(Luận văn thạc sĩ) Tách dòng và thiết kế vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA THỊ THU LỆ

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR
CHUYỂN GENE CHỊU HẠN AtYUCCA6
TỪ CÂY Arabidopsis thaliana

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA THỊ THU LỆ

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR
CHUYỂN GENE CHỊU HẠN AtYUCCA6
TỪ CÂY Arabidopsis thaliana
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành: 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Tiến Dũng
2. GS TS. Ngô Xuân Bình

Thái Nguyên - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu.
Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc. Kết quả trình bày trong
luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng được ai
công bố trước đây.
Thái Nguyên, ngày 2 tháng 8 năm 2019
Tác giả
Ma Thị Thu Lệ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ii

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn, em đã nhận được sự giúp
đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Tiến Dũng và
GS TS. Ngô Xuân Bình đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình

thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến các cán bộ, giảng viên khoa Công nghệ sinh học
- Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện
thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,
người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................ iii
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ................................... v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................... vii
MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề .......................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................... 2
3. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .......................................... 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 3

1.1. Ảnh hưởng của hạn đối với thực vật .............................................. 3
1.2. Đáp ứng hạn của thực vật ............................................................... 6
1.3. Nhóm gene chịu hạn AtYUCCA và đặc điểm của gene chịu hạn
AtYUCCA6 ..................................................................................................... 11
1.4. Những kết quả nghiên cứu về chuyển gene chịu hạn ................... 13
1.4.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gene chịu hạn ......................... 13
1.4.2. Những kết quả nghiên cứu về chuyển gene chịu hạn
AtYUCCA6 ...................................................................................... 15
1.5. Phương pháp chuyển gene ở thực vật qua Agrobacterium .......... 16
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 18
2.1. Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu ...................................... 18
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................ 18
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................... 18
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................ 18
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu.............................................................. 18
2.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................. 18
2.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu.......................................... 18
2.3.1. Vật liêu nghiên cứu ................................................................ 18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




iv

2.3.2. Hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu .................................... 19
2.4. Nội dung nghiên cứu .................................................................... 21
2.4.1. Nội dung 1: Sàng lọc gen chịu hạn AtYUCCA6................... 21
2.4.2. Nội dung 2: Tách dòng gen AtYUCCA6 .............................. 21
2.4.3. Nội dung 3: Thiết kế vector chuyển gen AtYUCCA6 .......... 22

2.4.4. Nội dung 4: Nghiên cứu chuyển gen trên cây Arabidopsis
thaliana .............................................................................................. 22
2.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 22
2.5.1. Sàng lọc gene chịu hạn AtYUCCA6 ..................................... 22
2.5.2. Tách dòng gene AtYUCCA6 ................................................. 22
2.5.3. Phương pháp thiết kế vector chuyển gene AtYUCCA6 ........ 28
2.5.4. Phương pháp chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana....... 29
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 33
3.1. Phân tích gene AtYUCCA6 trên cơ sở dữ liệu database ............. 33
3.2. Tách dòng gene AtYUCCA6 ....................................................... 34
3.3. Gắn vào vector chuyển gene ........................................................ 39
3.4. Tạo cây Arabidopsis chuyển gene AtYUCCA6........................... 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................. 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 45
PHỤ LỤC ................................................................................................ 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




v

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

ABA

:

Axit abxixic

BR

:

Brassinosteroid

DREB

:

Dehydration - responsive element binding

ERF

:

Ethylene - responsive factor

FMOs

:

Monooxygenease flavin

GPCRs

:

G-protein-couple receptor

IAA

:

Indole-3-acetic acid

PBS

:

pBluescript)

RAV

:

Related to ABI3/VP1

RLKs

:

Eceptor-like kinase

ROS

:

Reactive oxygene species

T6P

:

Trehalose - 6 - phosphate

Trp

:

Tryptophan

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1.

Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn ......................... 8

Hình 1.2.

Sơ đồ chuyển đổi Trp thành IAA có sự tham gia của YUCs .... 11

Hình 2.1.

Sơ đồ tạo cây A. thaliana chuyển gen ....................................... 30

Hình 3.1.

Vị trí của gen AtYUCCA6 (At5g25620) trên nhiễm sắc thể số 5
................................................................................................... 33

Hình 3.2 .

Cấu trúc gen AtYUCCA6. ......................................................... 33

Hình 3.3.

Biểu hiện của gene AtYUCCA6 ở cây Arabidopsis thaliana .... 34

Hình 3.4 .

Trình tự vùng mã hóa của gen AtYUCCA6 và trình tự protein
tương ứng. ................................................................................. 35

Hình 3.5.

Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng và vector chuyển gene
AtYUCCA6. ............................................................................. 37

Hình 3.6.

Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gene AtYUCCA6 bằng PCR và

enzyme giới hạn. ....................................................................... 38

Hình 3.7.

Kết quả giải trình tự gene tách dòng AtYUCCA6 với cặp mổi
ngược M13. ............................................................................... 38

Hình 3.8.

Kết quả giải trình kiểm tra kết quả thiết kế vector chuyển gen
AtYUCCA6 .............................................................................. 40

Hình 3.9.

Kết quả phân tích cây chuyển gen bằng PCR sử dụng cặp mồi
AtYUCCA6-F và pER8-R. ....................................................... 42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1.

Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu ............................ 19

Bảng 2.2.

Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ............. 19

Bảng 2.3.

Trang thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu .......................... 21

Bảng 2.4.

Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ...................................... 23

Bảng 2.5.

Thành phần của phản ứng PCR .................................................. 24

Bảng 2.6.

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ................................................ 24

Bảng 2.7.

Thành phần hóa chất tách chiết plasmid .................................... 26

Bảng 3.1.

Kết quả chọn lọc cây chuyển gen AtYUCCA6 trên môi trường
kháng sinh kanamycin ................................................................ 41

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Hạn hán là một trong những yếu tố thách thức nền an ninh lương thực thế giới
vào thế kỉ 21. Trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu, ở Việt Nam, hạn hán xảy ra
ngày càng thường xuyên hơn, ở nhiều vùng rộng lớn, với mức độ và thời gian khác
nhau gây thiệt hại to lớn đối với kinh tế xã hội, đặc biệt là sản xuất nông nghiệp. Vấn
đề càng trở nên cấp thiết khi hầu hết đất canh tác bị hạn lại tập trung ở vùng sâu vùng
xa - nơi mà cuộc sống của người dân còn nhiều thiếu thốn, chủ yếu dựa vào sản phẩm
nông nghiệp. Vì vậy, việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gene có tính chịu hạn
cao có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc giữ vững và nâng cao năng suất cây
trồng, góp phần xóa đói giảm nghèo, ổn định xã hội.
Trong cơ thể thực vật, hạn hán gây ra nhiều phản ứng, từ việc thay đổi biểu
hiện gene, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến mức
sinh trưởng và năng suất cây trồng. Ở mức độ phân tử, yếu tố môi trường bất lợi làm
gia tăng mức độ biểu hiện và tích lũy của hàng loạt các gene đáp ứng điều kiện hạn,
bao gồm các gene liên quan đến tổng hợp chất điều hòa thẩm thấu, các gene mã hóa
cho các protein, các phân tử tín hiệu và các yếu tố phiên mã [37]. Trong đó, các yếu
tố phiên mã được nghiên cứu nhiều bởi hoạt động của chúng gây tác động đến sự
biểu hiện của hàng loạt các đáp ứng với điều kiện bất lợi của môi trường.
AtYUCCA6 là một gene thuộc họ gene YUCCA mã hóa cho protein nhóm flavin
monooxyenases có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp auxin - hormone sinh
trưởng có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của tế bào và cơ thể thực vật.
Auxin kích thích sự phát triển của rễ, thúc đẩy sự hấp thụ và vận chuyển nước trong
cây, giúp cây vượt qua điều kiện hạn hán, bất lợi [30]. Nhiều bài báo Quốc tế đã chỉ

rằng sự có mặt và tăng cường biểu hiện của gene AtYUCCA6 làm tăng khả năng chịu
hạn của cây do thúc đẩy tổng hợp auxin trong cơ thể thực vật [45, 32]. Tuy nhiên,
cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có một công trình nào nghiên cứu phân lập có hệ
thống gene AtYUCCA6.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




2

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tách dòng và thiết kế
vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập, tách dòng và thiết kế thành công vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6.
- Nghiên cứu chuyển gene và đánh giá biểu hiện của gene trên cây Arabidopsis thaliana.
3. Đối tượng nghiên cứu
- Gen chịu hạn AtYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
* Về mặt khoa học
- Việc tách dòng và phát triển thành công vector chuyển gene thực vật mang cấu
trúc gene AtYUCCA6 góp phần khẳng định cơ sở khoa học của kỹ thuật chuyển gene
trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây.
- Toàn bộ nghiên cứu là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và
giảng dạy.
* Về mặt thực tiễn
- Kết quả thiết kế vector chuyển gene thực vật mang gene AtYUCCA6 liên quan
đến tính chịu hạn của cây là vật liệu quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ
thuật chuyển gene trong cải thiện khả năng chịu hạn của thực vật.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ảnh hưởng của hạn đối với thực vật
Hạn đối với thực vật là khái niệm đựợc dùng để chỉ trạng thái thiếu nước do
môi trường gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn sống, làm ảnh
hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Môi trường khô hạn gây
ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới
phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển [4]..
Hạ 4].ối với thực ác yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng và
năng suất cây trồng. Hạn làm thay đổi nhiều quá trình sinh lý và có thể làm bi 4].ối
với thực ác yếu tố môi tH 4].ối với thực ác yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới
sinh trưởng và năng suất câng mưa, giảm lượng ẩm trong không khí, suy kiệt dòng
chảy sông suối, hạ thấp mực nước ao hồ, mực nước trong các tầng chứa nước dưới
đất, … Xét trên mối quan hệ giữa hạn với thực vật, hạn của môi trường được chia
làm hai kiểu: Hạn đất và hạn không khí [3].
- Hạn đất: Hạn đất xuất hiện khi không có mưa trong thời gian dài, khi cây
không thể hút đủ nước bù đắp lại lượng nước mất đi qua con đường thoát hơi nước,
dẫn tới sự mất cân bằng nước trong cây và cây có dấu hiệu bị khô héo.
- Hạn không khí: Hạn không khí xuất hiện khi độ ẩm tương đối của không khí
giảm xuống quá thấp, gia tăng gradient hơi nước giữa không gian bên trong lá dưới
khí khổng và không gian ngay bên ngoài lá, thoát hơi nước tăng nhanh, gây nên sự
mất cân bằng nước trong mô cây và cây bị héo
a. Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật.

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng chống chịu của thực vật
trước các điều kiện phi sinh học. Nhiệt độ cao, hạn và nồng độ muối cao là những
yếu tố gây hại lớn nhất, ảnh hưởng nghiêm trọng đến thực vật. Nhiệt độ cao ảnh
hưởng trực tiếp đến cấu trúc protein, màng sinh chất và làm ngừng các quá trình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




4

quang hợp, hô hấp nội bào và thậm chí có thể gây chết tế bào hàng loạt. Trong khi
đó, hạn và mặn làm giảm thế nước của thực vật, làm tế bào không thể phát triển, phá
vỡ các protein trong tế bào, gây mất cân bằng ion dẫn đến các hoạt động trao đổi chất
bị đình trệ, quang hợp bị ức chế và có thể gây chết tế bào [2].
b. Ảnh hưởng của hạn đến sự sinh trưởng và hấp thu nước
Đáp ứng đầu tiên của thực vật đối với điều kiện bất lợi gây ra bởi hạn là ngừng
sinh trưởng. Sự hạn chế sinh trưởng của chồi trong điều kiện hạn làm giảm nhu cầu
trao đổi chất của thực vật và kích thích các quá trình sinh tổng hợp các hợp chất bảo
vệ, điều chỉnh thẩm thấu. Sự ngưng sinh trưởng ở rễ cho phép mô phân sinh của rễ
vẫn thực hiện chức năng và phát triển nhanh chóng khi điều kiện bất lợi giảm. Hạn
chế sự phát triển rễ bên cũng là một cách thức đáp ứng hạn, điều này thúc đẩy sự sinh
trưởng của rễ chính, giúp tăng cường khả năng hấp thu nước từ các tầng đất sâu hơn.
Nước sẵn có trong tế bào bị giảm do thiếu hụt nước từ rễ lên lá, gây ra bởi sự
đóng khí khổng. Quá trình dẫn truyền nước trong cây giảm làm giảm nhu cầu dinh
dưỡng của chồi, nó cũng cản trở sự dẫn truyền trong mạch gỗ và có thể hình thành
một đáp ứng thích nghi. Điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một cách đối phó với hạn
của thực vật. Sự tổng hợp các chất tan như polyol và proline trong điều kiện bất lợi
giúp thực vật ngăn chặn sự mất nước và các chất này đóng vai trò quan trọng trong
việc duy trì sức trương của tế bào [3]. Sự thay đổi trong sinh trưởng cùng với việc

giảm hoạt động của cơ quan quang hợp do sự tiếp xúc với điều kiện bất lợi trước đó
dẫn đến sự biến đổi trong sự phân chia nguồn carbon giữa các tế bào/mô sản xuất và
tế bào/mô tích trữ. Vì vậy, các phân tử carbohydrate cung cấp cho quá trình sinh trưởng
trong điều kiện bình thường bây giờ được dùng cho sinh trưởng rễ hoặc để tổng hợp các
chất điều chỉnh thẩm thấu [1].
c. Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp
Sự thiếu hụt nước đã làm tăng cường tổng hợp ABA khiến cho khí khổng đóng
lại. Điều này làm giảm hàm lượng CO2 trong mô lá và cản trở quá trình quang hợp.
Sự cản trở quá trình quang hợp sẽ mất đi và quang hợp sẽ phục hồi nếu khí khổng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




5

mở ra khi điều kiện trở lại bình thường. Một vài loài thực vật đã sử dụng sản phẩm
của quang hợp để điều chỉnh thẩm thấu, điều này giúp ngăn cản sự mất sức trương
của tế bào.
Sự hạn chế CO2 do kéo dài thời gian đóng khí khổng trong điều kiện bất lợi dẫn
đến sự tích lũy các hợp chất làm giảm khả năng vận chuyển electron, điều này có thể
làm giảm các phân tử oxy và tăng cường các dạng ROS (reactive oxygene species).
ROS là các phân tử hóa học chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp vỏ ngoài cùng như
superoxide, hydropeoxide, hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gây
tác động trực tiếp đến các phân tử lớn như axit nucleic (DNA và RNA), protein và
lipid. Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu trúc và cơ chế tổng hợp,
gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai hỏng hoặc mất chức năng,
thậm chí gây chết tế bào [3].
d. Ảnh hưởng của hạn đến hô hấp nội bào
Sinh trưg của hạn đến hô hấp nội bàoc chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp 2 đưh

trưg của hạn đến hô hấp nội bào2 thh trưg của hạn đến hô hấp nội bệ số hô hấp được
điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp - ATP, nưg của
hạn đến hô hấp nội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng
sản phẩm của hô hấp hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gt triển
của thực vật). Trong điều kiện hạn, các quá trình này bị ảnh hưởng và dẫn đến sự tăng
cường hô hấp. Bên cạnh đó, sự tăng cường hô hấp cũng là do sự kích hoạt các quá
trình đòi hỏi nhiều năng lượng như tổng hợp các chất điều chỉnh thẩm thấu và chống
oxi hóa xảy ra trong điều kiện hạn [1].
e. Ảnh hưởng của hạn đến hormone
Hormone thcủa hạn đến hormonenội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá
trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất
ROS trong tế bào gt triển của tàm khí khổng đóng lại và cản trở quá trình sinh trưởng
của thực vật, vì vậy nó cho phép thực vật thích ứng với điều kiện hạn [1]. Ở lúa mne
thcủa hạn đến hormonenội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




6

sử dụng sản phẩm của hô hấp hydroxyhống chịu hạn. Kết quả theo dõi 9-cisepoxycarotenoid dioxygenease (NCED3), mhạn đến hormonenội bệ số hô hấp được
điều chỉnh bởi các A. thaliana trong điana, mhạn đến hormonenội bệ số hô hấp được
hiong[34]. Bên c điana, mhạn đến hormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến
đổi khi thực vật chống chịu với hạn. Ở lúa mì, khả năng chống chịu hạn đã được hỗ
trợ bởi sự giảm hàm lượng indole-3-acetic acid (IAA) ormo. Tuy nhiên, có m(IAA)
ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai đoạn
đầu tiếp xúc với hạn, sau đó giúp thực vật tập chống chịu với hạn ở giai đoạn sau [2].
S2]. nhiên, có m(IAA) ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực
vật chốsuốt giai đoạn đầu tiếp xúc với hạn, sau đó giúp thực vật tập chcytokinin cũng

gihiên, có m(IAA) ormonenộ1]. gihiên, có m(IAA) ormonenội bệ số hô hượng auxin
cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai đoạn đầu tiếp Cytokinin đư có m(IAA)
ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai có sự
tăng cường biểu hiện của gene ipt liên quan đm(IAA) ormonenội bệ số hôn dẫn đến
những đáp ứng hạn. Cytokinin cũng gây ng hạnnenội bệ số hô hượng auxin cũng có
sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai có sự tăng cường biểu hiện của đó giúp thực vật
tậchịu hạn của A.thaliana đưhalianan cũ..
Brassinosteroid (BR) cũng đã được báo cáo rằng có khả năng bảo vệ thực vật
chống lại nhiều yếu tố bất lợi phi sinh học. BR làm tăng cường khả năng hấp thu nước
và ổn định màng cũng như làm giảm sự rò rỉ ion khỏi màng ở lúa mì khi chống chịu
với hạn.
1.2. Đáp ứng hạn của thực vật
Tính chịu hạn của những thực vật ở cạn hạn sinh có bản chất di truyền, thể hiện ra
ở các thích nghi về hình thái và sinh lý. Một số giảm thiểu sự thoát hơi nước nhờ có
lớp cutin dày, khí khổng nằm sâu, thân mọng nước, lá có thể tiêu giảm, sử dụng nước
hiệu quả bằng cách tiến hành quang hợp theo con đường CAM. Một số ngừng sinh
trưởng cho đến khi điều kiện trở lại bình thường. Một số có chu kỳ sinh dưỡng ngắn,
chỉ trong vài tuần. Khi có mưa, đất ẩm, hạt giống của chúng nảy mầm. Chúng sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




7

trưởng và phát triển thật nhanh chóng, hình thành hạt trước khi mùa khô hạn đến [3].
Thực vật có những cơ chế đáp ứng giúp chúng tăng cường tính chống chịu đối với
các điều kiện bất lợi trên. Hệ thống mô hình xử lý hạn cho cây mô hình A. thaliana
đã được Amal Harb và cs thiết kế để nghiên cứu những thay đổi của cây khi bị hạn.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, thực vật đáp ứng với yếu tố bất lợi qua ba giai đoạn:
giai đoạn ban đầu là giai đoạn đánh giá điều kiện, tiếp đó thực vật đáp ứng tập chống
chịu và cuối cùng sẽ hình thành một cân bằng mới [25]. Thực vật đáp ứng với điều
kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường: phụ thuộc ABA và không phụ thuộc
ABA. Theo các con đường đó các tín hiệu bất lợi từ môi trường được tế bào tiếp nhận
và được dẫn truyền đến nhân theo hai con đường hoặc thông qua ABA hoặc không
thông qua ABA. Các yếu tố phiên mã gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gene
liên quan đến tính chống chịu. Các đáp ứng này sẽ bị mất dần khi điều kiện bất lợi
mất đi [6].
Thực vật cảm nhận các yếu tố bất lợi, hay các tác nhân từ môi trường nói chung
thông qua hàng loạt các thụ thể bề mặt tế bào như các serine/threonine-like receptor
kinase, được gọi chung là các receptor-like kinase (RLKs), các thụ thể liên kết với
kênh ion (ion chanel-linked receptor), các G-protein-couple receptor (GPCRs) và các
thụ thể histidine kinase. Các kênh Ca2+ cho phép Ca2+ được chuyển vào tế bào chất
khi được kích hoạt bởi các yếu tố bất lợi. Vì vậy các kênh này hoạt động như các các
thụ thể liên kết với kênh ion của yếu tố bất lợi. GPCRs là một nhóm thụ thể màng
khác. Trong điều kiện bất lợi, chúng kích hoạt các enzyme phospholipase C hoặc D
và chuyển hóa thành các tín hiệu [9].
Các thụ thể nội bào ABA, PYR/RCAR, là các tín hiệu của yếu tố bất lợi gây ra
bởi hạn, thông qua kích hoạt serine/threonine kinase SnRK2 trong đáp ứng với ABA
[73]. Do sự tổng hợp ABA dẫn đến tăng cường đáp ứng với điều kiện bất lợi, thụ thể
ABA có thể được coi là một thiết bị cảm biến yếu tố bất lợi.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




8

Hình 1.1. Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn [1]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




9

Trong quá trình tiếp nhận tín hiệu bất lợi từ môi trường không thông qua ABA,
đường là một hợp chất quan trọng. Các hexokinase là thiết bị cảm biến đường ở thực
vật, chúng đóng vai trò ngăn chặn sự biểu hiện các gene liên quan đến quá trình quang
hợp khi hàm lượng hexose trong tế bào lá cao [4]. Trehalose - 6 - phosphate (T6P) là
một phân tử đường tín hiệu, có chức năng điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát triển
và làm tăng hàm lượng sucrose trong thời kỳ ra hoa. Sự tăng cường biểu hiện của
T6P ở ngô trong thời kỳ ra hoa giúp cải thiện năng suất trong điều kiện hạn. ROS là
sản phẩm của các quá trình trao đổi chất trong điều kiện bất lợi, cũng là những phân
tử tín hiệu quan trọng [1]. Các tín hiệu oxi hóa được chuyển qua tín hiệu trung gian
thứ hai như Ca2+ hoặc phosphatidic acid (PA) - kích hoạt protein kinase
serine/threonine và mitogene - activated protein kinase (MAP) dẫn đến sự phiên mã
của các gene đóng vai trò quan trọng trong tập chống chịu.
 Cơ chế truyền tín hiệu
Các tín hiệu được các thụ thể tiếp nhận sau đó truyền lại cho các phân tử tín
hiệu thứ hai như các protein kinase, các phosphatase (serine/threonine phosphatases),
các phospholipid như phosphoinositides. ROS, Ca2+, nitric oxide, cAMP và các phân
tử đường đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu [1]. Trong điều kiện
bất lợi gây ra bởi những yếu tố khác nhau có nhiều phân tử tín hiệu giống nhau. Điều
này chỉ ra rằng các con đường đáp ứng các điều kiện bất lợi khác nhau có thể xảy ra
nhờ những chất truyền tín hiệu chung. Các phân tử protein kinase kích hoạt phân chia
tế bào thông qua quá trình phosphoryl hóa các protein và là một trong các cơ chế

chính của quá trình truyền tín hiệu.
Hàm lượng canxi trong tế bào chất tăng trong điều kiện bất lợi. Ca2+ trong tế
bào chất tăng lên chủ yếu từ ngoài vào tế bào qua màng hoặc được huy động từ nguồn
dự trữ trong tế bào, cụ thể là từ không bào. Một vài kênh cảm ứng Ca2+ như
calmodulin (CaM) hay CaM - binding protein đã được tìm thấy trong tế bào tham gia
truyền tín hiệu đến nhân thông qua các tín hiệu như phospholipase hay Ca2+ dependent kinase [4].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




10

 Điều khiển phiên mã trong biểu hiện gene
Một số lượng lớn các gene được tìm ra liên quan đến các đáp ứng với điều kiện
bất lợi [34]. Microarray DNA cung cấp thông tin có ý nghĩa lớn trong việc phân tích
biểu hiện của toàn bộ hệ gene và đã được sử dụng để nghiên cứu các mô hình biểu
hiện gene ở các đáp ứng với hạn hoặc mặn ở một số loài thực vật. [37, 29, 26, 23].
Các gene tăng cường biểu hiện trong điều kiện hạn bao gồm các gene liên quan đến
tổng hợp các chất điều hòa thẩm thấu, các gene mã hóa cho các protein LEA,
aquaporin, các phân tử tín hiệu và các yếu tố phiên mã. Trong đó, các gene mã hóa
cho các yếu tố phiên mã được quan tâm nhiều bởi các yếu tố phiên mã hoạt động như
những công tắc tác động đến hàng loạt các gene đáp ứng với điều kiện bất lợi [11].
Có hơn 100 yếu tố phiên mã mà sự biểu hiện của chúng được tăng cường khi tiếp xúc
với điều kiện hạn, chúng đã được tìm ra bằng phân tích toàn bộ hệ phiên mã ở cây
A.thaliana tiếp xúc với hạn [35]. Hạn làm tăng cường mức độ biểu hiện của các gene,
được điều khiển bởi các yếu tố phiên mã thuộc họ bZIP, AP2/ERF, HD-ZIP, MYB,
Bhlh, NAC, NFY, EAR và ZPT2 [44]. Những yếu tố phiên mã này được kích hoạt
bởi các tín hiệu hạn. Do hạn xảy ra cùng với sự tăng lên về hàm lượng ABA, một vài

yếu tố phiên mã được kích hoạt bởi ABA. Những các yếu tố phiên mã đáp ứng ABA
(ABFs) chủ yếu thuộc họ bZIP và kết hợp với các yếu tố đáp ứng ABA (ABRE) trong
các promoter của các gene đáp ứng hạn [44, 26]. Trong khi đó, sự hoạt động của một
số gene mã hóa yếu tố phiên mã họ CBF/DRE, NAC và ZF-HD lại không phụ thuộc
ABA. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt động của các gene mã hóa yếu
tố phiên mã thuộc họ AP2/ERF được điều khiển qua cả 2 con đường phụ thuộc ABA
và không phụ thuộc ABA. APETALA2/ethylene response element - binding protein
(AP2/EREBP) là họ yếu tố phiên mã chính trong các họ yếu tố phiên mã ở A.thaliana,
gồm 147 gene, chiếm 9% các yếu tố phiên mã [17]. Ở thực vật bậc cao, có gần 200
gene yếu tố phiên mã AP2 đã được báo cáo. Dựa vào sự có mặt của một hoặc hai AP2
- DNA, họ gene này được chia thành 4 phân họ: AP2, DREB, ERF, RAV. Phân họ
AP2 mã hóa cho các protein có hai AP2 domain và các protein này liên quan đến các
quá trình sinh trưởng như phát triển các mô phân sinh, các bào quan và sự phát triển
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




11

hoa. Các phân họ DREB (dehydration - responsive element binding), ERF (ethylene
- responsive factor) và RAV (related to ABI3/VP1) mã hóa cho các protein chứa một
AP2 domain và các thành viên trong phân họ gene này liên quan đến hệ thống truyền
tín hiệu [38, 20].
1.3. Nhóm gene chịu hạn AtYUCCA và đặc điểm của gene chịu hạn AtYUCCA6
AtYUCCA6 là một gene thuộc họ YUCCA trên NST số 5 của các cây thuộc họ
Arabidopsis thaliana, mã hóa protein monooxygenease flavin (FMOs). FMOs tham
gia xúc tác cho một giai đoạn quan trọng trong việc tổng hợp axit lndole-3-acetic
(IAA) - một loại auxin chính trong cơ thể thực vật, từ tiền chất tryptophan (Trp) . Gần
đây, một con đường hai bước chuyển đổi Trp thành IAA đã được đề xuất là con đường

sinh tổng hợp IAA chính trong thực vật (Hình 1.2).

Hình 1.2. Sơ đồ chuyển đổi Trp thành IAA có sự tham gia của YUCs [32]
Trp đầu tiên được loại bỏ nhóm amin chuyển thành indole-3-pyruvate (IPA)
bởi họ aminotransferases TAA1. Sau đó, các monooxygeneases có chứa flavin trong
họ YUC xúc tác cho việc sản xuất IAA bằng cách sử dụng IPA làm chất nền [44].
Phản ứng xúc tác YUC là bước giới hạn tốc độ trong quá trình sinh tổng hợp auxin.
Gene YUC đã được xác định trong tất cả các bộ gene thực vật đã được giải trình tự,
cho thấy rằng quá trình sinh tổng hợp auxin qua trung gian YUC phổ biến và cần thiết
đối với sự phát triển của thực vật. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức
gene YUC trong cây dạ yến thảo, thuốc lá, và cây lúa dẫn đến sự sản sinh quá mức
auxin [32, 31, 27, 16].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




12

Trong cây Arabidopsis, có 11 gene YUC. Việc ngừng hoạt động của một
gene trong họ YUC không gây ra những thay đổi lớn trên cơ thể thực vật do có sự
tương tác trong sản phẩm của các gene YUC. Tuy nhiên, việc bất hoạt đồng thời
YUC1 và YUC4 sẽ gây ra những biểu hiện rõ rệt, ức chế sự phát triển của mạch dẫn
và hoa. Những nghiên cứu về đột biến gene YUC đã chứng minh rằng sự tổng hợp
auxin là quan trọng trọng mọi quá trình phát triển chính của cây, bao gồm sự phát
triển phôi, tăng trưởng cây con, kéo dài rễ, hình thành mô và phát triển hoa. Đặc
biệt những đột biến trong gene YUC gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất ở cây lúa,
ngô, dạ yến thảo. Điều này cho thấy hoạt động của gene YUC rất cần thiết cho sự
phát triển của cây trồng.

Sự tăng cường khả năng chống hạn của cây còn được thực hiện nhờ hoạt động
của gen AtYUCCA6 kiểm soát các gốc tự do oxy hóa trong cây, thúc đẩy cây thích
ứng với điều kiện stress và làm chậm sự chết tế bào. ROS ( Reactive oxygene species)
- gốc tự do oxy hóa là những sản phẩm trung gian được tạo ra trong các quá trình sinh
hóa của tế bào thực vật. Ở mức độ nhất định, sự có mặt của gốc tự do là tín hiệu cần
thiết thông báo sự phát triển và phát triển của ổn định của cây trồng và kích hoạt
các phản ứng chống lại stress. Trong điều kiện hạn hán, sự tăng ROS trong tế bào
thực vật là tín hiệu điều chỉnh việc đóng khí khổng, từ đó hạn chế sự thoát hơi nước
của cây giúp cây thích nghi với điều kiện bất lợi. Tuy nhiên, sự tích lũy nồng độ
ROS cao lại gây độc và gây chết tế bào đặc biệt các tế bào trung gian trong con
đường tổng hợp auxin. Vì vậy, việc kiểm soát sự gia tăng ROS ở một nồng độ nhất
định có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh những thay đổi phát triển do stress
gây ra. Trong tế bào thực vật, nhiều enzyme và hợp chất có chức năng loại bỏ các
gốc tự do ROS như superoxide dismutase, catalase, ascorbate peroxidase, GSH
peroxidase và Trx peroxidase (peroxiredoxin, PrxR). Chúng rất quan trọng cho quá
trình giải độc ROS, chẳng hạn như NTRC chloroplast-localized có khả năng thu
nhận H2O2 giúp bảo vệ diệp lục trong bảo quan lục . Đối với gene AtYUCCA6, do
sản phẩm của gene có hoạt tính khử thiol - redutase nên có thể tham gia kích hoạt
hệ thống oxi hóa khử, giúp kiểm soát ROS gia tăng ở mức độ nhất định [38].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




13

1.4. Những kết quả nghiên cứu về chuyển gene chịu hạn
1.4.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gene chịu hạn
1.4.1.1. Trên thế giới
Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào chuyển các gene chịu hạn ở lúa nước.

Chống chịu khô hạn là tính trạng phức tạp, bị ảnh hưởng bởi sự thể hiện đồng thời cả
một hệ thống gene mục tiêu và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố về môi trường, vật lý, hóa
học. Điều này làm cho những tiến bộ nhất định về biến đổi di truyền tính chống chịu
khô hạn xảy ra rất chậm chạp. Chiến lược có hiệu quả đã được ghi nhận là làm gia
tăng lượng đường dễ hòa tan, các hợp chất cần thiết thông qua tiếp cận với kỹ thuật
chuyển nạp gene. Những hợp chất đó là: proline, trehalose, betaine và mannitol, đóng
vai trò như những thể bảo vệ thẩm thấu (osmoprotestants); trong vài trường hợp,
chúng ổn định được các phân tử chức năng dưới điều kiện bị stress. Protein LEA (late
embryogenesis abundant) cũng được chú ý trong điều kiện bị stress do thiếu nước
[4]. Sự thể hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của nó cho thấy
vai trò bảo vệ cây chống chịu sự kiện mất nước. Ví dụ, gene HVA1 mã hóa nhóm
protein 3 LEA của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.). Người ta đã chuyển nạp gene
này thành công vào cây lúa để tăng cường tính chống chịu khô hạn và chống chịu
mặn trong điều kiện ở nhà lưới [2].
Những năm gần đây, do sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học
cùng với sự ra đời của các chỉ thị phân tử đặc biệt là ở lúa, các nhà khoa học đã thiết
lập được một số bản đồ phân tử cho các tính trạng số lượng như chịu hạn, chịu úng,
chịu phèn. Đối với đặc tính chống chịu hạn bằng sử dụng chỉ thị phân tử như SSR,
AFLP, RFLP, SNP,... các QTL kháng hạn đã được định vị ở nhiều loại cây trồng khác
nhau cũng như cây lúa [2].
Phương pháp phân tích sự đóng góp của các tính trạng có liên quan, với mô
hình QTL (quantitative trait loci). Phương pháp tiếp cận này phù hợp với hầu hết các
loài cây trồng chủ yếu như cây lúa, nhờ bản đồ di truyền với nhiều marker phân tử
ADN phủ kín trên nhiễm sắc thể.
1.4.1.2. Ở Việt Nam
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

14

Ở nước ta, việc nghiên cứu, đánh giá chọn tạo các giống cây chịu hạn mà điển
hình là các giống lúa đã có từ những năm thập kỉ 90. Cho đến nay, đã có rất nhiều
các giống lúa chịu hạn được các nhà khoa học chọn tạo ra thông qua chọn tạo giống
truyền thống cũng như ứng dụng công nghệ sinh học. Tại Việt Nam, nghiên cứu lập
bản đồ QTL kháng hạn ở giống lúa nương sử dụng chỉ thị phân tử do tổ chức
Rockefeller tài trợ đã được tiến hành tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, viện
Công nghệ Sinh học, viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, viện Bảo vệ Thực vật,
trường Đại học Nông nghiệp [2]. Chương trình tuyển chọn và phát triển giống lúa cạn
cải tiến LC93-1 phục vụ sản xuất lượng thực ở vùng cao của Viện Bảo Vệ Thực Vật
Từ Liêm, Hà Nội với phương pháp chọn lọc từ tập đoàn lúa cạn IRRI nhập nội, năm
1993 đã chọn được giống LC93-1 có thời gian sinh trưởng 115 - 125 ngày, năng suất
3 - 4 tấn/ha, chịu hạn khá, chất lượng gạo tốt, thích hợp cho vùng đồng bào dân tộc
nghèo ở vùng cao. Nghiên cứu chọn giống lúa chống chịu khô hạn của Viện Cây
lương thực thực phẩm với phương pháp thu thập nguồn vật liệu giống lúa cạn chịu
hạn địa phương và các dòng lúa cải tiến nhập nội từ IRRI với phương pháp lai hữu
tính kết hợp với gây đột biến để tạo ra các tổ hợp lai có khả năng chịu hạn khá và
năng suất cao như CH2, CH3, CH133, CH5 trồng rộng rãi ở vùng Trung du miền núi
phía Bắc, Trung bộ, Đông Nam bộ và Tây Nguyên. Ở Việt Nam, cho đến nay kỹ thuật
nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi để đánh giá khả năng chống
chịu và chọn dòng chống chịu như chịu hạn mang lại hiệu quả cao. Tác giả Đinh Thị
Phòng (2001) bằng các phương pháp thổi khô mô sẹo của các giống lúa CR203,
CH133, Lốc, X11, C70 đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng
chịu hạn. Tác giả đã chọn tạo được giống DR1, DR2 cho năng suất cao, ổn định, có
khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn giống gốc [2]. Nguyễn Thị Thu Hoài (2005)
khi nghiên cứu về khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn địa phương đã kết luận
rằng khả năng chịu mất nước và tốc độ sinh trưởng của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô
của các giống nghiên cứu có sự sai khác rõ rệt, giống BC12 là giống chịu hạn tốt nhất
so với các giống nghiên cứu [3]. Bên cạnh lúa nước, việc chuyển các gene chịu hạn

còn được thực hiện thành công ở khoai tây, đậu tương...Đối với gene chịu hạn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




15

AtYUCCA6, cho đến nay ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nghiên cứu có hệ thống
liên quan đến việc phân lập gene này.
1.4.2. Những kết quả nghiên cứu về chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6
Mặc dù một số con đường sinh tổng hợp auxin đã được xác định, tuy nhiên
bản chất của cơ chế sinh tổng hợp auxin có liên quan đến hoạt động của AtYUCCA6
chưa được làm sáng tỏ. Nghiên cứu của Kim (2011) đã cho thấy trong cây có đột biến
AtYUCCA6 hàm lượng auxin cao hơn nhiều lần so với kiểu hoang dã, hơn nữa, quá
trình già hóa của cây bị đột biến bị kìm hãm [27].
Hệ thống các đột biến gene AtYUCCA6 liên quan đến tính chịu hạn của thực
vật rất đa dạng, gần đây nhiều nhà khoa học quan tâm đến việc phát hiện, phân lập
và nghiên cứu hoạt động của chúng trong các điều kiện bất lợi của môi trường, hướng
đến việc cải thiện khả năng chống chịu của thực vật bằng chuyển gene.
Năm 2015, Cha và cộng sự đã chuyển gene AtYUCCA6 thành công trên
cây khoai tây và phân tích biểu hiện của cây chuyển gene. Trong nghiên cứu này,
những cây khoai tây trồng trong đất 3 tuần tuổi đã bị rút nước trong 1014 ngày
và các triệu chứng héo ở lá được ghi lại định kỳ. Các triệu chứng héo lớn hơn
đáng kể ở lá của cây dại so với lá của các dòng biểu hiện quá mức AtYUCCA6.
Mặt khác, sự tăng trưởng của cây khoai tây dại bị ức chế nhiều hơn so với cây
biểu hiện quá mức AtYUCCA6 khi kiểm tra phản ứng của cây với stress oxy hóa
nguyên phát trên môi trường chứa Methyl viologene (MV) - chất xúc tác cho
việc sản xuất ROS và thúc đẩy stress oxy hóa trong thực vật. Kết quả nghiên
cứu cho thấy sự biểu hiện quá mức ATYUCCA6 giúp làm giảm tỷ lệ mất nước,

kiểm soát tích lũy ROS dưới áp lực hạn hán và oxy hóa, tăng khả năng chịu hạn
của những cây khoai tây chuyển gene [16]
Những kết quả nghiên cứu của Jeong Im Kim và cộng sự (2011) sau phân tích
cây hoa hồng chuyển gene AtYUCCA6 cho thấy sự biểu hiện quá mức của gene
AtYUCCA6 dẫn đến gia tăng hàm lượng auxin, làm trì hoãn sự hóa già của cây. Ngoài
ra, các gene trong họ YUCCA được chuyển thành công vào cây ăn quả như
đào…nhằm hạn chế sự mềm của quả khi chín [27].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




16

Mặc dù trên thế giới có nhiều nghiên cứu về gene AtYUCCA6, tuy nhiên cho
đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu hệ thống liên quan đến việc phân lập
gene này.
1.5. Phương pháp chuyển gene ở thực vật qua Agrobacterium
Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, thuộc nhóm vi khuẩn yếm khí. Chi
Agrobacterium gồm 4 loài, trong đó A. tumerfaciens có khả năng tạo ra khối u trong
tế bào thực vật thông qua một loại plasmid đặc hiệu gây nên khối u gọi là Tiplasmid (tumour inducing) [3,2]. Ti-plasmid có khả năng chuyển một số gene
chúng mang vào cây trồng khi ADN vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực
vật nó sẽ tấn công vào hệ thống tế bào của thực vật một cách có hiệu quả và sử
dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn đây được coi là hiện
tượng chuyển gene tự nhiên. Agrobacterium có 3 thành phần di truyền cần thiết
cho quá trình chuyển gene:
- Vùng T-ADN: là đoạn ADN chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào
thực vật. Đặc điểm của vùng này là xâm nhập ổn định vào bộ gene của cây chủ,
không mã hóa cho các sản phẩm trợ giúp quá trình biến nạp, độ dài thay đổi khác
nhau ở các Ti-plasmid tự nhiên và mang rất nhiều gene có thể biểu hiện trong quá

trình chuyển hóa của tế bào thực vật [22].
- Vùng gây độc Vir (Virulence Region): gồm 24 gene vir được sắp xếp trong 8
operon từ virA đến virH, mỗi operon chứa một số gene. Vùng Vir có vai trò kích thích
việc biến nạp của T-ADN. Trong đó Vir A; B; D; G có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong
quá trình biến nạp ở tế bào thực vật, Vir C; E; F; H có tác dụng làm tăng cường hiệu
quả quá trình biến nạp gene [22].
- Nhiễm sắc thể (NST) của Agrobacterium: Vùng Vir có vai trò chủ yếu trong
quá trình biến nạp T- ADN, tuy nhiên NST của vi khuẩn cũng rất cần thiết đối với
quá trình này. Chúng tác dụng lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, cụ thể giúp tạo ra
exopolysaccarid, chế biến và bài tiết ra ngoài (pscA/exoC, chvA, hvB) đồng thời gắn
vi khuẩn vào tế bào thực vật (tt genes) … Ngoài ra những gene khác như mia A đóng
vai trò thứ yếu hơn trong quá trình biến nạp [22].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN