Phân tích sắc ký Chương 3: Sắc ký lỏng hiệu nâng cao HPLC

13-Nov-18

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chương 3.
SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO

1


13-Nov-18

High
High
Pressure
Price Liquid
Liquid
Chromatography
Chromatography
High
Perfomance
Liquid
Chromatography

Chương CƠ
3 SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)

SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode)
a Russian-Italian
botanist
1903,
Tswett
Михаи́л
Семёнович
Цвет
F: flow rate (mL/min)
time (min)
- Sắc ký pha thuận có pha tĩnh phân cực hơn phaT:động

2


13-Nov-18

Chương CƠ
3 SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT

SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode)

Pha tĩnh

Silic dioxyd (silica)..

Chương CƠ
3 SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode)

Pha tĩnh

Silica trên nền mạch Cacbon.

R

cyano (-CH2 – (CH2)2 – CN);
amino (-CH2 – (CH2)2 – NH2);

diol (-CH2CH2 – CH(OH)CH2OH)
R là các nhánh có các nhóm chức phân cực
Độ phân cực tăng dần từ -cyano đến diol.

3


13-Nov-18

Chương CƠ
3 SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode)

Thành
phần

Dung môi chủ
yếu
(làm pha động )

Pha động

Dung môi phụ
Thay đổi tR

Không phân cực Phân cực hoặc hơi
phân cực.
Các dung môi thường không hấp thu trong vùng UV

Chương CƠ
3 SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
3.1. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode)

Cơ chế lưu giữ: sắc kí hấp phụ
Cơ chế lưu giữ: Chất phân tích cạnh tranh với
các phân tử của pha động được hấp phụ ở các
tâm hoạt động của pha tĩnh. Lực liên kết giữa
pha tĩnh và chất phân tích chủ yếu là lực tương
tác lưỡng cực – lưỡng cực, liên kết hidrogen.

4

13-Nov-18

Chương 3
SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
CƠ
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
3.1. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.1. Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode)
Sắc ký pha đảo có pha tĩnh kém phân cực hơn pha động. Áp dụng
cho các chất ít phân cực (háo dầu). Chất tan càng kỵ nước càng bị
giữ lại mạnh.

Pha tĩnh

Chế tạo từ silica, tác dụng với clorosilan tạo ra dẫn xuất
siloxan như cột ở pha thuận nhưng điều khác biệt là R
là các gốc HC no không phân cực, hoặc gốc phenyl

- CH2 – (CH2)16- CH3 : gốc octadecyl . Cột C18 (ODS)
- CH2 – (CH2) 6- CH3 : gốc ocyl . Cột C8
- CH2 – (CH2) 2- CH3 : gốc butyl Cột C4
- CH2 – (CH2) 2- C6H5 : gốc phenyl propyl . Cột phenyl.

Chương CƠ

3 SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.1. Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode)

Pha động

Dung môi hữu cơ, dung mội hữu cơ và nước, hoặc
dung môi hưu cơ và đệm

Các dung môi hữu cơ thường sử dụng là Methanol (MeOH),
acetonitrile (ACN) hay THF (Tetrahydrofuran (CH2)4O ). Thành phân
nước trong pha động tăng thì lực rửa giải giảm.
Khi sử dụng dung dịch đệm, những thông số quan trọng: nồng độ
đệm và pH ; Thành phần dung dịch đệm và dung môi hữu cơ

5


13-Nov-18

Chương
Chương 3CƠ

3 SẮC
SẮC
KÝ
KÝLÝ
LỎNG
LỎNG
HIỆU
HIỆU NĂNG
NĂNG
CAO
CAO (HPLC)
(HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.1. Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode)

Cơ chế lưu giữ

Pha tĩnh không phân cực , Liên kết giữa pha tĩnh và chất tan là
liên kết kị nước: phần ít phân cực của chất phân tích được gắn trên
pha tĩnh
Nếu phân tử chất tan có
nhiều dây Cacbon, nhóm
thơm. tính kỵ nước mạnh
hơn, Chất tan sẽ bi lưu giữ
mạnh trong cột
Nếu mẫu có nhiểu nhóm cacboxyl, nhóm amino, nhóm hydroxyl

tính kỵ nước yếu hơn. Chất tan sẽ ít bị lưu giữ và ra nhanh hơn.

Chương 3CƠ
SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.3. Sắc ký trao đổi ion

a.Khái niệm

Dựa vào lực hút trái dấu của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên
pha tĩnh.
Chất trao đổi cation và chất trao
đổi anion là polymer không tan
trong nước mang các nhóm trao đổi
ion được gọi là chất trao đổi ion
(ion exchangers) hoặc nhựa trao đổi
(ion exchange resins)

Tương tác giữa nhựa trao đổi
ion và ion tích điện trái dấu

6

13-Nov-18

Chương 3CƠ
SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.3. Sắc ký trao đổi ion

b. Pha tĩnh và pha động

Pha tĩnh
- Nhựa trao đổi
cation
Loại acid
mạnh

Loại acid
yếu

Nhựa trao đổi
anion

Base
mạnh

Base yếu

Chương 3CƠ
SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.3. Sắc ký trao đổi ion
Pha
Tĩnh
Nhựa
trao
đổi
Cation

b. Pha tĩnh và pha động

• Mang nhóm acid sulfonic (R-SO3- H+) . phân ly hoàn
toàn , không phụ thuộc pH
AXIT
- +

+
•
MẠNH R- C6H5-SO3 H → R- C6H5-SO3 + H .
AXIT
YẾU

• mang nhóm R-COOH
• chỉ hoạt động trong một khoảng pH>PKa để tồn tại
dưới dạng anion mới có thể tham gia trao đổi ion .

• ở pH nào cationit mạnh cũng có thể tồn tại dưới
KHÁC
dạng anion, còn cationit yếu chỉ mang điện tích ở
NHAU pH>pKa và lúc đó mới hoạt động được

7


13-Nov-18

Chương 3
SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
CƠ
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ

1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.3. Sắc ký trao đổi ion

b. Pha tĩnh và pha động

Nhựa trao đổi Anion có nhóm base amin liên kết
với phân tử polymer
Chất trao đổi base mạnh có nhóm amin
bậc bốn [RN(CH3)3+ OH- ].
Dạng base yếu có nhóm amin bậc hai
hoặc bậc ba

Chương CƠ
3 SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.3. Sắc ký trao đổi ion

b. Pha tĩnh và pha động

R có thể là nền silica hay nền Polimer hữu cơ

Nhựa trao đổi cation trên
nền silica

Nhựa trao đổi cation trên
nền polymer

8


13-Nov-18

Chương CƠ
3 SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
3.1.3. Sắc ký trao đổi ion

b. Pha tĩnh và pha động

Pha động là Dung dịch có ion rửa giải pha trong nước hoặc đệm
Ion rửa giải là ion có thể đẩy các ion bị giữ trên pha tĩnh ra
Dung dịch đệm giữ cho PH của dung dịch rửa giải có giá trị ổn định
để cho chất phân tích tồn tại dạng ion và nếu là cột yếu thì cột hoạt

động được (tồn tại nhóm chức mang điện tích)

Chương CƠ
3 SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
1.7.3. Sắc ký trao đổi ion

c. Cơ chế lưu giữ

Bản chất lực tương tác : Lực tĩnh điện
Đầu tiên các ion trong pha động tương tác với pha tĩnh bị giữ lại trên pha
tĩnh.

Sau đó khi cho chất phân tích qua cột, các ion cần phân tích có lực tương
tác tĩnh điện mạnh hơn sẽ đẩy các ion pha động ra khỏi pha tĩnh

9


13-Nov-18

Chương 3

SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
CƠ
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
1.7.4. Sắc ký trao đổi ion

c. Cơ chế lưu giữ

Sắc ký đồ phân tích nước bằng sắc ký trao đổi ion

Chương CƠ
3 SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
1.7.4. Sắc ký ghép cặp ion (Reversed phase ion pairing)

a. Khái niệm

là một biến thể của sắc ký pha đảo

Điều khác biệt trong sắc ký ghép cặp ion phải tạo điều kiện để chất
phân tích phải ở dạng ion hóa hoàn toàn (bằng cách điều chỉnh pH)
Nếu chất phân tích là acid yếu HA thì HA phải phân ly hoàn toàn thành
H+ và A-. Nếu chất phân tích là baz yếu B thì B phải tác dụng với H+
để tạo thành BH+.
Thêm 1 chất đối ion Q+,
hay Q-

A- + Q+  [A-,Q+ ]
BH+ + Q-  [BH+, Q- ]

Đuôi kỵ nước

Cặp ion có tính kỵ nước cao bị pha tĩnh giữ lại giống như một phân
tử không điện tích

10


13-Nov-18

Chương CƠ
3 SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG

CAO (HPLC)
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
3.1.
1.7.4. Sắc ký ghép cặp ion (Reversed phase ion pairing)

b. Cơ chế lưu giữ.
Cặp ion [ A-,Q+],
[ BH+,Q- ] được
hình thành trong
pha động như
một hợp chất
trung hòa được
lưu giữ theo cơ
chế như sắc kí
pha đảo.

Chương 3
SẮC
KÝLÝ
LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)
CƠ
SỞ
THUYẾT
SẮC KÝ
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG

3.1.
1.7.4. Sắc ký ghép cặp ion (Reversed phase ion pairing)

c. Pha tĩnh và pha động

Pha tĩnh giống như pha tĩnh trong pha đảo
Pha động : Pha động cũng là những dung môi như
trong sắc ký pha đảo .

CÁC THÔNG SỐ QUAN TRỌNG
-Loại chất ghép cặp
- Nồng độ chất ghép cặp
-pH của pha động
-Nồng độ dung môi hữu cơ trong pha động

11


13-Nov-18

Sc ký loi kớch thc (SEC)
1.
2.

Phân tách các cấu tử dựa trên kích thớc phân tử
Bao gồm 2 loại:
SEC trong dung dịch kỵ nớc: Sắc ký thấm gel (GPC)
SEC trong dung dịch nớc : Sắc ký lọc gel (GFC)
3. Không có tơng tác sắc ký giữa các cấu tử phân tích và pha
tĩnh của cột

Các phân tử mẫu khuyếch tán vào các lỗ xốp của hạt nhồi
Các phân tử đợc tách loại dựa vào sự khác biệt kích thớc của chúng tơng đối so với kích thớc các lỗ xốp : các
phân tử lớn hơn lỗ xốp không khuyếch tán đợc vào , còn
các phân tử nhỏ hơn khuyếch tán đợc
Các phân tử lớn sẽ rửa giải trớc, các phân tử càng nhỏ,
càng rửa giải chậm hơn
4. Pha động đợc lựa chọn chủ yếu dựa trên khả năng hòa tan
các cấu tử phân tích
5. Đợc sử dụng chủ yếu trong phân tích polymer và các protein
23

Cơ chế tách trong sắc ký loại kích thớc

24

12


13-Nov-18

S¾c ký HILIC
(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)
1.

Pha nh rất phân cực : Silica , NH2, Diol.. (tương tự NP-LC), nhưng pha
động vẫn sử dụng nước trong thành phần. Bởi vậy HILIC còn được gọi là:
‘sắc ký lỏng pha thường trong dung dịch nước (aqueous normal phase
HPLC)’.

2.

Pha động thường bao gồm thành phần nước (đệm) chiếm từ 2 – 40 %.
Dung môi hữu cơ thường là acetonitrile.

3.

Thứ tự rửa giải : ngược với RP-LC: càng phân cực, càng lưu giữ

4.

Cơ chế:
§

Dựa trên phân bố giữa lớp nước hấp phụ trên bề mặt pha nh với
pha động

§

Dựa trên tương tác của các chất phân ch phân cực với các nhóm
phân cực của pha nh

5.

Tăng hàm lượng nước trong pha động à giảm khả năng lưu giữ

6.

Ứng dụng với các chất rất phân cực, là một kỹ thuật bổ sung cho RP-LC.
Kết hợp tốt với LC/MS.

25

Trong HILIC, nước là một dung môi mạnh !

26

13


13-Nov-18

27

Các chÕ ®é ph©n tÝch HPLC vµ c¸c d¹ng mÉu tương ứng

28

14


13-Nov-18

B.) Low- and High-performance Liquid Chromatography:

Molecular mass

Many types of liquid chromatography are available, based on different stationary
phase and mobile phase combinations.
- each type may be further characterized based on its overall efficiency or
performance

Các chÕ ®é ph©n tÝch HPLC vµ c¸c d¹ng mÉu tương ứng
Loại HPLC

Pha tĩnh

Pha động

Dạng chất
được tách

Pha đảo
Ghép cặp ion
Pha thuận
Trao đổi ion
Loại kích cỡ

30

15


13-Nov-18

Các chÕ ®é ph©n tÝch HPLC vµ c¸c d¹ng mÉu tương ứng
Loại HPLC

Pha tĩnh

Pha động

Dạng chất
được tách

Pha đảo

C18; C8; C4,
C2

Nước/dm hữu
cơ

Trung tính; Các
Acid (base) yếu

Ghép cặp ion

C18; C8

Nước/dm hữu
cơ; Hóa chất
ghép cặp

Các Ion, base,
acid

Pha thuận

Silica; Amino,
Cyano Diol

Hữu cơ kém
phân cực

Các chất ko tan
trong nước;
các đồng phân
hữu cơ

Trao đổi ion

Nhựa trao đổi
Cation; Anion

Nước/Đệm; Ion Ion; các Ion vô
trái dấu
cơ

Loại kích cỡ

Polystyrene
Silica

Nước (GFC);
Hữu cơ (GPC)

31

Các hợp chất
polymer cao

phân tử

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
3.2. HỆ THỐNG MÁY HPLC

3.2.1. SƠ ĐỒ KHỐI MÁY HPLC

16


13-Nov-18

33

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.2. HỆ THỐNG CẤP PHA ĐỘNG
2.2.1. Khái niệm
Là hệ thống chứa pha động để cung cấp cho hệ thống HPLC.
Hệ thống này có thể có từ 1 đến 4 kênh (tương ứng với 1 đến 4 bình
chứa thủy tinh ).
Pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau
để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp

17


13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.2. HỆ THỐNG CẤP PHA ĐỘNG
2.2.1. Khái niệm

Điều kiện pha động

- Pha động phải tan lẫn vào nhau tốt .
- Phải lọc qua màng lọc 0.45 μm để không làm nghẹt cột
- Phải được khử khí hòa tan trong pha động. Khí hòa tan có thể
làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền, có thể
loại khí hòa tan bằng cách đánh siêu âm.

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.2. HỆ THỐNG CẤP PHA ĐỘNG
2.2.1. Khái niệm

Điều kiện pha động

Bộ phận lọc đầu vào bằng
thủy tinh hoặc thép không rỉ
có lỗ xốp 10 μm,

18

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.2. HỆ THỐNG CẤP PHA ĐỘNG
3.2.2. Cách dùng pha động rửa giải

Những nhược điểm của của kỹ thuật
đẳng dòng (isocratic)

• Độ phân giải thấp đối với những peak có hệ
số lưu giữ k nhỏ (rửa giải sớm)
• Độ phân giải thấp đối với những peak ra
muộn: do peak bành rộng.
• Với những dung dịch mẫu có nhiều cấu tử có k
khác nhau, thời gian phân tích bị kéo dài
• Cột hay bị ô nhiễm bởi những cấu tử có độ
lưu giữ cao

38

19


13-Nov-18

Những ưu điểm của kỹ thuật
gradient dung môi
• Tăng cường độ phân giải
• Tăng độ nhậy với những peak ra muộn (k lớn)
• Có khả năng phân tích những mẫu phức tạp (các hệ số k khác
biệt lớn)
• Cải thiện dạng peak sắc ký
• Giảm được thời gian phân tích, nhất là những mẫu có nhiều
cấu tử có độ phân cực khác nhau
• Tăng độ bền của cột do loại bỏ được các cấu tử có độ lưu giữ
mạnh.
39

… và những nhược điểm
• Thiết bị HPLC phức tạp hơn, giá thành cao hơn
• Thời gian phân tích thực tế tăng thêm do phải cộng thêm thời
gian cân bằng cột. Với chế độ cặp đôi ion, thời gian cân bằng
cột có thể kéo dài.
• Các hệ thiết bị LC khác nhau có thể tích trễ khác nhau làm ảnh
hưởng tới sự chuyển giao phương pháp giữa các thiết bị
• Một số detector hoặc ứng dụng không thể áp dụng gradient
dung môi.
• Nếu sử dụng van tỷ lệ, khả năng bị kết tủa muối ở van cao (cần
gia tăng quá trình rửa)
40

20


13-Nov-18

So sánh isocratic và gradient

Trường hợp A, isocratic: dạng peak không cân xứng, nhất là các peak rửa giải sau
khoảng10 phút.
Trường hợp B, gradient, Các peak tách đồng đều và có dạng peak hẹp, cân đối.
Chú ý: các cặp peak tại các điểm 1 và 2 trong trường hợp isocratic không tách đựơc
như trong trường hợp rửa giải gradient.
41

Biểu đồ thay đổi thành phần dung môi hữu cơ trong kỹ
thuật gradient (%B)

• Isocratic hold time: thời gian chờ ban đầu
• Gradient time tG: thời gian gradient diễn ra
• Purging: giai đoạn đuổi các cấu tử có độ lưu giữ cao
• Conditioning: ổn định lại cột, trở về thành phần ban đầu
• Equilibrium: cân bằng cột

42

21


13-Nov-18

Hệ số lưu giữ tương đối trong
kỹ thuật gradient
Do bản chất pha động thay đổi liên tục trong quá trình phân tích, do đó hệ số lưu giữ của các
cấu tử cũng thay đổi, bỏi vậy ta không thể sử dụng hệ số lưu giữ k như trong rửa giải isocratics.

Thay vào đó, ta sử dụng hệ số lưu giữ tương đối k* được xác định theo phương trình dưới
đây:

Trong đó:
tG:
thời gian gradient (phút)
F:
tốc độ dòng
(ml/ph)
S:
lấy bằng 4 (đại lượng này phụ thuộc vào bản chất các cấu
tử phân tích, với các phân tử nhỏ, S có giá trị khoảng từ 4-6. Với protein hay
peptide, S = 10 – 1000.
ΔΦ :
Vm:

sự thay đổi thành phần của dung môi B
Thể tích rỗng của cột phân tích (~0.68πr2L)

43

Values of 2 < k* < 10 are desired. A good starting value for k* is 5.
44

22


13-Nov-18

Độ dốc gradient ảnh hưởng lên

khả năng tách.

Tăng thời gian gradient từ 10 phút lên 60 phút làm giảm độ dốc gradient. Kết quả hai cặp
peak 1,2 và 6,7 đã tách được hoàn toàn.

45

Tính hệ số lưu giữ k* trong
sắc ký lỏng gradient

Với các giá trị đã cho, ta tính được hệ só lưu giữ tương đối k* :
k* = 25x2/(1.15x4x0.9x1.7) = 7,10
Với các cấu tử có phân tử lượng nhỏ, giá trị k* xấp xỉ 5 là được,
vậy giá trị k*=7,1 ở trên là có thể chấp nhận được
46

23


13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.3 BỘ KHỬ KHÍ ON LINE
Mục đích : nhằm loại trừ các bọt khí nhỏ còn sót lại trong dung môi
pha động ngay trong quá trình chạy máy sắc ký
Hoạt động : cho hai dung môi
A và B . Dung môi đi vào ống

polymer bên trong máy hút
chân không, chân không sẽ
kéo khí hòa tan đi xuyên qua
thành ống , chất lỏng ở lại
bên trong thành ống

Läc dung m«i vµ b¶o vÖ cét

48

24


13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.4 HỆ THỐNG BƠM
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện
Yêu cầu
quá trình chia tách sắc ký
Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at
đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar)
pump phải tạo dòng liên tục

Lưu lượng bơm từ 0.1 đến
9.999 ml/phú

Tương hợp với các loại dung môi
hữu cơ thông dụng, đệm, muối.

Khả năng cấp và trộn dung môi
chính xác trong gradien (với pump
đa kênh)

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

Vận hành ổn định,
lặp lại

Dễ bảo trì và sửa chữa

2.4 HỆ THỐNG BƠM

- Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã
được cài đặt . Trong quá trình chạy sắc ký áp suất
hiển thị là thông số vô cùng quan trọng biểu thị
sự ổn định của hệ thống .

25