiến nhà
nước phải có các chính sách khuyến khích người dân chuyển đổi các vùng trồng lúa
sang trồng ngô. Tuy nhiên, lợi nhuận từ việc trồng ngô thấp, chi phí trồng ngô cao
khiến người nông dân từ bỏ nhiều diện tích trồng ngô. Theo dự đoán, để đáp ứng
được nhu cầu về ngô, năng suất ngô nước ta phải đạt ít nhất 5 tấn/ha, giảm giá thành
sản xuất và tăng thu nhập trong người nông dân [19]. Do đó, vấn đề nâng cao sản
xuất ngô nội địa không chỉ đóng vai trò trong nông nghiệp mà còn quan trọng đối
với kinh tế nước nhà.

3


Hình 1.1. Tổng sản lượng ngô tiêu thụ theo năm tài chính giai đoạn 2015-2018 ở nước ta.
Đơn vị: triệu tấn [33]

1.1.2.

Hạn hán ảnh hưởng đến năng suất cây ngô
Năng suất trồng ngô nước ta tăng đáng kể trong những năm gần đây. Tuy

nhiên, con số 4,60 tấn/ha vẫn tương đối thấp và chưa đạt được đúng tiềm năng có
thể có ở cây ngô (so với Mỹ 11,08 tấn/ha) [31]. Năng suất của cây ngô có thể cao
hơn nhiều, nhưng trên thực tế, nhiều nhân tố chủ quan và khách quan có tác động
tiêu cực đến sản lượng ngô. Trong đó, hạn hán là một trong những nguyên nhân
chính gây mất mùa ở ngô. Nhất là khi, cùng với hiện tượng biến đổi khí hậu, các đợt
nắng nóng và hạn hán kéo dài xảy ra với tần suất ngày càng cao. Năm 2018 chứng
kiến nhiều đợt hạn hán nghiêm trọng kéo dài ở khu vực châu Âu; Mỹ phải chịu
đựng nhiều làn sóng nhiệt trong suốt mùa hè; châu Úc cũng báo cáo năm 2018 là
năm nắng nóng kỉ lục. Ở nước ta, thời điểm cuối tháng 6, đầu tháng 7 năm nay,
nắng nóng gay gắt xảy ra trên diện rộng các tỉnh Bắc Bộ và Trung Bộ đã ảnh hưởng
nghiêm trọng đến hoạt động canh tác của nông dân. Trong khi đó, vụ đông xuân
năm 2018-2019 cũng dược dự báo sẽ xảy ra nắng hạn đối với các tỉnh nam Trung
bộ và Tây Nguyên. Do đó, hạn hán là vấn đề cấp bách không chỉ đối với cây ngô
mà cả sản xuất nông nghiệp nói chung.
Hạn hán gây ảnh hưởng đến toàn bộ chu trình sống của cây ngô, đặc biệt
nghiêm trọng nếu hạn xảy ra vào giai đoạn phát triển, trước và sau khi ra hoa [12].

4


Khi bị thiếu nước, cây ngô biểu hiện một loạt các triệu chứng như toàn bộ thân và lá
sẽ chuyển từ màu xanh sang màu xanh xám, các lá có hiện tượng cuộn lại từ dưới
lên trên ngọn, khí khổng lá đóng lại, quang hợp giảm mạnh, giảm cố định carbon và
do đó sinh trưởng bị chậm lại. Nếu cây gặp hạn trước khi ra hoa 7-10 ngày, sự phát
triển của bắp sẽ chậm hơn cờ, do đó quá trình phun râu chậm hơn sự tung phấn,
điều này dẫn đến khả năng thụ phấn thấp. Nếu hạn nặng ở giai đoạn ra hoa có thể
dẫn đến việc mất hoàn toàn bắp và do đó mất năng suất [8]. Nếu hạn hán xảy ra

trong thời gian tạo hạt, bắp ngô sẽ có ít hàng hạt và các hàng không có nhiều hạt
[13]. Như vậy, hạn hán dù ngắn hay dài, nhẹ hay nghiêm trọng cũng ảnh hưởng
không nhỏ đến năng suất của cây ngô.
1.1.3.

Nâng cao năng suất ngô trong điều kiện hạn hán
Hai hướng tiếp cận chính để giảm thiểu thiệt hại do thiên tai nói chung và

hạn hán nói riêng đối với cây trồng là (1) giảm khả năng cây gặp điều kiện bất lợi
và (2) làm tăng khả năng cây chống chịu với các bất lợi đó.
Để giảm khả năng cây gặp hạn, thông thường cần cải tạo hệ thống thủy lợi
tưới tiêu, xây dựng các hồ dự trữ nước để đối phó với điều kiện hạn. Đôi khi, việc
thay đổi phương thức canh tác, thời gian canh tác cũng có thể giúp cây hạn chế gặp
hạn ở các giai đoạn quan trọng trong chu trình sống. Tuy nhiên, thực tế là, ước tính
khoảng 80% diện tích trồng ngô của nước ta không có hệ thống thủy lợi, hoạt động
tưới tiêu phụ thuộc vào nguồn nước mưa tự nhiên. Hơn nữa, phần lớn ngô được
trồng trên khu vực đồi núi trọc, núi đá, các khu vực này thường có khí hậu khắc
nghiệt, điều kiện thời tiết thất thường, khả năng giữ nước của đất kém. Vì vậy, biện
pháp giảm khả năng cây ngô gặp hạn trở nên bất khả thi trong thời gian cấp bách
khi các đợt hạn xảy ra nhiều và khó dự báo hơn.
Biện pháp làm tăng khả năng chống chịu với hạn của cây ngô được cho là có
tiềm năng và lợi thế hơn. Hiện nay, người ta có thể dùng phương pháp lai tạo giống
hoặc tạo cây chuyển gen để tạo ra các cây có tính trạng mới tốt hơn. Phương pháp
lai tạo được coi là phương pháp truyền thống để tạo giống mới. Tuy nhiên, lai tạo

5


ngô cần nhiều thời gian, công sức và diện tích trồng. Hơn nữa, trong quá trình lai
tạo, bên cạnh tính trạng mong muốn thường đi kèm với các tính trạng không mong

muốn. Ngoài ra, sự cách ly sinh sản giữa các loài cũng là một trong những hạn chế
của phương pháp lai tạo giống này [6]. Trong khi đó, phương pháp tạo cây biến đổi
gen mang lại nhiều lợi thế cho người tạo giống. Thời gian để tạo cây mang tính
trạng mong muốn cần ít thời gian hơn, phương pháp sàng lọc đơn giản hơn. Đồng
thời, sự cách biệt về khoảng cách di truyền được xóa bỏ giúp các nhà khoa học có
thể đưa vào cây trồng các đặc tính tốt của những loài nằm rất xa trong cây phát sinh
chủng loại [6]. Do đó, ngày càng nhiều các giống cây trồng mới được tạo ra là kết
quả của công nghệ tạo cây biến đổi gen.
1.2.
1.2.1.

Nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen chịu hạn
Tình hình nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen trên thế giới
Các nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen trên thế giới bắt đầu từ những cuối

những năm 1980, sau đó tăng dần vào đầu những năm 1990 và tăng mạnh trong giai
đoạn 2000 - 2010 cùng với sự phát triển của cây trồng biến đổi gen nói chung (Hình
1.2) [32]. Tuy nhiên, số lượng các thử nghiệm trên đồng ruộng của cây ngô biến đổi
gen luôn chiếm tỉ lệ cao trong tổng số các thử nghiệm được USDA cấp phép trong
những năm qua, khoảng 30-50% (Hình 1.2). Đồng thời, diện tích trồng ngô biến đổi
gen cũng tăng mạnh trong những năm gần đây. Tuy nhiên, số lượng các thử nghiệm
trên đồng ruộng của cây ngô chuyển gen đang có xu hướng giảm trong vài năm gần
đây, cùng với xu hướng của cây chuyển gen nói chung. Nguyên nhân là do cây số
lượng lớn các nghiên cứu tìm kiếm các gen và con đường tiềm năng liên quan đến
các tính trạng tốt đã được thực hiện từ những năm 2000. Do đó, các nghiên cứu hiện
tại phần lớn tập trung vào việc khai thác các gen giá trị, tích hợp các gen này vào
cùng một cây và tối ưu các yếu tố liên quan đến điều hòa gen trong cây chuyển gen.

6

Hình 1.2. Số lượng các thử nghiệm cây biến đổi gen trên đồng ruộng qua các năm [32].

Đến nay, ngô là loài cây trồng có số lượng sự kiện chuyển gen được USDA
thông qua nhiều nhất với 148 sự kiện [18]. Từ đó đến nay, không thể phủ nhận lợi
ích của ngô chuyển gen mang lại cho kinh tế, xã hội và môi trường. Năm 2017, diện
tích trồng ngô biến đổi gen đạt 59,7 triệu ha toàn cầu, chiếm 32% tổng diện tích
trồng ngô nói chung (188 triệu ha) [19]. Trong đó, 5,3 triệu ha trồng ngô có khả
năng kháng sâu, 6,3 triệu ha ngô kháng thuốc diệt cỏ và 48,1 triệu ha trồng ngô có
cả hai đặc tính trên. Việc trồng ngô biến đổi gen đã mang lại lợi nhuận cho người
nông dân trong giai đoạn 21 năm (1996-2016) ước tính đạt 63,7 tỷ đô la Mỹ và chỉ
riêng trong năm 2016 là 6,9 tỷ đô la Mỹ [19].
1.2.2.

Tình hình nghiên cứu tạo giông ngô biến đổi gen chịu hạn trên thế giới
Những thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các giống cây biến đổi gen chịu

hạn nói chung và cây ngô nói riêng bắt đầu từ năm 1998 với số lượng ít và tăng
chậm trong 6 năm sau đó [32]. Tuy nhiên, con số này tăng dần từ năm 2005, đạt ổn
định tương đối vào giai đoạn 2008-2015 (khoảng 100-150 thử nghiệm mỗi năm).
Sau đó, số lượng các thử nghiệm giảm từ từ, đến năm 2017, chỉ 55 thử nghiệm về
cây chuyển gen chịu hạn được cấp phép (Hình 1.3). Trong đó, cây ngô có số lượng
thử nghiệm trên đồng ruộng cao nhất, trung bình chiếm 87% trong tổng số các loài
cây trồng. Tuy vậy, so với các tính trạng trên cây ngô như kháng thuốc diệt cỏ hoặc
thuốc trừ sâu, các thử nghiệm về tính trạng chịu hạn vẫn còn hạn chế (chiếm 9%).

7


Hình 1.3. Số lượng các thử nghiệm đồng ruộng của cây biến đổi gen chịu hạn [32].

Giống ngô chịu hạn đầu tiên là Genuity® DroughtGard™, do Công ty
Mosanto sản xuất, được phê duyệt bởi USDA vào tháng 12 năm 2011, chứa gen
CspB (cold shock protein B) có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Theo thống
kê của ISAAA [19], diện tích trồng ngô Genuity® DroughtGard™ tăng từ 50.000
ha vào năm 2013 lên 810.000 ha vào năm 2015. Năm 2016, diện tích trồng ngô biến
đổi gen chịu hạn đạt 1,2 triệu ha đã tạo ra lợi ích về kinh tế đạt 20 triệu đô la Mỹ, so
với giai đoạn 2014-2016 là 33,3 triệu đô la Mỹ [19]. Giống ngô này sử dụng nước
hiệu quả trong điều kiện bất lợi, do đó đã làm giảm các chi phí liên quan đến động
tưới tiêu. Người nông dân ở các nước đang phát triển, có cánh đồng nhỏ và ít tập
trung hơn sẽ thu được nhiều lợi ích hơn từ công nghệ này. Hơn nữa, các sự kiện ngô
với tính trạng kết hợp như chịu hạn, chịu thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu đã được thử
nghiệm từ năm 2014. Năm 2017, khoảng 1,4 triệu ha ngô chuyển gen chịu hạn với
các tính trạng kết hợp khác [19]. Giống ngô biến đổi gen chịu hạn này cũng sẽ
mang lại lợi ích cho người nông dân ở các nước thường xuyên phải đối mặt với các
đợt hạn nghiêm trọng như châu Phi, châu Âu và một vài khu vực châu Mỹ Latin và
châu Á.

8


1.2.3.

Tình hình nghiên cứu cây ngô biến đổi gen ở Việt Nam
Công nghệ sinh học được coi là công cụ quan trọng để đạt các mục tiêu quốc

gia, do đó đang được tập trung nghiên cứu và phát triển để hiện đại hóa nền nông
nghiệp và góp phần phát triển nông thôn Việt Nam. Tầm nhìn của nước ta đến năm
2020 là 70% các sản phẩm công nghiệp có nguồn gốc từ công nghệ sinh học. Trong
đó, 30-50% là cây trồng biến đổi gen, 70% các cây giống có nguồn gốc từ nuôi cấy

in vitro, 80% diện tích trồng rau và hoa quả sử dụng phân bón và chế phẩm trừ sâu
có nguồn gốc sinh học. Cuối cùng, công nghệ sinh học với vai trò là một cấu thành
của khoa học và công nghệ đóng góp 50% vào giá trị nông nghiệp ở nước ta [19].
Ở Việt Nam, ngô là cây trồng biến đổi gen đầu tiên được chấp thuận trồng
thương mại [19]. Với con số 45.000 ha vào năm 2017, diện tích trồng ngô đạt mức
tăng trưởng 13 lần so với năm 2015 là 3.500 ha. Đồng thời, ước tính 37.500 người
nông dân đã chấp thuận và trồng ngô biến đổi gen vào năm 2017, tăng 29% so với
năm 2016 [19]. Đến nay, Việt Nam đã cấp phép cho 22 sự kiện cây biến đổi gen,
trong đó có 14 sự kiện là cây ngô được sử dụng làm thức ăn và thức ăn chăn nuôi.
Trong đó, năm sự kiện (một sự kiện kháng thuốc diệt cỏ và bốn sự kiện đồng thời
kháng côn trùng và thuốc diệt cỏ) được cho phép trồng thương mại ở nước ta [19].
Các giống ngô chuyển gen được trồng từ năm 2015 chủ yếu mang tính trạng kết
hợp kháng côn trùng và kháng thuốc diệt cỏ. Nghiên cứu của Brookes và Barfoot đã
ước tính rằng, việc chấp thuận ngô biến đổi gen vào năm 2015 đã dần dần mang lại
lợi nhuận cho người nông dân và đồng thời được cho là làm giảm lượng ngô nhập
khẩu [7]. Cụ thể, lợi ích của việc trồng ngô biến đổi gen từ năm 2015 đến 2016 ở
Việt Nam đạt 5,45 triệu đô la Mỹ, trong đó 5 triệu đô la Mỹ chỉ tính trong năm
2016. Do đó, người nông dân Việt Nam sẽ có lợi nhiều hơn khi xu hướng chấp nhận
cây biến đổi gen tăng nhanh [7].
Các nghiên cứu phân lập gen và tạo cây ngô chuyển gen ở Việt Nam mới
đang ở giai đoạn đầu tuy nhiên đã đạt được những thành tựu nhất định. Nhóm
nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Đồng [2-4] đã phân lập và chuyển thành công

9


các gen chịu hạn ZmNF-YB2 và IPT vào các dòng ngô VH1 và C8H9 cho kết quả
ổn định và đồng đều. Một nghiên cứu khác thực hiện chuyển gen CspB đã tối ưu
hóa codon vào ba dòng ngô Việt Nam V152N, C436 và C7N với hiệu suất chuyển
gen của ba dòng lần lượt là 0,90%, 0,28% và 0,50% [5]. Các nghiên cứu khác hiện

nay tập trung vào việc phân lập các gen có giá trị và tiềm năng liên quan đến các
tính trạng mong muốn; tối ưu hóa các quy trình chuyển gen và nuôi cấy mô để phù
hợp với các dòng ngô nền của Việt Nam.
1.3.
1.3.1.

Tính trạng chịu hạn ở thực vật và nhân tố phiên mã DREB
Cơ sở phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật
Khi cây đối mặt với hạn, một loạt các thay đổi về mặt sinh lý và hóa sinh

được diễn ra ở cấp độ tế bào, bao gồm mất lực trương, thay đổi tính thấm và thành
phần của màng, thay đổi nồng độ các chất hòa tan và sự tương tác của proteinprotein hay protein-lipid [9]. Cây có thể chống chịu với hạn bằng các cơ chế như
tránh sự mất nước, thích ứng với sự mất nước, hoặc cả hai. Các hình thức chống
chịu trên được điều khiển bởi các tính trạng hình thái và sinh trưởng như độ dày của
rễ, khả năng rễ xâm nhập vào các lớp đất đặc, độ sâu và sinh khối rễ. Các tính trạng
mang tính cơ định trên được thể hiện kể cả khi cây không gặp điều kiện hạn. Trong
khi đó, các tính trạng mang tính thích ứng, ví dụ như khả năng điều hòa thẩm thấu
và thích nghi với hạn, xuất hiện khi hiện tượng thiếu nước xảy ra [17]. Sự giảm hoạt
động quang hợp, tích lũy các chất hữu cơ và hòa tan và sự thay đổi trong quá trình
chuyển hóa carbohydrate là các đáp ứng sinh lý và hóa sinh điển hình khi cây gặp
bất lợi. Sự giảm các hoạt động quang hợp là do các sự kiện khác nhau, ví dụ việc
đóng khí khổng và giảm hoạt động của enzyme trong chu trình. Việc tổng hợp các
chất có hoạt tính điều hòa thẩm thấu là một trong các cơ chế giúp cây thích nghi với
điều kiện thiếu nước. Các phân tử này, hoạt động như là các nhân tố giúp cân bằng
thẩm thấu, sẽ tích lũy trong các tế bào thực vật khi hạn xảy ra và sau đó bị phân giải
khi điều kiện môi trường trở về bình thường. Đồng thời, các protein tham gia vào

10

trung hòa các gốc oxi hóa tự do sinh ra khi cây gặp bất lợi cũng đóng vai trò bảo vệ
các thành phần của tế bào (Hình 1.4).

Hình 1.4. Các nhóm protein tham gia vào quá trình đáp ứng của cây khi gặp hạn [28].

Các thay đổi kể trên là kết quả của sự kết hợp hài hòa giữa sự đóng hoặc mở
các nhóm gen liên quan trong cây. Việc nắm rõ cơ sở phân tử của quá trình đáp ứng
hạn là vô cùng quan trọng trong cải tiến khả năng chịu hạn của giống thông qua
công nghệ gen. Nhiều nghiên cứu đã phân lập và đánh giá hàng trăm gen được cảm
ứng khi cây gặp hạn. Sản phẩm của các gen này hoặc tham gia tiếp nhận và dẫn
truyền tín hiệu bất lợi cho tế bào, hoặc điều hòa sự biểu hiện của các gen đáp ứng,
hoặc tham gia bảo vệ và duy trì hoạt động tế bào (Hình 1.4). Trong khi các gen mã
hóa cho protein tham gia bảo vệ có tác dụng trực tiếp, các gen mã hóa cho các
protein tiếp nhận và dẫn truyền và nhân tố phiên mã lại gián tiếp giúp cây tồn tại
bằng cách ảnh hưởng đến các gen khác [17].
Việc sử dụng một hoặc một vài gen mã hóa protein bảo vệ giúp các nhà khoa
học kiểm soát đầu ra rõ ràng hơn bởi hoạt động của các sản phẩm gen có tác động
trực tiếp lên kiểu hình chịu hạn. Tuy nhiên, tính trạng chịu hạn là một tính trạng
phức tạp, việc tác động lên một vài gen bảo vệ thường không đủ hiệu quả. Hơn nữa,
việc chuyển đồng thời nhiều gen vào cây không những yêu cầu kĩ thuật cao và thời

11


gian dài mà còn có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến sự cân bằng hệ gen của cây. Do
đó mà hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu đến nhóm gen mã hóa
cho nhân tố phiên mã hoặc nhân tố tham gia tiếp nhận và truyền tín hiệu. Nguyên
nhân là do chỉ cần thao tác trên một gen thuộc nhóm này cũng có thể tạo nên ảnh
hưởng đến nhiều gen khác nhau và do đó tác động lên kiểu hình theo nhiều hướng
khác nhau để cùng tạo nên tính trạng mong muốn. Tuy nhiên, điều này cũng cần

được nghiên cứu một cách kỹ càng và cẩn thận bởi các tác động có thể gây ra bất
thường trong sinh trưởng của cây.
1.3.2.

Họ nhân tố phiên mã DREB
Nhân tố phiên mã là các protein tham gia khởi động quá trình phiên mã của

gen bằng cách bám vào các vùng trình tự đặc hiệu nằm trên vùng promoter của gen
đó. Các nhân tố phiên mã làm thay đổi mức độ biểu hiện của các gen đáp ứng với
hạn kể trên, từ đó các đặc điểm sinh lý và hóa sinh của cây được điểu chỉnh phù hợp
để cây sống sót và duy trì sinh trưởng trong điều kiện thiếu nước. Trong nhiều năm
qua, các nhà khoa học đã phát hiện và nghiên cứu nhiều họ nhân tố phiên mã khác
nhau tham gia vào con đường đáp ứng của cây với điều kiện bất lợi, trong đó có
điều kiện hạn. Các nhân tố phiên mã đáp ứng với hạn gồm WRKY, zinc finger,
AP2/ERF2 (AP2/ethylene-responsive element-binding), MYB và NAC [30].
Ở thực vật, nhóm nhân tố phiên mã đáp ứng tốt nhất với các điều kiện bất lợi
là protein C-repeat-binding factor (CBF)/dehydrationresponsive element-binding
(DREB) thuộc họ protein AP2/ERF2 [22]. Promoter của các gen được điều hòa bởi
các nhân tố phiên mã DREB có chứa yếu tố DRE (Dehydration Responsive
Element), với trình tự lõi là A/GCCGAC. Nhân tố phiên mã DREB bám vào các
trình tự DRE bằng domain bám DNA đặc hiệu - AP2 và được phân thành hai nhóm:
DREB1 và DREB2 [21]. Mặc dù chúng chủ yếu tham gia con đường điều hòa của
các gen liên quan đến bất lợi về nước, những chức năng khác cũng được tìm thấy ở
từng gen DREB nhất định. Ví dụ, gen DREB1D/CBF4 có vai trò trong khả năng
thích ứng với hạn của cây, trong khi gen tương đồng với nó là DREB1A/CBF3 lại

12


có chức năng trong đáp ứng với lạnh [16]. Trong khi đó, protein DREB1C/CBF2

được xác định là nhân tố điều hòa dương tính trong con đường đáp ứng với lạnh ở
cây bằng việc điều hòa chặt chẽ sự biểu hiện của hai gen DREB1A/CBF3 và
DREB1B/CBF1 [23]. Hai nhân tố phiên mã thuộc nhóm DREB2 là DREB2A và
DREB2B ở cây Arabidopsis thaliana lại cho thấy vai trò ở hai điều kiện bất lợi
khác nhau, lần lượt là bất lợi về thẩm thấu và nhiệt độ cao [26]. Trong khi đó, gen
DREB2B phân lập từ lúa tăng cường khả năng chịu hạn và lạnh ở cây chuyển gen
[10]. Đồng thời, một gen thuộc nhóm DREB2 phân lập từ cây dương (Populus
euphratica) lại có hiệu quả trong cả điều kiện lạnh, mất nước và nồng độ muối cao
[11]. Có thể thấy, các gen DREB khác nhau có sự phân hóa chức năng rõ ràng và
hiện đang là một vấn đề được quan tâm. Dù vậy, các nghiên cứu trên nhiều loài
khác nhau, ví dụ như lúa, cà chua, đậu tương, lúa mì, lúa mạch và ngô gợi ý rằng
gen DREB nằm ở trung tâm trong con đường đáp ứng bất lợi ở thực vật.
1.3.3.

Nhân tố phiên mã ZmDREB2.7
Protein DREB2.7 thuộc họ nhân tố phiên mã DREBs/CBFs (Dehydration

Responsive Element Binding proteins/C-repeat Binding Factors - DREBs). Liu và
cộng sự đã phân tích protein ZmDREB2.7 và phát hiện rằng protein có khả năng
bám với hai trình tự DRE điển hình, ACCGAC và GCCGAC với ái lực như nhau
[22]. Khi so sánh với protein ZmDREB2A, protein ZmDREB2.7 cũng có ái lực bám
thấp với trình tự GCC - trình tự đặc trưng trong promoter của các gen đáp ứng với
ethylene hay các bất lợi sinh học [24]. Điều này thể hiện rằng tình tự GCC không
phải là vị trí nhận biết đặc hiệu của protein ZmDREB2.7. Khi chuyển gen
ZmDREB2.7 vào Arabidopsis, người ta nhận thấy, cây chuyển gen tăng khả năng
chịu hạn lên đáng kể. Phần lớn các dòng chuyển gen biểu hiện protein ZmDREB2.7
có kiểu hình bình thường trừ một dòng có mức độ biểu hiện cao nhất của protein
này có sự giảm nhẹ về kích thước lá. Như vậy, sự biểu hiện của yếu tố phiên mã này
không ảnh hưởng nhiều đến kiểu hình và sự sinh trưởng của cây [22].

13


Liu và cộng sự đã phân tích dữ liệu hệ gen của ngô tham chiếu B73 và xác
định được 20 gen ZmDREB khác nhau [22]. Trong đó, gen ZmDREB2.7 trong ngô
B73 dài 1080bp, không chứa intron và nằm trên NST số 1. Nghiên cứu của Liu và
cộng sự đồng thời chỉ ra rằng gen ZmDREB2.7 có mức độ biểu hiện rất thấp ở các
mô khác nhau và chỉ được cảm ứng biểu hiện nhẹ ở mô rễ và lá dưới điều kiện khô
hạn. Tuy nhiên, protein ZmDREB2.7 lại có khả năng hoạt hóa phiên mã cao so với
các protein ZmDREB khác. Như vậy, gen ZmDREB2.7 đóng vai trò quan trọng
trong cơ chế đáp ứng với bất lợi phi sinh học của ngô [22]. Do đó, gen ZmDREB2.7
từ các giống chống chịu hạn tốt có thể cung cấp nguồn vật liệu di truyền giá trị cho
chuyển gen và lai tạo giống.

14


Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
Vật liệu

2.1.

Mẫu thực vật

2.1.1.

- Nguồn vật liệu phân lập gen là giống ngô Tẻ vàng 1 do Viện Nghiên cứu
Ngô cung cấp. Hạt ngô được gieo trong phòng thí nghiệm đến giai đoạn ba lá thì thu
mẫu để phân lập gen.
- Nguồn vật liệu để chuyển gen là phôi non dòng ngô K7 do Viện Nghiên cứu

Ngô cung cấp. Cây ngô được trồng và chăm sóc ngoài đồng ruộng. Sau 55 - 60
ngày, các cây cho phôi được thụ phấn bằng các hạt phấn màu trắng hoặc vàng sáng
từ cây cho phấn. Sau 9 - 13 ngày, bắp ngô non được thu để cung cấp phôi cho thí
nghiệm chuyển gen.
Chủng vi khuẩn, vector và mồi

2.1.2.

- Chủng vi khuẩn cho thí nghiệm nhân dòng là Escherichia coli DH10β.
Chủng vi khuẩn sử dụng để chuyển gen vào cây ngô là A. tumefaciens EHA105.
Các chủng vi khuẩn do Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen
cung cấp.
- Các vector được sử dụng trong nghiên cứu gồm: vector nhân dòng pJET 1.2
(Thermo Scientific, Mỹ), vector nhân dòng trung gian pRTL2/rd29A và vector biểu
hiện thực vật pCAMBIA1300 do Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu
hệ gen cung cấp.
- Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu được thiết kế và tổng hợp bởi
Công ty Integrated DNATechnologies (Mỹ). Danh sách các cặp mồi được liệt kê
trong Bảng 2.1

15