Xác định đồng thời vitamin B1, B6 và B12 trong sữa bột và sữa tươi Dielac Grow Plus và Dielac Alpha Gold bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN GIA HUY

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI VITAMIN B1, B6 VÀ B12
TRONG SỮA BỘT VÀ SỮA TƯƠI DIELAC GROW PLUS
VÀ DIELAC ALPHA GOLD BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Ngành: Hoá Phân tích
Mã số: 8.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Giảng viên hướng dẫn khoa học: PGS.TS Mai Xuân Trường

THÁI NGUYÊN - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất cứ một công trình nào. Tôi xin
cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm
ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019
Tác giả luận văn
Nguyễn Gia Huy

i

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Mai Xuân Trường
người đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực
hiện luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học và
các cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại
học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu
và hoàn thiện luận văn.
Do thời gian có hạn và trình độ còn hạn chế, luận văn này không tránh
khỏi những thiếu sót. Em rất mong được sự đóng góp ý kiến của thầy cô để
luận văn này được hoàn thiện hơn.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019
Người thực hiện
Nguyễn Gia Huy

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC............................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN ........................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN ........................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN ........................................................ vi
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về vitamin B1 .............................................................................. 3
1.1.1.Tên gọi ........................................................................................................ 3

1.1.2. Công thức hóa học ..................................................................................... 3
1.1.3. Tính chất vật lý .......................................................................................... 3
1.1.4. Tính chất hóa học ...................................................................................... 4
1.2. Giới thiệu về vitamin B6 .............................................................................. 5
1.2.1. Tên gọi ....................................................................................................... 5
1.2.2. Công thức hóa học ..................................................................................... 5
1.2.3. Tính chất vật lý .......................................................................................... 5
1.2.4. Tính chất hóa học ...................................................................................... 6
1.3. Giới thiệu về vitamin B12 ............................................................................ 6
1.3.1. Tên gọi ....................................................................................................... 6
1.3.2. Công thức hóa học ..................................................................................... 7
1.3.3. Tính chất vật lý .......................................................................................... 7
1.3.4. Tính chất hóa học ...................................................................................... 7
1.4. Nhu cầu vitamin B1, B6, B12 và nguồn thực phẩm..................................... 8
1.5. Giới thiệu sữa Dielac Grow Plus và sữa Dielac Alpha Gold ..................... 11
1.6. Tổng quan xác định vitamin B1, B6 và B12 theo phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) ..................................................................... 12
iii


1.6.1. Phương pháp sắc ký lỏng sử dụng cột tách pha đảo RP-LC, detector
UV-Vis..................................................................................................... 12
1.6.2. Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector huỳnh quang ............ 13
1.6.3. Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector PDA......................... 14
Chương 2: THỰC NGHIỆM ............................................................................. 16

2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ....................................................... 16
2.1.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 16
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 16
2.2. Thực nghiệm ............................................................................................... 20

2.2.1. Dụng cụ.................................................................................................... 20
2.2.2. Hóa chất ................................................................................................... 20
2.2.3. Các dung dịch tiêm sắc ký ....................................................................... 20
2.3. Sơ đồ nghiên cứu của phương pháp phân tích ........................................... 23
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................... 24

3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký ..................................................................... 24
3.1.1. Khảo sát lựa chọn bước sóng................................................................... 24
3.1.2. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy........................................................ 25
3.1.3. Khảo sát lựa chọn tỉ lệ pha động ............................................................. 26
3.2. Đánh giá phương pháp định lượng ............................................................. 28
3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ vitamin B1, B6, B12 .............. 28
3.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ vitamin B1, B6, B12 theo
phương pháp thêm chuẩn ........................................................................ 30
3.2.3. Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống ...................................................... 50
3.3. Xác định vitamin B1, B6, B12 trong sữa Dielac Grow Plus và sữa
Dielac Alpha Gold ................................................................................... 53
3.3.1. Xác định vitamin B1, B6, B12 trong sữa bột Dielac Grow Plus và
sữa bột Dielac Alpha Gold ...................................................................... 53

iv


3.3.2. Xác định vitamin B1, B6, B12 trong sữa tươi Dielac Grow Plus và
sữa tươi Dielac Alpha Gold ..................................................................... 56
3.3.3. Xác định vitamin B1, B6, B12 trong sữa Dielac Grow Plus và sữa
Dielac Alpha Gold theo phương pháp thêm chuẩn ................................. 61
KẾT LUẬN ........................................................................................................ 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 72
PHỤ LỤC ........................................................................................................... 74

v


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Axetonitril

HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

Chromatography

cao

PDA

Photometric Diode Array

Dãy diod quang

ReV

Recovery

Độ thu hồi

RSD
UV – Vis

Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
Ultra Violet – Visble

iv

Phổ tử ngoại – khả kiến


DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN
Bảng 1.1:

Tính chất vật lí của 3 dạng vitamin B6 ........................................... 6

Bảng 1.2.

Nhu cầu cung cấp vitamin B1, B6 và B12 của người ................... 10

Bảng 2.1.

Các điều kiện tiến hành sắc ký ......................................................... 19

Bảng 3.1.

Bước sóng hấp thụ cực đại của vitamin B1, B6 và B12 ............... 25

Bảng 3.2.

Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1,
B6 và B12 ...................................................................................... 28

Bảng 3.3.

Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm
chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold .................................... 31

Bảng 3.5.

Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm
chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold .................................... 32

Bảng 3.6.

Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B1 bằng phương
pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold ................... 32

Bảng 3.7.

Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B6 theo phương

pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold ................... 33

Bảng 3.8.

Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B12 theo phương
pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold ................... 34

Bảng 3.9.

Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm
chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus ...................................... 36

Bảng 3.10. Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 theo phương pháp thêm
chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus ...................................... 36
Bảng 3.11. Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm
chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus ...................................... 37
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B1 bằng phương
pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus..................... 37
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B6 theo phương
pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus..................... 38

v


Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B12 theo phương
pháp thêm chuẩn trên nền sữa bột Dielac Grow Plus..................... 39
Bảng 3.15. Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm
chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold ................................... 41
Bảng 3.16. Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 theo phương pháp thêm
chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold ................................... 41

Bảng 3.17. Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm
chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold ................................... 42
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B1 bằng phương
pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold ................. 42
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B6 theo phương
pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold ................. 43
Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B12 theo phương
pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Alpha Gold ................. 44
Bảng 3.21. Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm
chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus ..................................... 46
Bảng 3.22. Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 theo phương pháp thêm
chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus ..................................... 46
Bảng 3.23. Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm
chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus ..................................... 47
Bảng 3.24. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B1 bằng phương
pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus ................... 47
Bảng 3.25. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B6 theo phương
pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus ................... 48
Bảng 3.26. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin B12 theo phương
pháp thêm chuẩn trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus ................... 49
Bảng 3.27. Kết quả khảo sát thời gian lưu....................................................... 50
Bảng 3.28. Kết quả khảo sát diện tích pic ....................................................... 51
vi


Bảng 3.29. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp ............................... 52
Bảng 3.30. Kết quả phân tích sữa bột Dielac Alpha Gold .............................. 53
Bảng 3.31. Kết quả phân tích sữa bột Dielac Grow Plus ................................ 55
Bảng 3.32. Kết quả phân tích sữa tươi Dielac Grow Plus 180 mL ................. 57
Bảng 3.33. Kết quả phân tích sữa tươi Dielac Alpha Gold 180mL ................ 59

Bảng 3.34. Bảng thêm chuẩn vitamin B1 trong sữa bột Dielac Alpha Gold .... 61
Bảng 3.35. Bảng thêm chuẩn vitamin B6 trong sữa bột Dielac Alpha Gold .... 61
Bảng 3.36. Bảng thêm chuẩn vitamin B12 trong sữa bột Dielac Alpha Gold ....... 62
Bảng 3.37. Kết quả phân tích sữa bột Dielac Alpha Gold theo phương
pháp thêm chuẩn............................................................................ 62
Bảng 3.38. Bảng thêm chuẩn vitamin B1 trong sữa bột Dielac Grow Plus ...... 63
Bảng 3.39

Bảng thêm chuẩn vitamin B6 trong sữa bột Dielac Grow Plus ...... 63

Bảng 3.40. Bảng thêm chuẩn vitamin B12 trong sữa bột Dielac Grow Plus .... 64
Bảng 3.41. Kết quả phân tích sữa bột Dielac Grow Plus theo phương
pháp thêm chuẩn............................................................................ 64
Bảng 3.42. Bảng thêm chuẩn vitamin B1 trong sữa tươi Dielac Alpha Gold........ 65
Bảng 3.43. Bảng thêm chuẩn vitamin B6 trong sữa tươi Dielac Alpha Gold........ 66
Bảng 3.44. Bảng thêm chuẩn vitamin B12 trong sữa tươi Dielac Alpha Gold ...... 66
Bảng 3.45. Kết quả phân tích sữa tươi Dielac Alpha Gold theo phương
pháp thêm chuẩn............................................................................ 67
Bảng 3.46. Bảng thêm chuẩn vitamin B1 trong sữa tươi Dielac Grow Plus .... 68
Bảng 3.47. Bảng thêm chuẩn vitamin B6 trong sữa tươi Dielac Grow Plus .... 68
Bảng 3.48. Bảng thêm chuẩn vitamin B12 trong sữa tươi Dielac Grow Plus ...... 69
Bảng 3.49. Kết quả phân tích sữa tươi Dielac Grow Plus theo phương
pháp thêm chuẩn............................................................................ 69

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN
Hình 1.1.

Công thức cấu tạo của vitamin B1 .............................................. 3

Hình 1.2.

Công thức cấu tạo của vitamin B6 ................................................ 5

Hình 1.3.

Hidroxocobalamin ......................................................................... 7

Hình 1.4.

Xianocobalamin ............................................................................ 7

Hình 1.5.

Sữa Dielac Grow Plus ................................................................. 11

Hình 1.6.

Sữa Dielac Alpha Gold ............................................................... 11

Hình 3.1.

Sắc đồ quét phổ hấp phụ vitamin B1 .......................................... 24

Hình 3.2.

Sắc đồ quét phổ hấp phụ vitamin B6 .......................................... 24

Hình 3.3.

Sắc đồ quét phổ hấp phụ vitamin B12 ........................................ 24

Hình 3.4.

Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 ở tốc độ 0,8
mL/phút ....................................................................................... 25

Hình 3.5.

Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 ở tốc độ 1
mL/phút ....................................................................................... 25

Hình 3.6.

Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 ở tốc độ 1,2
mL/phút ....................................................................................... 26

Hình 3.7.

Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 tỉ lệ pha động
10:90 ............................................................................................ 26

Hình 3.8.

Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 tỉ lệ pha động
30:70 ............................................................................................ 27

Hình 3.9.

Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 tỉ lệ pha động
20:80 ............................................................................................ 27

Hình 3.10.

Sắc ký đồ của hỗn hợp vitamin B1, B6, B12 .............................. 28

Hình 3.11.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B1 ........................................................ 29

Hình 3.12.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B6 ........................................................ 29

vi


Hình 3.13.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B12 ...................................................... 30

Hình 3.14.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên

nền sữa bột Dielac Alpha Gold ...................................................... 33

Hình 3.15.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên
nền sữa bột Dielac Alpha Gold ...................................................... 34

Hình 3.16.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn
trên nền sữa bột Dielac Alpha Gold ................................................ 35

Hình 3.17.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên
nền sữa bột Dielac Grow Plus ........................................................ 38

Hình 3.18.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên
nền sữa bột Dielac Grow Plus ........................................................ 39

Hình 3.19.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn

trên nền sữa bột Dielac Grow Plus ................................................. 40

Hình 3.20.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên
nền sữa tươi Dielac Alpha Gold ..................................................... 43

Hình 3.21.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên
nền sữa tươi Dielac Alpha Gold ..................................................... 44

Hình 3.22.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn
trên nền sữa tươi Dielac Alapha Gold ............................................. 45
vii


Hình 3.23.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn trên
nền sữa tươi Dielac Grow Plus ....................................................... 48

Hình 3.24.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn trên
nền sữa tươi Dielac Grow Plus ..................................................... 49

Hình 3.25.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và
diện tích pic của vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn
trên nền sữa tươi Dielac Grow Plus .............................................. 50

Hình 3.26.

Biểu đồ thể hiện sự chênh lệch về hàm lượng giữa lí thuyết
và thực tế của các vitamin trong sữa bột Dielac Alpha Gold ..... 54

Hình 3.27.

Biểu đồ thể hiện sự chênh lệch về hàm lượng giữa lí thuyết
và thực tế của các vitamin trong sữa bột Dielac Grow Plus ....... 56

Hình 3.28.

Biểu đồ thể hiện sự chênh lệch về hàm lượng giữa lí thuyết
và thực tế của các vitamin trong sữa tươi Dielac Grow Plus
180 mL ........................................................................................ 58

Hình 3.29.

Biểu đồ thể hiện sự chênh lệch về hàm lượng giữa lí thuyết
và thực tế của các vitamin trong sữa tươi Dielac Alpha Gold

180 mL ........................................................................................ 60

viii


MỞ ĐẦU
Vitamin là một nhóm các hợp chất hữu cơ, có cấu tạo hóa học rất khác nhau
do đó các tính chất hóa học cũng như lí học cũng khác nhau, nhưng chúng đều
giống nhau ở chỗ là rất cần thiết cho hoạt động sống của bất kỳ cơ thể nào. Hiện
nay người ta đã nghiên cứu và phân lập được trên 30 loại vitamin khác nhau, đồng
thời đã nghiên cứu các thành phần, cấu tạo và tác dụng sinh lý của chúng.
Vitamin nhóm B bao gồm các loại: B1, B2, B3, B5, B6, B7, B8, B9, B12.
Nhìn chung, vitamin nhóm B đều có tác dụng hỗ trợ quá trình sản xuất năng lượng
trong cơ thể cũng như trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng trong tế bào.
Vitamin B1 còn gọi là thiamin có vai trò vô cùng quan trọng trong việc
duy trì các hoạt động tương tác của tế bào trong cơ thể, nhất là việc sản xuất
năng lượng. Trong đó các tế bào của cơ thể đã dùng oxi để chuyển hóa
cacbonhydrat và các loại đường thành năng lượng.
Hiện tượng thiếu hụt vitamin B1 được chuyên môn gọi là hiện tượng beri
beri rất ít khi xảy ra nhưng khi xuất hiện thường kèm theo các dấu hiệu như
giảm tính ngon miệng, mệt mỏi, ngại vận động, khó tiêu hóa, táo bón, lo sợ,
đặc biệt các cơ bắp xuất hiện hiện tượng như có kim châm, đầu ngón chân ngón
tay bị tê cứng…
Vitamin B6 là một vitamin hòa tan trong nước và là một phần của nhóm
vitamin B. Vitamin B6 hoạt động như một coenzym giúp chuyển hóa
tryptophan thành niacin. Nó đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa chất
đạm, chất béo, cacbonhydrat. Sự thiếu hụt vitamin B6 có thể gây ra nhiều triệu
chứng: mệt mỏi, mất ngủ, khó chịu, rối loạn tâm thần, môi nứt nẻ, da khô, rụng
tóc. Ở trẻ em thiếu vitamin B6 thường chậm lớn và có thể có những cơn co giật.
Vitamin B12 rất cần thiết cho quá trình nhân lên của tế bào. Thiếu vitamin

B12 ảnh hưởng một cách đặc biệt đến tất cả các mô mà trong đó quá trình nhân
đôi xảy ra nhanh chẳng hạn ở máu, niêm mạc ruột non, nội mạc tử cung. Vitamin
B12 tham gia vào chức năng của hệ thống thần kinh (trí nhớ, khả năng học...) và
quá trình phát triển hài hòa ở trẻ em.
1


Việc xác định chính xác hàm lượng vitamin B1, B6 và B12 được bổ sung
rất có ý nghĩa trong việc đảm bảo quyền lợi và sức khỏe của người tiêu dùng.
Để xác định hàm lượng vitamin nhóm B trong thực phẩm và dược phẩm, có rất
nhiều phương pháp phân tích đã được nghiên cứu và áp dụng để phân tích riêng
rẽ hoặc đồng thời các vitamin nhóm B như phương pháp điện hóa, phương
pháp động học huỳnh quang, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trong
các phương pháp này, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, detector
UV - Vis và detector PDA với cột tách C18 được sử dụng một cách rộng rãi do
khả năng tách rất tốt các vitamin và đáp ứng nhu cầu cho phân tích đồng thời
lượng nhỏ các vitamin nhóm B trong dược phẩm và lượng vết vitamin trong
thực phẩm…
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn để tài: “Xác định đồng
thời vitamin B1 và B6 và B12 trong sữa bột, sữa tươi dielac grow plus và
dielac alpha gold bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”.

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về vitamin B1
1.1.1.Tên gọi
 Tên thông thường: Vitamin B1 hay thiamin.

 Tên IUPAC: 2-[3-[(4-amino-2-metyl-pyrimidin-5-yl)metyl]-4- metylthiazol-5-yl]etanol.
1.1.2. Công thức hóa học
Công thức phân tử: C12H17SON4
Khối lượng mol phân tử: 265,35 (g/mol)

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của vitamin B1
Công thức cấu tạo của vitamin B1 cho thấy nó là một dẫn xuất pyrimidin
gắn với dẫn xuất thiazol qua nhóm metylen.
1.1.3. Tính chất vật lý
Vitamin B1 là những tinh thể trắng nhỏ hay bột kết tinh, có mùi đặc
trưng. Khi tiếp xúc với không khí, chế phẩm khan nhanh chóng hút ẩm
(khoảng 4 % nước). Dung dịch trong nước có môi trường axit, nóng chảy ở
2480C và phân hủy.
Vitamin B1 có tính axit, hoà tan tốt trong môi trường nước, axit axetic,
nhưng khó tan trong etanol 96 % và metanol, không tan trong ete, benzen hay
clorofom và chịu nhiệt khá nên không bị phân huỷ khi nấu nướng. Vitamin B1

3


nóng chảy ở 2330C - 2520C. Vitamin B1 bền trong môi trường axit, còn trong
môi trường kiềm nó rất dễ bị phân huỷ khi đun nóng.
Trong môi trường không phân cực vitamin B1 hấp thụ tại 2 bước sóng
λmax1 = 246,9 nm và λmax2 = 264,5 nm.
Vitamin B1 không ổn định với ánh sáng và độ ẩm. Mất hoạt tính trong
môi trường trung tính và bazơ. Ổn định tính chất ở pH = 4.
Dạng chế phẩm của vitamin B1 có thể tồn tại ở dạng thiamin
monohydroclorua, thiamin mononitrat...[8].
1.1.4. Tính chất hóa học
Thiamin là dẫn xuất pyrimidin gắn với dẫn xuất thiazol qua nhóm

metylen.
Do có 3 nguyên tử N nên mang lại cho thiamin tính bazơ. Tuy nhiên 2
nguyên tử N có tính bazơ yếu. Vì vậy chế phẩm được dùng loại thiamin
monohydroclorua, dung dịch của chúng trong nước có môi trường axit, chúng
dễ tan trong nước và vững bền hơn thiamin bazơ.
Do nguyên tử N bậc 4 nên vòng thiazol trong thiamin kém vững bền đặc
biệt trong môi trường kiềm. Trong môi trường này vòng bị mở và lúc đó dễ bị
oxi hóa thành các sản phẩm không có hoạt tính vitamin. Do vậy khi pha chế
dung dịch thiamin phải đựng trong cốc thủy tinh trung tính, pH của dung dịch
phải axit.

Thiamin bị oxy hóa bởi K3[Fe(CN)6] trong môi trường kiềm tạo thành
thiocrom màu vàng phát huỳnh quang màu xanh da trời. Phản ứng này được
dùng để định tính thiamin và định lượng thiamin bằng phương pháp đo
huỳnh quang [8].
4


Nhóm -OH trong phân tử làm cho thiamin có thể ete hóa hay este hóa tạo
thiamin panmitat, thiamin stearat, thiamin phtalat… song quan trọng nhất là tạo
với H3PO4 thiamin pyrophotphat (TPP) - là coenzym xúc tác nhiều quá trình
chuyển hóa trong cơ thể.
1.2. Giới thiệu về vitamin B6
1.2.1. Tên gọi
 Tên thông thường: Vitamin B6 hay piridoxin.
 Tên IUPAC: 4,5-đihidroximetyl-2-metylpiridin-3-ol.
1.2.2. Công thức hóa học
Công thức phân tử: C8H11NO3
Khối lượng mol phân tử: 169,18 (g/mol).

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của vitamin B6

1.2.3. Tính chất vật lý
Vitamin B6 là tinh thể không màu, vị hơi đắng, hòa tan tốt trong nước và
trong rượu, chịu nhiệt, nhiệt độ nóng chảy ở 1600C. Vitamin B6 bền khi đun sôi
trong axit hay kiềm, không bền trong môi trường có tính oxy hóa. Vitamin B6
nhạy cảm với ánh sáng, chúng phân hủy nhanh khi chiếu sáng ở môi trường
kiềm hay trung tính.
Vitamin B6 tồn tại ở 3 dạng: Piridoxin, Piridoxal, Piridoxamin. Ba
dạng này có thể chuyển hoá lẫn nhau.

5


Bảng 1.1: Tính chất vật lí của 3 dạng vitamin B6
Tên chất

Piridoxin.HCl

Piridoxal.HCl

Piridoxamin.HCl

Khối lượng mol phân tử

205,64

303,63

241,12

Công thức
(g) phân tử

C8H11NO3.HCl C8H9NO3.HCl

C8H12N2O2.HCl

Nhiệt độ nóng chảy (0C)

204 - 206

160

226 - 227

λmax (nm)

292; 290; 253

390; 318

328; 253

1.2.4. Tính chất hóa học
Do có nguyên tử N nên mang lại cho piridoxin tính bazơ. Piridoxin khả
năng tác dụng với các axit tạo thành muối.
Piridoxin dễ bị oxy hóa, tác nhân xúc tác quá trình này là ánh sáng tia tử
ngoại, pyridoxin tác dụng với Fe (III) cho muối phức màu đỏ. Piridoxin ở
dạng dẫn xuất photphat như piridoxin photphat tham gia vào các quá trình

chuyển hóa axit amin, lipit, gluxit, chuyển protein sang gluxit [8].
Vitamin B6 giữ vai trò đặc biệt trong chuyển hóa axit amin.
Vitamin B6

Ngoài ra, vitamin B6 còn tham gia vào quá trình tách CO 2 của các axit
amin và liên quan đến cân bằng năng lượng cơ thể. Các phản ứng chuyển hóa
liên quan đến sự hình thành chất trung gian thần kinh và các chất điều hòa
khác: taurine, histamine…
1.3. Giới thiệu về vitamin B12
1.3.1. Tên gọi
Tên thông thường: Vitamin B12 hay cobalamin.
Tên IUPAC: α-(5,6-dimetylbenzimidazolyl)cobanmitxianide.
6


1.3.2. Công thức hóa học
Công thức phân tử: C16H88CoN14O14P
Khối lượng mol phân tử: 1355,37 (g/mol).
Vitamin B12 thường tồn tại ở hai dạng: xianocobalamin hoặc
hidroxocobalamin.

Hình 1.3. Hidroxocobalamin

Hình 1.4. Xianocobalamin

1.3.3. Tính chất vật lý
Vitamin B12 thường ở trạng thái kết tinh, có kích thước rất nhỏ, có màu
đỏ sẫm, không mùi, không vị. Vitamin B12 tan tốt trong nước, không tan trong
các dung môi hữu cơ như ete, axeton, benzen, clorofom. Vitamin B12 bền
trong bóng tối ở nhiệt độ thường, khá bền với nhiệt. Vitamin B12 dễ bị phân

hủy bởi ánh sáng. Khi tiếp xúc với kim loại nặng dễ bị mất hoạt tính và không
bền trong môi trường kiềm (pH > 7).
1.3.4. Tính chất hóa học
Vitamin B12 là vitamin nhóm B duy nhất có nguyên tử kim loại trong
phân tử, có cấu tạo phức tạp. Có thể chia thành hai phần:
Phần thứ nhất gồm 4 nhân pyrol, giữa nhân là nguyên tử coban hóa trị
III, các nhân này đã bị thế bởi các nhóm metyl, axetamit, propionamit. Phần

7


thứ hai là phần nucleotit gồm 5,6-dimetylbenzimidazol đã este hóa bởi axit
photphoric. Hai phần này nối với nhau qua cầu nối là isopropanol.
Nguyên tử coban liên kết cộng hóa trị với một nguyên tử nitơ của một
nhân pyrol, liên kết cho nhận với ba nguyên tử nitơ còn lại và nguyên tử nitơ
trong nhân benzimidazol; liên kết ion với nguyên tử oxi của phân tử axit
photphoric. Nguyên tử coban còn liên kết với các nhóm chức khác nhau tạo ra
các vitamin B12 khác nhau. Vitamin B12 thường tồn tại ở hai dạng:
xianocobalamin khi nguyên tử Co liên kết với nhóm -CN và hidroxocobalamin
khi nguyên tử Co liên kết với nhóm -OH.
Vitamin B12 là thành phần cấu tạo nên các enzim xúc tác cho phản
ứng chuyển hóa ribonucleotit thành deoxyribonucleotit. Vitamin B12 là xúc
tác quan trọng của hai loại phản ứng thiết yếu: đồng phân hóa, vận chuyển
nhóm metyl.
1.4. Nhu cầu vitamin B1, B6, B12 và nguồn thực phẩm
Với nồng độ cao vitamin B1 được hấp thụ bằng cơ chế thụ động nhưng ở
nồng độ thấp nó được hấp thụ bằng hệ thống vận chuyển chủ động qua trung
gian một số chất mang. Vitamin B1 sau khi được hấp thụ trong ruột non và tá
tràng, nó chuyển vào gan liên kết với photpho thành dạng hoạt động, rồi vào
máu để phân bố đi khắp cơ thể. Trong máu, vitamin B1 gắn với protein huyết

tương mà chủ yếu là albumin và hồng cầu. Các cơ quan dự trữ vitamin B1 bao
gồm cơ, tim, gan, thận và não, trong đó cơ là nơi dự trữ chính. Hàm lượng
vitamin B1 trong các mô là rất ít, vì thế hàm lượng B1 trong cơ thể phụ thuộc
vào lượng đưa vào qua thức ăn.
Cho đến nay khoa học chưa thấy hiện tượng thừa vitamin B1. Ngược lại
thiếu vitamin B1 là một bệnh khá phổ biến trên phạm vi toàn cầu.

8


Hầu hết những người thiếu vitamin B1 trên thế giới là do ăn kém. Thiếu
vitamin B1 cũng thường gặp hơn ở các nước dùng gạo làm lương thực chính do
vitamin B1 có nhiều ở lớp vỏ ngoài ngay sát hạt gạo. Do vậy việc xay sát các
loại ngũ cốc (gạo, mì) quá kỹ sẽ làm cho lượng vitamin B1 bị hao hụt nhiều…
Ở các nước phương Tây, nguyên nhân chủ yếu gây thiếu vitamin B1 là nghiện
rượu và bệnh mãn tính. Rượu ảnh hưởng gián tiếp đến sự hấp thu vitamin B1.
Bệnh nhân suy dinh dưỡng và bệnh nhân mắc bệnh gan do rượu có nguy cơ
thiếu vitamin B1 vì lượng vitamin B1 dự trữ trong gan và cơ bị giảm. Người
lao động nặng tăng tiêu hao nhiều năng lượng, người cao tuổi do ăn uống kém
dễ bị thiếu vitamin B1.
Thiếu hụt vitamin B1 có thể xảy ra khi chế độ ăn uống nghèo nàn, ít thức
ăn động vật (thịt, cá, trứng...) hoặc do một số bất thường liên quan đến hệ tiêu
hóa thì có thể dẫn đến mắc bệnh Beriberi. Chính vì vậy, hằng ngày cần bổ sung
các loại thực phẩm giàu vitamin B1 như: gạo, thịt, cá, trứng, các loại đậu…
Vitamin B6 khi vào cơ thể được hấp thu nhanh và dự trữ phần lớn ở gan,
một phần ở não và cơ. Nếu lượng vitamin B6 đưa vào cơ thể vượt quá nhu cầu
thì sẽ bị đào thải ra ngoài qua thận dưới dạng chuyển hóa.
Hiếm gặp tình trạng thiếu hụt vitamin B6 ở người tuy nhiên vẫn có thể
xảy ra đối với phụ nữ thời kỳ mang thai hoặc cho con bú, trẻ em chậm lớn,
người già, vận động viên phải tập luyện nặng. Các trường hợp rối loạn chuyển

hóa bẩm sinh, rối loạn hấp thu, rối loạn do dùng thuốc.
Khi bị thiếu hụt vitamin B6 có thể dẫn đến thiếu máu nguyên bào sắt,
viêm dây thần kinh ngoại vi, viêm da tăng bã nhờn và khô nứt môi... Do đó,
cần thiết phải bổ sung vitamin B6.
Vitamin B6 có nhiều trong các loại thực phẩm như: thịt bò, thịt gia cầm,
thịt lợn, trứng, cá, ngũ cốc nguyên hạt, khoai tây, đậu nành, đậu hạt, lạc, cà
9


rốt... Không nên dùng vượt quá 100 mg mỗi ngày vì có thể gây tổn thương hệ
thần kinh.
Bảng 1.2. Nhu cầu cung cấp vitamin B1, B6 và B12 của người
Nhu cầu

Nhu cầu

Nhu cầu

vitamin B1

vitamin B6

vitamin B12

(mg/ngày)

(mg/ngày)

(μg/ngày)

0,2

0,1

0,3

6-11 tháng

0,3

0,3

0,4

1-3

0,5

0,5

0,9

4-6

0,6

0,6

1,2

7-9

0,9

1,0

1,8

Nam vị thành niên

10-19

1,2

1,3

2,4

Nữ vị thành niên

10-18

1,1

1,2

2,4

Phụ nữ có thai

1,4

1,9

2,6

Bà mẹ cho bú

1,5

2,0

2,8

Nhóm / giới/ tình
trạng sinh lí
Trẻ em

Tuổi
Dưới 6
tháng

Trẻ nhỏ

Vitamin B12 khi đi vào cơ thể sẽ phân bố vào máu, tích lũy nhiều ở gan,
thần kinh trung ương, tim và nhau thai. Ở người bình thường, tổng số vitamin
B12 dự trữ khoảng 1 - 10 mg. Trong khi đó nhu cầu tối thiểu hàng ngày của
vitamin B12 chỉ bằng 0,1 mcg. Chỉ khi cơ thể không được cung cấp vitamin
B12 trong thời gian dài (khoảng 5 năm trở lên), lượng B12 trong cơ thể mới
cạn kiệt và tình trạng thiếu vitamin B12 mới xảy ra.

Trong thực tế, thiếu vitamin B12 rất hiếm gặp. Hầu hết thiếu vitamin
B12 ở người là do kém hấp thu B12, hoặc những người ăn chay, hoàn toàn
không ăn thịt cá, những người có bệnh ở dạ dày, người uống nhiều vitamin C.
Thiếu vitamin B12 có thể gây ra thiếu máu, các bệnh liên quan đến thần
kinh (alzheimer, bệnh hoang tưởng, trầm cảm…). Khi đó cơ thể cần bổ sung
kịp thời vitamin B12. Một số thực phẩm cung cấp vitamin B12 như: thịt, ngũ
cốc, phô mai và sữa.
10


1.5. Giới thiệu sữa Dielac Grow Plus và sữa Dielac Alpha Gold
Dielac là nhãn hiệu sữa công thức của vinamilk - thương hiệu sữa hàng
đầu Việt Nam hiện nay. Trong đó Dielac Grow Plus và sữa Dielac Alpha Gold
là hai loại sữa tốt và phù hợp nhất cho sự phát triển của trẻ nhỏ.
Sữa Dielac Grow Plus và sữa Dielac Alpha Gold là hai sản phẩm của
công ty vinamilk. Nhà máy Sữa Việt Nam được trang bị dây chuyển sản xuất
sữa tươi tiệt trùng với thiết bị hiện đại và công nghệ sản xuất tiến tiến hàng đầu
hiện nay. Nhà máy hoạt động tren một dây chuyền tự động, khép kín, từ khâu
nguyên liệu đầu vào đến đầu ra sản phẩm.

Hình 1.5. Sữa Dielac Grow Plus

Hình 1.6. Sữa Dielac Alpha Gold

- Đối tượng nghiên cứu của luận văn bao gồm:
 Sữa bột Dielac Alpha Gold 100 gam của công ty vinamilk sản xuất, lô số
R3, ngày 26/02/2019 có hạn sử dụng đến ngày 26/02/2021 có thành phần
0,63 mg B1; 0,75 mg B6 và 1,5 μg B12.
 Sữa bột Dielac Grow Plus 100 gam của công ty vinamilk sản xuất, lô số
E7, ngày 26/02/2019 có hạn sử dụng đến ngày 26/02/2021 có thành phần

1,1 mg B1; 1,1 mg B6 và 2,2 μg B12.
 Sữa tươi Dielac Alpha Gold 180 mL của công ty vinamilk sản xuất, lô số
0D72GPG03, ngày 28/6/2019 có hạn sử dụng đến ngày 27/12/2019 có
thành phần 0,14 mg B1; 0,2 mg B6 và 0,58 μg B12.
 Sữa tươi Dielac Grow Plus 180 mL của công ty vinamilk được sản xuất,
lô số 0E72GPG15, ngày 28/6/2019 có hạn sử dụng đến ngày 27/12/2019
có thành phần 0,2 mg B1; 0,36 mg B6 và 0,67 μg B12.
11


1.6. Tổng quan xác định vitamin B1, B6 và B12 theo phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Hiện nay, phương pháp HPLC là một phương pháp được sử dụng rộng
rãi để xác định các vitamin trong các loại thực phẩm và dược phẩm. Mỗi đối
tượng khác nhau thì các điều kiện tiến hành sắc ký cũng khác nhau.
1.6.1. Phương pháp sắc ký lỏng sử dụng cột tách pha đảo RP-LC, detector UV-Vis
Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector UV-Vis được ứng
dụng rất phổ biến, mặc dù detector UV vốn đã có độ nhạy thấp hơn so với sử
dụng detector huỳnh quang. Tuy nhiên quá trình xử lý mẫu cho detector UV thì
đơn giản hơn nhiều so với sử dụng detector huỳnh quang. Phương pháp HPLC
sử dụng detector UV đã được sử dụng thành công trong việc phân tích vitamin
B1, B6 trong các sản phẩm ngũ cốc, sản phẩm gạo và một vài loại nấm lớn.
Năm 1979, Toma và Tabekhia áp dụng phương pháp sắc ký sử dụng cặp
ion trong pha động và cột tách pha đảo đã tách được vitamin B1 và B6 trong
gạo và các sản phẩm tử gạo [15]. Kể từ đó, phương pháp sắc ký sự dụng cặp
ion trong pha động và cột tách pha ngược đă được sử dụng cho nhiều đối tượng
khác nhau như trứng, sữa…
Năm 1997, Soledad Albalá - Hurtado đã phát triển phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao HPLC để xác định đồng thời 06 vitamin tan trong mẫu sữa
bột và sữa tươi [20]. Sử dụng phương pháp sắc ký cặp ion với cột tách pha đảo

C18. Tổng thời gian phân tích cho các vitamin này là 55 phút. Pha động gồm
kênh A là metanol và kênh B là nước với tỉ lệ 15:85 về thể tích. Tốc độ dòng
1,0 mL/phút. Detector UV tại các bước sóng khác nhau. Với các điều kiện sắc
ký như trên đã cho kết quả tách có độ tin cậy cao về độ tuyến tính, độ chính xác
và độ nhạy của phương pháp. Giới hạn phát hiện nằm trong khoảng từ 0,02 đến
0,1 mg/L. Giới hạn định lượng nằm trong khoảng từ 0,03 đến 0,25 mg/L.
Năm 2005, Amidzic nghiên cứu xác định các vitamin B1, B6 và B12
trong thuốc đa vitamin [21]. Độ thu hồi của phương pháp đạt giá trị từ 90,4 đến
108,5%, với độ lệch chuẩn RSD từ 0,5 đến 4,1%.
12