Nghiên cứu tạo dung dịch keo bạc nano để phòng trừ bệnh rụng lá corynespora trên cây cao su do nấm corynespora cassiicola

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
[1] L. T. A. Nhien, L. T. T. Tien, N. D. Luong, L. Q. Luan, “Radiation
synthesis of silver nano particles/chitosan for controlling leaf fall disease on
rubber trees causing by Corynespora cassiicola” Journal of Nanomaterials, vol.
2018, pp. 1-9, 2018. />[2] Lê Thị An Nhiên, Trần Đức Trọng, Lê Thị Thủy Tiên, Nguyễn Đức Lượng,
Lê Quang Luân, “Nghiên cứu sinh tổng hợp bạc nano từ dịch nội bào vi khuẩn
Bacillus subtillis ứng dụng trong nông nghiệp”. Tạp chí Khoa học Công nghệ
Nông nghiệp Việt Nam, vol. 2(87), pp. 109-116, 2018.
[3] L. T. A. Nhien, L. N. T. Tam, D. H. Xo, L. Q. Luan, N. D. Luong,
“Radiation synthesis of silver nano particles/chitosan against Corynespora
cassiicola causing leaf fall disease on rubber trees,” Journal of Science and
Technology, vol. 55(1B), pp. 29-40, 2017. />[4] L. T. A. Nhien, N. T. Vu, H. T. M. Huong, H. Quyen, L. T. T. Tien, N. D.
Luong, L. Q. Luan, “Study on the antifungal effect against plant pathogenesis
funguses of silver nano particles synthesized by γ-rays radiation,” Proceedings
of IWNA 2017, 2017.
[5] Lê Thị An Nhiên, Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, Nguyễn Thanh
Quang, “ hảo s t ảnh hư ng của m i trư ng nu i c y, nhiệt ộ, p
bảo vệ th c v t

v thu c

n s ph t tri n của n m Corynespora cassiicola (Berk. and

Curt.) Wei trên cây cao su,” Tạp chí Bảo vệ thực vật, vol. 5, pp. 51-56, 2016.
[6] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị An Nhiên, Lê Thị Thủy Tiên và Nguyễn Thanh
Quang, "Tìm hi u về khả năng

i kháng của một s Vi sinh v t

i với n m

Corynespora cassiicola trên cây cao su Hevea brasiliensis Müller Arg," Hội
nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, 2013.
1


MỞ ĐẦU
Cây cao su (Hevea brasiliensis) là cây công nghiệp dài ngày có giá trị kinh t
cao, cung c p mủ và gỗ cho nhiều ngành công nghiệp. Đ

p ứng nhu cầu kinh

t , c c dòng cao su ược l a chọn theo hướng sinh trư ng mạnh. Cùng với s
sinh trư ng mạnh của cây cao su thì những thiệt hại do bệnh gây ra cũng gia
tăng. Đ ng k

nh t là bệnh rụng lá Corynespora do n m Corynespora

cassiicola gây ra, bệnh xu t hiện năm 1999 v

ang có chiều hướng lan rộng

gây hại cho các dòng vô tính cao su. Với hiện trạng dịch bệnh bùng phát thì
thu c hoá học trước mắt vẫn giữ vai trò chủ l c trong công tác trị bệnh. Cũng
như nhiều loại hoá ch t khác, thu c trừ n m C. cassiicola gây bệnh rụng lá
Corynespora có th gián ti p làm hại sức khỏe con ngư i, là m i e dọa cho
các hệ sinh th i, ồng th i làm giảm ch t lượng sản phẩm.
Gần ây, c ng nghệ nano ngày càng phát tri n và ược ịnh hướng trong việc
nâng cao ch t lượng v năng su t cây trồng, trong ó nano bạc ược tổng hợp
b ng phư ng ph p sinh học và phư ng ph p chi u xạ, ược coi là một sản phẩn
an toàn góp phần trong công tác phòng và trị bệnh trên cây trồng. Cây cao su là

loại cây xu t khẩu có giá trị hiện nay nhưng lại ang gặp phải khó khăn về v n
ề bệnh rụng lá Corynespora do n m C. cassiicola gây ra thì việc phòng và trị
bệnh b ng biện ph p an to n ược ặc biệt quan tâm. Từ v n ề th c tiễn nêu
trên, ề tài: “Nghiên cứu tạo dung dịch keo bạc nano

phòng trừ bệnh rụng lá

Corynespora trên cây cao su do n m Corynespora cassiicola” ược th c hiện.
Đối tượng nghiên cứu
N m C. cassiicola ược phân l p từ lá của cây cao su bị bệnh Corynespora
trồng tại Đồng Nai.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Tìm hi u bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su do n m C. cassiicola gây ra
v tìm phư ng ph p tạo ch phẩm phòng trừ bệnh rụng lá Corynespora có hiệu
quả trong phòng thí nghiệm v trên cây cao su trong vư n ư m.
Ý nghĩa khoa học
2


Lu n n

c ịnh ược c c iều kiện th ch hợp cho qu trình tạo ra 4 ch phẩm

gồm huyền ph vi khuẩn B. subtilis, B. thuringiensis, dung dịch keo bạc nano từ
dịch nội b o vi khuẩn B. subtilis v dung dịch keo bạc nano - chitosan b ng
phư ng ph p chi u ạ.
c ịnh ược khả năng ức ch n m C. cassiicola gây bệnh rụng l Corynepora
trên cây cao su của c c dung dịch trong iều kiện in vitro, khả năng phòng v trị
bệnh rụng l Corynespora trên cây cao su 9 th ng tuổi trong vư n ư m b ng
dung dịch keo bạc nano - chitosan.

Ý nghĩa thực tiễn
Lu n án góp phần tìm ra giải pháp phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora do
n m C. cassiicola gây ra trên cây cao su. Bước ầu thành công trên cây cao su 9
tháng tuổi trong vư n ư m.
Việc ứng dụng nano bạc

phòng v trị bệnh rụng l Corynespora của cây cao

su là một phư ng ph p mới, có hiệu quả,

p ứng một s v n ề sau:

- Áp dụng công nghệ cao phục vụ sản xu t nông nghiệp.
-

iệc giảm sử dụng các loại thu c bảo vệ th c v t hóa học sẽ góp phần bảo
vệ sức khỏe của nông dân.

Tính mới của luận án
1.

c ịnh ược ảnh hư ng của kh i lượng phân tử v

ộ deacetyl hóa

chitosan lên k ch thước hạt bạc nano.
2. Bước ầu

c ịnh ược ảnh hư ng của bạc nano lên hệ sợi n m C.

cassiicola b ng ảnh SEM .
3. Xây d ng ược quy trình và ch tạo ược dung dịch keo bạc nano có kích
thước hạt khác nhau sử dụng chitosan làm ch t ổn ịnh b ng phư ng ph p
chi u xạ.
4. Chứng minh ược hiệu quả của dung dịch keo bạc nano - chitosan ch tạo
ược

i với bệnh rụng l Corynespora trên cây cao su trong vư n ư m.

3


Nội dung nghi n ứu
1. Phân l p và khảo sát một s y u t ảnh hư ng lên s sinh trư ng của n m
C. cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su, từ ó ặt k
hoạch tạo ch phẩm phòng ch ng chúng.
hảo s t khả năng

2.

i kh ng n m C. cassiicola của B. subtilis và

B. thuringiensis.
hảo s t khả năng tổng hợp bạc nano từ dịch nội b o của vi khuẩn

3.

B. subtilis có khả năng kh ng n m C. cassiicola.
4. Ch tạo dung dịch keo bạc nano - chitosan có khả năng ức ch n m
C. cassiicola b ng phư ng ph p chi u xạ.

5. Khảo sát khả năng ức ch n m C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano
trong iều kiện in vitro.
6. Khảo sát khả năng phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora do n m
C. cassiicola gây ra trên cây cao su 9 tháng tuổi trong vư n ư m của dung
dịch keo bạc nano - chitosan có k ch thước hạt bạc 10 nm.
Bố cục
Lu n n gồm 167 trang, 20 bảng, 68 hình v 84 t i liệu tham khảo, bao gồm c c
phần:

ầu; Chư ng 1: Tổng quan t i liệu; Chư ng 2:

ph p; Chư ng 3:
mục c ng trình

t lu n v ki n nghị; Danh

c ng b ; T i liệu tham khảo v Phụ lục.

CHƯƠNG 1
1.1

t quả v thảo lu n; Chư ng 4:

t liệu v phư ng

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

ượ v

ệnh rụng

Corynespora

Bệnh rụng lá Corynespora do n m Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.)
Wei. gây ra

gây thiệt hại r t nghiêm trọng

Việt Nam mà còn

i với ngành cao su không chỉ

nhiều qu c gia trên th giới. N m C. cassiicola có th gây

ra thiệt hại trên nhiều bộ ph n của cây cao su vào mọi giai oạn sinh trư ng và
có th xảy ra quanh năm. Các dạng v t bệnh phổ bi n trên lá gồm có dạng
ư ng c , dạng

m trên phi n lá, trên gân lá phụ, trên gân lá chính.

4


1.2

ượ v nano

Nano bạc là những hạt bạc có k ch thước từ 0,1

n 100 nm. Nano bạc thư ng

dưới dạng dung dịch keo với ch t bảo vệ là các polymer giúp cho các hạt bạc
không bị k t tụ. Nano bạc là ứng dụng khoa học và công nghệ nano

i với bạc

tăng t nh năng diệt khuẩn, sát trùng và khử m i, ược ứng dụng trong sản
xu t rau sạch.
1.3

T nh h t kh ng khu n ủa

nano

Bạc nano ược em như một tác nhân kháng vi sinh v t có tác dụng ức ch
mạnh mẽ với phổ hoạt ộng khá rộng

ình 1.1 C ch diệt vi khuẩn của
bạc nano th ng qua c c tư ng t c
với protein v nucleic acid

i với vi khuẩn, n m và virus.

ình 1.2 C ch diệt n m của bạc nano
th ng qua t c ộng của c c g c o y hóa
t do (ROS) n ty th v DNA

ình 1.3 C c c ch t c ộng của bạc nano
5

n vi sinh v t


CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật iệu
- Lá cây cao su thuộc dòng vô tính RRI 4 ược thu hái tại N ng trư ng cao
su Cẩm Đư ng - tỉnh Đồng Nai, có các bi u hiện ặc trưng của bệnh rụng lá
Corynespora.
- Cây cao su 9 tháng tuổi DVT RRIV 4, không bị bệnh do Công ty TNHH
Một Thành viên Gi ng cây trồng s một cung c p.
- Chủng vi khuẩn B. subtilis (ATCC6633) và B. thuringiensis (ATCC10792)
do Bộ môn Công nghệ sinh học - Khoa Kỹ thu t Hóa học - Đại học Bách
khoa thành ph Hồ Chí Minh cung c p.
2.2
2.2.1

Nội ung và phư ng ph p nghi n ứu
Phân lập và khảo sát một số
ốả
n sự
của nấm C. cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su

Thu mẫu lá cây cao su bị bệnh rụng l Corynespora, phân l p n m C. cassiicola
c ịnh các y u t ảnh hư ng lên s sinh trư ng của n m C. cassiicola như
m i trư ng nu i c y, nhiệt ộ, p .
2.2.2

Khảo sát khả ă ức chế nấm C. cassiicola của vi khuẩn B. subtilis
và B. thuringiensis

hảo s t v so s nh khả năng ức ch n m C. cassiicola của dung dịch vi khuẩn
B. subtilis v B. thuringiensis.
2.2.3

Khảo sát một số y u tố ả
ẩn B. subtilis

ạ

Khảo sát khả năng tổng hợp bạc nano của dịch nội bào và xác t bào vi khuẩn
B. subtilis; ảnh hư ng của nhiệt ộ, p

n quá trình tổng hợp bạc nano từ dịch

nội bào vi khuẩn B. subtilis. Đồng th i khảo sát th i gian ổn ịnh của dung dịch
keo bạc nano ược tạo thành.

6


2.2.4

Ch tạo dung dịch keo bạc nano - chitosan bằ
xạ.

c ịnh các y u t ảnh hư ng

ơ

u

n k ch thước hạt bạc nano ược tạo thành

như: liều xạ bão hòa; nồng ộ AgNO3; nồng ộ, kh i lượng phân tử v

ộ

deacetyl hóa của chitosan. Đồng th i khảo s t ộ ổn ịnh của ch phẩm.
2.2.5

Khảo sát hiệu lực ức ch nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc
ều kiện in vitro

Khảo sát khả năng ức ch n m C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano ược
tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis.
Khảo sát khả năng ức ch n m C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano
- chitosan ược ch tạo b ng phư ng ph p chi u ạ với c c k ch thước hạt bạc
nano nồng ộ bạc nano kh c nhau; So sánh hiệu quả ức ch n m với dung dịch
keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis.
hảo s t ảnh hư ng của nồng ộ v k ch thước hạt bạc nano của dung dịch keo
bạc nano - chitosan
2.2.6

n hình th i sợi n m C. cassiicola

Khảo sát khả ă

ị ệnh rụng lá Corynespora của cây
ơm ủa dung dịch keo bạc nano - chitosan

hảo s t khả năng phòng v trị bệnh rụng l Corynespora do n m C. cassiicola
gây ra trên cây cao su 9 tháng tuổi (có 3 tầng lá ổn ịnh thuộc dòng vô tính
RRIV 4 không bị bệnh, sinh trư ng ồng ều v

ược trồng trong vư n ư m 1

th ng trước khi ti n hành thí nghiệm) trong vư n ư m b ng dung dịch keo bạc
nano - chitosan có k ch thước hạt 10 nm.
2.3

Phư ng ph p

số iệu

C c s liệu ược tính toán và xử lý trên máy tính b ng phần mềm Excel và
chư ng trình SPSS 16.0. Trắc nghiệm th ng kê sử dụng là trắc nghiệm Duncan
d a vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng so sánh khác biệt giữa các
nghiệm thức. T-Test ược d ng

so sánh s khác biệt có ý nghĩa

su t p = 0,05 của hai giá trị.

7

mức xác



đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu:

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phân lập và khảo sát một số ếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
của n m C. cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su
3.1.1
m
ị ệ
ụ
ập nấm
C. cassiicola
3.1

Chủng n m C. cassiicola phân l p từ lá cao su bị bệnh. K t quả ịnh danh b ng
phư ng ph p giải trình t gen ITS ược th hiện trong k t quả tra cứu trên
BLAST SEARCH
3.1.2 Ả
ng củ
mô
ng ô ấ
Sau 10 ng y nu i c y trên m i trư ng thạch l cao su, n m C. cassiicola sinh
trư ng t t nh t ạt ư ng k nh t i a 90,00 mm v có chiều dài bào tử cao nh t
(86,39 μm) (Bảng 3.1).
8

Bảng 3.1 Đư ng k nh tản n m v chiều dài trung bình của bào tử n m
C. cassiicola sau 10 ng y nu i c y trên c c m i trư ng kh c nhau
Môi trường
Đường k nh tản n
Chi u dài trung bình của bào t (μ )

PDA
59,70
44,12

Th ch malt
61,80
54,03

Th ch lá cao su
90,00
86,39

3.1.3 Ả
ng của nhiệ ộ
Sau 10 ng y nu i c y trên m i trư ng thạch l cao su, n m C. cassiicola sinh
trư ng t t nh t

nhiệt ộ 29C ( ư ng k nh tản n m ạt 90 mm) (Bảng 3.2).

Bảng 3.2 Đư ng k nh tản n m sau 10 ng y nu i c y
Nhiệt độ (C)
Đường k nh tản n

10C
18,13

c c nhiệt ộ kh c nhau

22C
85,63

29C
90,00

35C
22,75

3.1.4 Ả
ng của pH
Sau 10 ng y nu i c y, pH 6,5 ư ng kính tản n m C. cassiicola ạt k ch
thước lớn nh t (90,00 mm) (Bảng 3.3).
Bảng 3.3 Đư ng k nh tản n m sau 10 ng y nu i c y
pH
Đường k nh tản n

3.2

4,5
62,33

(mm)

5,0
73,67

c c p kh c nhau

5,5
76,17

6,0
77,33

6,5
90,00

7,0
88,56

Khảo sát khả n ng ức chế n m C. cassiicola của vi khu n B. subtilis
và B. thuringiensis

hả năng ức ch n m C. cassiicola của vi khuẩn B. subtilis (45,67 %) cao h n
so với vi khuẩn B. thuringiensis (33,04 %) (Bảng 3.4).
Bảng 3.4 So s nh hiệu quả ức ch n m C. cassiicola của vi khuẩn
B. subtilis và B. thuringiensis sau 10 ng y nu i c y
Đường kính tản n m (mm)
90,00a*
48,89b
60,27c

Nghiệm thức

Đối chứng
B. subtilis
B. thuringiensis

*: c
ộ ộ
3.3
3.3.1

ị

Hiệu lực ức chế (%)
0,00c
45,67b
33,04a

ự

ệ

Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp
bào vi khu n B. subtilis
Q

ự

ố

ạ

ị

ộ

nano từ dịch nội
ẩ

Ở c c nghiệm thức sử dụng dịch nội bào và phần xác t bào vi khuẩn B. subtilis
ều xu t hiện bước sóng h p thụ c c ại ặc trưng của bạc nano tại 415 nm.
9


Tuy nhiên m t ộ quang của nghiệm thức sử dụng dịch nội bào vi khuẩn ạt
0,65 cao h n 2,5 lần so với nghiệm thức sử dụng phần xác t bào (Hình 3.1).

Mật độ quang

Như v y, dung dịch keo bạc nano ược tạo ra chủ y u từ dịch nội bào vi khuẩn.

Bướ sóng n

Hình 3.1 Quang phổ h p thụ của dịch nội b o v
c t b o vi khuẩn B.subtilis
sau qu trình sinh tổng hợp bạc nano
3.3.2

Ả

ng của pH

Dung dịch keo bạc nano ược tạo th nh

p 10 có bước sóng h p thụ c c ại

412 nm (Hình 3.2). Tại bước sóng 420 nm, m t ộ quang ạt giá trị cao nh t
(1,12) v k t quả ảnh TE
tại p

cũng cho th y k ch thước hạt bạc nano hình th nh

10 l nhỏ nh t, trung bình 7,14 nm. Như v y p

10 l p

t t nh t cho

Mật độ quang

quá trình tổng hợp bạc nano từ B. subtilis

Bướ sóng n

Hình 3.2 Quang phổ h p thụ của dung dịch keo bạc nano hình th nh
khác nhau
3.3.3

Ả

ng của nhiệ

ộ

10

c cp


Ở nhiệt ộ 80C, dung dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội b o vi
khuẩn B. subtilis có bước sóng h p thụ c c ại l 415 nm, m t ộ quang ạt giá

Mật độ quang

trị cao nh t (1,45) (Hình 3.3) v hạt bạc nano có k ch thước nhỏ nh t (7,78 nm).

Bướ sóng n

Hình 3.3 Quang phổ h p thụ của dung dịch sau phản ứng
3.3.4

Th i gian

c c nhiệt ộ

ịnh của dung dịch keo bạc nano

K t quả o quang phổ h p thụ của dung dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ
dịch nội b o vi khuẩn B. subtilis ( ình 3.4) cho th y m t ộ quang không thay
ổi nhiều trong th i gian 20 ng y, chỉ giảm từ 1,45
1,23

ng y ầu tiên xu ng còn

ng y thứ 20. Như v y dung dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội

Mật độ quang

b o vi khuẩn B. subtilis có ộ ổn ịnh khoảng 20 ng y.

Bướ sóng n

ình 3.4 Quang phổ h p thụ của dung dịch keo bạc nano theo th i gian
3.4 Chế t o ung ị h k o b c nano - chitosan bằng phư ng ph p hiếu x
3.4.1

Liều xạ bão hòa của dung dịch bạc có nồ
11

ộ bạc nitrate khác nhau


Nồng ộ bạc nitrate ược bổ sung trong dung dịch chi u ạ l 1,0; 2,5; 5,0 v
10,0 m

có liều xạ chuy n hóa b o hòa tư ng ứng lần lượt l 8, 12, 16 v

28 kGy, với bước sóng h p thụ c c ại tăng dần từ 397,5 lên 405,5 nm.

ch

thước trung bình của hạt nano bạc tăng dần theo nồng ộ bạc nitrate, lần lượt l

5,18; 7,13; 8,69 v 10,06 nm (Bảng 3.5).
Bảng 3.5 Đặc i m của dung dịch keo bạc nano - chitosan theo nồng ộ bạc
nitrate
Nồng độ AgNO3
(mM)
1,0
2,5
5,0
10,0

3.4.2

Ả

i u
o
h a kG
8
12
16
28

λmax
(nm)
397,5
402,5
403,0
405,5

1,26

1,20
1,03
1,02

ộ chitosan lên í

ng của nồ

K h thước h t
(nm)
5,18 ± 0,18
7,13 ± 0,34
8,69 ± 0,50
10,06 ± 0,57

OD

hi bổ sung chitosan với nồng ộ 1, 2, 3 v 5

ớc hạt ạ nano
v o dung dịch keo bạc nano,

k ch thước trung bình của hạt bạc nano tạo th nh giảm dần với s gia tăng nồng
ộ chitosan, lần lượt l 10,06; 8,60; 7,83 v 6,40 nm (Bảng 3.6).
Bảng 3.6 Ảnh hư ng của nồng ộ chitosan lên k ch thước hạt bạc nano
Nồng độ chitosan (%)

1

2

3

5

K h thước h t (nm)

10,06 ± 0,57

8,60 ± 0,25

7,83 ± 0,27

6,40 ± 0,26

3.4.3

Ả
ng của khố
hạt ạ nano

hi bổ sung chitosan 1

ng phân tử (Mw) chitosan lên í

ớc

với kh i lượng phân tử 100, 250 và 550 kDa v o

dung dịch keo bạc nano, k ch thước trung bình của hạt bạc nano tạo th nh giảm

dần khi kh i lượng phân tử tăng, lần lượt l 14,36; 11,72 v 10,13 nm
(Bảng 3.7).
Bảng 3.7 Ảnh hư ng của kh i lượng phân tử chitosan lên k ch thước
hạt bạc nano
Mw của chitosan (kDa)
K h thước h t (nm)

3.4.4

Ả

100
14,36 ± 0,21

250
11,72 ± 0,33

500
10,13 ± 0,21

ó ộ deacetyl hóa (DD) khác nhau lên kích
ớc hạt bạc nano
12


hi bổ sung chitosan 1

với ộ deacetyl hóa 7B, 8B, 9B v 10B v o dung

dịch keo nano bạc, k ch thước trung bình của hạt nano bạc tạo th nh tăng dần

theo ộ deacetyl hóa, lần lượt l 8,67; 10,06; 10,78 v 11,88 nm (Bảng 3.8).
Bảng 3.8 Ảnh hư ng của ộ deacetyl hóa của chitosan lên k ch thước
hạt bạc nano
Độ deacetyl (%)
K h thước h t
trung bình (nm)

3.4.5

Th i gian
gian

70,0

80,0

90,0

99,9

8,67 ± 0,42

10,06 ± 0,57

10,78 ± 0,23

11,88 ± 0,21

ịnh của

ị

bạc nano - chitosan theo th i

Dung dịch keo bạc nano - chitosan có ộ ổn ịnh khoảng 12 th ng. Cụ th , các
mẫu có OD c c ại tại c c ỉnh 404, 405, 410 v 411 l 1,12; 1,20; 1,00 v 1,10
tư ng ứng với các th i gian bảo quản mẫu là 0, 3, 6 và 12 tháng tại nhiệt ộ

Mật độ quang

phòng (Hình 3.5).

Bướ sóng n

Hình 3.5 Quang phổ h p thụ của dung dịch keo bạc nano - chitosan theo
th i gian lưu trữ
3.5
3.5.1

Hiệu lực ức chế n m C. cassiicola của dung dịch keo b c nano trong
đi u kiện in vitro
ệ ự ức ch ấm
ủ
ịch keo bạ
t ng h p t dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis
ồ
nhau

c
ộ

Dung dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội b o vi khuẩn B. subtilis có
hiệu l c ức ch n m C. cassiicola
cao nh t ạt 59,46

t t cả c c nồng ộ v hiệu l c kh ng n m

nồng ộ 80 ppm (Bảng 3.9 và Hình 3.6).
13


Bảng 3.9 hả năng ức ch n m C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano ược
tổng hợp từ dịch nội b o vi khuẩn B. subtilis c c nồng ộ kh c nhau sau 10
ng y nu i c y
Nồng độ pp
Đường k nh tản n
Hiệu lực ức chế (%)
74,00a*
0,00e
0 ĐC
b
57,89
21,77d
20
44,56c
39,78c
40
d
39,00
47,30b

60
e
30,00
59,46a
80
*: c
ị
ự
ệ ự
ộ ộ
ố

ình 3.6 Tản n m C. cassiicola trong iều kiện m i trư ng có bổ sung dung
dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội b o vi khuẩn B. subtilis c c
nồng ộ kh c nhau
3.5.2

ệ

ự ức ch ấm
ủ
ị
ớ
í
ớc hạt bạc nano khác nhau

Dung dịch keo bạc nano - chitosan có k ch thước 5, 10, 15 nm

ạ

nồng ộ

50 ppm ều có khả năng kh ng n m với hiệu l c ức ch lần lượt l 100,00;
62,22 v 52,08 % sau 8 ngày nuôi c y (Bảng 3.10 và Hình 3.7).
Bảng 3.10 Khả năng ức ch n m C. cassiicola của dung dịch keo bạc nano
- chitosan c c k ch thước khác nhau sau 8 ngày nuôi c y
K h thước h t b c nano (nm) Hiệu lực ức chế (%)
ĐC
0,00d*
5
100,00a
10
62,22b
15
52,08c
*: c
ị
ự
ệ ự
ộ ộ
ố

14


Hình 3.7 Tản n m C. cassiicola sau 8 ng y nu i c y trên m i trư ng thạch lá
cao su bổ sung dung dịch keo bạc nano - chitosan c c k ch thước khác nhau
ệ

3.5.3

ự ức ch
ớ ớ

ấm
ồ

ủ

ị

ạ

-

ộ ạ

Dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) có hiệu l c ức ch n m C.
cassiicola

t t cả c c nồng ộ v hiệu l c ức ch n m cao nh t ạt 100,00

nồng ộ 90 ppm trong iều kiện in vitro (Bảng 3.11 và Hình 3.8).
Bảng 3.11 Khả năng ức ch n m C. cassiicola của dung dịch keo
bạc nano - chitosan (10 nm) các nồng ộ sau 9 ng y nu i c y
Nồng độ b c nano
Đường kính tản n m
Hiệu lực ức chế
(ppm)
0 ĐC

10
30
50
70
90

*: c
ộ ộ

(mm)
90,00a*
84,33b
73,33c
30,25d
7,50e
0,00g

ị

ự

(%)
0,00g
6,29e
18,52d
66,39c
91,67b
100,00a

ệ

ự

ố

ình 3.8 Tản n m C. cassiicola trong iều kiện m i trư ng có bổ sung
dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) c c nồng ộ kh c nhau
15


3.5.4

So sánh hiệu lực ức ch nấm C. cassiicola của dung dịch keo bạc
c t ng h p t dịch nội bào vi khuẩn B. subtilis với dung
dịch keo bạc nano - chitosan

Ở c ng nồng ộ ử lý 90 ppm, dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) có
khả năng ức ch n m C. casiicola (Hiệu l c ức ch 100,00 %) cao h n dung
dịch keo bạc nano ược tổng hợp từ dịch nội b o vi khuẩn B. subtilis (Hiệu l c
ức ch 66,30 %) (Bảng 3.12 và Hình 3.9). Nên ch ng t i chọn dung dịch keo
bạc nano - chitosan (10 nm) cho c c th nghiệm sau.
Bảng 3.12 So s nh hiệu l c ức ch n m của 2 dung dịch keo bạc nano
(A - dung dịch keo bạc nano - chitosan v B - dung dịch keo bạc nano ược
tổng hợp từ dịch nội b o vi khuẩn B. subtilis)
Nồng độ

Đường k nh A
tản n
B
(mm)

T-Test

Hiệu lực ức A
chế (%)
B
T-Test

ĐC
90,00

10 ppm
84,50

30 ppm
73,67

50 ppm
30,85

70 ppm
7,67

90 ppm
0,00

90,00

79,67

61,18

51,67

42,50

30,33

0,00
0,00
-

+
6,11
11,48
+

+
18,15
32,02
+

+
65,72
42,59
+

+
91,48
52,78
+

+
100,00
66,30
+

(-) h c biệt kh ng có ý nghĩa ( ) h c biệt có ý nghĩa

ình 3.9 Tản n m C. cassiicola trong m i trư ng có bổ sung dung dịch keo bạc
nano với c c nồng ộ khác nhau sau 10 ngày nuôi c y. (A) Bổ sung dung dịch
keo bạc nano - chitosan (10 nm); (B) Bổ sung dung dịch keo bạc nano ược
tổng hợp từ dịch nội b o vi khuẩn B. subtilis
3.5.5

Ả
ạ

ủ
-

ồ

ộ

í

16

ớ

ạ ạ
ủ
ấm . cassicola

ị


K t quả khi quan sát hình SEM (Hình 3.10) cho th y:

nghiệm thức

i chứng

không xử lý dung dịch keo bạc nano, các sợi n m có hình dạng bình thư ng.
Nghiệm thức có phun dung dịch keo bạc nano 15 nm - 7,5 ppm, các sợi n m bắt
ầu khô, co rút, hình dạng vẫn còn rõ ràng. Nghiệm thức có phun dung dịch keo
bạc nano 15 nm - 12,5 ppm, các sợi n m kh , h i d nh lại với nhau do sợi n m
bắt ầu có hiện tượng co lại, sợi n m bi n dạng. Nghiệm thức có phun dung
dịch keo bạc nano 10 nm - 7,5 ppm, 10 nm - 12,5 ppm và 5 nm - 7,5 ppm thì
các sợi n m b t lại và khô nhiều h n, kh ng còn hình dạng như sợi n m ban
ầu. Nghiệm thức có phun dung dịch keo bạc nano 5 nm - 12,5 ppm, thì các sợi
n m bi n dạng, khô hoàn toàn. Như v y, nồng ộ bạc nano càng cao, kích
thước hạt bạc càng nhỏ thì khả năng ức ch và diệt n m càng cao.

Hình 3.10 Ảnh SE của sợi n m C. cassiicola sau khi phun dung dịch keo bạc
nano - chitosan theo nồng ộ v k ch thước hạt bạc nano khác nhau
3.6
6.6.1

Hiệu lự ph ng ệnh v trị ệnh rụng lá Corynespora ủa cây cao su

trong vườn ư
của ung ị h k o b c nano - chitosan
ệ

Hiệu lự

Ở nghiệm thức

i chứng âm kh ng có cây cao su bị nhiễm bệnh

th i i m

28 ngày sau chủng bệnh (NSCB) theo dõi chứng tỏ không có s nhiễm chéo
giữa các nghiệm thức.

17


Về tỉ lệ bệnh của cây (Bảng 3.13): sau 28 ng y chủng bệnh, tỉ lệ cây bị bệnh
giảm dần khi tăng nồng ộ ử lý dung dịch keo bạc nano - chitosan. Cụ th , khi
ử lý dung dịch keo bạc nano - chitosan

c c nồng ộ 0,0; 0,5; 1,0 v 1,5 ppm

và nghiệm thức sử dụng chitosan 16,0 ppm tỉ lệ cây bệnh ạt 100,00

cao h n

so với khi tăng nồng ộ ử lý lên 2,0 v 2,5 ppm tỉ lệ cây bị bệnh ạt lần lượt l
63,33 v 53,33

.

Về tỉ lệ bệnh của l (Bảng 3.14): sau 28 ngày chủng bệnh, ngiệm thức
chứng dư ng có 100,00

i

l bị nhiễm bệnh, các nghiệm thức ử lý với dung

dịch keo bạc nano - chitosan

nồng ộ 0,5 ppm, 1,0 ppm v

có tỉ lệ lá bị nhiễm bệnh l 100,00

v 61,36

;

i chứng chitosan

nồng ộ 1,5; 2,0 và 2,5 ppm

có tỉ lệ lá bị nhiễm bệnh tư ng ứng là 51,14 %; 42,89 % và 34,27 %.
Về khả năng sinh trư ng của cây cao su (Bảng 3.15): sau 28 ngày chủng bệnh,
nghiệm

i chứng âm cây phát tri n bình thư ng, chiều cao tăng trư ng của

cây ạt 12,28 cm;
cây ạt 7,72 cm;

nghiệm thức

i chứng dư ng chiều cao tăng trư ng của

c c nghiệm thức có ử lý dung dịch keo bạc nano - chitosan

với nồng ộ 2,0 ppm v 2,5 ppm thì chiều cao tăng trư ng của cây ạt 11,85 cm
v 12,45 cm, kh ng có s kh c biệt về mặt ý nghĩa th ng kê so với nghiệm thức
i chứng âm.
Bảng 3.13 Ảnh hư ng của c c nồng ộ dung dịch keo bạc nano-chitosan
(10nm) n tỷ lệ cây cao su bị nhiễm bệnh
Nồng độ
nano (ppm)
0,0 ĐC-)
0,0 ĐC+
16,0 ppm CTS
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5

*: c
ộ ộ

7 NSCB
0,00a*

46,67d
43,33cd
43,33cd
36,67bc
33,33b
6,67a
3,33a

T ệ
ị nhiễm bệnh (%)
14 NSCB
21 NSCB
0,00a
0,00a
c
100,00
100,00d
c
100,00
100,00d
c
100,00
100,00d
c
100,00
100,00d
c
100,00
100,00d
b

46,67
56,67c
b
43,33
46,67b

ị

ự
ố

18

28 NSCB
0,00a
100,00d
100,00d
100,00d
100,00d
100,00d
63,33c
53,33b

ệ

ự


Bảng 3.14 Ảnh hư ng của c c nồng ộ dung dịch keo bạc nano-chitosan
(10nm) n tỷ lệ l cây cao su bị nhiễm bệnh

Nồng độ
nano (ppm)
0,0 ĐC-)
0,0 ĐC+
16,0 ppm CTS
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
*: c
ộ ộ

7 NSCB
0,00a*
50,57g
35,23e
37,02e
22,25d
13,65c
10,53bc
9,47b
ị

T ệ
ị nhiễm bệnh (%)
14 NSCB
21 NSCB 28 NSCB
0,00a
0,00a

0,00a
g
g
74,53
100,00
100,00g
51,31e
75,25e
100,00g
e
e
55,31
77,25
100,00g
d
d
36,41
47,49
61,36e
29,58c
41,67c
51,14d
b
b
22,38
31,10
42,89c
b
b
21,89

28,29
34,27b
ự
ệ ự
ố

Bảng 3.15 Chiều cao tăng trư ng của cây cao su sau chủng bệnh
ược ử lý
trước b ng dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm) c c nồng ộ kh c nhau
Nồng độ
ĐC(ppm)
Chi u
cao cây 12,28a*
(cm)

ĐC+

16,0 ppm
CTS

7,72c

7,83c

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

9,42bc 10,02abc 10,19abc 11,85ab 12,45a

*: c
ị
ộ hàng

ự
ố

19

ệ

ự


Hình 3.11 Cây cao su trong vư n ư m ược ử lý dung dịch keo bạc nano
- chitosan (10 nm) c c nồng ộ kh c nhau sau 28 ng y sau chủng bệnh. (a, b,
c, d, e, g v h lần lượt là 0,0 ppm (ĐC âm); 0,0 ppm (ĐC dư ng), 16,0 ppm
CTS 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 ppm) (phòng bệnh)
Như v y, dung dịch
ệ

ả

6.6.2

Hiệu lự

Ở nghiệm thức

ệ

ạ
ố

ư c ạ bạc 10

-chitosan v
ồng ộ

ppm.

ị ệ
i chứng âm không có cây cao su bị nhiễm bệnh

th i i m

28 ngày sau xử lý (NSXL) dung dịch keo bạc nano - chitosan theo dõi chứng tỏ
không có s nhiễm chéo giữa các nghiệm thức.

25 cm

20

25 cm

t quả ược ghi nh n trong bảng 3.16; 3.17 v 3.18 cho th y tại th i i m 28
ng y sau khi ử lý trị bệnh b ng dung dịch keo bạc nano - chitosan (10 nm),
c c nghiệm thức ử lý dung dịch keo bạc nano - chitosan

c c nồng ộ lần lượt

2,5; 5,0; 7,5 ppm khả năng trị bệnh còn th p (tỉ lệ cây bị bệnh giảm từ
50,00 % xu ng còn tư ng ứng l 30,00; 26,67; 23,33

v tỉ lệ l bị bệnh giảm

từ 50,00 % xu ng còn tư ng ứng là 31,48; 28,28; 24,52

). Tuy nhiên,

nghiệm thức ử lý dung dịch keo bạc nano - chitosan với nồng ộ 10,0 v
12,5 ppm thì hiệu quả trị bệnh tăng lên (tỉ lệ cây bị bệnh giảm mạnh từ 50,00 %
xu ng còn tư ng ứng là 13,33 v 6,67

v tỉ lệ l bị bệnh cũng giảm từ

50,00 % xu ng còn tư ng ứng l 13,23 v 6,75 %).
Về khả năng sinh trư ng của cây cao su (Bảng 3.18): Sau 28 ng y ử lý dung
dịch keo bạc nano - chitosan

nghiệm

i chứng âm cây phát tri n bình

thư ng, chiều cao tăng trư ng của cây ạt 13,43 cm;
dư ng chiều cao tăng trư ng của cây ạt 9,75 cm;

nghiệm thức

i chứng

c c nghiệm thức có ử lý

dung dịch keo bạc nano - chitosan với nồng ộ 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 v 12,5 ppm
chiều cao tăng trư ng của cây ạt tư ng ứng 12,87; 12,88; 12,13; 12,85 v
13,15 cm, kh ng có s kh c biệt về mặt ý nghĩa th ng kê so với nghiệm thức
i chứng âm.
Bảng 3.16 Ảnh hư ng của c c nồng ộ dung dịch keo bạc nano-chitosan
(10nm) n tỷ lệ cây cao su bị nhiễm bệnh
Nồng độ
nano-chitosan
(ppm)
0,0 ĐC-)
0,0 ĐC+
80,0 ppm CTS
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5

*: c

T lệ
0 NSXL
a*

0,00
50,00b
50,00b
50,00b
50,00b
53,33b
53,33b
50,00b

7 NSXL
a

0,00
100,00e
46,67d
46,67d
43,33cd
40,00bcd
36,67bc
33,33b

ị
ộ ộ

ị nhiễm bệnh (%)
14 NSXL

a

28 NSXL

a

0,00
100e
46,67d
43,33d
40,00cd
36,67cd
33,33bc
26,67b

0,00a
100,00g
30,33e
30,00e
26,67de
23,33d
13,33c
6,67b

0,00
100,00e
36,67d
36,67d
33,33cd
30,00cd

26,67c
16,67b

ự

ệ
ố

21

21 NSXL

ự


Bảng 3.17 Ảnh hư ng của c c nồng ộ dung dịch keo bạc nano-chitosan
(10nm) n tỷ lệ l cây cao su bị nhiễm bệnh
Nồng độ b c
nano-chitosan
(ppm)
0,0 ĐC-)
0,0 ĐC+
80,0 ppm CTS
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5

T lệ

0 NSXL
a*

0,00
50,32b
51,23b
51,54b
49,81b
50,22b
51,74b
50,19b

*: các giá trị
trong cùng một cộ

ị nhiễm bệnh (%)

7 NSXL

14 NSXL

a

a

0,00
73,03g
47,89e
47,75e
43,52de

40,24cd
36,11bc
33,59b

21 NSXL
a

0,00
100,00e
44,29d
44,44d
40,54d
35,32c
33,13c
28,06b

0,00
100,00g
36,47e
36,33e
34,27de
30,87cd
26,73c
16,56b

28 NSXL
0,00a
100,00d
31,60c
31,48c

28,28c
24,52c
13,23b
6,75ab

ự khác nhau th hiện sự khác nhau
m t thống kê v i p <0,05.

Bảng 3.18 Chỉ s bệnh Corynespora của cây cao su sau khi phun dung dịch keo
bạc nano - chitosan (10 nm) c c nồng ộ kh c nhau
Nồng độ
chitosan (ppm)
0,0 ĐC-)
0,0 ĐC+
80,0 ppm CTS
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5

0 NSXL
0,00
24,58
23,89
23,83
23,16
24,53
24,55
24,59

7 NSXL
0,00
27,86
23,45
23,11
21,97
22,24
22,71
22,78

Ch số ệnh (%)
14 NSXL
21 NSXL
0,00
0,00
30,15
33,98
23,01
22,14
22,94
22,56
21,21
19,47
20,88
19,93
21,67
18,96
20,75
18,21

28 NSXL
0,00
37,00
22,13
22,13
19,01
18,48
16,37
15,03

Bảng 3.19 Chiều cao tăng trư ng của cây cao su sau 28 ng y ử lý b ng dung
dịch keo bạc nano - chitosan c c nồng ộ kh c nhau
Nồng độ
ĐC 80 ppm
ĐC2,5
(ppm)
+
CTS
Chi u ao
t ng trưởng 13,43a* 9,75b 13,12b 12,87a
(cm)

*: các giá trị
trong cùng một hàng

5,0

7,5

10,0

12,5

12,88a 12,13a 12,85a 13,15a

ự khác nhau th hiện sự khác nhau
m t thống kê v i p <0,05.

22


Hình 3.12 Cây cao su trong vư n ư m sau khi ử lý b ng dung dịch keo bạc
nano - chitosan (10 nm) c c nồng ộ kh c nhau sau 28 ng y.
(a, b, c, d, e, g v h lần lượt l 0,0 ppm (ĐC âm); 0,0 ppm (ĐC dư ng); 80,0
ppm chitosan; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 và 12,5 ppm) (trị bệnh)
Như v y: dung dị
ệ

ả ị ệ

ạ
ố

-chitosan v i kích
ồng ộ

23

ppm.

ư

ạ

ạc nano 10


 Tổng kết đ

đi

của 4 chế ph m đ nghi n ứu

Bảng 3.20 Tóm tắt ặc i m của b n 4 ch phẩm
Chế ph m
Số
thứ
tự

Huyền phù
Bacillus
thuringiensis

Huyền
phù
Bacillus
subtilis

B c nano

đượ tổng
hợp từ ị h
nội o vi
khu n
B. subtilis
(7 nm)

B c nano chitosan
(5, 10 v 15 nm)

1,6 × 109

2,2× 109

0,0

Không có

Ch
tiêu
1

2

3

Tổng số vi
khu n sống
(tế bào/ml)

In vitro:
- 33,04 %

In vitro:
- 45,67 %

In vitro:
- 66,30 %
( 90 ppm)

In vitro:
- 100 % (5 nm,
50 ppm).
- 100,00 % (10 nm,
90 ppm).
- 52,08 % (15 nm,
50 ppm).
In vivo: dung dịch
10 nm
- iệu quả phòng
bệnh t t nh t
nồng ộ 2,5 ppm
- iệu quả trị bệnh
t t nh t 12,5 ppm

Hiệu quả
th p

Hiệu quả
th p

Hiệu quả
th p

- Có khả năng diệt
n m trong iều
kiện in vitro
- Có khả năng phòng
v trị bệnh rụng l
Corynespora của
cây cao su trong
vư n ư m.

Hiệu ự ức
chế n m
C. cassiicola
(%)

Nhận t
khả n ng ức
chế v iệt
n
C. cassiicola

24


CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận
1. N m C. cassiicola

phân l p từ l

cây cao su bị bệnh rụng l

Corynespora ph t tri n t t trên m i trư ng thạch l cao su

nhiệt ộ

29C và pH 6,5.
2.

iệu l c ức ch n m của huyền ph vi khuẩn B. subtilis ( ạt 45,67
cao h n so với B. thuringiensis ( ạt 33,04

)

) trong iều kiện in vitro.

3. Dung dịch keo bạc nano từ dịch nội b o của vi khuẩn B. subtilis với k ch
thước hạt bạc trung bình 7 nm, có ộ ổn ịnh trong 20 ng y

iều kiện

nhiệt ộ phòng; iệu l c ức ch n m C. cassiicola ạt 66,30

nồng ộ

90 ppm trong iều kiện in vitro.
4. Dung dịch keo bạc nano - chitosan tạo ra có k ch thước hạt bạc trung bình
5 - 15 nm, nồng ộ 100 - 1.000 ppm, th i gian ổn ịnh ạt 12 th ng.
5. Trong iều kiện in vitro, hiệu l c ức ch n m của dung dịch keo bạc
nano-chitosan với k ch thước hạt bạc nano trung bình l 5 nm ạt 100
nồng ộ 50 ppm; C c sợi n m bi n dạng, kh ho n to n

nồng ộ

12,5 ppm.
6. Dung dịch keo bạc nano-chitosan với k ch thước hạt bạc 10 nm có hiệu
quả phòng bệnh rụng l Corynespora của cây cao su 9 th ng tuổi trong
vư n ư m t t nh t

nồng ộ 2,5 ppm v hiệu quả trị bệnh t t nh t

nồng ộ 12,5 ppm.
4.2 Kiến nghị
Ti n hành khảo nghiệm hiệu l c của dung dịch keo bạc nano – chitosan trong
việc trị bệnh rụng lá do n m C. cassiicola gây ra trên cây cao su trên cây trư ng
thành

25