Phân tích đặc tính gen mã hóa enzyme methionine sulfoxide reductase từ hệ gen cây đậu tương (glycine max)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ KIM LIÊN

PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HÓA ENZYME
METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE TỪ HỆ GEN
CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ KIM LIÊN

PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HÓA ENZYME
METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE TỪ HỆ GEN
CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn:

TS. Lê Tiến Dũng
TS. Trần Thị Dụ Chi

Hà Nội, 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Tiến Dũng và TS.
Trần Thị Dụ Chi, những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt
quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại
Trường.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên
tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di
truyền Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp
đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong thời gian qua.
Luận văn nằm trong đề tài nghiên cứu cơ bản “Nghiên cứu protein mẫn cảm
với oxi hóa methionine và vai trò của enzyme methionine sulfoxide reductase của
cây nông nghiệp” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia tài trợ mã số
106-NN.02-2013.46.

Hà Nội, tháng 06 năm 2015
Học viên

Nguyễn Thị Kim Liên

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số protein và peptide bị ảnh hưởng khi Met bị oxi hóa ................... 13
Bảng 1.2. Các MSR ở vi khuẩn E. coli .................................................................. 14
Bảng 1.3. Tóm tắt các nghiên cứu di truyền về vai trò của MSRA ......................... 18
Bảng 1.4. Số lượng gen MSRA và MSRB ở một số nhóm sinh vật ........................ 20
Bảng 2.1. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu ............................... 25
Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu ........................................... 26
Bảng 2.3. Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR ................................................... 29
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 50 l ......................... 30
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân dòng cADN ................................... 30
Bảng 2.6. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR và RT-PCR ......................... 31
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 25 l ......................... 32
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển ........ 32
Bảng 3.1. Xác định domain đặc trưng và dự đoán vị trí trong tế bào của các protein
MSRA ................................................................................................................... 35
Bảng 3.2. Dự đoán vị trí Cys xúc tác và Cys tái tạo của các GmMSRA .................. 38
Bảng 3.3. Số lượng exon và intron của các GmMSRA ............................................ 39


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Methionine ............................................................. 2
Hình 1.2. Quá trình sinh tổng hợp Methionine ......................................................... 3
Hình 1.3. Tổng hợp ethylene trong hệ thống mô hình hóa học ................................. 6
Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp ethylene ........................................................... 6
Hình 1.5. Sơ đồ sinh tổng hợp Glucosinolate từ Methionine .................................... 8
Hình 1.6. Sơ đồ hình thành các gốc tự do chứa oxi .................................................. 9
Hình 1.7. Quá trình oxi hóa Met ........................................................................... 11
Hình 1.8. Phản ứng khử MetO về Met của các MSR.............................................. 12
Hình 1.9. Sơ đồ minh họa cơ chế xúc tác phản ứng khử MetO của MSR ............... 16
Hình 3.1. So sánh đa trình tự các protein GmMSRA.............................................. 37

Hình 3.2. Số lượng exon và intron của các gen mã hóa cho GmMSRA ................. 38
Hình 3.3. Các GmMSRA được hình thành do nhân đôi hệ gen .............................. 40
Hình 3.4. Đồ thị đánh giá mức độ biểu hiện của các Gm MSRA ở các mô khác nhau
.............................................................................................................................. 41
Hình 3.5. Mức độ biểu hiện của các GmMSRA ở các giai đoạn phát triển khác nhau
.............................................................................................................................. 42
Hình 3.6. Mức độ biểu hiện của các GmMSRA trong điều kiện bình thường và điều
kiện khô hạn .......................................................................................................... 43
Hình 3.7. Kết quả nhân dòng đoạn cADN mã hóa gen GmMSRA6 ....................... 44
Hình 3.8. Cấu trúc vector tách dòng pKS............................................................... 45
Hình 3.9. Vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn ................................................ 46
Hình 3.10. Kết quả biến nạp gen GmMSRA6 vào vector pKS ............................... 46
Hình 3.11. Cấu trúc vector biểu hiện nấm men p425GPD ...................................... 47
Hình 3.12. Kết quả biến nạp gen GmMSRA6 vào vector p425 .............................. 48
Hình 3.13. Thử nghiệm hoạt tính enzyme in vivo .................................................. 49
Hình 3.14. Thử nghiệm khả năng kháng lại tác nhân oxi hóa H2O2 ........................ 51
Hình 3.15. Cấu trúc vector pGreen ........................................................................ 52


Hình 3.16. Tạo cây chuyển gen bằng phương pháp nhúng hoa và chọn lọc trên môi
trường ½ MS, kanamycin 30 mg/L. ....................................................................... 53
Hình 3.17. Điện di kiểm tra ADN tổng số được tách chiết từ cây chuyển gen A.
thaliana (gel agarose 0,8%, nhuộm ethidium bromide) .......................................... 54
Hình 3.18. Điện di sản phẩm PCR mẫu ADN tổng số cây chuyển gen (gel agarose
1,3%, nhuộm ethidium bromide) ........................................................................... 55
Hình 3.19. Điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR trên gel agarose 1.3%, nhuộm
ethidium bromide .................................................................................................. 56
Hình 3.20. Hình thái cây mang gen chuyển (A) và không mang gen chuyển (B) ở
giai đoạn 10 ngày tuổi ........................................................................................... 57
Hình 3.21. Dòng cây đối chứng ở thế hệ F3 ........................................................... 58

Hình 3.22. Dòng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-1 ở thế hệ F3 .......................... 59
Hình 3.23. Dòng cây chuyển gen 35S::GmMSRA6-2 ở thế hệ F3 .......................... 60
Hình 3.24. Hình thái các dòng cây chuyển gen trên đĩa thạch ở các giai đoạn tuổi
khác nhau .............................................................................................................. 61
Hình 3.25. Hình thái các dòng cây chuyển gen trên giá thể đất ở các giai đoạn tuổi
khác nhau .............................................................................................................. 62
Hình 3.26. Đĩa cây đối chứng môi trường ½ MS, kanamycin 30 mg/ L ................. 63
Hình 3.27. Thử nghiệm kháng mặn trên dòng cây đối chứng và dòng cây chuyển
gen ........................................................................................................................ 64


BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết
tắt, kí hiệu

Tiếng Anh

cs
Met

Cộng sự
Methionine

MetO

Methionine sulfoxide

MS

Murashige & Skoog

MSR

Tiếng Việt

Methionine sulfoxide reductase

NST

Nhiễm sắc thể

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

ROS

Reactive Oxygen species

Các gốc tự do chứa oxi

RT-PCR

Reverse transcription polymerase
chain reaction


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 2
1.1. METHIONINE VÀ QUÁ TRÌNH OXI HÓA METHIONINE BỞI CÁC
GỐC TỰ DO CHỨA OXI (REACTIVE OXYGEN SPECIES - ROS) ................. 2
1.1.1. Giới thiệu chung về methionine ............................................................. 2
1.1.1.1. Cấu trúc hóa học, đặc tính sinh học và sinh tổng hợp methionine ...... 2
1.1.1.2. Methionine và dẫn xuất S-adenosyl-L-methionine ............................ 4
1.1.1.3. Methionine và chu trình sinh tổng hợp ethylene ................................ 5
1.1.1.4. Methionine – tiền chất của quá trình chuyển hóa glucosinolate ......... 7
1.1.2. Quá trình oxi hóa methionine bởi các gốc tự do chứa oxi ....................... 9
1.2. ENZYME METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE (MSR) VÀ CƠ
CHẾ SỬA CHỮA METHIONINE SULFOXIDE .............................................. 12
1.2.1. Lịch sử phát hiện họ enzyme MSR ....................................................... 12
1.2.2. Chức năng bảo vệ tế bào của hệ thống các MSR .................................. 13
1.2.3. Các thành viên trong họ enzyme MSR ................................................. 14
1.2.4. Cơ chế sửa chữa oxi hóa Met của hệ thống MSR ................................. 15
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ....................................................................... 18
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ....................................................... 18
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ........................................................ 22
1.4. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................ 23
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................ 24
2.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 24
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 24


2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 25
2.1.3. Thiết bị ................................................................................................ 26
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................ 27
2.2.1. Tìm kiếm các gen mã hóa cho enzyme methionine sulfoxide reductase A
trong hệ gen của cây đậu tương (GmMSRA)................................................... 28

2.2.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA ...................................... 28
2.2.2.1. Mức độ biểu hiện ở các mô cơ quan và điều kiện sinh trưởng khác
nhau ............................................................................................................. 28
2.2.2.2. Đánh giá biểu hiện gen trong điều kiện bình thường và bất lợi. ....... 28
2.2.3. Xác định đặc tính của các GmMSRA thông qua biểu hiện trên nấm men
Saccharomyces cerevisiae.............................................................................. 29
2.2.3.1. Kỹ thuật tách dòng gen ................................................................... 29
2.2.3.2. Phân tích đặc tính gen mã hóa MSRA biểu hiện trên nấm men........ 30
2.2.4. Phân tính đặc tính của các GmMSRA thông qua biểu hiện trên cây mô
hình Arabidopsis thaliana .............................................................................. 31
2.2.4.1. Tạo cây mô hình A. thaliana siêu biểu hiện GmMSRA ................... 31
2.2.4.2. Phân tích kiểu hình cây chuyển gen................................................. 32
2.2.4.3. Đánh giá hình thái cây chuyển gen .................................................. 32
2.2.4.4. Thử nghiệm tính kháng mặn............................................................ 33
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 34
3.1. KẾT QUẢ TÌM KIẾM VÀ PHÂN TÍCH CÁC GEN MÃ HÓA CHO
ENZYME MSRA TRONG HỆ GEN ĐẬU TƯƠNG ......................................... 34
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN MÃ HÓA
MSRA TRONG HỆ GEN ĐẬU TƯƠNG .......................................................... 41
3.2.1. Đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA ở các mô khác nhau ...... 41


3.2.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA ở các giai đoạn phát triển
khác nhau trên Genevestigator® .................................................................... 42
3.2.3. Đánh giá mức độ biểu hiện của các GmMSRA trong điều kiện bình
thường và bất lợi ............................................................................................ 43
3.3. PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HÓA ENZYME GmMSRA CỦA ĐẬU
TƯƠNG THÔNG QUA BIỂU HIỆN TRÊN NẤM MEN SACCHAROMYCES
CEREVISIAE. .................................................................................................... 44
3.3.1. Kết quả tách dòng gen .......................................................................... 44

3.3.1.1. Nhân dòng cADN sử dụng kĩ thuật PCR ......................................... 44
3.3.1.2. Chuyển gen GmMSRA6 vào vector pKS ........................................ 45
3.3.1.3. Chuyển gen vào vector đặc hiệu nấm men p425 .............................. 47
3.3.2. Kết quả thử nghiệm in vivo hoạt tính xúc tác phản ứng chuyển hóa MetO
thành Met của các GmMSRA. ....................................................................... 49
3.3.3. Kết quả đánh giá khả năng kháng lại tác nhân oxi hóa của các chủng
nấm men mang vector biểu hiện gen mã hóa cho MSRA ............................... 50
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH GEN MÃ HÓA ENZYME GmMSRA
THÔNG QUA BIỂU HIỆN TRÊN CÂY MÔ HÌNH ARABIDOPSIS THALIANA
........................................................................................................................... 52
3.4.1. Kết quả tạo cây mô hình A. thaliana siêu biểu hiện gen mã hóa cho
enzyme MSR bằng phương pháp nhúng hoa. ................................................. 52
3.4.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số cây chuyển gen. ................................. 54
3.4.3. Kết quả PCR mẫu ADN tổng số cây chuyển gen nhằm phát hiện sự có
mặt của gen chuyển. ...................................................................................... 55
3.4.4. Xác định sự biểu hiện của gen chuyển bằng RT-PCR........................... 56
3.4.5. Kết quả xác định tỷ lệ đồng hợp/dị hợp của các dòng cây chuyển gen ở
thế hệ F3......................................................................................................... 57


3.4.6. Kết quả đánh giá hình thái các dòng cây chuyển gen. ........................... 61
3.4.6.1. Hình thái cây trên đĩa thạch ............................................................. 61
3.4.6.2. Hình thái cây trên giá thể đất........................................................... 62
3.4.7. Kết quả thử nghiệm kháng mặn ............................................................ 63
THẢO LUẬN .................................................................................................... 66
KẾT LUẬN ........................................................................................................... 71
KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 73

MỞ ĐẦU
Biến đổi khí hậu gây ảnh hưởng không nhỏ tới nông nghiệp toàn cầu, tạo sức ép
lên vấn đề an ninh lương thực và tình trạng nghèo đói trên thế giới. Tại Việt Nam,
điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra bởi biến đổi khí hậu như hạn hán, ngập mặn có
tác hại rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng.
Ở thực vật, các gốc tự do chứa oxi (Reactive Oxygen Species - ROS) được tạo
ra chủ yếu ở lục lạp, ty thể và peroxisomes với vai trò là các phân tử dẫn truyền tín
hiệu nội bào trong nhiều quá trình khác nhau.Việc cân bằng giữa sản xuất và loại bỏ
ROS được điều hòa chặt chẽ bởi các chất chống oxi hóa nội bào. Tuy nhiên, quá
trình này có thể bị phá vỡ bởi các yếu tố bất lợi từ môi trường và tổn thương cơ học.
Methionine (Met) là một α-axit amin chứa lưu huỳnh (S) có vai trò thiết yếu và
là tiền chất của rất nhiều phản ứng chuyển hóa quan trọng trong chu trình sinh
trưởng và phát triển của tế bào. Khi hàm lượng ROS trong tế bào tăng cao, các phân
tử Met tồn tại dạng tự do hay dạng liên kết trong protein rất dễ bị oxi hóa thành
methionine sulfoxide (MetO), làm biến đổi cấu trúc của protein, dẫn đến sai hỏng
hoặc mất chức năng và protein có thể bị phân hủy, do đó gây ảnh hưởng không nhỏ
đến sức đề kháng và sức sống của cây trồng. Trong cơ thể sinh vật, MetO được sửa
chữa bằng enzym methionine sulfoxide reductase (MSR). Các nghiên cứu trên thế
giới chỉ ra rằng, hoạt động của MSR tạo ra những tác động tích cực đến sinh vật,
đặc biệt là ở thực vật như khả năng đề kháng cao, chống lại quá trình oxi hóa gây ra
bởi các bất lợi môi trường. Như vậy, những hiểu biết về cơ chế hoạt động của MSR
trong tế bào thực vật sẽ tạo tiền đề cho việc phát triển các giống cây trồng có khả
năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường. Xuất phát từ những lý do trên,
chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu: “Phân tích đặc tính gen mã hóa enzyme
methionine sulfoxide reductase từ hệ gen cây đậu tương (Glycine max)”.
Đề tài nghiên cứu này nằm trong đề tài nghiên cứu cơ bản “Nghiên cứu protein
mẫn cảm với oxi hóa methionine và vai trò của enzyme methionine sulfoxide
reductase của cây nông nghiệp” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc
gia tài trợ.
1

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. METHIONINE VÀ QUÁ TRÌNH OXI HÓA METHIONINE BỞI CÁC
GỐC TỰ DO CHỨA OXI (REACTIVE OXYGEN SPECIES - ROS)
1.1.1. Giới thiệu chung về methionine
1.1.1.1. Cấu trúc hóa học, đặc tính sinh học và sinh tổng hợp methionine
Methionine là một trong những α-axit amin cuối cùng được phát hiện và
phân lập lần đầu tiên bởi Mueller vào năm 1922. Sau đó, Barger và Coyne đã xác
định cấu trúc hóa học và đặt tên cho axit amin mới này là Methionine (Met) [9].
Cùng với cysteine (Cys), Met là axit amin chứa lưu huỳnh (S) mạch hở, không phân
cực, mạch bên (gốc R) kị nước và không phân nhánh (hình 1.1).

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Methionine [7]
Met được mã hóa chỉ bởi duy nhất bộ ba AUG, đây là mã mở đầu, xác lập tín
hiệu bắt đầu quá trình dịch mã sinh tổng hợp chuỗi polypeptit trên phân tử mARN.
Do đó, ở nhóm sinh vật nhân chuẩn và vi khuẩn cổ, Met thường xuất hiện ở đầu N
(N-terminal) trong chuỗi peptide, tuy nhiên, Met có khả năng bị loại bỏ trong quá
trình cải biến protein sau dịch mã. Ở vi khuẩn, dẫn xuất N-formylmethionine cũng
có vai trò như các axit amin mở đầu chuỗi peptide.
Thuộc nhóm axit amin không thể thay thế với đời sống sinh vật nói chung,
Met không được tổng hợp trong cơ thể người và động vật, mà phải lấy từ nguồn
thức ăn bên ngoài có chứa Met. Ở thực vật và vi sinh vật, Met được tổng hợp từ axit
aspartic và Cys. Sơ đồ sinh tổng hợp methionine được mô tả trên hình 1.2.

2


Hình 1.2. Quá trình sinh tổng hợp Methionine [20]
3

1.1.1.2. Methionine và dẫn xuất S-adenosyl-L-methionine
Một trong những dẫn xuất quan trọng của Met, được tổng hợp từ Met và
ATP bởi enzyme AdoMet synthetase là S-adenosyl-L-methionine (AdoMet hay
SAM). Thông qua SAM, Met tham gia vào các phản ứng chuyển hóa nhiều hợp
chất quan trọng trong chu trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Ở thực vật,
SAM là cơ chất của một số lượng lớn các phản ứng xúc tác bởi enzyme. SAM
không chỉ cung cấp nhóm methyl (–CH3) cho các enzyme vận chuyển
methyltransferase trong phản ứng methyl hóa nhiều hợp chất sinh học (axit béo,
pectin, alkaloid, phytosterol…) mà còn đóng vai trò tiền chất trong sinh tổng hợp
polyamine, nicotianamine [44].
Polyamine là các hợp chất hữu cơ chứa nitơ như spermidine, spermine.
Trong điều kiện pH của tế bào, do tích điện dương, chúng có khả năng tương tác
hóa học với các đại phân tử như ADN (thúc đẩy phản ứng trùng hợp các
cytoskeletal, ảnh hưởng đến cấu hình và tính ổn định của ADN), phospholipid (ảnh
hưởng đến độ bền của màng tế bào), hoạt hóa phức hệ ribosome trong sinh tổng hợp
protein. Đặc biệt, ở thực vật bậc cao, polyamine liên quan đến kiểm soát phân chia
tế bào, điều hòa quá trình sinh trưởng (tương tự các hormone sinh trưởng auxin và
gibberellin), tạo rễ và hoa, đáp ứng với điều kiện bất lợi và làm chậm quá trình lão
hóa tế bào. Tuy nhiên, cơ chế điều hòa của các polyamine ở mức độ nội bào vẫn
chưa được giải thích rõ ràng [27].
Nicotianamine là một phức chất bền của sắt và các kim loại chuyển tiếp
khác, xuất hiện phổ biến ở thực vật bậc cao. Đặc biệt ở các loài thuộc họ lúa,
nicotianamine là tiền chất cho quá trình sản xuất các phytosiderophore-hợp chất cần
thiết cho sự hấp thu sắt từ đất. Khi thực vật chịu các điều kiện bất lợi liên quan đến
thiếu sắt, rễ cây tăng tiết đáng kể lượng phytosiderophore vào đất, tại đây
phytosiderophore sẽ liên kết tạo phức với các ion Fe3+ ít tan. Phức hệ
phytosiderophore-Fe3+ sau đó được vận chuyển lên rễ, từ đó cung cấp lượng sắt cần
thiết cho các quá trình trao đổi chất khác nhau ở thực vật [44].

4


1.1.1.3. Methionine và chu trình sinh tổng hợp ethylene
Ethylene (CH2 = CH2) là một hormone thực vật, được tạo thành ở tất cả các
bộ phận thiết yếu của cây bao gồm rễ, thân, lá, hoa, quả, củ và hạt. Sản xuất
ethylene có vai trò quan trọng trong điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển
của thực vật bắt đầu từ giai đoạn nảy mầm cho đến khi lão hóa, đặc biệt lượng
ethylene tăng lên đáng kể trong giai đoạn làm chín trái cây. Ethylene liên quan đến
các đáp ứng với một loạt bất lợi sinh học và phi sinh học bao gồm tổn thương tế
bào, dịch bệnh, ngập úng, hạn hán, suy giảm nồng độ oxi tế bào, thay đổi nhiệt độ,
tác động của các hóa chất độc hại (O3, SO2) [60]. Ethylene cũng được cho là có vai
trò ức chế làm giảm số lượng nốt sần được hình thành trong rễ ở nhiều loài thực vật
như cỏ linh lăng, Lotus japonicus. Tuy nhiên, vai trò của ethylene đối với quá trình
sinh tổng hợp các nốt sần của vi khuẩn cố định đạm vẫn chưa thực sự rõ ràng [6].
Do cấu trúc hóa học đơn giản, ethylene có thể được chuyển hóa từ nhiều hợp
chất thông qua các phản ứng hóa học khác nhau. Một danh sách các hợp chất được
đề xuất với vai trò là tiền chất của ethylene bao gồm: axit linoleic, axit axetic, axit
acrylic, axit fumaric, ethionine, β-alanine, ethanol, propanal và Met. Điều đáng chú
ý là, ở thực vật bậc cao, Met được xác nhận là tiền chất đáp ứng tốt nhất đối với nhu
cầu sinh tổng hợp ethylene [60]. Trong một nghiên cứu của Lieberman và Mapson
(1965), liên quan đến quá trình tổng hợp ethylene trên hệ thống mô hình hóa học,
nhóm tác giả nhận thấy, sự phân hủy các phân tử axit linoleic đã bị peroxit hóa (xúc
tác phản ứng: ion Cu +) đã tạo thành ethane (C2H6), ethylene (C2H4) và các
hidrocacbon khác. Vì các gốc tự do có vai trò trung gian trong phản ứng peroxit hóa
axit linoleic, do đó để kiểm tra thực sự có hay không sự hình thành ethylene từ phản
ứng trên, nhóm nghiên cứu tìm cách ức chế phản ứng bằng cách bổ sung Met – axit
amin được biết đến trong vai trò “dọn dẹp” các gốc tự do. Trái ngược với kết quả
mong đợi, quá trình sản xuất ethylene tăng lên rất nhiều sau khi Met được bổ sung

vào môi trường phản ứng. Như vậy, khi vắng mặt các phân tử axit linoleic đã bị
peroxit hóa, Met có khả năng hoạt động như một tiền chất của ethylene và ethylene
tạo thành có nguồn gốc từ cacbon C3 và C4 trên phân tử Met (hình 1.3) [60].
5


Hình 1.3. Tổng hợp ethylene trong hệ thống mô hình hóa học [60]
Báo cáo của Lieberman và Mapson là một bằng chứng trực tiếp về vai trò của Met
đối với sinh tổng hợp ethylene trong hệ thống sinh học. Do C2H4 và CO2 đều được
tạo ra trong hệ thống hóa học lẫn trong mô tế bào thực vật, nên ban đầu người ta
cho rằng cơ chế sản xuất ethylene trong cơ thể và trong hệ thống hóa học là tương
tự nhau. Tuy nhiên, sự chuyển hóa Met thành ethylene trong hai hệ thống này diễn
ra theo 2 cách thức khác biệt [60].
Quá trình sinh tổng hợp ethylene từ tiền chất Met gồm hai bước đươc minh
họa trong hình 1.4, trong đó S-adenosyl-methionine (S-AdoMet) và 1aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) là các chất trung gian chính.

Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp ethylene [5]
Trong bước đầu tiên, SAM được chuyển hóa thành ACC nhờ enzyme ACC
synthase. Sản phẩm phụ được tạo thành trong bước này là 5′-methylthioadenosine
(MTA) sẽ tham gia chu trình Met (chu trình Yang) để tái tạo tiền chất Met thông
qua các phản ứng enzyme kế tiếp nhau với hai chất trung gian là 5-methylthioribose
(MTR), 2-keto-4-methylthiobutyrate (KMB). Bước thứ hai là quá trình oxi hóa

6


ACC nhờ enzyme ACC oxidase (ACO) để tạo thành ethylene và sản phẩm phụ gồm
CO2 và hydrogen cyanide (HCN). Hoạt tính của enzyme ACO kiểm soát quá trình
sản xuất ethylene trong cơ thể và có đóng góp quan trọng trong giai đoạn nảy mầm
hạt [5].

1.1.1.4. Methionine – tiền chất của quá trình chuyển hóa glucosinolate
Glucosinolate là nhóm tương đối nhỏ nhưng đa dạng của các hợp chất
chuyển hóa thứ cấp chứa lưu huỳnh ở thực vật. Có hơn 120 glucosinolate khác nhau
đã được xác định và chúng gần như chỉ được tìm thấy ở các thành viên thuộc bộ Cải
(bộ Mù tạt) – Brassicales bao gồm: bắp cải, bông cải xanh, mù tạt, cải dầu và
Arabidopsis. Bên cạnh hướng nghiên cứu từ lâu đã thu hút nhiều sự quan tâm, liên
quan đến ảnh hưởng của glucosinolate lên hương vị, mùi thơm và hàm lượng tinh
dầu của các cây họ Cải thì thời gian gần đây, các nhà khoa học đang hướng đến vai
trò của glucosinolate trong việc cải thiện sức đề kháng của cây trồng đối với các
loại côn trùng, nấm và sâu bệnh . Các nghiên cứu trên cây mô hình A. thaliana cho
thấy, các glucosinolate chính của A. thaliana được tổng hợp từ 3 axit amin: Met,
tryptophan (Trp) và phenylalanine (Phe), trong đó các glucosinolate có nguồn gốc
từ Met chiếm số lượng lớn nhất. Điều này cũng xảy ra tương tự ở nhiều loài khác
thuộc bộ Cải. Con đường sinh tổng hợp glucosinolate từ tiền chất Met được mô tả
trong hình 1.5. Trong đó, đáng chú ý là giai đoạn gắn lần lượt từ 1 – 6 nhóm
methylene để kéo dài mạch bên của Met trước khi bước vào tổng hợp chính
glucosinolate [56].

7


Hình 1.5. Sơ đồ sinh tổng hợp Glucosinolate từ Methionine [56].
Như vậy, với vai trò tiền chất cơ bản của quá trình chuyển hóa Glucosinolate
ở nhóm thực vật họ Cải, Met liên quan đến khả năng tăng cường sức đề kháng trong
điều kiện bất lợi gây ra bởi dịch bệnh và côn trùng ở thực vật.

8

1.1.2. Quá trình oxi hóa methionine bởi các gốc tự do chứa oxi
ROS (Reactive Oxygen Species) là một thuật ngữ dùng để chỉ các phân tử
hóa học chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp vỏ ngoài cùng như superoxide,
hydroperoxide, hydroxyl (hình 1.6). ROS được tạo ra chủ yếu ở lục lạp, ty thể và
peroxisome, một phần là kết quả của quá trình trao đổi chất hiếu khí (hô hấp và
quang hợp) trong tế bào, một phần là do sự hoạt hóa hệ thống enzyme liên kết với
màng tế bào như phức hệ NADPH oxidase [31].

Hình 1.6. Sơ đồ hình thành các gốc tự do chứa oxi [4]
Ở thực vật, trong điều kiện sinh lý bình thường, ROS được tạo thành với vai
trò của các phân tử dẫn truyền tín hiệu nội bào, kiểm soát nhiều quá trình khác nhau
trong tế bào gồm: (i) Điều hòa sinh trưởng tế bào: vai trò của H2O2 trong chuỗi tín
hiệu auxin ở rễ ngô đã được báo cáo [28]. (ii) Tham gia các đáp ứng bảo vệ tế bào
khỏi tác nhân gây bệnh liên quan đến vi khuẩn, nấm và virus. Báo cáo đầu tiên ghi
nhận vai trò này của ROS thuộc về Doke (1985) đã chứng minh sự tạo thành
hydrogen peroxide trong mô củ khoai tây có tác dụng kháng lại sự lây nhiễm của vi
khuẩn Phytopthera infestans [4]. (iii) Hoạt động của khí khổng: ROS là tín hiệu
trung gian cần thiết trong việc cảm ứng ABA (Abscisic acid) để đóng khí khổng.
Một nghiên cứu trên Arabidopsis cho thấy, H2 O2 được tạo thành và tham gia chuỗi
tín hiệu ABA, cảm ứng đóng khí khổng thông qua kích hoạt các kênh Ca2+ trên
màng tế bào trong các đáp ứng liên quan đến stress nước [41], (iv) Quá trình
apoptosis (tế bào chết theo chương trình). Cho đến này, chưa có khẳng định rõ ràng
về những hợp chất nào có vai trò loại bỏ các gốc −OH để bảo vệ tế bào khỏi những
tổn thương oxi hóa gây ra bởi gốc −OH. Nhiều nghiên cứu được ghi nhận chứng
9


minh tế bào đã phát triển các cơ chế phức tạp liên quan kiểm soát phản ứng tạo ra
các gốc tự do này cũng như duy trì nồng độ O2, H2O2 và các ion kim loại chuyển
tiếp ở mức độ thích hợp, đảm bảo các hoạt động trao đổi chất của cơ thể diễn ra

bình thường. Đáng chú ý là 2 cơ chế liên quan đến vai trò của: (i) Các chất chống
oxi hóa nội bào không có hoạt tính enzyme (non‒enzymatic antioxidant) gồm
ascorbate, glutathione (GSH), tocopherol, flavonoid, alkaloids và carotenoid. Các
đột biến liên quan đến suy giảm hàm lượng axit ascorbic hay thay đổi nồng độ GSH
làm gia tăng mức độ nhạy cảm với điều kiện bất lợi. (ii) Hệ thống các enzyme loại
bỏ ROS ở thực vật gồm superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX),
glutathione peroxidase (GPX) và catalase (CAT). Trong đó, SOD có vai trò bảo vệ
“tiên phong” ngăn chặn sự biến đổi của H2O2, tiếp đó APX, GPX và CAT sẽ loại bỏ
H2O2 để tránh gây độc cho tế bào [43]. Như vậy, việc cân bằng giữa sản sinh và loại
bỏ ROS được điều hòa và kiểm soát rất chặt chẽ. Tuy nhiên, quá trình này có thể bị
phá vỡ bởi các yếu tố bất lợi từ môi trường đặc biệt là các bất lợi do oxi hóa, kết
quả là kích thích sản sinh ROS, thường thấy là sự tích tụ H2O2 trong tế bào. Việc
ROS được tăng cường một cách đột ngột và hàm lượng tăng lên nhanh chóng tạo ra
tác động trực tiếp đến các chất phân tử lớn như axit nucleic (ADN và ARN), protein
và lipid. Các phân tử hợp chất khi bị oxi hóa bởi ROS có thể bị biến đổi trong cấu
trúc và cơ chế tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai
hỏng hoặc mất chức năng, thậm chí gây chết tế bào [31].
Trong tế bào sinh vật nói chung, các axit amin trong protein là một trong
những mục tiêu chính của ROS cũng như các chất oxi hóa khác. Tất cả các axit
amin đều có thể bị oxi hóa bởi ROS, làm thay đổi cấu trúc không gian của chuỗi
polypeptit cũng như trình tự mạch bên của các axit amin. Cơ chế chung tác động
của ROS tới axit amin được mô tả là: các gốc tự do chứa oxi (ví dụ nhóm −OH) lấy
nguyên tử H từ Cα hoặc từ nguyên tử C ở mạch bên của axit amin gây ra phản ứng
phân cắt các liên kết peptide trong chuỗi polypeptide [52]. Cùng với Cys và Trp,
Met nằm trong nhóm các axit amin đặc biệt nhạy cảm với quá trình oxi hóa gây ra
bởi ROS. Khi hàm lượng ROS trong tế bào tăng cao, các phân tử Met tự do cũng
10


như Met trên protein dễ dàng bị oxi hóa theo 2 giai đoạn được mô tả trong hình 1.7.

Điều đáng chú ý là trong khi sự tạo thành methionine sulfone MetO2 (một hợp chất
hiếm khi được tìm thấy trong các hệ thống sinh học), cần một lực oxi hóa mạnh và
không có tính thuận nghịch thì quá trình chuyển hóa giữa Met và MetO lại có tính
thuận nghịch, phản ứng “đảo ngược” sự oxi hóa Met được thực hiện nhờ hệ thống
các chất khử hóa học hoặc sinh học [57].

Hình 1.7. Quá trình oxi hóa Met [57]
Cùng với quá trình methyl hóa và phosphoryl hóa, oxi hóa Met được cho là
liên quan đến điều hòa hoạt tính sinh học và chức năng của protein. Đặc tính mạch
bên của Met thường có kích thước dài, linh hoạt và không phân cực. Tuy nhiên, khi
bị oxi hóa, mạch bên của MetO do gắn thêm nguyên tử oxi, trở nên cứng và phân
cực hơn, chỉ số kỵ nước được xác định là tương đương với lysine (Lys). Sự thay đổi
này làm tính chất protein bị biến đổi, gây bất hoạt chức năng thậm chí bị phân hủy.
Như đã trình bày ở trên, Met tiền chất của rất nhiều phản ứng chuyển hóa các hợp
chất quan trọng trong chu trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Do đó, việc các
phân tử Met bị oxi hóa thành MetO gây ra bởi ROS dẫn tới những hậu quả nghiêm
trọng cho tế bào như suy giảm chức năng hoặc gây chết, đẩy nhanh quá trình lão
hóa hoặc giảm sức sống cho cây trồng.

11


1.2. ENZYME METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE (MSR) VÀ CƠ
CHẾ SỬA CHỮA METHIONINE SULFOXIDE
1.2.1. Lịch sử phát hiện họ enzyme MSR
Năm 1981, khi tiến hành nghiên cứu hoạt tính sinh học của protein L12 được
phân lập và tinh sạch từ ribosome của vi khuẩn E. coli, nhóm nghiên cứu của Brot
nhận thấy L12 bị mất hoạt tính khi một hoặc nhiều hơn 3 gốc Met trong protein bị
oxi hóa thành MetO. Một enzyme, ban đầu được gọi là peptide methionine
sulfoxide reductase và bây giờ là MSRA, có khả năng sửa chữa các tổn thương oxi

hóa, khử các MetO trong protein về Met đồng thời phục hồi hoạt tính sinh học của
L12 đã được phát hiện. Đó là nghiên cứu đầu tiên các MSR được biết đến với vai
trò “đảo ngược” quá trình oxi hóa Met, góp phần quan trọng trong việc khôi phục
cấu trúc và chức năng của các protein, bảo vệ tế bào khỏi những tổn thương gây ra
bởi các tác nhân oxi hóa [58]. Với cấu trúc hóa học chứa nguyên tử S trung tâm bất
đối xứng của Met nên các MetO được tạo thành tồn tại ở hai dạng đồng phân quang
học là Methionine-S-sulfoxide (Met-S-O) và Methionine-R-sulfoxide (Met-R-O), do
đó các sinh vật đã hình thành 2 họ enzyme MSR hoàn toàn khác biệt về trình tự, cơ
chất đặc hiệu và cấu trúc trung tâm hoạt động, đó là MSRA và MSRB, tương ứng
xúc tác đặc hiệu cho phản ứng khử Met-S-O và Met-R-O về Met (hình 1.8) [8].

Hình 1.8. Phản ứng khử MetO về Met của các MSR [8]

12


Tuy nhiên, trong những năm đầu thập niên 80 của thế kỉ XX, tầm quan trọng
của quá trình oxi hóa Met cũng như vai trò của MSRA vẫn là một câu hỏi chưa có
câu trả lời, và đó dường như là lý do có rất ít nghiên cứu mang tính chi tiết về hệ
thống MSR trong giai đoạn này.

1.2.2. Chức năng bảo vệ tế bào của hệ thống các MSR
Hệ thống các enzyme MSR có thể bảo vệ tế bào theo 2 cách:
(i) Sửa chữa các tổn thương oxi hóa sinh ra khi các gốc Met quan trọng trong phân
tử protein bị oxi hóa thành MetO. Giả thiết này có vẻ hợp lý vì một số lượng lớn các
protein bị biến đổi hoạt tính sinh học (bảng 1.1) khi quá trình oxi hóa Met xảy ra có
thể được phục hồi chức năng khi ủ với MSRA có mặt các chất khử như DTT hoặc
thioredoxin dạng khử [58].
Bảng 1.1. Một số protein và peptide bị ảnh hưởng khi Met bị oxi hóa [58]
Tên protein/ peptide

Sinh vật nghiên cứu

Tài liệu tham
khảo gốc

E. coli

[11]

Ribosomal protein L12
α-1-Proteinase inhibitor

[12]

Calmodulin

[59]

Thrombomodulin

[22]

Shaker K+ channel

Ruồi giấm

[13]

β-Amyloid peptide

[50]

fMet-Leu-Phe

[14]

(ii) Ngăn chặn quá trình oxi hóa Met gây ra bởi các tác nhân oxi hóa như ROS:
Khả năng loại bỏ ROS của MSR lần đầu tiên được Levine và cs (1996) ghi nhận
trong nghiên cứu in vitro về tác động oxi hóa của H2O2 đến hoạt tính xúc tác của
enzyme glutamine synthetase phân lập từ E. coli. Theo nhóm tác giả, so với các gốc
Met nằm trong cấu trúc lõi thì các gốc Met trên bề mặt protein dễ bị oxi hóa tạo
thành MetO và MSR sẽ khử các Met bị oxi hóa về lại Met. Như vậy, các Met trên

13


phân tử protein có vai trò “chất xúc tác” kích hoạt chức năng dọn dẹp ROS của hệ
thống các chất chống oxi hóa và MSR là một thành viên hiệu quả của hệ thống này.

1.2.3. Các thành viên trong họ enzyme MSR
Họ enzyme MSR ở vi khuẩn E. coli gồm ít nhất 6 thành viên khác biệt nhau
về cơ chất đặc hiệu (dạng MetO tự do và/ hoặc liên kết trong chuỗi peptide), đồng
phân quang học (S- hoặc R-) và vị trí trong tế bào (dạng hòa tan hay liên kết với
màng tế bào). Đặc điểm của các MSR phân lập từ E. coli được tóm tắt trong bảng
1.2 [58].
Bảng 1.2. Các MSR ở vi khuẩn E. coli [58]
Cơ chất
MSR

Dạng tự do
Met-R-O

MSRA

Dạng liên kết trong protein

Met-S-O

Met-R-O

+

MSRB

(+)

fRMSR

+

fSMSR

+
+

+

MSRA1
Mem-R, S-MSR

Met-S-O

+
+

+

+

+

Ghi chú: (+) hoạt tính xúc tác yếu.
Trong số 6 thành viên MSR liệt kê ở trên, MSRA và MSRB được nghiên
cứu nhiều nhất. MSRA là một dạng enzyme phổ biến, được tìm thấy trong hầu hết
các sinh vật từ vi khuẩn, thực vật đến động vật có vú, trong đó có cả người, còn
MSRB được ghi nhận ở tất cả các mô tế bào của sinh vật nhân chuẩn với những
mức độ biểu hiện khác nhau [24]. Các MRSA có hoạt tính đối với Met-S-O ở trạng
thái tự do cũng như trạng thái liên kết trong phân tử protein, trong khi do ái lực với
cơ chất cực kỳ thấp các MSRB khử Met-R-O dạng tự do kém hiệu quả hơn dạng
liên kết trong protein. Khi gây đột biến đồng thời MSRA/ MSRB, hoạt tính của các
14