chuyên đề “hệ thống lí thuyết và câu hỏi vận dụng chuyên đề ứng dụng di truyền học

HỘI THẢO CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC
VÙNG DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẰNG BẮC BỘ NĂM 2019

HỆ THỐNG LÍ THUYẾT VÀ CÂU HỎI VẬN DỤNG
CHUYÊN ĐỀ ỨNG DỤNG DI TRUYỀN HỌC


Năm học 2019- 2020


MỤC LỤC


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
Di truyền học ra đời năm 1900, là ngành khoa học tự nhiên nghiên cứu thế giới sinh
vật, nó có vị trí và vai trò đặc biệt đối với con người. Mendel là người đặt nền móng đầu tiên
cho di truyền học. Suốt thế kỉ 20, di truyền học đã phát triển nhanh như vũ bão, sự hiểu biết
sâu sắc về bản chất của tính di truyền đã có vai trò cách mạng hóa đối với sinh học. Nếu thế
kỉ 21 là thế kỉ của sinh học thì di truyền học là một trọng tâm của sự phát triển đó. Di truyền
học ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, y học. Với những ứng
dụng cụ thể như chọn, tạo giống vật nuôi và cây trồng, chuẩn đoán sớm bệnh tật di truyền ở
người và có khả năng chữa bệnh, dùng trong điều tra tội phạm …
Trong thực tế, di truyền học, đã và đang được đẩy mạnh nghiên cứu mạnh mẽ, càng
đào sâu tìm hiểu chúng ta càng thấy được sự logic, chặt chẽ và vô tận của nó. Các đề thi học
sinh giỏi Quốc tế, học sinh giỏi Quốc gia trong nhiều năm gần đây đều khai thác triệt để các
vấn đề xoay quanh lĩnh vực di truyền học. Trong biển kiến thức dường như “vô tận” của lĩnh
vực này, những vấn đề về chuyên đề ứng dụng di truyền học đang rất được các nhà khoa học
quan tâm. Vì vậy, nhằm biên soạn một bộ tài liệu với hệ thống lí thuyết tổng thể và những
dạng câu hỏi vận dụng chuyên sâu phục vụ cho việc giảng dạy của các thầy cô và việc ôn
luyện của các em học sinh giỏi, tôi chọn chuyên đề: “Hệ thống lí thuyết và câu hỏi vận dụng
chuyên đề Ứng dụng di truyền học”.

Cấu trúc chuyên đề gồm 3 phần:
Phần 1: Mở đầu
Phần 2: Nội dung
1. Hệ thống lí thuyết về chuyên đề Ứng dụng di truyền học.
2. Các dạng câu hỏi vận dụng chuyên sâu.
Phần 3: Kết luận

4


PHẦN 2. NỘI DUNG
A. Hệ thống lí thuyết về chuyên đề Ứng dụng di truyền học
I.
MỘT SỐ KĨ THUẬT DI TRUYỀN
1. Tách chiết và định lượng acid nucleic
I.1. Tách chiết acid nucleic
a. Phương pháp tách chiết DNA
Yêu cầu:
- Có được đủ một lượng axit nucleic mong muốn, còn nguyên vẹn.
- Không bị phân huỷ, bị gãy bởi tác động cơ giới, hoặc bị phân giải bởi một số
enzyme nội, ngoại bào và hoá chất.
- Không hoặc ít lẫn tạp protein, RNA và một số đại phân tử khác như lipid, gluxit và
các xác tế bào khác.
Nguyên lý:
- Vận dụng tính kị nước của phenol để kết tủa protein => loại bỏ protein
- Sử dụng hỗn hợp phenol:phenol-chloroform và chloroform để loại bỏ hoàn toàn
protein và lipit
Trong cả bước trên, DNA vẫn tan trong nước.
- Kết tủa DNA trong Ethanol 70o để tinh sạch hoàn toàn
Các bước cơ bản:

1. Thu mẫu, phá vỡ tế bào, nhân => giải phóng các thành phần bên trong
Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Ở tế bào động vật hoặc thực vật, bằng cách
nghiền tế bào hoặc mô trong nitơ lỏng – 1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS,
Sarcosyl) và proteinase K.

Hình 1. Nghiền tế bào bằng cối chày sứ

5


2. Hòa tan DNA và loại bỏ các thành phần không mong muốn như các protein,
polysaccharide.
Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamine tỉ lệ
25:24:1), lắc mạnh cho đến khi dung dịch có dạng trắng sữa.
Protein sẽ bị biến tính và kết tủa
DNA, RNA được hoà tan trong nước.
Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha:
+ Pha trên cùng là pha nước chứa DNA, RNA.
+ Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa.
+ Phá dưới là dung dịch phenol: chloroform: isoamine

Hình 2. Li tâm mẫu

3. Kết tủa DNA
+ Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở - 20 oC trong 30 phút hoặc ở
0oC qua đêm. Hầu như toàn bộ các phân tử axít nucleic đều kết tủa.
+ Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0 oC, các phân tử DNA có trọng lượng phân tử
thấp không bị kết tủa.
Sau đó ly tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn được rửa bằng cồn 70% để loại
bỏ muối và isopropanol còn lại.

4. Hòa tan DNA, loại bỏ ARN
Hoà tan cặn (DNA, RNA) và xử lý loại bỏ RNA bằng enzyme Rnase. Sau đó kết
tủa lại được DNA.

6


7
5

Hòa tan cứ 100 mg mô nghiền thành bột trên với 1,2 ml dung dịch phân giải. Vừa ủ mẫu và vừa lắc nhẹ ở nhiệt độ 500C từ 12 – 18h, nhớ

•

Chiết xuất DNA bằng cách thêm vào mẫu một lượng thể tích tương đương hỗn hợp Phenol :Chloroform : Isoamyl alcohol.

•

Ly tâm trong vòng 10 phút với tốc độ vòng quay là 1700 x g

•

4

3

đậy chặt ống nghiệm, bước này nhằm phá hủy và phân rã màng tế bào.

2

Chuẩn bị tế bào: Cắt càng nhanh càng tốt lấy mẫu mô động vật bỏ vào ống nghiệm, đặt ngay vào nitơ lỏng. Trường hợp nếu lấy mô gan thì

•

Lấy từ 200 mg đến 1 g mô, nghiền trong cối và chày đã được làm lạnh trước trong nitơ lỏng

•

1

phải bỏ mật ra vì mật chứa nhiều enzym phân rã DNA.

Tách chiết DNA động vật


8
10
10

Rửa pellet bằng cồn 70%, để bay hơi làm khô ethanol cần đặt ống nghiệm trong bình hút chân không hoặc úp ngược ống nghiệm để

•

0
Hòa tan DNA trong TE bufer, có thể lắc nhẹ ở nhiệt độ trong phòng hoặc ở nhiệt độ 65 C trong vài giờ.

•

0
Bảo quản ở nhiệt độ 4 C, pha nồng độ để có khoảng 1mg/ml DNA, nồng độ này được sử dụng trong nhiều nghiên cứu

•

99

88
khô tự nhiên trong phòng.

•

77
Thu nhận DNA kết tủa bằng cách quay ly tâm với tốc độ 1700 x g trong 2 phút. Khâu này nếu nồng độ muối trong mẫu cao sẽ làm
giảm lượng RNA trong dung dịch DNA.

•

Tinh lọc DNA, chuyển lớp dung dịch phía trên (chứa DNA) sang ống nghiệm mới, rồi thêm dung dịch 7,5 M amonium acetate với

66

lượng bằng 1/2 dung tích mẫu và 2 lần thể tích ban đầu 100% ethanol=> DNA sẽ kết tủa.


Tinh sạch DNA
Hòa tan pellet với 9 ml dung dịch TE, ủ 550C, + 9,7g CsCl đặc rồi trộn nhẹ
Ủ mẫu trong đá 30 phút, ly tâm 10 phút 8000rpm ở 4 0C => thu lấy dịch phía trên.
+ 0,5ml dung dịch 10mg/ml ethidium bromide vào rồi ủ trong đá 30 phút.
Ly tâm 8000 x g ở 40C trong 10 phút.
Chuyển dung dịch phía trên sang 2 ống nghiệm dung tích 5 ml có thể ly tâm và
bịt miệng được.

Ly tâm 4 tiếng 80.000 x g ở 20 0C hoặc ly tâm qua đêm với tốc độ 60.000 x g ở
0
20 C.
Thu nhận băng DNA.
Loại bỏ ethidium bromide bằng cách chiết tách lặp lại mẫu DNA thu được với
isopropanol.
Thêm 2 thể tích nước và 6 thể tích ethanol vào dung dịch chứa DNA, trộn đều
rồi ủ 1h ở nhiệt độ – 200C.
Ly tâm 10 phút 8000 x g ở 40C.
Hoà tan kết tủa pellet trong dung dịch TE và kết tủa lại bằng cách đổ 1/10 thể
tích dung dịch 3M sodium acetate và 2 phần thể tích ethanol.
Nếu chưa nhìn thấy kết tủa thì ủ lại tại nhiệt độ – 20 0C đến khi có kết tủa thu
được.
Làm khô pellet, hoà tan trong TE.

b. Phương pháp tách chiết RNA
Tách chiết RNA tổng số và mRNA
- Chú ý:
+ Phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ bởi enzyme Rnase.
+ Rnase lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, trong nước bọt, trong không

9


-

khí…).
+ Rnase là một enzyme có hoạt tính cao, bền nhiệt.
Do đó: Thao tác tách chiết RNA tốt nhất là ở điều kiện vô trùng, tránh tiếp xúc
bằng tay trần.

Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng tương tự DNA. Chỉ khác là ở bước
cuối cùng dùng enzyme Dnase loại bỏ DNA.
• Tách chiết mRNA
Dựa vào phân tử mRNA có đuôi poly A
Do đó sau khi tách chiết được RNA toàn phần, cho qua cột sắc ký ái lực (oligod Tcellulose hoặc các viên bi từ gắn đoạn oligod T).
mRNA có đuôi poly A sẽ liên kết bổ sung với đoạn oligod T.
Dùng dung dịch rửa cột, các rRNA, tRNA sẽ bị rửa trôi chỉ còn mRNA được giữ
lại.
Sau đó dùng dung dịch có nồng độ muối thấp rửa cột hoặc li tâm sẽ thu được các
phân tử mRNA.

Hình 3. Tách chiết RNA

c. Phương pháp sắc kí
Sắc ký ái lực: trên poly U-Sepharose hay oligoT-xenlulose, dùng để tinh sạch

10


mARN
Sắc ký lọc gel dùng trong phân tách các acid nucleic và các nucleotit tự do trong
quá trình tạo mẫu dò đánh dấu
Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi những lượng DNA rất nhỏ
Sắc ký lỏng hiệu suất cao: Có độ phân giải rất cao, dùng trong tinh sạch các
oligonucleotit tổng hợp, plasmit, các phân đoạn DNA
I.2. Định lượng acid nucleic
Trong các thí nghiệm DNA tái tổ hợp thường cần phải biết liều lượng DNA hoặc RNA
tham gia phản ứng. Định lượng DNA và RNA có thể dựa vào nguyên lý hóa học và vật lý.
Tuy nhiên trong các thí nghiệm công nghệ DNA thì có thể sử dụng nucleic acid đã được tinh
chế vừa phải, nghiêm ngặt định lượng là không hoàn toàn cần thiết (sai mấy % không thành

vấn đề) và yêu cầu phương pháp trắc định càng đơn giản và càng nhanh càng tốt. Dưới đây
trình bày ba phương pháp định lượng nucleic acid thường áp dụng với mục đích nêu trên.
a. Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế
Đây là phương pháp lợi dụng tính hấp phụ tử ngoại của nucleic acid và là
phương pháp định lượng nhanh DNA và RNA. Nucleic acid chứa các loại base (A,
T, G, C, U) có độ hấp phụ cực đại bức xạ có bước sóng gần 260 nm. Các base khác
nhau có bước sóng bức xạ hấp thụ cực đại cũng như hệ số hấp thụ quang khác nhau,
thậm chí cùng loại base nhưng với pH khác nhau cũng có hệ số hấp thụ khác nhau.
Tuy nhiên, bình quân phân tử DNA hai sợi có hệ số hấp thụ A260 = ~20 có nồng độ
1 mg/ml còn dung dịch có A260 = 1 có nồng độ 50 µg/ml, với RNA cũng như DNA
một sợi thì A260 = ~33 có nồng độ 1 mg/ml còn dung dịch có A260 = 1 có nồng độ
40 µg/ml. Máy trắc định DNA/RNA có thể được kết nối máy in để ghi lại kết quả
đo.
Với phương pháp này có thể định lượng chính xác DNA tinh chế, nhưng do các
đường và protein cũng hấp thụ UV nên với DNA chiết xuất từ động vật cũng như từ
vi khuẩn có thể xác định sai nồng độ. Ngoài ra, các hợp chất dùng tinh chế DNA
(như phenol, mercaptoethanol, EDTA...) cũng hấp thụ UV nên cần chú ý khi định
lượng DNA bằng phương pháp này. Đặc biệt phenol có độ hấp thụ UV cao và cũng
tan trong nước nên sau khi chiết xuất DNA bằng phenol và kết tủa bằng ethanol rồi
hòa tan trong nước thì khả năng phenol hấp thụ UV là rất cao. Vì vậy, chú ý xử lý
chloroform sau xử lý phenol.
b. Phương pháp định lượng bằng điện di
Trong nhiều trường hợp trắc định DNA bằng UV vẫn để lại nỗi lo cho nhà nghiên cứu,
khi đó cần điện di một lượng mẫu trong gel agarose hoặc gel polyacrylamide chứa ethidium
bromide và quan sát băng DNA dưới UV. Nếu điện di đồng thời với DNA đã biết nồng độ
được pha loãng dần thì có thể xác định được nồng độ DNA cần nghiên cứu. Phương pháp
này không chỉ giúp định lượng DNA hay RNA mà còn biết trong DNA có chứa nhiều RNA
hay không cũng như các nucleic acid cần nghiên cứu có bị phân giải hay không, làm yên tâm
trong quá trình nghiên cứu.
c. Phương pháp nhỏ giọt định lượng acid nucleic

Trong nhiều trường hợp việc định lượng nucleic acid được thực hiện bằng các
phương pháp trên nhưng khi đó phải có nhiều DNA và phải cô đặc lại hoặc khả năng tạp
nhiễm nuclease là rất cao.

11


Trong trường hợp tinh chế poly(A)-RNA, lượng nucleic acid có được thường rất ít
(dưới 1 µg) nên thực hiện định lượng theo các phương pháp trên thường gặp nhiều trở ngại
và hao tổn vật liệu. Khi đó có thể dùng phương pháp nhỏ giọt để định lượng nucleic acid.
Với phương pháp này có thể nhận ra lượng nucleic acid khoảng 1 ng. Lấy các dung dịch
chứa 0,1 - 5 ng nucleic acid có thêm 1 µg/ml ethidium bromide làm dung dịch nucleic acid
chuẩn được nhỏ lên tờ giấy bóng mỏng (Saran wrap) đặt trên máy chiếu xạ UV thành nhiều
điểm mỗi điểm 3 µl. Lại nhỏ 3 µl dung dịch nguyên liệu nghiên cứu có chứa ethidium
bromide tương tự bên cạnh dãy nucleic acid chuẩn nêu trên. Bật đèn tử ngoại để đối chiếu
nồng độ nucleic acid mẫu với nucleic acid chuẩn mà xác định nồng độ mẫu. Sau đó, có thể
dùng pipet để hút thu hồi mẫu.
2. Điện di
2.1. Nguyên tắc điện di
Phương pháp điện di trong gel (keo) thường được sử dụng để phân li (phân
đoạn) DNA, RNA, oligonucleotide, protein... sau đó có thể dùng để giám biệt (đồng
định) và tinh chế các chất đó. Việc phân li các chất dựa trên độ lớn, điện tích cũng
như hình thái của các chất. Thông thường sử dụng gel agarose và gel
polyacrylamide nhưng gel agarose cho phép phân li nucleic acid lớn hơn 1 kb, còn
gel polyacrylamide thường dùng để phân li các đoạn nucleic acid nhỏ hơn 1 kb.
Nguyên lý của việc điện di DNA là khi ở trong điện trường, do tích điện âm nên
các phân tử DNA dịch chuyển về phía anode và với tốc độ dịch chuyển của chúng
khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử. Các đoạn DNA càng lớn thì dịch
chuyển càng chậm. Kết quả là từ một điểm chung (lỗ hay "giếng" tải mẫu) các đoạn
DNA khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một làn (lane), và trên làn đó

có các đoạn DNA khác nhau phân bố ở các vị trí (các băng - band) khác nhau tương
ứng với độ lớn của chúng.
Trong khi đó, các phân tử protein do tích điện bề mặt khác nhau nếu điện di
trong gel không gây biến tính thì dịch chuyển theo các hướng khác nhau với tốc độ
khác nhau phụ thuộc cả khối lượng phân tử lẫn điện tích bề mặt, nhưng nếu điện di
trong gel sau khi xử lý bằng SDS thì do bề mặt protein trở nên tích điện âm đồng
nhất nên chúng dịch chuyển về anode với tốc độ khác nhau hầu như chỉ phụ thuộc
khối lượng phân tử.
2.2. Điện di agarose
- Chế tác gel agarose
Dưới đây giới thiệu phương pháp chế gel agarose điện di DNA.
1. Cho đủ lượng agarose (Seakem Agarose, Nusieve Agarose...) cần pha vào dung dịch TAE 1×
trong một bình tam giác theo bảng dưới đây để có độ phân li nucleic acid thích hợp. Để có
dung dịch TAE 1× cần cho thêm 19 lần nước khử ion vào dung dịch gốc TAE 20×.
Nồng độ agarose (%)
Độ lớn DNA phân ly
(kb)
0.3
60-5
0.6
20-1
0.7
10-0.8
0.9
7-0.5
1.2
6-0.4

12

2.

3.

4.
5.

1.5
4-0.2
2.0
3-0.1
Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút trong nồi hấp cao áp ở 115 °C hoặc bằng vi sóng. Chú ý khi
dùng lò vi sóng cần quan sát để tránh trào gel ra ngoài, nên chờ đến khi gel sôi thì cắt điện,
lấy ra (coi chừng bỏng) lắc đều rồi cho vào làm sôi lần nữa. Lặp lại ba lần cho agarose tan
hoàn toàn.
Cho vào chậu bảo ôn ~50 °C cho đến khi dịch gel đạt đến khoảng 50 - 60 °C (tay chạm vào
được) thì cho vào gel một lượng dung dịch ethidium bromide để có hàm lượng cuối cùng
của chất màu này là 50 μg/ml. (Nếu không cho ethidium bromide vào gel lỏng trước khi rót
gel vào khuôn thì ngâm bản gel vào dung dịch này sau khi đã điện di).
Chú ý: Ethidium bromide là chất độc gây ung thư, vì vậy cần tránh tiếp xúc trực tiếp vào cơ
thể và phải có nơi đựng chất thải riêng sau khi sử dụng, không được thải ra ngoài môi trường
khi chưa được xử lý thích hợp.
Rót gel vào khuôn đã được chắn hai đầu bằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã cài sẵn lược
(comb) và đặt trên mặt phẳng (xác định bằng thủy bình kế, tức ligô).
Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel.
- Điện di agarose

Hình 4:

1. Tháo bản gel ra khỏi kẹp hoặc băng chắn, đặt khuôn gel trong chậu điện di ngang, rót dung
dịch đệm vào cho ngập gel, chú ý đầu có lỗ lược nằm ở phía cathode.
2. Pha nucleic acid cần điện di với dung dịch màu tải mẫu (điện di) 6× hoặc bằng hợp chất
màu tương tự. Dịch màu có tỷ trọng cao này giúp nucleic acid không bị xáo động bởi dòng
đối lưu của dung dịch nên khi tải vào lỗ răng lược thì nằm gọn trong đó và có màu rõ ràng.
Dung dịch màu tải mẫu 6× (dịch nạp mẫu) chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue
(BPB) và 0,25% xylencyanol (XC).

13


3. Bằng micropipet hút mẫu DNA nhỏ vào lỗ răng lược.
4. Bật điện một chiều để thực hiện điện di. Cường độ dòng điện khoảng 50 - 150 V tùy loại
thiết bị điện di. Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của DNA, nồng độ agarose
của gel và cường độ dòng điện.
Chú ý: Lượng DNA có thể điện di trong mỗi lỗ răng lược nhiều ít tùy kích thước răng
lược, nếu quá nhiều sẽ xuất hiện hiện tượng "tailing" (kéo đuôi) khó phân li.
- Kiểm tra băng DNA
1) Nếu điện di DNA trong gel có pha sẵn ethidium bromide thì chiếu tia tử
ngoại cũng có thể phát hiện được các băng DNA trong quá trình điện di cũng như sau khi
điện di. Kiểu dạng (pattern) các băng phụ thuộc vào thành phần DNA có trong mẫu cần điện
di.
2) Nếu không cho trước ethidium bromide thì sau khi điện di cần ngâm gel 30 - 60 phút trong
dung dịch thuốc nhuộm này ở nồng độ 0,5 μg/ml.
3) Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu thì có thể dùng máy ảnh pollaroid với ống kính có phin lọc ánh
sáng thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiết bị phân tích gel số hóa (gel
documentation system).
Chú ý: Đèn tử ngoại (UV) có hai loại bức xạ với bước sóng 254 nm (UV sóng ngắn) và
366 nm (UV sóng dài). UV sóng ngắn giúp quan sát rõ DNA nhưng làm tổn hại cấu trúc chất
này, cho nên nếu cần thu hồi DNA từ gel thì không nên áp dụng.

Hình 5:

2.3.

Hai làn hai bên là dấu khối lượng phân tử (DNA molecular marker), mỗi băng (vệt
sáng) của mỗi làn này cách nhau 100 base pair (bp), băng nhỏ nhất (dưới cùng)
"nặng" 100 bp, băng nặng nhất 2.000 bp (giữa 1.000 bp và 2.000 bp không có các
băng trung gian). Để ước định khối lượng phân tử làn DNA nào đó thì có thể đặt
một thước thẳng lên nó và dóng ngang xem nó tương ứng với băng nào trong làn
dấu khối lượng phân tử, trường hợp không trùng khít thì có thể ước lượng.
Điện di polyacrylamide
- Chế gel polyacrylamide
Gel polyacrylamide thường đặt đứng, để chế gel cần sử dụng các tấm thủy tinh có kết
cấu chuyên dụng để làm khuôn.

14


Về nguyên tắc để phân li DNA (cũng như các chất khác như protein) thường cần bản
gel polyacrylamide gồm hai thành phần: gel phân tách (separating gel) có nồng độ tương đối
cao và lớp gel tập trung có nồng độ thấp.
Gel tập trung (stacking gel) có tác dụng làm nguyên liệu tập trung tạo nên một băng
mẫu vật gọn, mảnh (các thành phần của mẫu nằm sát nhau nên có cùng điểm xuất phát),
trước khi chúng đi vào lớp gel phân tách. Tuy nhiên, nhiều khi do lượng mẫu cần điện di rất
nhỏ, không cần lớp gel tập trung này.
Dưới đây cách chế bản gel chỉ gồm gel polyacrylamide phân tách thường dùng trong
điện di DNA. Khuôn gel thường làm từ hai tấm thủy tinh khác nhau: một tấm hình chữ nhật,
tấm khác có kích thước hoàn toàn tương tự nhưng được cắt bớt một phần ở một cạnh trừ hai
góc, hai phần chừa lại này làm thành hai "tai" ("rabbit ear"). Phần cắt bớt của tấm kính là nơi

ráp "lược" tạo các lỗ tải mẫu và sau đó, trong quá trình điện di, là nơi dung dịch đệm điện di
kết nối với gel duy trì dòng điện giữa hai đầu (đầu có tai và đầu đáy) của bản gel.
Để chế gel polyacrylamide phân tách DNA cần thực hiện các bước sau:
B1) Rửa sạch các tấm thủy tinh kỹ bằng nước sạch, để khô rồi lau lại bằng ethanol.
Ráp các tấm thủy tinh theo hướng dẫn của hãng sản xuất sao cho tạo được khoảng hở giữa
hai tấm thủy tinh được bịt kín ba phía để không làm chảy nguyên liệu tạo gel khi rót vào.
Trước tiên đặt tấm thủy tinh nguyên, đặt các thanh cách dọc theo mép tấm thủy tinh đó, rồi
đặt tấm thủy tinh có "tai" lên trên sao cho các cạnh của hai tấm thủy tinh trùng khít nhau.
Trong một số trường hợp, tùy thiết kế, có thể cần dán các mép bên và khe hở đáy bản gel
bằng băng keo rồi dùng kẹp để kẹp các tấm thủy tinh (kẹp trước để các tấm thủy tinh ổn
định, dán từng cạnh rồi thay kẹp). Tuy nhiên, cũng có thiết kế gài vào khuôn ngoài không
cần kẹp.
B2) Chế gel theo nồng độ thích hợp cho việc phân tách DNA như trình bày trong bảng
sau (pha 100 ml):

B3) Bổ sung vào dung dịch này 15 µl TEMED (N,N,N',N' tetramethylethylenediamine)
lắc nhẹ cho đều rồi rót vào giữa khuôn thủy tinh sao cho không hình thành bọt khí trong gel.
Thông thường, nên rót gel từ một mép trong khuôn. Trong quá trình này, nếu bản gel không
được cố định trước (như gel dùng cho việc giải trình DNA) thì cần nâng dần miệng bản
khuôn gel từ thế nằm ngang lên cao dần để gel không bị chảy ra ngoài còn bọt khí (nếu có)
cũng từ từ thoát lên trên mà ra khỏi gel. Bọt khí thường gây biến dạng các băng sản phẩm
nhưng điều quan trọng là ôxy làm giảm khả năng polymer hóa của acrylamide. Khi gel lỏng
đã đầy khuôn bản gel, cắm lược vào đầu khuôn gel (khoảng giữa hai tai) rồi kẹp chặt (chú ý
chỉ nên kẹp lược với bản thủy tinh nguyên, không kẹp cả hai tấm thủy tinh để không tạo khe

15


1)
2)

3)
4)
5)

hở giữa gel và hai tấm thủy tinh sau khi bỏ kẹp khỏi khuôn bản gel, do có sự đàn hồi các tấm
thủy tinh bị ép vào nhau thẳng trở lại sau khi bỏ kẹp).
Trong trường hợp cần bổ sung lớp gel tập trung ở trên thì khuôn bản gel phải cố định
theo đúng phương thẳng đứng (kiểm tra bằng thủy bình kế), sau khi rót đủ lượng gel phân
tách (chừa lại một khoảng ở trên) cần bổ sung lớp nước cất ở phía trên mà không cần cài
lược. Chờ đến khi gel phân tách hóa rắn thì rót bỏ lớp nước này, thay bằng gel tập trung (gel
nồng độ thấp) rồi ráp lược lên trên để tạo các lỗ giếng tải mẫu điện di.
Thông thường gel cứng trong vòng 30 phút. Tuy nhiên, thời gian hóa rắn của gel tăng
khi nhiệt độ hạ cũng như khi nồng độ TEMED và ammonium persulfate tăng.
- Điện di gel polyacrylamide
Sau khi gel cứng lấy lược ra khỏi khuôn bản gel, tháo khuôn bản gel khỏi khuôn ngoài hoặc
kẹp cũng như vật chắn khác sao cho gel có hai đầu (trên và dưới) thông với bên ngoài. Gắn
khuôn bản gel vào chậu điện di.
Gắn điện cực vào chậu điện di sao cho cực âm (cathode) ở trên còn cực dương (anode) ở
dưới. (Các cặp dây dẫn và ổ cắm trên máy có màu tương phản, thường là đỏ và đen; trong
khi thực hiện không làm giao chéo).
Điện di tiền khởi bằng điện áp 20 V trong 30 - 60 phút.
Trộn 0,1 - 1 µg DNA với dung dịch màu tải mẫu điện di 6×, cho vào mỗi lỗ răng lược
khoảng 20 µl (với lỗ 0,5 cm).
Điện di với 100 - 200 V điện một chiều trong khoảng 1 - 3 giờ, có thể quan sát thấy vị trí của
dịch màu trong gel để quyết định dừng điện di. (Hình dưới)
Bảng dưới chỉ mối quan hệ giữa độ lớn của DNA với dịch màu BPB và XC khi dịch
chuyển trong gel agarose. Trong quá trình điện di vệt cần theo dõi băng màu lam dịch
chuyển, dừng nguồn điện khi băng này cách mép dưới của bản gel khoảng 0,5 - 1 cm.

16

Hình 6: Sơ đồ ráp bản gel vào bể điện di đứng với trường hợp chạy một bản gel.
Bên trái đã ráp gel điện di, bên phải không điện di nhưng cần ráp một tấm thủy tinh để
giữ nước cho bể dung dịch đệm ở cathode. Nếu điện di hai gel thì ráp đối xứng.
6) Sau khi điện di tháo gel khỏi khuôn, nhỏ lên bề mặt gel dung dịch ethidium bromide 5
µg/ml, để 15 - 30 phút cho ngấm, rửa gel rồi soi UV để quan sát các băng DNA.

Hình 7: Kết quả điện di trong gel polyacrylamide DNA để giải trình.
Các làn có các băng tách biệt là kết quả của quá trình dịch chuyển từ một điểm (giếng tải
mẫu) với vận tốc khác nhau phụ thuộc độ lớn của các DNA.
3. Thu hồi đoạn DNA từ gel điện di
Nếu có nhu cầu sử dụng các phân đoạn DNA đã được phân li và tinh chế nhờ điện di
cho các thí nghiệm tiếp theo thì thao tác để thu hồi DNA từ gel là cần thiết. Có một số
phương pháp thu hồi DNA được trình bày và chúng có những ưu điểm và nhược điểm nhất
định như thời gian thao tác, độ phức tạp và tỷ lệ thu hồi, cũng như khả năng lẫn các polymer
hòa tan hoặc các chất hỗn tạp có trong gel agarose và gel polyacrylamide làm cản trở đến
các phản ứng sẽ thực hiện trong thí nghiệm sau đó.

17


3.1.
1)

2)
3)

4)
5)

3.2.
1)
2)
3)

3.3.
1)
2)
3)

Phương pháp dùng giấy DEAE cần thời gian ngắn và lượng chất hỗn tạp tương đối ít
nhưng từ gel polyacrylamide tỷ lệ thu hồi các đoạn DNA dài hoặc DNA một sợi thường
thấp.
Phương pháp thu hồi nhờ điện di có thể thực hiện để thu hồi DNA từ gel agarose cũng
như polyacrylamide nhưng lượng thu hồi được dưới dạng dung dịch với lượng tương đối lớn
cần phải cô đặc, cho nên chất hỗn tạp lẫn nhiều. Hơn nữa, từ gel agarose việc thu hồi thường
khó khăn. Phương pháp hồi thu từ agarose tan chảy nhiệt độ thấp có thể thu hồi DNA trong
thời gian ngắn thao tác cũng đơn giản, tỷ lệ thu hồi cao không phụ thuộc vào độ lớn của các
đoạn DNA nhưng hỗn tạp nhiều.
Phương pháp sử dụng giấy DEAE (DE 81)
Trong khi điện di DNA trong gel agarose (có ethidium bromide trong gel hoặc pha trong
dịch đệm điện di), quan sát các băng DNA đích dưới UV khi thấy băng đó đã phân li hoàn
toàn thì dùng dao cắt thành rãnh ở trước và sau băng DNA rồi chèn giấy Whatman DE 81
vào đó.
Tiếp tục điện di cho đến khi băng DNA bám hết vào giấy DE 81 thì cắt điện.
Lấy giấy DE 81 ra khỏi gel, cho vào ống Eppendorf 0,5 ml đã được chọc thủng ở đáy (hoặc
ống bơm tiêm 1 ml) rồi lắp vào trong một ống li tâm lớn hơn (như ống Eppendorf 1,5 ml đối
với ống 0,5 ml, hoặc ống li tâm 10 ml đối với bơm tiêm 1 ml) rồi cho vào đó một lượng
dung dịch đệm TAE có 50 mM NaCl, quay li tâm và lặp lại 3 lần như vậy để rửa sạch. Dung
dịch đệm TAE có 50 mM NaCl chứa Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, NaCl 50mM (không hòa

tan DNA).
Thêm 100 µl TE chứa NaCl 1M, quay li tâm nhẹ rồi để yên cho ngấm đều vào giấy DE
khoảng 5 phút, sau đó li tâm lại làm cho dung dịch đệm thoát xuống hết. Lặp lại ba lần để
cho DNA thoát hết khỏi giấy DE theo dung dịch đệm.
Chiết xuất bằng phenol và bằng chloroform mỗi thứ một lần để loại bỏ tạp chất rồi kết tủa
bằng ethanol ba lần mỗi lần đều kết tủa ở nhiệt độ −70 °C rồi quay li tâm thu hồi.
Phương pháp thu hồi bằng điện di
Xác nhận các băng DNA (bằng UV với gel đã nhuộm ethidium bromide) rồi cắt băng DNA
đích đã hoàn toàn phân li khỏi gel. Cho mẫu gel đó vào túi thẩm tích đã buộc kỹ một đầu, để
cho dung dịch đệm ngấm đều rồi kẹp đầu còn lại.
Đặt túi thẩm tích vào chậu điện di nằm ngang sao cho hướng điện di vuông góc với túi thẩm
tích.
Cứ để vậy mà điện di với điện áp 100 - 200 V, soi dưới UV xác nhận băng DNA đã thoát hết
ra khỏi gel. Để tăng độ thu hồi cần điện di ngược chiều vài phút (cho DNA đã bám vào túi
thoát ngược trở lại dung dịch) rồi mở túi hút hết dịch ra (nhưng cần tránh hút gel) cho vào
ống nghiệm, chiết xuất bằng phenol và chloroform rồi kết tủa bằng ethanol để thu hồi DNA.
Phương pháp chiết xuất DNA từ gel nghiền (từ gel polyacrylamide)
Xác nhận (bằng UV) vị trí DNA đã phân li cần thu hồi, cắt thu lấy gel.
Cho mẫu gel vào ống 1 ml, nghiền nát, hoặc cho vào ống Eppendorf rồi dùng đũa thủy tinh
nghiền nát.
Cho gel nát vào ống nghiệm rồi cho vào đó dung dịch đệm dung xuất (thường là lượng ngập
không quá 2 lần lượng gel, nhiều hay ít tùy nồng độ của DNA trong gel), ủ mấy giờ cho đến
qua đêm ở 37 °C (nếu cần, khi lượng nhỏ DNA khó tạo kết tủa thì thêm RNA nấm men đến

18


4)
3.4.
1)

2)
3)
4)
5)
6)

4.

4.1.

nồng độ 10 µ g/ml).Dung dịch đệm dung xuất chứa ammonium acetate ở nồng độ 500mM,
MgCl2 10mM, EDTA 1mM và SDS 1%.
Li tâm nhẹ rồi thu lấy nước mặt, dùng cột DEAE cellulose để tinh chế, cô đặc (xem phần
sau). Chiết xuất bằng phenol-chloroform rồi chloroform và sau đó kết tủa bằng ethanol để
thu hồi DNA.
Thu hồi từ gel agarose tan chảy nhiệt độ thấp
Gel agarose tan chảy nhiệt độ thấp có nhiệt tan chảy 60 °C và gel hóa ở 30 °C do một
số hãng (như BioRad, Takara...) sản xuất và phát mại.
Chế gel nêu trên bằng cách pha vào dung dịch đệm, làm tan chảy ở khoảng 70 °C, pha
ethidium bromide ở khoảng 37 °C rồi đổ bản gel, hạ nhiệt cho gel trở nên cứng.
Điện di với điện áp thấp để tránh tăng nhiệt độ làm tan chảy gel.
Soi UV với sự trợ giúp của ethidium bromide, cắt băng DNA đích đã phân li.
Thêm vào 5 lần TE, ủ ở 65 °C cho gel tan chảy.
Thêm một lượng tương đương phenol-chloroform, trộn đều rồi quay li tâm thu lấy nước mặt
rồi chiết xuất bằng chloroform lần nữa.
Kết tủa bằng ethanol để thu hồi DNA.
Chú ý: Một số hãng đã sản xuất và phát mại kit thu hồi DNA bằng cách nghiền và làm
tan gel agarose thông thường. Chẳng hạn "QIAquick Gel Extraction Kit" của hãng QIAGEN
Co. dùng máy li tâm cỡ nhỏ cao tốc, có thể chiết xuất và làm sạch các đoạn DNA dài từ 70
bp đến 10 kb từ gel (thông thường cũng như nóng chảy thấp) điện di trong dung dịch đệm

TAE hoặc TBE. Bộ kit này gồm dung dịch QG (màu vàng), dung dịch PE, dung dịch đệm
EB, ethanol, các cột hấp phụ (QIAquick spin column) và ống chứa 2 ml.
PCR (polymerase chain reaction)
Phương pháp tạo dòng invivo mà chúng ta đã đề cập trong Module “Công nghệ DNA
tái tổ hợp và sự tách dòng” tuy đã giải quyết về vấn đề số lượng, nhưng đòi hỏi thao tác quá
phức tạp và thời gian quá dài. Trong sự ra đời của các phương pháp khuếch đại (tái bản
nhanh) invitro có chọn lọc, chúng ta phải kể đến phương pháp PCR.
Phương pháp PCR - phản ứng dây chuyền nhờ hoạt động của enzyme DNApolymerase - do K. Mulis cùng cộng sự phát minh năm 1985, đã đưa lại một cuộc cách mạng
trong di truyền học phân tử. Đây là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu, phân
tích gen và hệ gen. Khó khăn lớn nhất trước đây trong việc phân tích gen là ở chỗ chúng là
những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp khổng lồ. Kỹ thuật PCR ra đời
đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn
DNA mong muốn.
Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR được
nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinh
trùng và cho kết quả rất chính xác. Mặt khác, sự phân tích thành phần và trật tự nucleotide
trên phân tử DNA trong hệ gen còn có ý nghĩa to lớn trong phân loại các loài sinh vật. Chính
nhờ tính thực tiễn to lớn của kỹ thuật này mà tác giả của PCR, Kary Mulis, được tặng giải
thưởng Nobel vào năm 1993.
Thực chất đây là phương pháp tạo dòng invitro, không cần đến sự hiện diện của tế
bào và dựa trên nguyên tắc được trình bày sau đây:
Nguyên tắc của phương pháp PCR

19


−
−
−
−

−
4.2.

Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa
trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung.
Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm:
Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để
thiết kế hai mồi oligonucleotide.
Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Là tín hiệu chỉ hướng đi (5’
→ 3’) của enzyme DNA-polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai
đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung.
Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
Môi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzyme RNase và DNase.
Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq)
Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 µl đến 50µl.
Đặc điểm của phản ứng PCR là chọn lọc, nhạy và nhanh.
Các bước tiến hành thí nghiệm
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ và mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình dưới)
Bước 1 - Thực hiện qúa trình biến tính DNA bằng nhiệt
Đưa DNA vào dung dịch phản ứng (gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép), tăng
nhiệt độ của dung dịch lên tới 90÷98°C, thời gian lưu tương ứng khoảng từ 30s÷1 phút. Tại
nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép bị tách ra (do liên kết hydrô bị đứt), tạo nên các sợi
đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới.
Bước 2 - Thực hiện phản ứng lai
Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống từ từ và nhỏ hơn nhiệt độ Tm của mồi,
vào khoảng 37÷68°C và thời gian lưu 30s÷1 phút. Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi
khuôn. Mồi được tổng hợp hóa học, có mồi ngược và xuôi. Người ta còn có thể dựa vào
trình tự nucleotide ở đầu 3’ của khuôn để tổng hợp mồi. Sau đó bổ sung DNA-polymerase để
kéo dài mồi.

20


4.3.

Hình 8: Quá trình PCR
Hình 9: Sơ đồ phản ứng PCR nhiều chu kỳ
Bước 3 - Tổng hợp mạch mới hay còn gọi là kéo dài (extension)
Nâng nhiệt phản ứng lên 72°C trong vài chục giây đến 1 phút để DNA- polymerase tổng
hợp sợi mới. Trong thực tế, thời gian và nhiệt độ phản ứng phụ thuộc vào sợi DNA cần
khuếch đại.
Kết thúc một chu kỳ từ một DNA kép mẹ tổng hợp 2 sợi DNA kép con. Cứ như vậy,
phản ứng xảy ra trong 25 đến 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72°C trong
khoảng từ 5 đến 10 phút sao cho tất cả các sợi đơn xoắn lại và tạo nên sản phẩm của PCR.
Sau đó hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm.
Các bước thực hiện phản ứng PCR một chu kỳ
Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose nồng độ từ
0,8%÷2% để phát hiện sự đa hình của các đoạn DNA đặc thù, hoặc các đoạn DNA bị thay
đổi do các tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp).
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
- DNA mẫu làm khuôn
Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt
nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1÷1,5kb.
Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt, tuy nhiên, kỹ thuật chuẩn đoán bằng phương pháp
này vẫn đạt kết quả tốt trong trường hợp mẫu DNA không cần có độ tinh sạch cao, như vết
máu khô, những mẫu vật khảo cổ (tóc, móng tay người đã chết). Phương pháp này cho phép
xác định DNA với một lượng thấp, khoảng nhỏ hơn 100 ng (1g = 109ng).
- Enzyme DNA-polymerase

21

-

Chất lượng của phương pháp phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzyme
polymerase (do phản ứng luôn phải thực hiện ở nhiệt độ khác nhau). Đầu tiên người ta sử
dụng các đoạn Klenow của DNA-polymerase I từ E. Coli ở 37°C (cắt nhỏ mảnh DNApolymerase I thành đoạn Klenow mất hoạt tính exonuclease) do đó đã nhận được đoạn cần
nhân không tinh sạch vì đây không phải là enzyme chịu nhiệt.
Phương pháp PCR chuyển sang một bước ngoặt mới cùng với sự phát hiện enzyme
Taq-polymerase có nguồn gốc vi khuẩn (Thermus aquaticus) tách từ suối nước nóng nên
chịu được nhiệt độ cao. Với enzyme này cho phép nhận được các sản phẩm DNA tinh sạch.
Điều này cho phép tự động hóa tất cả các bước của chu trình nhân bản DNA. Từ đó máy chu
trình nhiệt PCR ra đời và có khả năng điều khiển về cả nhiệt độ lẫn thời gian. Ngày nay có
rất nhiều hãng trên thế giới sản xuất máy chu trình nhiệt PCR như: Perkin Elmer, MJ,
Eppendorf, ...
Nhược điểm của enzyme này là không tổng hợp được trình tự DNA dài quá 3kb, hơn
nữa, enzyme này không có khả năng sửa sai trong quá trình sao chép. Hiện nay có nhiều
enzyme polymerase chịu nhiệt mới được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt
và hoàn thiện hơn, như là Tth- polymerase tách từ vi khuẩn Themus thermophilus, Elogase
(bao gồm nhiều enzyme kết hợp trong đó có sự tham gia của Taq-polymerese).
- Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi
Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả
cao. Chọn mồi phải tuân theo nguyên tắc sau đây:
Trình tự của mồi được chọn không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, và cũng
không tạo những cấu trúc kẹp tóc.
Mồi phải chọn đặc trưng cho DNA cần khuếch đại và không trùng với các trình tự lặp lại
trên gen.
Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (1kb).
Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 đến 30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide, mồi bám
không đặc hiệu. Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng ở Bước 3.

Tm mồi xuôi và mồi ngược không cách nhau quá xa, thông thưòng trong khoảng từ 4÷5°C,
và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 72°C.
- Ảnh hưởng của các nuleotit
Cần phải có bốn loại nucleotide dạng triphosphat như: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng
độ mỗi loại nucleotide phải ở dạng cân bằng, ứng với khoảng 20÷200µM cho mỗi loại
nucleotide. Nếu mất trạng thái cân bằng thì sẽ gây ra lỗi khi sao chép, nếu nồng độ các
nucleotide cao hay thấp hơn sẽ dẫn đến hiện tượng sao chép giả.
• Môi trường phản ứng
Ion Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ Mg 2+ tối ưu để
thực hiện PCR từ 150÷200µM. Nồng độ chuẩn cho từng khoản tương ứng, phải được xác
định trong điều kiện thí nghiệm nhất định.
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào.
Không được chứa các enzyme cắt hạn chế và các enzyme phân hủy axit nucleic.
Môi trường dung dịch đệm phải ổn định.
• Thời gian và số lượng chu kỳ

22


Qua nghiên cứu cho thấy: tổng thời gian cho mỗi bước của một chu kỳ và của chu kỳ đầu
với các chu kỳ tiếp theo là khác nhau. Ngoài ra, thời gian cho mỗi phản ứng còn phụ thuộc
vào độ dài của đoạn DNA cần nhân dòng.
Số lượng chu kỳ cho một phản ứng PCR thông thường trong khoảng từ 30 đến 40 chu kỳ.
Bởi vì phản ứng diễn biến theo hai giai đoạn: Ở giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo
cấp số nhân, và đến một giới hạn nào đó thì số bản sao giảm, hiệu quả khuếch đại giảm do
các nguyên nhân:
− Nồng độ nucleotide giảm
− Xuất hiện sản phẩm phụ
− Do các bản sao không bắt cặp với mồi mà chúng lại bắt cặp với nhau
Ngoài ra, số chu kỳ phụ thuộc vào số bản mẫu ban đầu, nếu số bản mẫu là 105 thì thực

hiện 25÷30 chu kỳ, còn số mẫu 102÷103 thì thực hiện 35÷40 chu kỳ.
• Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt độ nhanh và chính xác. Tránh tối đa sự
bốc hơi nước trong quá trình phản ứng. Tuy nhiên, ứng với mỗi phản ứng cụ thể có các thiết
bị và dụng cụ khuếch đại riêng.
4.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR
• Ưu điểm:
Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự đáng
quan tâm. Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic
nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện đồng thời). Yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu
không cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ, những vết tích để lại của người đã chết).
• Nhược điểm:
Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại. Để có đoạn mồi này ít nhất
phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại. Kích thước DNA cần khuếch đại không
vượt quá 3kb. Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần). Sai sót còn do sử dụng ETaq-polymerase khoảng 10 4 (sai sót cho một lần sao chép).
4.5. Ứng dụng PCR
Sản xuất mẫu dò đánh dấu phóng xạ (dầu dò) với khối lượng lớn, phù hợp với phương
pháp lai giữa DNA và DNA, RNA và DNA.
Khuếch đại số lượng RNA, do lượng mRNA nhỏ dưới mức cho phép nên người ta dùng
phương pháp RT-PCR để tăng nồng độ mRNA đến một giới hạn phát hiện bằng cách phiên
mã ngược: mRNA → cDNA. Từ cDNA, ta đánh giá được mRNA.
Khuếch đại DNA và RNA ngay tại hệ mô: Gọi là kỹ thuật insitu, kỹ thuật này có nguyên
tắc như trên, được tiến hành ngay trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame trong thiết bị PCR
có bộ phận tạo nhiệt cho lame.
Trong nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật PCR được dùng để nghiên cứu những thay đổi ở mức
độ DNA của các dòng mô nuôi cấy và các cây tái sinh từ mô sẹo, để nghiên cứu sự có mặt
của các gen ngoại lai trong các cây biến nạp.
Định lượng DNA: Khi nồng độ DNA thấp, dùng phương pháp PCR nhân lên đến mức
xác định. Người ta xác định được số lượng bản mẫu ban đầu qua tính toán dựa vào sản phẩm
cuối cùng và số chu kỳ nhân. Điều quan trọng là số chu kỳ nhân không được vượt quá giai

23


đoạn đầu của phản ứng, khi mà số lượng bản sao còn tỷ lệ thuận với số lượng bản mẫu ban
đầu.
Ứng dụng trong pháp y, chuẩn đoán những bệnh di truyền, nghiên cứu mẫu khảo cổ, bảo
tồn và duy trì những gen quí.
4.6. Nguyên lý cơ bản của phản ứng RT-PCR (PCR ngược)
Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn RNA, theo
nguyên lý của phản ứng PCR gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất là sao chép RNA
khuôn thành DNA sợi đôi nhờ hoạt động của enzyme sao chép ngược. Giai đoạn này được
thực hiện ở 50÷55°C và thời gian là 30 phút. Giai đoạn 2 là dùng chính DNA vừa sao chép
làm khuôn cho phản ứng PCR, quá trình được thực hiện theo ba bưóc như đã trình bày ở
trên.
Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm của phản ứng PCR ngược được giảm xuống 4°C để
bảo quản cho tới khi sử dụng. Để đánh giá và phát hiện sản phẩm PCR ngược người ta cũng
điện di trên gel agarose 0,8÷1%. Và DNA chuẩn là DNA λ được cắt bởi enzyme HindIII có
độ dài 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb.
5. Lai phân tử
5.1. Cơ sở của lai phân tử
a. Khái niệm nhiệt độ nóng chảy của DNA
Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng
chảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hidro nối liền hai mạch.
Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xảy ra đột ngột sau khi nhiệt độ dao
động rất ít xung quanh Tm, do tính “cộng hưởng” của phản ứng. Hiện tượng “cộng hưởng”
này giống như trên một dây kéo, khi ta tác động một lực kéo dưới một ngưỡng nhất định thì
hoàn toàn không có tác dụng. Nhưng nếu lực kéo đủ mạnh để làm bật chỉ một nút nhỏ thì
toàn bộ dây kéo sẽ bung ra mà không cần thêm một lực tác động nào. Sự chuyển từ mạch đôi
sang mạch đơn được xác định rõ ràng thông qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang

(OD) ở bước sóng 260nm. Giá trị của mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển
thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect).
Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong phân tử DNA mạch đôi, các base (thành phần
hấp thụ ánh sang ở bước sóng 260nm) nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song;
cấu trúc đó che lấp một phần các base khiến chúng không hấp thụ ánh sang như những đơn
vị toàn vẹn khác với ở DNA mạch đơn.
b. Các nhân tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA
Hai mạch đôi của phân tử DNA bắt cặp với nhau nhờ các phân tử hydro. Sự tách rời
hai mạch tương ứng với sự phá liên kết ấy. Do đó, số lượng các liên kết và yếu tố làm thay
đổi tính ổn định của chúng sẽ làm thay đổi “nhiệt độ nóng chảy” của phân tử DNA.
• Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA
Trong phân tử DNA, khi tăng nhiệt độ các mối liên kết A-T dễ bị đứt trước, khi nhiệt
độ >900C các liên kết G-C bị đứt. Do đó thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có
ảnh hưởng rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt các base G, C trong điều
kiện chuẩn. DNA có tỉ lệ G-C cao sẽ có điểm nóng chảy cao, DNA có 60% G-X thì điểm
nóng chảy là 950C. Biểu thức thể hiện sự phụ thuộc của Tm vào thành phần các base:
Tm=69,3+0,41 (%G+C)
• Ảnh hưởng của độ dài DNA

24


Đoạn DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hydro nối hai mạch càng lớn bấy
nhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng càng cao. Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử
DNA được tính theo công thức sau:
Tm=-500/số lượng cặp base
Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối với nhũng đoạn
DNA ngắn. điều này chính là kết quả của tính “hợp tác” đã đề cập ở phần trên.
• Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch)
Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) sẽ làm giảm tính

ổn định của một phân tử lai. Thông thường người ta ước lượng Tm giảm 10C cho mỗi 1%
phần trăm bắt cặp sai lệch. Nhưng cũng như các thành phần các base, các mismatch chỉ có ý
nghĩa thực tiễn đối với các đoạn DNA ngắn.
• Ảnh hưởng của môi trường phản ứng
- Ảnh hưởng của nồng độ muối
Sự giảm lực ion (nồng độ muối) của môi trường sẽ làm giảm rất mạnh nhiệt độ nóng
chảy. Tm sẽ làm giảm khoảng 150C cho mỗi logarithm nộng độ đối với các ion hóa trị I. các
cation hóa trị II cón có tác động mạnh hơn. Như vậy, một dung dịch càng loãng thì càng làm
mất ổn định chuỗi xoắn kép của DNA.
- Ảnh hưởng của formamide
Hóa chất này có khả năng hạ thấp Tm rất nhiều, đối với những đoạn dài hơn 100 cặp
nucleotide, sự giảm Tm có thể được ước lượng theo công thức sau:
Tm= -0.6x(%formamide)
Formamide được sử dụng trong các phương pháp li phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ
lai. Nồng độ thông dụng là 50% tương ứng với việc hạ nhiệt độ tương ứng tới 300C.
Trong thực tế cần lưu tâm đến tất cả các chỉ tiêu nêu trên khi tính toán Tm. Công thức
thực nghiệm sau đây cho phép tập hợp mọi yếu tố để ước lượng Tm:
Tm=16,6 log [m]+0.41(%GC)+81,5-%mismatch-675/chiều dài (cặp base)0,65(%formamide).
Công thức này dùng cho những đoạn DNA ngắn hơn 100 cặp nucleotide; trong đó
[M] biểu thị nồng độ ion Na+.
c. Khái niêm về lai phân tử
Hai mạch đơn của phân tử DNA gắn với nhau nhờ các liên kết hydro. Khi đun nóng
DNA từ từ, vượt quá nhiệt độ nóng chảy Tm, các liên kết hydro giữa hai mạch bị phá vỡ, hai
mạch sẽ tách rời nhau.
Nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột thì sự bắt cặp sẽ không xảy ra. Lúc đó phân
tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình vô trật tự.
Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ cộng với điều kiện
thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này được gọi là lai phân tử (molecular
hybridization).
d. Đặc điểm của lai phân tử

Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung với
nhau dẫu chúng chỉ có hai bản sao nằm lẩn giữa hàng triệu trình tự khác.
Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử
DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA.
e. Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử

25