Khảo Sát Hiệu Lực Diệt Sâu Và Khả Năng Sinh Sản Của Hai Chủng Tuyến Trùng S - Xt Và H - Cp16

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HIỆU LỰC DIỆT SÂU VÀ KHẢ NĂNG SINH
SẢN CỦA HAI CHỦNG TUYẾN TRÙNG S – XT VÀ H –
CP16 TRÊN SÂU XANH DA LÁNG Spodoptera exigua VÀ
XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH CÔN TRÙNG CỦA
TUYẾN TRÙNG

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện

: LÊ QUỐC VŨ

MSSV: 1151110545

Lớp: 11DSH05

TP. Hồ Chí Minh, 2015


LỜI CAM ĐOAN

Là sinh viên năm năm cuối của Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, nay
được vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn tất chương trình học của mình. Tôi cam
đoan đây là nghiên cứu do tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học
– Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh.
Những số liệu, hình ảnh trong bài hoàn toàn trung thực chưa từng có ai công bố.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Lê Quốc Vũ


LỜI CẢM ƠN
Tận đáy lòng con xin ghi khắc công lao cha mẹ đã gian khó nuôi dạy con thành
người. Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất, là người nâng con dậy sau mỗi lần vấp
ngã, là động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống.
Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Trường
Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức
quý giá ngay từ những ngày đầu tiên bước vào giảng đường đại học.
Đặc biệt, con xin chân thành biết ơn cô Nguyễn Hoài Hương, người thầy đáng
kính, luôn hết mình chỉ dạy để con có thể hoàn thành đồ án. Và hơn thế nữa là những
lời khuyên, bài học cuộc sống cô dạy bảo, sẽ là hành trang quý báu cho con sau này.
Con cũng xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn con về
phương pháp nuôi sâu, tuyến trùng và cũng là người cho con nguồn nấm bệnh trong
những thí nghiệm. Con cũng chân thành cô Đỗ Thị Tuyến đã cho con vi khuẩn chỉ thị
và hoá chất để con có thể hoàn thành đồ án.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng, cô
Nguyễn Trần Thái Khanh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng
thí nghiệm.
Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH đã luôn khích lệ và giúp đỡ mình trong suốt quá
trình học tập tại trường. Cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Anh Kha, anh Nguyễn Ngọc

Phong, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, bạn Phan Nguyễn Hương Thảo, Phạm Hải Hậu, Đinh
Thị Minh Châu, Hồ Thị Bích Phương cùng em Lê Thị Ngọc Dung 12DSH01 đã cùng
đồng hành, sát cánh trong những ngày làm đồ án tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015
SVTH: Lê Quốc Vũ


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................x
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................4
1.1 Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) ..............................................4
1.1.1. Khái niệm EPN .................................................................................................4
1.1.2. Vai trò và ƣu thế của EPN.................................................................................4
1.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng .........................................................5
1.2.1. Phân loại ............................................................................................................5
1.2.2. Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis.....................6
1.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus .......................7
1.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae .....................................................8
1.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus .........................................................9
1.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản ..................................................................11
1.4. Tổng quan về Serratia marcescens ....................................................................16
1.4.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens ...........................................................16
1.4.2. Phân loại Serratia marcescens ........................................................................17

1.4.3. Đặc điểm của Serratia marcescens .................................................................17
1.4.3.1. Đặc điểm sinh lý...........................................................................................17
1.4.3.2. Đặc điểm sinh hóa ........................................................................................18
1.4.3.3. Đặc điểm phân bố.........................................................................................20
i


Đồ án tốt nghiệp

1.4.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens ..............................20
1.4.4.1. Sắc tố ............................................................................................................20
1.4.4.2. Biosurfactants ...............................................................................................21
1.4.4.3. Acid béo .......................................................................................................22
1.4.4.4. Enzyme .........................................................................................................22
1.4.5. Yếu tố độc lực của Serratia marcescens .........................................................22
1.5. Mối quan hệ cộng sinh .......................................................................................23
1.5.1. Vai trò của tuyến trùng ....................................................................................23
1.5.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh........................................................................24
1.5.3. Tổng quát mối quan hệ trong tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn..........................24
1.5.4. Mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng EPN và Serratia sp.. ......................28
1.6. Khái quát về các loài côn trùng bị EPN và vi khuẩn tiêu diệt ...........................29
1.6.1. Đặc trƣng côn trùng bị EPN tiêu diệt ..............................................................29
1.6.2. Các loài côn trùng bị EPN tiêu diệt.................................................................29
1.7. Khái quát về SXDL Spodoptera exigua ............................................................30
1.7.1. Đặc điểm hình thái ..........................................................................................30
1.7.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái .......................................................................30
1.6.2.1. Vòng đời (30 – 40 ngày) ..............................................................................30
1.7.2.2. Thiên địch .....................................................................................................31
1.7.3. Một số biện pháp phòng trừ ............................................................................32
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................33

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................33
2.1.1. Thời gian .........................................................................................................33
2.1.2. Địa điểm ..........................................................................................................33
ii


Đồ án tốt nghiệp

2.2. Vật liệu – thiết bị - hoá chất ...............................................................................33
2.2.1. Nguồn vi sinh vật ............................................................................................33
2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất sử dụng .......................................................33
2.3. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................36
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm .....................................................38
2.4.1. Phƣơng pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm ..............................................38
2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu tuyến trùng in vivo ..................................................38
2.4.2.1 Phƣơng pháp thử nghiệm trong đĩa petri (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) .........38
2.4.2.2 Phƣơng pháp bẫy nƣớc thu tuyến trùng Whitetrap (White, 1927)................39
2.4.2.3. Phƣơng pháp lọc rửa tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2009) ...................39
2.4.2.4. Phƣơng pháp đếm tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) ........................40
2.4.2.5. Phƣơng pháp bảo quản tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Phong, 2013) ..............40
2.4.2.6. Phƣơng pháp xác định hoạt động của tuyến trùng (Albrecht M.
Koppenhofer, 2007) ..................................................................................................41
2.4.2.7. Thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16
trên đối tƣợng SXDL tuổi .........................................................................................41
2.4.2.8. Thí nghiệm khảo sát sự tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm - sản lƣợng IJ
và chu kì kí sinh – phát tán của các chủng tuyến trùng trên vật chủ SXDL .............43
2.4.2.9. Thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S – XT, H
– CP16 bằng phƣơng pháp tiêm và bƣớc đầu xác định tác nhân gây chết................44
2.4.3. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn .....................................................................46
2.4.3.1. Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp của Akhurst (1980) và

Sun Ho Park và Yeon Su Yu (1999) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2009) ...................46
2.4.3.2. Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp của Lawrwnce A.
Lacey (2011) .............................................................................................................48
iii


Đồ án tốt nghiệp

2.4.3.3. Phƣơng pháp chứng minh nội sinh ..............................................................48
2.4.3.4. Phƣơng pháp định lƣợng vi khuẩn nội sinh ................................................49
2.4.4. Phƣơng pháp định danh vi khuẩn phân lập .....................................................49
2.4.4.1. Phƣơng pháp kiểm tra độ thuần khiết ..........................................................49
2.4.4.2. Phƣơng pháp quan sát hình thái, sinh lý ......................................................50
2.4.4.3. Thử nghiệm sinh hoá ....................................................................................50
2.4.4.4. Phƣơng pháp định danh bằng APIKIT 20E ..................................................50
2.4.4.5. Giải trình tự 16S rRNA ................................................................................50
2.4.5. Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính sinh học........................................................50
2.4.5.1. Phƣơng pháp định tính enzyme ....................................................................50
2.4.5.2. Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng kháng sinh .....................................51
2.4.5.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn- phƣơng pháp cấy chéo ............................51
2.4.5.4. Khảo sát hoạt tính kháng nấm ......................................................................53
2.4.5.5. Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phƣơng pháp tiêm .....................................53
2.4.5.6. Khảo sát sự tính tƣơng tác tổ hợp vi khuẩn và tuyến trùng EPN .................54
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ...................................................................56
3.1. Kết quả đánh giá LD50 của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 .........56
3.1.1. Chủng S – XT..................................................................................................57
3.1.2. Chủng H – CP16 .............................................................................................58
3.2. Khả năng sinh sản của tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên SXDL ...............60
3.2.1. Khả năng nhân của 2 chủng tuyến trùng trên SXDL tuổi 4 ............................62
3.2.1.1. Chủng S – XT...............................................................................................62

3.2.1.2. Chủng H – CP16 ..........................................................................................63
3.2.2. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng IJ gây nhiễm và sản lƣợng IJ sinh ra .............63
iv


Đồ án tốt nghiệp

3.2.2.1. Chủng S – XT...............................................................................................64
3.2.2.2. Chủng H – CP16 ..........................................................................................66
3.2.3. Chu kỳ kí sinh và phát tán của hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H –
CP16 trên SXDL .......................................................................................................68
3.2.3.1. Chu kỳ kí sinh hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H – CP16 trên SXDL
...................................................................................................................................68
3.2.3.2. Chu kỳ phát tán của hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H – CP16 trên
SXDL ........................................................................................................................69
3.3. Xác định tác nhân gây chết sâu ..........................................................................72
3.4. Phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng ..............................................................75
3.5. Kết quả định lƣợng tổng số vi khuẩn trong tuyến trùng (cfu/IJ) .......................79
3.6. Quan sát hình thái, sinh lý ..................................................................................80
3.7. Thử nghiệm sinh hóa ..........................................................................................83
3.8. Kết quả định danh bằng KIT API 20E (Biomerieux).........................................85
3.9. Kết quả giải trình tự rRNA 16S .........................................................................86
3.10. Khả năng tiết enzymme ngoại bào ...................................................................88
3.11. Khả năng kháng kháng sinh .............................................................................91
3.12. Hoạt tính kháng khuẩn .....................................................................................94
3.14.1. Đối kháng không tiếp xúc .............................................................................95
3.14.2. Đối kháng tiếp xúc ........................................................................................96
3.13. Hoạt tính kháng nấm ........................................................................................98
3.14. Hiệu lực diêt sâu .............................................................................................101
3.17. Khảo sát sự tƣơng tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn ......................................104

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................107
v


Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................109

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
PTSH : P òng trừ sinh học
IJ
EPN

: Ấu trùng xâm nhiễm (viết tắt tên tiếng Anh: Infective juveniles).
: tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh:

entomopathogenic nematodes).
S-XT : Steinernema guangdongense XT
H-CP16: Heterorhabditis indica CP16
VKCS : Vi khuẩn cộng sinh.
BSL

: Bƣớm sáp lớn.

SB

: Serratia marcescens SB

HB

: Serratia marcescens HB

VSV

: Vi sinh vật.

SXDL

: Sâu xanh da láng

vii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng............................................... 6
Bảng 1.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus ...................................... 9
Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus ....... 11
Bảng 1.4.Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của
Xenorhabdus / Photorhabdus .............................................................................. 12
Bảng 1.5. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Photorhabdus .................................... 14
Bảng 1.6. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus....................................... 15
Bảng 1.7. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens .......................... 19
Bảng 1.8. Vòng đời của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh ................................ 27

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H –
CP16 trên đối tƣợng SXDL tuổi 4 ...................................................................... 42
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm và sản lƣợng IJ
sinh ra đối với 2 chủng tuyến trùng .................................................................... 43
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S
– XT, H – CP16 bằng phƣơng pháp tiêm ............................................................ 45
Bảng 3.1. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng S – XT ........................... 57
Bảng 3.2. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng H – CP16 ....................... 59
Bảng 3.3. Khả năng sinh sản của chủng S – XT trên SXDL ............................... 61
Bảng 3.4. Khả năng sinh sản của chủng H – CP16 trên SXDL .......................... 61
Bảng 3.5. Chu kỳ kí sinh của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên
SXDL ................................................................................................................... 68
Bảng 3.6. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng S – XT ...................... 70
Bảng 3.7. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng H – CP16 ................. 71
Bảng 3.8 Kết quả diệt sâu ở một số nồng độ gây nhiễm của hai chủng S – XT và H
– CP16 bằng phƣơng pháp tiêm .......................................................................... 73
Bảng 3.9. Kết quả khử trùng bề mặt tuyến trùng ................................................ 76

viii


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.10. Bảng tóm tắt đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng phân lập
............................................................................................................................ 84
Bảng 3.11. Kết quả định danh bằng KIT API 20E của hai chủng SB và HB ..... 85
Bảng 3.12. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của SB và HB .............................. 89
Bảng 3.13. Tỷ lệ đối kháng nấm của 2 chủng SB, HB ..................................... 100
Bảng 3.14. LD50, LD90 của chủng SB và HB sau 48 giờ đƣợc tiêm vào sâu . 103
Bảng 3.15. Tỷ lệ chết của S – XT sau 12 ngày.................................................. 104

Bảng 3.16. Tỷ lệ chết của H – CP16 sau 12 ngày ............................................. 104

ix


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng ....................................... 7
Hình 1.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus ......................... 10
Hình 1.3. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) ...... 17
Hình 1.4. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở 25oC
sau 48 giờ (David, 2012) ..................................................................................... 18
Hình 1.5. Vòng đời SXDL da láng ..................................................................... 31
Hình 2.1. Quy trình khảo sát sản lƣợng, chu kì kí sinh- phát tuyến trùng trên kí chủ
SXDL và phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng ............................................... 36
Hình 2.2. Quy trình khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa và định danh vi
khuẩn .................................................................................................................... 37
Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn mới phân lập .. 37
Hình 2.4. Quy trình phân lập vi khuẩn từ tuyến trùng EPN ............................... 47
Hình 3.1. Dấu hiệu sâu chết bởi tuyến trùng ...................................................... 56
Hình 3.2. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng S – XT
trên SXDL tuổi 4 ................................................................................................. 58
Hình 3.3. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng H –
CP16 trên SXDL tuổi 4 ........................................................................................ 60
Hình 3.4. Tƣơng quan giữa số lƣơng gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra của chủng S
– XT ..................................................................................................................... 65
Hình 3.5. Tƣơng quan giữa số lƣơng gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra của chủng
H – CP16 ............................................................................................................. 67
Hình 3.6. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng S – XT ....................... 70

Hình 3.7. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng H – CP16 .................. 72
Hình 3.8. Sâu chết bởi tuyến trùng bằng phƣơng pháp tiêm ............................... 74
Hình 3.9. Khuẩn lạc vi khuẩn từ huyết tƣơng sâu trên môi trƣờng NBTA ......... 75
Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc hai chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ tuyến trùng
khử trùng bề mặt trên NBTA, MacConkey, NA và PGA .................................... 78
x


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng SB .................................................... 80
Hình 3.12. Hình thái khuẩn lạc của chủng HB .................................................... 81
Hình 3.13. Kết quả nhuộm Gram của hai chủng SS1 và SH1............................. 83
Hình 3.14. Cây phát sinh loài của SB và HB ...................................................... 88
Hình 3.15. Khả năng tiết enzyme ngoại bào ....................................................... 90
Hình 3.16. Kết quả kháng sinh đồ ....................................................................... 92
Hình 3.17. Kết quả đối kháng không tiếp xúc ..................................................... 95
Hình 3.18. Kết quả đối kháng tiếp xúc (mặt trên) ............................................... 96
Hình 3.19. Kết quả đối kháng tiếp xúc (mặt dƣới) .............................................. 97
Hình 3.20. Kết quả đối kháng với các chủng nấm ............................................ 100
Hình 3.21. Khả năng diệt sâu của SB, HB sau 48 giờ tiêm vào sâu ................. 102
Hình 3.22. Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 giờ tiêm SB vào SXDL .......... 102
Hình 3.23. Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 giờ tiêm HB vào SXDL ......... 103
Hình 3.24. Tỷ lệ chết của chủng tuyến trùng S – XT ....................................... 105
Hình 3.25. Tỷ lệ chết của chủng tuyến trùng H – CP16.................................... 105

xi


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay ngành nông nghiệp Việt Nam đang trên đà phát triển hết sức mạnh mẽ
cả về số lƣợng và chất lƣợng, trong đó một số mặt hàng nông sản nhƣ cà phê, lúa
gạo có kim nghạch xuất khẩu cao và có vị thế trên thị trƣờng quốc tế. Nhu cầu tăng
sản lƣợng, rút ngắn thời gian sản xuất để nâng cao lợi nhuận đang đƣợc đặt ra, đi
đôi với nó luôn đòi hỏi những kiến thức để sản xuất sản phẩm an toàn.
Tuy nhiên không phải chỉ riêng Việt Nam mà hầu nhƣ tất cả các nƣớc nông
nghiệp ngƣời nông dân ít đƣợc trang bị đầy đủ kiến thức về sản xuất để đảm bảo
tính bền vững. Vì vậy ở không ít nơi ngƣời nông dân sử dụng ồ ạt các loại thuốc trừ
sâu, thuốc diệt cỏ có nguồn gốc hóa học vì không hiểu biết hay đã biết đƣợc tác hại
nhƣng vẫn cố ý sử dụng để tăng sản lƣợng, thu lợi nhuận. Chính việc sử dụng mà
không tuân thủ các quy định về liều lƣợng và cách thức đã làm dịch bệnh trở nên
nhiều hơn, nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đó, SXDL da láng
(Spodoptera exigua) là một trong những loài sâu ăn tạp khá phổ biến, phá hoại trên
nhiều loại cây trồng nhƣ họ bầu bí, họ thập tự, hành, lạc, nho,… có khả năng kháng
thuốc hóa học rất cao nếu ngƣời dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học
không đúng cách. Vì vậy xu hƣớng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đang
trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, đảm bảo sức
khỏe cho con ngƣời, đồng thời tính an toàn môi trƣờng cao.
Trong các biện pháp sinh học đƣợc sử dụng hiện nay thì dùng tuyến trùng ký
sinh gây bệnh côn trùng (EPN) gồm hai giống Steinernema và Heterorhabditis đang
đƣợc các nƣớc trên thế giới và Việt Nam đặc biệt chú ý. Tuy nhiên, các loài tuyến
trùng EPN này sẽ không thực sự phát huy hiệu quả nếu không có mặt VKCS trong
ruột chúng là nguyên nhân chính gây ra cái chết của côn trùng. Hai loài VKCS phổ
biến từng đƣợc nghiên cứu và biết đến nhiều nhất gồm Photorhabdus, Xenorhabdus
nhƣng theo một số báo cáo gần đây thì Serratia macescens cũng có vai trò này.Với
vai trò đặc biệt, VKCS trở thành mấu chốt trong mối quan hệ giữa sâu hại – tuyến
1

Đồ án tốt nghiệp

trùng – vi khuẩn. Đây đƣợc coi là những loài vi khuẩn có đời sống rất đặc biệt khi
cộng sinh trong một vật chủ và gây hại cho một vật chủ khác thông qua vật chủ mà
nó cộng sinh. Mặt khác có thể thấy đƣợc khả năng kháng mạnh với các loài vi
khuẩn có hại gây bệnh cho gia súc và các loài nấm gây hại cho nông nghiệp, điều
này mở ra những ứng dụng rất lớn. Tuy nhiên ở Việt Nam hiện chỉ có một số
nghiên cứu tại Hà Nội có liên quan đến VKCS trong tuyến trùng EPN, ở các tỉnh
thành miền Nam chƣa có nghiên cứu về vấn đề phân lập và ứng dụng vi khuẩn
cộng sinh này. Trong nghiên cứu này sử dụng hai nguồn tuyến trùng gồm
Heterorhabditis indica (H – CP16) và Steinernem guangdongense (S – XT), H –
CP16 và S – XT là hai chủng tuyến trùng mới chƣa có bất kỳ nghiên cứu về các
chủng VKCS với nó cũng nhƣ việc đánh giá hiệu lực diệt sâu của chúng trên đối
tƣợng SXDL (Spodoptera exigua) . Vì những lợi ích rất quan trọng của hai chủng
tuyến trùng và VKCS ngƣời tiến hành đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là
: “Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S
– XT và H – CP16 trên sâu xanh da láng Spodoptera exigua và xác định tác
nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng ”
2. Mục đích của nghiên cứu
Ứng dụng khả năng phòng trừ sâu hại và nhân nuôi in vivo tuyến trùng EPN trên
đối tƣợng SXDL Spodoptera exigua của hai chủng tuyến trùng S – XT và H –
CP16.
Xác định các chủng vi khuẩn là tác nhân gây bệnh côn trùng của hai chủng tuyến
trùng S – XT và H – CP16 và ứng dụng chúng trong đấu tranh sinh học bảo vệ thực
vật.
3. Nhiệm vụ của nghiên cứu
Đánh giá hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S –
XT và H – CP16 trên đối tƣợng SXDL.

Phân lập các chủng vi khuẩn là tác nhân gây bệnh côn trùng của hai chủng tuyến
trùng S – XT và H – CP16.

2


Đồ án tốt nghiệp

Khảo sát các hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập và bƣớc đầu xác
định mối quan hệ giữa chúng với hai loài tuyến trùng khảo sát.
4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài.
Xác định đƣợc chỉ số LD50 và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng trên
đối tƣợng SXDL.
Phân lập đƣợc hai chủng vi khuẩn SB, HB lần lƣợt trên tuyến trùng S – XT và H
– CP16. Kết quả định danh cho thấy 2 chủng SB, HB đều thuộc loài Serratia
macescens.
Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng kháng sinh, hoạt tính enzyme, tỉ lệ ức
chế nấm bệnh gây hại cây trồng, hiệu lực diệt sâu và sự tƣơng tác với kí chủ tuyến
trùng của hai chủng vi khuẩn SB, HB.

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN)
1.1.1. Khái niệm EPN
EPN viết tắt của từ Entomopathogenic Nematodes, đây là thuật ngữ dùng để chỉ
các loài tuyến trùng kí sinh thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis, chúng

vừa có khả năng ký sinh lại vừa có khả năng gây bệnh giết chết côn trùng.
Thực chất các loài tuyến trùng kí sinh này là tổ hợp đƣợc hình thành trong tự
nhiên và có sự chuyên hóa cao, trong đó các loài tuyến trùng thuộc giống
Steinernema cộng sinh với vi khuẩn Xenorhabdus, còn Heterorhabditis thì cộng
sinh với vi khuẩn Photorhabdus. Sở dĩ đƣợc gọi là cộng sinh vì cả vi khuẩn và
tuyến trùng đều dựa vào nhau để tồn tại, phát triển, sinh sản. Đây là một hiện tƣợng
cộng sinh bắt buộc, cả tuyến trùng và vi khuẩn không thể tồn tại độc lập trong tự
nhiên (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).
1.1.2. Vai trò và ưu thế của EPN
Vai trò của EPN đƣợc thấy trƣớc tiên nhƣ là các thiên địch tự nhiên có tác dụng
điều chỉnh mật độ quần thể côn trùng, trong đó có nhiều loài sâu hại. Thực tế cho
thấy, trong tự nhiên nơi đâu có sự tồn tại của EPN thì nơi đó hầu nhƣ không bùng
phát dịch hại do côn trùng gây ra (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).
EPN đang nhận đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng có
những ƣu thế sau :
a. Phƣơng pháp s đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng
có những ƣu thế sau :t độ quần thể cô
b. EPN có kháp s đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng
có những ƣu thế sau
c. Các loài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chú
d. Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng
e. Áp dhoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng
có những ƣu thế
4


Đồ án tốt nghiệp

f.

Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng

có
g. Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là
h. Tó khoà bsâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và in vitro và in vivo. to
những ƣu thế sau :t độ quần thể côn trù
i.

Dà bsâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và in vitro và in v

1.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng
1.2.1. Phân loại
Tuyến trùng ký sinh côn trùng đã đƣợc tìm thấy trong sáu bộ tuyến trùng:
-

Aphelenchida

-

Diplogasterida

-

Mermithida

-

Oxyurid

-

Rhabditida

-

Tylenchida

Trong các bộ trên thì bộ Rhabditida, Mermithida và Tylenchida là quan trọng
nhất.
Trong bộ Rhabditida, tuyến trùng trong hai họ sau đây đã đƣợc đề cập:
-

Hrong bộ Rhabditida, tuyến trùng tSteinernema và Neosteinernema

-

Heosteinernemaitida, tuyến trùng trong Heterorhabditis.

Steinernema đã đƣợc Steiner mô tả năm 1923 với tên gọi Aplectana, vì tên này
đã đƣợc sử dụng trƣớc đó, nên năm 1927, Travassos đổi tên thành Steinernema,
trƣớc năm 1982 rất nhiều loài của tuyến trùng này có tên khác là Neoaplectana.
Hiện nay có khoảng 56 loài đã đƣợc mô tả. Neosteinernema đƣợc Nguyễn và Smart
mô tả năm 1994, tuyến trùng này chỉ có một loài và ký sinh trên mối.
Heterorhabditis đƣợc Poinar mô tả năm 1976, Heterorhabditis có 12 loài. Đây đƣợc
đánh giá là nhóm tuyến trùng quan trọng nhất trong bảo vệ mùa màng, vì vậy có
nhiều nghiên cứu tập trung về các giống này.

5

Đồ án tốt nghiệp

Vòng đời của EPN khoảng 10 - 12 ngày và trung bình từ một vật chủ cho khoảng
5×104 ấu trùng tùy thuộc vào loài và trọng lƣợng vật chủ.
Bảng 1.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng
Tên

Phân loại

Ngành

Nematoda

Lớp

Chromadorea

Phân

Chromadoria

lớp
Bộ

Rhabditida

Phân

Panagrolaimomorpha

bộ
Họ
Giống

Steinernematidae
Steinernema

Neosteinernema

Heterorhabditiae
Heterorhabditis

1.2.2. Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis
Ấu trùng tuyến trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJ) mang vi khuẩn cộng sinh trong ruột.
Khi vào đến bên trong vật chủ, chúng xâm nhập vào xoang máu, tuyến trùng sẽ
phóng thích các vi khuẩn cộng sinh từ ruột của chúng vào trong máu của côn trùng.
Vi khuẩn sẽ phát triển nhanh nhờ huyết tƣơng của côn trùng tạo ra hiện tƣợng ngộ
độc máu làm côn trùng chết trong khoảng từ 24 đến 48 giờ đồng hồ. Vi khuẩn sẽ
phân hủy mô trong cơ thể côn trùng giúp ấu trùng tuyến trùng hấp thu chất dinh
dƣỡng để phát triển sang tuổi 4 và thành thành trùng thế hệ 1. Phụ thuộc vào nguồn
dinh dƣỡng mà tuyến trùng có cách phát triển khác nhau trong cơ thể côn trùng nhƣ
hình 2.1.

6


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng
a. Chu trình sinh sản tuyến trùng trong cơ thể côn trùng

Khi nguồn thức ăn phong phú thì tuyến trùng sẽ sống theo vòng tròn nhƣ hình
2.1. Trứng của tuyến trùng thế hệ 1 sẽ nở ra ấu trùng tuyến trùng thế hệ 1 và chúng
lại tiếp tục ăn vi khuẩn để phát triển sang ấu trùng tuổi 2, 3, 4 và thành trùng thế hệ
thứ 2. Thành trùng thế hệ mới sẽ tiếp tục chu trình sống và sinh sản nhƣ ở thế hệ 1.
b. Chu trình sống khi không đủ dinh dưỡng
Khi không có đủ nguồn dinh dƣỡng thì tuyến trùng sẽ sống theo chu kỳ ngắn nhƣ
vòng nửa vòng cung phía dƣới của hình 2.1. Trứng của thành trùng thế hệ thứ 1 sẽ
nở ra ấu trùng tuổi 1, từ đây phát triển sang dạng ấu trùng tuổi 2, kế đó sẽ chuyển
sang dạng trung gian giữa ký sinh và tiềm sinh, cuối cùng thành ấu trùng gây
nhiễm, chờ thời cơ để xâm nhập vào vật chủ.
1.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus
Photorhabdus và Xenorhabdus đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh
với côn trùng cũng nhƣ cung cấp dinh dƣỡng cho tuyến trùng. Đây đƣợc đánh giá là
hai chi vi khuẩn đặc biệt nhất trong giới vi sinh vật khi cộng sinh với một vật chủ là
tuyến trùng và ký sinh gây hại với một vật chủ khác là côn trùng (Steven Forst và
David Clarke, 2011).
7


Đồ án tốt nghiệp

Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus
thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đƣờng ruột).
1.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae là một họ vi khuẩn lớn, gồm trên 100 loài mang những đặc
điểm cơ bản sau:
a. Nơi cư trú
Họ vi khuẩn đƣờng ruột gồm những vi khuẩn thƣờng trú trên cơ thể, ở ống tiêu
hóa của ngƣời và động vật, có thể gây bệnh hoặc không gây bệnh.
b. Hình thái

Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn, không sinh nha
bào. Một số giống vi khuẩn thƣờng không di động (Klebsiella, Shigella), một số vi
khuẩn khác di động (E. coli, Salmonella) nhờ có tiên mao ở xung quanh thân tế
bào. Một số giống có vỏ nhìn thấy đƣợc nhờ kính hiển vi thƣờng nhƣ Klebsiella.
c. Sinh lý
Các vi khuẩn đƣờng ruột là gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, phát triển
đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng.
d. Tính chkhuẩn đường
Lên men glucose, có sinh hơi hoặc không sinh hơi, oxidase âm tính, hầu hết
catalase dƣơng tính, khử nitrate thành nitrite.
Lên men một số đƣờng nhƣ glucose, galactose hoặc không lên men một số đƣờng
nhƣ lactose, manose, saccharose.
Có thể có một số enzyme nhƣ urease, tryptophanase.
Khả năng sinh ra H2S khi dị hóa protein, axít amin hoặc các dẫn chất có lƣu
huỳnh.

8


Đồ án tốt nghiệp

1.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus
Bảng 1.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus
STT

Phân loại

1

Giới

Bacteria

2

Ngành

Proteobacteria

3

Lớp

Gramma proteobacteria

4

Bộ

Enterobacteriales

5

Họ

Enterobacteriaceae

6

Chi

Photorhabdus

Xenorhabdus

Hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus có mối quan hệ với nhau, có thể thấy mối
quan hệ giữa hai chi qua hình 2.1.

9


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus

10


Đồ án tốt nghiệp

1.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản
Đây là hai chi có sự tƣơng tự cả về hình thái, sinh lý và sinh hóa, tuy nhiên có thể
phân biệt chúng theo một số đặc điểm cơ bản đƣợc nhắc đến trong bảng 1.3.
Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus
STT
1

2

3

5

Đặc điểm

Photorhabdus

Xenorhabdus

Trình tự 16S

Tại vị trí 208 – 213

Tại vị trí 208 – 211

rRNA
Đặc điểm
hình thái

Điều kiện
nuôi cấy

TGAAAG

TTCG

Tế bào có hình que,

Tế bào có hình que

kích thƣớc vào khoảng và kích thƣớc là (0,3 - 2
(0,5 - 2 × 1 – 10 µm)
Phát triển tối ƣu ở
0

28 C, một vài chủng phát
triển ở 37 - 380C.

Loài vật chủ
cộng sinh

Heterorhabditis

× 2 – 10 µm)
Điều kiện phát triển
tốt nhất là 280C hoặc
nhỏ hơn, một vài chủng
phát triển ở 40C.

Steinernema

Ngoài ra còn có một số đặc điểm cơ bản khác về mặt sinh hóa thì tùy thuộc từng
loài và chủng cụ thể.
a. Đặc điểm sinh lý nổi bật
Photorhabdus và Xenorhabdus là Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có cả hai quá trình
lên men và hô hấp trong tế bào.
Đặc điểm nổi bật nhất phải nhắc đến là hiện tƣợng biến đổi pha, đây đƣợc coi là
một hiện tƣợng rất độc đáo trong hai chi vi khuẩn này.
Hiện tượng biến đổi pha:
Đây là thuật ngữ để chỉ giai đoạn biến đổi tự nhiên xảy ra ở một số vi khuẩn về

một số điểm nhƣ hình thái, màu sắc, tính chất hóa lý trong tế bào vi khuẩn. Nguyên
nhân do biến đổi trong cấu trúc DNA đã làm thay đổi cấu trúc phân tử của các
11