SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN độc tố AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Đỗ Thị Lan

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN
ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ: VẬT LÝ CHẤT RẮN

Hà Nội – 2019


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Đỗ Thị Lan

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN
ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Vật Lý chất rắn
Mã số: 8.44.01.04

LUẬN VĂN THẠC SĨ: VẬT LÝ CHẤT RẮN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS: Nguyễn Thanh Bình

Hà Nội – 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn “sử dụng phương pháp quang phổ phát hiện
độc tố aflatoxin trong thực phẩm” do PGS.TS Nguyễn Thanh Bình hướng
dẫn là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong
luận văn này là trung thực và không sao chép các công trình của người khác.
Nếu có sai sót tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, tháng 09 năm 2019

Học viên
Đỗ Thị Lan

i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn
Thanh Bình – người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong
quá trình thực hiện luận văn!
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, cán bộ phòng tại Viện Vật
Lý – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi thực hiện và hoàn thiện luận văn!
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè
đồng nghiệp của tôi – những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này!
Trong quá trình thực hiện luận văn, do kiến thức còn hạn chế không
tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp
của quý Thầy Cô để tôi có thể hoàn thiện luận văn này!

ii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii
MỤC LỤC...................................................................................................... 1
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................... 3
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ 4
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ .................................................. 5
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 7
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................. 9
1.1: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN .............................................................. 9

1.1.1: Khái niệm các loại aflatoxin ................................................................ 9
1.1.1.1: Khái niệm aflatoxin ....................................................................... 9
1.1.1.2: Lịch sử phát hiện aflatoxin ............................................................ 9
1.1.1.3: Điều kiện gây nhiễm bẩn của aflatoxin ....................................... 10
1.1.1.4: Các dạng aflatoxin và chuyển hóa của chúng ............................. 12
1.1.2: Cấu tạo hóa học và tính chất của aflatoxin B1 ................................... 13
1.1.2.1: Cấu tạo hóa học của aflatoxin B1................................................. 13
1.1.2.2: Tính chất của aflatoxin B1 ........................................................... 14
1.1.3: Độc tính và cơ chế gây bệnh của aflatoxin B1 ................................... 15
1.1.3.1: Độc tính của aflatoxinB1.............................................................. 15
1.1.3.2: Cơ chế gây bệnh của aflatoxin B1................................................ 15
1.2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN AFLATOXIN .............................. 17
1.2.1: Phương pháp sử dụng kít thử nhanh độc tố nấm mốc aflatoxin ........ 17
1.2.2: Phương pháp sử dụng sắc ký kết hợp phổ khối ................................. 17
1.2.2.1: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography –
TLC) .......................................................................................................... 17
1.2.2.2: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high ferformane
thin layer chromatography – HPTLC) ...................................................... 18
1


1.2.2.3: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high ferformane liquid
chromatography – HPLC) ......................................................................... 19
1.3: PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN AFLATOXIN ............... 19
1.3.1: Khái niệm hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang
(FRET) ......................................................................................................... 20
1.3.2. Cơ sở lý thuyết của hiệu ứng FRET [8], [27] .................................... 22
CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM ................................................. 27
2.1: CHUẨN BỊ MẪU .................................................................................... 27
2.1.1: Aflatoxin B1 ....................................................................................... 27

2.1.2: Chấm lượng tử bán dẫn CdSe/ ZnS ................................................... 27
2.2. PHỔ HẤP THỤ UV – VIS ...................................................................... 28
2.3: PHỔ HUỲNH QUANG ........................................................................... 31
2.4: PHỔ HUỲNH QUANG PHÂN GIẢI THỜI GIAN SỐNG .................... 32
2.4.1. Quang phổ phân giải thời gian và thời gian sống phát quang ........... 32
2.4.2. Cấu tạo và nguyên lý kỹ thuật của hệ đo huỳnh quang phân giải thời
gian ............................................................................................................... 35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 39
3.1: TÍNH CHẤT QUANG CỦA AFLATOXIN B1 ...................................... 39
3.2: TÍNH CHẤT QUANG CỦA CHẤM LƯỢNG TỬ CdSe/ZnS ............... 40
3.3: TRUYỀN NĂNG LƯỢNG HUỲNH QUANG CỘNG HƯỞNG CỦA
AFLATOXIN VÀ CHẤM LƯỢNG TỬ CdSe/ZnS....................................... 41
3.4: THỬ NGHIỆM XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG NGÔ ................... 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 49

2


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
*: Trạng thái kích thích
A: Acceptor
AFB1: Aflatoxin B1
D: Donor
ELISA: Enzyme – linked Immunosorbent Assay
FDA: Cục Dược Phẩm và Thực Phẩm Hoa Kỳ
FRET: Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang
HPLC: Phương pháp sắc ký lỏng cao áp
HPTLC: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
IAC: Vincam Aflatest P 1 ml

Ml: Microgam/ kg
PBS: Phosphate buffer solution
TCSPC: Đếm đơn photon tương quan thời gian
TLC: Phương pháp sắc ký lớp mỏng
SILAR: Successive ionic layer adsorption and reaction
UV – Vis: Phổ hấp thụ vùng tử ngoại- khả kiến

3


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các giới hạn tối đa hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm
Bảng 1.2: Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của bộ y tế Việt Nam
Bảng 2.1: Chuẩn bị mẫu aflatoxin B1 – CdSe/ZnS
Bảng 3.1: Thời gian sống huỳnh quang của mẫu aflatoxin B1-CdSe/ZnS
tại bước sóng 435 nm và 545 nm

4


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Aspergillus flavus
Hình 1.2: Aspergillus parasiticus
Hình 1.3: Một số loại nông sản bị nhiễm aflatoxin
Hình 1.4: Cấu tạo hóa học của một số loại aflatoxin
Hình 1.5: Cấu tạo hóa học của aflatoxin B1
Hình 1.6: Mô hình hiệu ứng FRET
Hình 1.7: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET
Hình 1.8: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất donor và
accepter

Hình 1.9: Hiệu suất truyền năng lượng FRET được vẽ như hàm khoảng
cách cặp donor – acceptor, khoảng cách R0 là khoảng cách mà hiệu suất
truyền bằng 50%
Hình 1.10: Quang phổ huỳnh quang của donor và accepter và dung dịch
hỗn hợp của donor – accepter
Hình 2.1: Sơ đồ nguyên lí của hệ đo hấp thụ quang học UV – VIS
Hình 2.2: Máy đo quang phổ UV – VIS
Hình 2.3: Sơ đồ nguyên lí của máy quang phổ kế huỳnh quang Cary
Hình 2.4: Máy đo phổ huỳnh quang Cary
Hình 2.5: Nguyên lí tổng quát của kỹ thuật TCSPC
Hình 2.6: Sơ đồ tổng quát của hệ TCSPC
Hình 3.1: Phổ hấp thụ và huỳnh quang của Aflatoxin B1
Hình 3.2: Phổ hấp thụ và huỳnh quang của chấm lượng tử CdSe/ZnS
Hình 3.3: Phổ hấp thụ (a); phổ huỳnh quang (b) của các mẫu aflatoxin
B1 với tỉ lệ hàm lượng khác nhau
Hình 3.4: Đường cong suy giảm huỳnh quang của aflatoxin B1 –
CdSe/ZnS với tỉ lệ khác nhau đo tại bước sóng 435 nm (a) và 545 nm (b) kích
thích tại bước sóng 405 nm

5


Hình 3.5: Xác định nồng độ aflatoxin B1 theo thời gian sống huỳnh
quang
Hình 3.6: Phổ huỳnh quang trạng thái dừng của aflatoxin B1 chiết suất
từ ngô

6

MỞ ĐẦU
Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài Aspergillus
flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus nomius – đây là các loại nấm
mốc. Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung thư. Chính vì thế, việc kiểm
định độc tố aflatoxin trong thực phẩm giữ vai trò hết sức quan trọng. Các loại
nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa, miến, gạo, lúa
mì…), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông…), gia vị (ớt,
hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng…) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ,
dừa…Trên cơ sở những nghiên cứu của các nhà khoa học, Bộ Y tế đã ban
hành QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI GIỚI HẠN Ô
NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM TRONG THỰC PHẨM. Văn bản pháp quy này
được công bố ngày 25 tháng 10 năm 2011.
Nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới là điều kiện thuận lợi để các loại vi
nấm như aflatoxin phát triển. Do ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới, tác động
của các loại vi nấm gây nên tổn thất lớn cho nông sản giai đoạn sau thu hoạch
và bảo quản, trong đó tổn thất gây ra do nấm mốc chiếm phần đáng kể. Ngoài
việc gây tổn thất về số lượng, nấm mốc còn sinh ra các độc tố đặc biệt nguy
hiểm với sức khỏe con người và động vật. Nấm mốc phát triển trên lương
thực, ngũ cốc, bên cạnh việc sử dụng chất dinh dưỡng của hạt như protein,
glucid, lipid, vitamin… chúng còn sinh ra các độc tố. Aflatoxin có thể gây độc
cho người và gia súc như gây tổn thương gan, gây quái thái, đột biến, ung thư,
thậm chí với liều lượng cao có thể gây tử vong…
Có nhiều phương pháp để xác định aflatoxin như phương pháp sắc ký
lỏng, phương pháp khối phổ. Đây là phương pháp cho phép ngưỡng phát hiện
rất cao, tuy nhiên các thiết bị rất đắt tiền chỉ có ở cơ sở kiểm định chuyên
nghiệp đồng thời quy trình rất phức tạp đòi hỏi nhiều thời gian. Phương pháp
sử dụng kít thử nhanh, phương pháp này cho kết quả nhanh tuy nhiên giới hạn
phát hiện và độ chính xác lại bị hạn chế. Phương pháp quang phổ dựa trên
tính chất quang của độc tố aflatoxin – hấp thụ – phát quang trong vùng nhìn
thấy cho phép phát hiện aflatoxin với ngưỡng cao hơn nhiều so với phương

7


pháp dùng kit thử nhanh với thao tác đơn giản, không cần hóa chất xử lý mẫy,
thiết bị phân tích quá đắt tiền.
Mục đích của đề tài:
Sử dụng phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang
(FRET) thông qua tương tác của cặp donor – acceptor là aflatoxin B1 – chấm
lượng tử CdSe/ZnS phát hiện aflatoxin B1. Phương pháp này cho phép phát
hiện hàm lượng aflatoxin B1 tới ppM.
Thử nghiệm phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang
phát hiện AFB1 trong ngô.
Phương pháp nghiên cứu
Luận văn được tiến hành chủ yếu bằng phương pháp thực nghiệm
Luận văn với tiêu đề “ Sử dụng phương pháp quang phổ phát hiện độc
tố aflatoxin trong thực phẩm”. Nội dung luận văn được chia làm 3 chương:
Chương 1: Tổng quan. Tìm hiểu về khái niệm aflatoxin, các loại
aflatoxin và dạng chuyển hóa của chúng, điều kiện gây nhiễm aflatoxin và độc
tính của aflaftoxin. Các phương pháp phát hiện aflatoxin và phương pháp
quang phổ phát hiện aflatoxin.
Chương 2: Kỹ thuật thực nghiệm. Trình bày quá trình chuẩn bị mẫu
đo, các phương pháp thực nghiệm được sử dụng trong luận văn như đo phổ
hấp thụ, phổ huỳnh quang, thời gian sống huỳnh quang.
Chương 3: Trình bày các kết quả tính chất quang của aflatoxin, đặc
trưng hình thái và tính chất quang của chấm lượng tử CdSe/ZnS. Truyền năng
lượng huỳnh quang cộng hưởng của aflatoxin và chấm lượng tử CdSe/ZnS.
Thử nghiệm xác định aflatoxin trong hạt ngô.

8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN
1.1.1: Khái niệm các loại aflatoxin
1.1.1.1: Khái niệm aflatoxin
Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số
loài Aspergillus, là một loại nấm mốc, đáng chú ý nhất là Aspergillus flavus
và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung
thư. Sau khi thâm nhập vào cơ thể, các aflatoxin có thể được gan chuyển hóa
thành dạng trung gian epoxit hoạt hóa hoặc được thuỷ phân và trở thành M1 ít
độc hơn.

Hình 1.1. Aspergillus flavus

Hình 1.2. Aspergillus parasiticus

1.1.1.2: Lịch sử phát hiện aflatoxin
Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở Anh bị tổn thất nặng nề, lúc đầu
hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “bệnh gà tây X” (Turkey X
disease). Sau đó, các loại gia cầm khác như: Vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và
tử vong rất nhiều.Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đến
một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961, người ta đã
tìm ra bản chất hóa học của độc tố này là aflatoxin do vi nấm Aspergillus
flavus và Aspergillus parasiticus.

9


Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng aflatoxin được

tạo ra bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u gan
ở động vật. Trên động vật thủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tố
aflatoxin trên cá hồi được thực hiện bởi Ashley và các cộng sự.
Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố aflatoxin. Các
nhà khoa học cũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo
của aflatoxin.
1.1.1.3: Điều kiện gây nhiễm bẩn của aflatoxin
Các loài sinh aflatoxin thuộc chi Aspergillus phân bố rất rộng trong tự
nhiên. Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào hạt trước khi thu hoạch
và trong quá trình bảo quản. Cây chủ rất dễ bị gây nhiễm bởi Aspergillus sau
phơi nhiễm kéo dài trong môi trường có độ ẩm cao hoặc bị tổn thương các
điều kiện xấu như hạn hán.
Các môi trường sống bản địa của Aspergillus là trong đất, thực vật mục
nát và ngũ cốc đang bị giảm sức đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cả
các loại chất hữu cơ mỗi khi có điều kiện được thuận lợi cho sự phát triển của
nó. Điều kiện thuận lợi bao gồm độ ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao.

Hình 1.3. Một số loại nông sản bị nhiễm aflatoxin
10


Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa
miến, gạo, lúa mì…), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt
bông…), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng…) và các loại quả hoặc
hạt khác như hạt dẻ, dừa…
Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn
bằng thức ăn nhiễm aflatoxin.
Hầu như tất cả các nước đều đã có quy chuẩn sử dụng aflatoxin. Tại
Hoa Kỳ có hàm lượng aflatoxin từ 0 ppb đến 20 ppb cho tiêu dùng trực tiếp,
mặc dù thức ăn dùng để vỗ béo cho bò thịt, lợn, gia cầm trong giai đoạn cuối

có thể chấp nhận mức 300 ppb, nhưng trong thực tế thường thấp hơn nhiều
mức khuyến cáo an toàn của Cục Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA).
FDA đã đưa ra mức khuyến cáo về hàm lượng aflatoxin trong thực
phẩm và thức ăn chăn nuôi nhằm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng và sức
khoẻ động vật.
Tại Việt Nam , Bộ Y tế đã ban hành quy chuẩn QCVN 8-1:2011/BYT
Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm độc tố vi nấm trong
thực phẩm trong đó gới hạn đối với aflatoxin được cho trong bảng 1.1 và
bảng 1.2
Bảng 1.1. Các giới hạn tối đa hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm
Hàm lượng,
ppb

Tiêu chí

20

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho vật nuôi chưa
trưởng thành (kể cả gia cầm chưa trưởng thành) và các
vật nuôi cho sữa hoặc dùng cho các mục đích khác
không được công bố; và đối với thức ăn chăn nuôi ngoại
trừ ngô và bột từ hạt bông

100

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho giống vật nuôi
(bò, lợn) hoặc gia cầm đã trưởng thành

11

200

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho lợn thịt từ 100
pound trở lên

300

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho bò giai đoạn cuối
(ví dụ vỗ béo) và đối với bột hạt bông dùng cho bò, lợn
và gia cầm

Bảng 1.2. Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam
ML
(microgam/kg)
5
15

0,5

Tiêu chí

Đối với Aflatoxin B1 trong thực phẩm nói chung
Đối với Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong thực phẩm nói
chung
Đối với Aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm sữa

1.1.1.4: Các dạng aflatoxin và chuyển hóa của chúng
Aflatoxin có ít nhất 18 dạng khác nhau trong tự nhiên, trong đó
Aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1 và M2 được coi là quan trọng vì có độc tố

mạnh [6]. Các nhóm aflatoxin khác nhau phân biệt bởi cấu trúc phân tử.
Aflatoxin nhóm B (B1 và B2) có một vòng cyclopentane, trong khi nhóm G
(G1 và G2) chứa vòng lacton [7]. Aflatoxin nhóm B có huỳnh quang màu
xanh dương (Blue), nhóm G thể hiện huỳnh quang màu lục (Green). Trong số
các nhóm aflatoxin, aflatoxin B1 là nhiều và phổ biến [8] chiếm 75% tổng số
aflatoxin gây ô nhiễm thực phẩm [16].
Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hóa thành aflatoxin M1, M2.

12


Hình 1.4. Cấu tạo hóa học của một số loại aflatoxin
Ngoài 6 loại aflatoxin chủ yếu trên, người ta còn phát hiện một số loại
aflatoxin khác, người ta đã đề nghị gọi các hợp chất đó là flavatoxin hoặc
flavacuramin:
- Aflatoxin P1: là một sản phẩm trao đổi chất, là dẫn xuất fenolic của
Aflatoxin B1. Người ta đã phân lập được chúng trên cột ambeclit XAD – 2
(Rohm và Haas). Trọng lượng phân tử của nó xác định bằng khối phổ là 2.8.
Sản phẩm này là kết quả sự khử metyl của aflatoxin B1.
- Aflatoxin 3B hay toxin B3: Một chất có Rf thấp, phân lập từ bình nuôi
cấy aflatoxin Flavus, dạng tinh thể, màu vàng kim, độ độc kém aflatoxin B1 từ
40 đến 50 lần.
- Aflatoxin B3 còn gọi là prositicol: Nhân xiclopenten tận cùng của
aflatoxin B1 được thay thế bằng một chuỗi etanol, do đó chất này là 6 – metoxi
– 7 – (2 – hydroxi etyl) difuro Cumarin.
1.1.2: Cấu tạo hóa học và tính chất của aflatoxin B1
1.1.2.1: Cấu tạo hóa học của aflatoxin B1
Aflatoxin B1 được coi là dạng độc nhất và được sản sinh bởi
Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Có công thứ là C17H12O6 với
trọng lượng phân tử là 321. Trong cấu trúc phân tử có nhóm lacton và

13


metoxyl, không có nhóm hidroxyl tự do. B là chữ viết tắt của blue (màu xanh
nước biển), aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh nước biển.

Hình 1.5. Cấu tạo hóa học của Aflatoxin B1
1.1.2.2: Tính chất của aflatoxin B1
Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím. Điều này cho
phép xác định các hợp chất này ở nồng độ thấp (0,5ng hay thấp hơn trên một
vết ở sắc kí bản mỏng).
Aflatoxin tinh khiết rất bền vững ở nhiệt độ cao lên đến điểm nóng
chảy, khi được làm nóng trong không khí. Tuy nhiên, nó tương đối không bền
khi để dưới không khí và dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặc
biệt khi hòa tan ở các dung môi có độ phân cực cao. Các aflatoxin trong các
dung môi clorofom và benzen bền vững trong nhiều năm nếu được giữ trong
chổ tối và lạnh. Các aflatoxin ít hoặc không bị phân hủy dưới điều kiện nấu
bình thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy nhiên, khi có độ ẩm và ở nhiệt
độ cao vẫn có thể tiêu hủy aflatoxin trong một thời gian nhất định.
Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như
clorofom, metanol. Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 10 –
20mg/l.

14


Tất cả các aflatoxin đều hiện diện dưới dạng tinh thể nhỏ, mịn, màu
trắng hoặc vàng lợt.
Aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh nước biển, là loại aflatoxin
thường gặp và độc nhất. Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân

tử thấp, dễ dàng được hấp thu sau khi ăn, sự hấp thu là hoàn toàn.
1.1.3: Độc tính và cơ chế gây bệnh của aflatoxin B1
1.1.3.1: Độc tính của aflatoxin B1
Aflatoxin là chất gây ung thư mạnh, trong đó aflatoxin B1 có độc tính
mạnh nhất.
Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10mg),
độc tố aflatoxin còn được coi là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư.
Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất, nếu hấp thu
một lượng là 2,5mg aflatoxin trong thời gian ngắn (khoảng 3 tháng) có thể
dẫn đến ung thư gan sau một năm.
Aflatoxin gây ra các tác hại chính sau đây:
- Phá hủy tế bào gan, thận và các bộ phận khác.
- Ức chế lên hệ miễn dịch.
- Ăn mòn thành ruột và dạ dày.
- Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết.
- Gây ra ung thư gan ở người và gia súc.
1.1.3.2: Cơ chế gây bệnh của aflatoxin B1
Do cấu trúc hóa học có vòng dihydro – furan nên aflatoxin B1 liên kết
với một số enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong. Ngoài ra,
Aflatoxin B1 còn tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền (DNA, RNA)
làm rối loạn cấu trúc di truyền dẫn đến tổn thương gan và ung thư gan. Với
phụ nữ mang thai, hấp thu lượng nhất định sẽ dẫn đến dị tật thai nhi hoặc quái
thai, nặng có thể gây chết non thai nhi.

15


Aflatoxin B1 là phân tử ái lực mạnh với thành ruột, có trọng lượng phân
tử thấp nên dễ dàng được hấp thu hoàn toàn sau khi ăn. Khi đến ruột non,
Aflatoxin B1 sẽ nhanh chóng được hấp thu vào tĩnh mạch và ruột non, tá

tràng. Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin được tập trung vào gan
nhiều nhất (chiếm khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận,
cơ, mô mỡ, tụy, lách... Trong vòng 24 giờ có khoảng 80% bị đào thải theo
đường tiêu hóa qua mật, đường tiết niệu qua thận và đáng chú ý nó còn bài
tiết qua tuyến sữa gây bệnh cho thai nhi đang bú sữa mẹ.
Cho đến nay, các luận chứng khoa học công nhận khả năng tác động
lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn sau:
- Ức chế các men polymerase mà chúng có vai trò tổng hợp DNA và
RNA.
- Làm chậm hoặc ngừng hẳn sự tổng hợp DNA.
- Ngăn cản cơ chế sinh tổng hợp RNA truyền tin.
- Biến đổi hình dạng nhân tế bào.
- Hạn chế quá trình sinh tổng hợp protein.
Hậu quả là gây ung thư biểu mô tế bào gan.
Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính ở người
và động vật, nghiêm trọng nhất và nguy hiểm nhất là khả năng gây ung thư
gan và xơ gan.
Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thực
thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nấm mốc là một vấn
đề hết sức quan trọng có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh
ung thư gan nguyên phát.

16


1.2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN AFLATOXIN
1.2.1: Phương pháp sử dụng kít thử nhanh độc tố nấm mốc
aflatoxin
Cơ sở để kiểm tra là dựa trên sự miễn dịch trên que thử. Trên que thử có
chứa kháng nguyên- kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

(ELISA) [19]. Kháng thể đặc hiệu chống lại độc tố aflatoxin và nhận ra
aflatoxin trong các phân tử trong mẫu. Kết quả được đánh giá và đọc nhanh
bằng hiển thị màu sắc trên kit thử. Phương pháp này đơn giản dễ sử dụng, tuy
nhiên độ nhạy còn hạn chế và thường phải kết hợp với các phương pháp khác
để phân tích.
1.2.2: Phương pháp sử dụng sắc ký kết hợp phổ khối
Đây là phương pháp có độ chính xác rất cao cho phép phân tích rất
nhiều chất [17], [23], [25]. Các phương pháp như sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc
ký lỏng hiệu năng cao kết hợp phổ khối… đều đáp ứng được yêu cầu và được
các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận. Tuy nhiên những
phương pháp này đòi hỏi đầu tư, chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ
năng và trình độ của kỹ thuật viên. Do vậy nó không phù hợp cho các phòng
kiểm nghiệm qui mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương.
1.2.2.1: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography –
TLC)
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm
lượng aflatoxin đầu tiên vào những năm 1960. Là một kỹ thuật sắc ký được
dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm
pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp thụ, thường là silicagel, aluminium
oxide được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch
cần phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc
ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các
thành phần trong dung dịch. Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng
là cloroform: methnol và clroform: aceton. Việc thêm nước vào hệ thống
dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin.

17


Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc ký, khoảng

1cm từ dưới lên. Bản sắc ký sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp,
như methanol hoặc nước, và được đặt vào một vật chứa có nắp. Dung môi di
chuyển lên bản sắc ký bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử
lên bản sắc ký. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển
với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh và độ
tan khác nhau trong dung môi. Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh
tranh của chất tan và pha động để có chỗ liên kết với pha tĩnh.
Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích. Khi
làm sắc ký một số hợp chất có thể tương tự aflatoxin.
1.2.2.2: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high ferformane
thin layer chromatography – HPTLC)
Do những khuyết điểm trong phương pháp sắc ký lớp mỏng đơn thuần
ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi. Phương
pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: Đưa mẫu lên bản
mỏng một các tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp thụ, chạy ban
mỏng trong dung môi có kiểm soát.
Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết được
định đúng vị trí và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy
densitimetess.
Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể bằng 1 l (so với 5 – 10
l mẫu trong phương pháp TLC) như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích

của vết (1mm). Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng
HPTLC, do đó có thể xácđịnh tới 30pg aflatoxin.
Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp
TLC như một phương pháp định lượng aflatoxin có hiệu quả nhất.

18

1.2.2.3: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high ferformane
liquid chromatography – HPLC)
Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC là hệ thống phân
tích đắt tiền, chọn lọc dùng định lượng aflatoxin. Phương pháp HPLC sử dụng
cả hai pha: Pha bình thường và pha phản.
Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (uv) và xác định cường độ
huỳnh quang.
Mẫu phân tích được tách bằng chloroform: Nước. Ly tâm chất tác dụng
làm sạch qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhối silicagel 0,5 m và
pha động sử dụng benzen: acetonitrit: acid formic. Giới hạn xác định là 0,5
m / kg .

Husst (1984) đã sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác
định được các aflatoxin B1, B2,G1, G2 ở nồng độ 5pg.
Davis (1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của
đồng phân iot của aflatoxin B1. Kết quả dẫn đến việc phát triển phương pháp
đồng phân cột.
1.3: PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN AFLATOXIN
Là phương pháp dựa trên đặc trưng vật lý của Aflatoxin như phổ hấp
thụ, huỳnh quang, hấp thụ hồng ngoại [9], [10], [13], [15]. Phương pháp này
cho phép phát hiện nồng độ tương đối cao, có thể tới ppM, trong khi đó vận
hành lại tương đối đơn giản và thời gian thực hiện nhanh. Gần đây phương
pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) được sử dụng
nhiều để xác định các độc tố có hàm lượng thấp bằng cách đưa vào mẫu thử
chất huỳnh quang tương thích với chất cần phát hiện. Khi có mặt của chất
độc, tính chất huỳnh quang sẽ thay đổi. Dựa vào sự thay đổi này người ta sẽ
xác định được hàm lượng chất cần phát hiện.

19

1.3.1: Khái niệm hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh
quang (FRET)
Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (Fluorescence
Resonance Energy Transfer - FRET ) là một cơ chế truyền năng lượng xảy ra
ở cấp độ nano thông qua tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, đây là một hiện
tượng vật lý quan trọng với nhiều lĩnh vực tiềm năng như lĩnh vực quang điện
tử và rất nhiều lĩnh vực khác. FRET được đưa ra từ thập kỷ 50 của thế kỷ
trước, hiện nay đang được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực đặc biết
trong nghiên cứu y sinh học [4], [15]. FRET là hiệu ứng phụ thuộc vào
khoảng cách truyền năng lượng từ một chất cho huỳnh quang (donor) tới một
chất nhận huỳnh quang (acceptor) phù hợp, là một trong số ít các công cụ có
sẵn để đo khoảng cách nanomet và xác định những thay đổi trong khoảng
cách cả trong in vitro lẫn trong cơ thể. Do có độ nhạy với khoảng cách cao,
nên hiệu ứng FRET đã được sử dụng để nghiên cứu động học, tương tác
nguyên tử. [3], [20], [24].
Cơ chế truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang liên quan đến các
chất phát huỳnh quang mà ở đây là điện tử ở trạng thái kích thích (donor),
một phân tử huỳnh quang có thể truyền năng lượng kích thích của nó cho một
phân tử huỳnh quang khác (acceptor) không phát xạ gần đó thông qua các
tương tác lưỡng cực – lưỡng cực tầm xa. Lý thuyết truyền năng lượng được
dựa trên khái niệm về một chất huỳnh quang kích thích như một dao động
lưỡng cực có thể trải qua sự trao đổi năng lượng với một lưỡng cực thứ hai có
tần số cộng hưởng tương tự. Vấn đề này, truyền năng lượng cộng hưởng
tương tự như sự dao động cùng tần số. Ngược lại, năng lượng bức xạ yêu cầu
phát xạ và tái hấp thụ một photon phụ thuộc vào kích thước vật lý và tính chất
quang học của donor – acceptor, cũng như hình dạng của bề mặt và khoảng
cách của donor – acceptor. Không giống như các cơ chế bức xạ, truyền năng
lượng cộng hưởng có thể mang lại một lượng đáng kể thông tin về cấu trúc
liên quan đến các phân tử donor – acceptor [5], [20], [24].

Một cặp phân tử tương tác với nhau thông qua hiệu ứng FRET được gọi
là một cặp donor – acceptor. Hiện tượng FRET không qua trung gian là quá

20


trình phát xạ photon. Ngoài ra, nó thậm chí không yêu cầu chất màu nhận
được phát huỳnh quang. Mặc dù trong hầu hết các ứng dụng, các donor và
acceptor đều có khả năng phát huỳnh quang [3], [14].
Một cặp nguyên tử tạo ra một điện trường do sự tương tác lưỡng cực.
Đầu tiên phân tử donor hấp thụ ánh sáng kích, các điện tử chuyển từ trạng thái
cơ bản lên trạng thái kích thích. Nếu không có mặt của phân tử acceptor, phân
tử donor có thể phát huỳnh quang và quay trở lại trạng thái cơ bản. Khi có
mặt phân tử acceptor một phần năng lượng ở trạng thái kích thích được truyền
cho lượng cho phân tử acceptor gần nhất có trạng thái năng lượng kích thích
thấp nhất qua sự trao đổi của một photon ảo. Phân tử donor trở về trạng thái
cơ bản còn phân tử acceptor chuyển lên trạng thái kích thích [19], [22], [24].
Như vậy phân tử acceptor được kích thích nhờ vào quá trình gián tiếp
nhận photon ảo, mặt khác đây cũng là hiện tượng xảy ra rất tự nhiên [5].
FRET là một hiện tượng tự nhiên đầy lý thú bởi vì nó không phụ thuộc vào sự
tiếp xúc vật lý cũng như truyền điện tử.

FRET

r

Donor

Phát xạ

Accepter

Hấp thụ
Hấp thụ chấp nhận

Huỳnh quang chất cho

Hình 1.6. Mô hình hiệu ứng FRET

21